JPH06501383A - 病原体又は日和見感染微生物に対する接着受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 病原体又は日和見感染微生物に対する接着受容体発明の分野 この発明は、病原体又は日和見感染微生物に対する受容体に関するものである。

この受容体は組成物のキット、器具そして病原体又は日和見感染微生物の検出や 定量に、そしてこれら微生物の流体からの除去、更にこれら微生物の感染や、そ の他の疾病の予防のための方法において利用され得る。

この発明は、更にこの受容体に結合する微生物の接着タンパク及びこのタンパク を作る方法にも関係する。この方法は、遺伝子工学によるタンパク質の合成をも 含む。このタンパクは、診断や治療のための組成物、特にヒトや動物を感染から 守るための、又はこれら微生物によって惹き起こされる病気の処置のためのワク チンに有効に利用されることが期待される。

関連資料 いくつかの公知資料が括弧付き数字で本明細書中に７照される。これら参考文献 の全引用は明細書の後、請求の範囲の前に添付される。これら資料を添付するこ とによって、そこにおける開示が本件出願に組み入れられる。

発明の背景 微生物か宿主細胞に結合することを付着又は接着という。現在では、この機構は 微生物のコロニー形成や感染に重要な段階であると一般的に受け入れられている 。細菌、カビ、マイコプラズマが宿主に特異的に接着するときには、細胞表層の 炭水化物を介して行われるということが長い間言われてきた（１．　２）。全て の動物細胞やヒトの細胞は糖鎖て覆われているので、このことは驚くべき二とて はない。すなわち、これらの細胞は、細胞膜に結合している塘タンパクや糖脂質 一般的に、宿主細胞への結合を仲介する微生物の構造をアドヘンンと言い、アド ヘンンによって認識される宿主細胞の炭水化物を受容体という。宿主細胞の受容 体の存在は、まさに微生物がアトへシンを発現することと同様に微生物の感染の 決定因子である。

細胞表層の炭水化物が受容体として機能するということは、単糖及び／又は細胞 をグリコシダーゼという炭水化物を切断する酵素で前もって処理することによっ て微生物の接着や赤血球凝集を阻害するといった間接的な研究によってなされて きた（２．　３）。最近になって、直接に結合をアッセイするという、より体系 だった研究がなされ始めた。このアッセイ方法は、糖脂質のクロマトグラムにラ ベルした微生物をオーバーレイするというもので、この方法によって多くの糖脂 質は特定の細菌、又はウィルスに結合するということが示されるだろうと思われ る。糖脂質は１分子当たり１つのオリゴ糖を含んでいるので（１分子当たりにい くつかの異なる糖を含む糖タンパクとは違って）、特異的な炭水化物の受容体の 配列かより正しく決定できる（４）。この方法を用いて、ヒトに尿路感染するＥ 。

ｃｏｌｉがＧａ１−ａｌｐｈａ−１−４Ｇａｌ−を含む糖脂質に結合することが 示された（５）。

この結果は、糖脂質が感染体やトキシンに対する受容体として機能するというこ との徹底的な研究を促進するものであった。

今日までに、あらゆる種類の微生物やトキシンに対する糖脂質が発見されてきた 。例えば、Ｐｒｏｐｉｏｎｔｂａｃｔｅｒｉｕｓの種類がラクトシルセラミド（ ＧａｌＢｌ−４ＧＩｃＢｌ−ＩＣｅｒ）に結合する。また、多くの肺を冒す病原 体、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｔｎｏｓａＧａｔを含む糖脂質 に結合するということが報告された（１０．１１）。最近、Ｎｅ１ｓｓｅｒｊａ 　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅが、Ｇａ１ＮＡｃＢｌ−４ＧａｌＢｌ−４Ｇｌｃを含 むガングリオ糖脂質に結合するということも報告された（１２．１３）。

驚くべきことに、発明者は病原体や日和見感染微生物に対するユニバーサルな受 容体を発見している。受容体と共に精製したアトへシンタンパク、それをコード する遺伝子、この遺伝子から作られたタンパク質をも得ている。このタンパク質 は、診断や治療のための組成物に加えて、これらの微生物に対する広範囲のワク チンに有益である。

とにある。

この発明の別の目的は、病原体又は日和見感染微生物に対する受容体を利用した 組成物を供給することにある。

この発明の更なる目的は、診断用キット及びサンプル中の病原体又は日和見感染 微生物の存在を検出する方法を検出することにある。

この発明のまた更なる目的は、流体中から病原体又は日和見感染微生物を除去す る方法や器具を供給することにある。

この発明のそしてまた別の目的は、病原体又は日和見感染微生物か惹き起こす動 物の病気や感染の処置、予防、改善のための薬剤掌上の方法及び組成物を供給す ることにある。

二の発明の更なる目的は、診断治療ワクチンに利用される単離された微生物のア トへシンタンパクを供給することにある。

この発明のまた更なる目的は、微生物アトへシンタンパクをコードするＤ　Ｎ　 Ａ、二のＤＮＡを含むベクター、及び二のＤＮＡやベクターによって形質転換し た微生物を供給することにある。

以下の明細書の記述で、上記以外にも本発明の目的および利点か示される箇所も あり、さらにその記述から明白とされる目的、利点、あるいは本発明を実践する 二とて明らかとなる目的、利点もあり得る。このような本発明の目的および利点 は、添付された請求の範囲中で示される器具および化合物によって達成される。

ユニで具体的かつ広範囲に記述されたように、この目的を達成するため、また本 発明の目的に沿うために、次の群の中から選ばれる充分純粋な化合物から構成さ れる病原体又は日和見感染微生物に対する受容体を供給する。この群は、Ｇａ１ Ｂ１−４ＧｌｃＮＡｃＢｌ−３ＧａｌＢＩ−４ＧｌｃＢ１−１−Ｘ（Ｒ）、　Ｇ ａ１Ｂｌ−３ＧｌｃＮＡｃＢＩ−３ＧａｌＢｌ−４ＧＩｃＢｌ|１−Ｘ（Ｒ）。

ＧｌｃＮＡｃＢｌ−３ＧａｌＢｌ−４ＧｌｃＢｌ−１−Ｘ（Ｒ）、Ｇａ１Ｂ１− ４ＧＩｃＮＡｃＢ［−３ＧａｌＢＬ−４Ｇｌｃ、　Ｇａ１Ｂ戟|３ＧｌｃＮＡ ｃＢｌ−３ＧａｌＢＩ−４ＧＩｃ、ＧｌｃＮＡｃＢｌ−３ＧａｌＢ１−４Ｇｌｃ 、　Ｇａ１ＢＩ−４ＧｌｃＮＡｃＢｌ−３Ｇａｌ及びＧａ１aｌ−３−Ｇｌ ｃ％ＡｃＢＩ−３Ｇａｌである。二こでＸは、スフィンコ゛ンン、ヒドロキシス フィンコ゛ンン又は飽和スフィンゴシンを示し、又ＲはＨか又はＸＮ−アシル脂 肪酸誘導体であり、例えばＸ　（Ｒ）はセラミドである。望ましいことは、かか る受容体か水溶性、又は不溶性の基質に結合している先の群の化合物から分離さ れて純粋である二とである。最も望ましいことは、この受容体がリポゾームに結 合することである。

他の具体例としては、本発明は疑わしきサンプル中に、病原体又はｅ初見感染微 生物か存在するかどうかを検出する方法を含む。もし、サンプル中に存在すると したら、受容体が微生物に結合するのに十分な時間及び条件下でサンプルを本発 明の受容体に接触させる。そして、受容体が微生物に結合するか否かの決定をす る。望ましくは、受容体か不溶性の基質に結合し、その複合体が微生物の細胞膜 上にある抗原に対するラベルした抗体で検出されることである。

本発明は更に、サンプル中のこれら微生物を検出する診断用キットを含む。この キットは、不溶性の支持体に結合する本発明の受容体を含有し、受容体と微生物 、又は受容体と微生物由来のアトへシンタンパクとの複合体形成を噴出又は測定 する手段を与える。このキットは、ヒト又は他の動物の体液中の病原体、又は日 和見感染微生物を検出するのに特にａ効である。好ましくは、この複合体を検出 又は測定する方法がイムノアッセイである二とである。

他の側面から見て、本発明は、これらの微生物を液体中から除去する方法及び器 具を含む。受容体が、微生物に結合するのに十分な時間及び条件で液体を本発明 の受容体に接触させる。そして液体を受容体との結合物から除去する。その結果 、液体から微生物を除去できる。器具は、液体を保持する容器、液体を容器に導 入する部分及び除去する部分からなる。容器は、本発明の受容体を含み、好ま他 の動物の感染、又はその他の病気の処置、予防又は改善のための方法及び薬剤学 的組成物を含む。処置、予防又は改善に、十分な量の本発明の受容体が哺乳動物 宿主に施される。好ましくは、薬剤学的に可能な担体と一緒に用いられる。望ま しくは、二の担体はリポゾームである。別の面から好ましいことは、担体は受容 体が結合する巨大分子である。特に好ましくは、受容体が物理的に哨乳動物細胞 と和合する液体に溶けているか、又は懸濁していて、この組成物かかかる細胞へ の病原体又は日和見感染微生物の接着を阻害し、又はかかる細胞から微生物を除 去するために用いられる。

そして更に本発明は、病原体又は日和見感染微生物の細胞表面から得られて、本 発明の受容体に結合する十分に純粋な微生物のアトへシンタンパクを供給する。

このタンパクは、病原体又は日和見感染微生物の膜を可溶化する二とによって得 られ、可溶化された成分の中にアトへシンタンパクが含まれている。この成分を 不溶性成分と分け、タンパク質分子が受容体に結合するのに十分な時間、本発明 の受容体と接触させる。受容体は、不溶性の固定支持体に結合している。そして タンパク質分子を受容体から除去し、回収する。好ましくは、結合しなかった成 分を完全に除去するために、受容体を可溶性成分と接触させた後洗浄する。

本発明はまた、アトへシンタンパク由来の修飾タンパクやポリペプチドを含む。

かかる誘導タンパク質やポリペプチドは本発明の受容体に結合する。好ましくは 、かかる誘導体はアトへシンタンパクの１つか又はそれ以上のエピトープである 。

望ましくは、これらのヒト又は動物宿主に対してイムノジェニックであり、微生 物のアトへシンタンパクと免疫学的に交差反応をする。特に好ましいことは、ポ リペプチドの免疫性を上げるように変化させることである。

このポリペプチドは、ヒト又は動物の宿主の感染、又は他の病気を予防、改善又 は処置するためのワクチンに存効である。このワクチンは、免疫学的に十分な量 の本発明のタンパク又はポリペプチドを薬剤学的に可能な担体の中に含んでいる 。第２に好ましいことは、このワクチンが、本発明のタンパク又はポリペプチド を遺伝学的に発現し得る非病原性の微生物を含むべきである。

好ましくは、本発明のタンパク質又はポリペプチドが、遺伝子工学によって作製 された、タンパク質又はポリペプチドであることである。これらは、かかるタン パク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡによって、形質転換される適当な細 胞によって産生されたものである。

本発明の、微生物アトへシンタンパクをコードする単離されたか又は十分に純粋 なりＮＡは次のようにして得られる。病原体又は日和見感染微生物のＤＮＡを含 むゲノムライブラリーをスクリーニングするのに本発明の受容体を用いる。この ライブラリーは、ＤＮＡの異なった配列か挿入されたベクターのクローンからな る。クローンのベクターは、ＤＮＡのただ一つの配列のみを含む。受容体に結合 するクローンを同定するために、本発明の受容体をこれらのクローンに接触させ る。こうしてクローンを単離する。好ましくは、外来性のＤＮＡを、クローンか ら回収する。

本発明は、更に、単離されたか又は純粋なこのＤＮＡの誘導体、例えば一つ又は それ以上の変異を持つＤＮＡを含む。好ましくは、かかるＤＮＡが穏やかな条件 で、ゲノムライブラリーから得られたＤＮＡにハイブリダイズする。

本明細書の一部となる図面には本発明の一実施例が示されており、明細書の記述 とともに、本発明の原理を分かりやすく説明するものである。

図面の簡単な説明 図１は１２５．てラベルしたＮ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅであるＭＳＩＩ、ｋ （Ｐ−、Ｐｌ＋）が、薄層クロマトグラフィーで分離されたバラグロボシド及び ラクト−Ｎ４リアオシルセラミドに結合する様子を示す。糖脂質をアルミニウム 板にシリカゲルを塗ったＨＰＴＬＣプレート上で、クロロホルム／メタノール１ ０．２５％ＫＣＩ水溶液を５二４：１の割合で含む溶液の中で展開した。このプ レートを０．１％ポリイソブチルメタクリル酸でコートしＴＢＳ−ＢＳＡに浸し 、ＨＢＳＳ−ＢＳＡに懸濁した１２５Ｉてラベルした淋菌と共に、２５℃で２時 間インキュベートした（パネルＢ）。また、オルシノール剤を吹きかけて、糖脂 質を検出した（パネルＡ）。レーン１は、１μｇガラクトシルセラミド（ＣＭＨ ）　、ラクトシルセラミドダブレッド（ＣＤＨ）、トリヘキソンルセラミド（Ｃ ＴＨ）　、グロボシド（ＧＬ４）、フォルスマン糖脂質（ＦＯＲ５）及びガング リオシド（０Ｍ２．ＧＭＩ。

ＧＤ３．ＧＤｌａ、ＧＤｌｂ及びＧＴｌｂを示す）。レーン２は、１μｇのシア リルバラグロボキシド、レーン３は、ユニーラミニダーゼ処理によって、シアリ ルバラグロポキシドから得られたバラグロボキシド１μｇを示す。レーン４は、 ベータガラクトシダーゼ処理によって、バラグロボキシドから得られたラクト− Ｎ−トリアオシルセラミド、レーン５は、Ｎ−アセチル−Ｂ−へキソサミニダー ゼ処理によって、ラクト−Ｎ−トリアオシルセラミドから得られたラクトシルセ ラミド１μｇを示す。構造はテーブル１に示す。

図２は、Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅであるＭＳＩＩ、ｋ（Ｐ−、ＰＩ＋−） の固定化された糖脂質ヘノ結合を示す。補助脂質であるコレステロール及びホス ファチジルコリンを、それぞれ０．　１μｇずつ含むメタノール中の脂質を、ポ リビニルクロリンマイクロタイタープレートの平底ウェルの中で蒸発乾固した。

ウェルを１％アルブミンによって一晩４℃でブロッキングし、ＨＢＳＳ−ＢＳＡ で２度洗浄し、１２５ＩてラベルされたＮ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ２５μｇ と共に２５℃でインキュベートした（およそ１０１０５ｃｐ。２時間後、ウェル を生理的食塩水で５度洗浄し、プレートから切り離し結合した放射活性を、ンン チレーションカウンターで測定した。非特異的な結合（およそ総放射活性の１０ ６以下）を補正するために、対照実験として、ｇＯｎｏｃｏｃｃ　ｌを補助脂質 のみとインキュベートした。Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのアシアロ−０Ｍ２ （■）、ハラグロボキンド（ム）及びラクトシルセラミド（ＧＭＩ）、又はシア リルバラグロボキシド（△）に対する結合をＨＢＳＳ−ＢＳＡの中て決定した。

図３は、抗ＬＯＳモノクロナル抗体４８Ｅ１２の、実際のバラグロポキントに対 する結合を示す。パネルＡは、オルシノール染色によって検出した糖脂質を示す 。パネルＢは、モノクロナル抗体Ｂ５４及び放射ラベルした抗マウスＩｇＭ抗体 でオーバーレイした、クロマトグラムのオートラジオグラムを示す。レーン１は 、それぞれ１μｇのガラクトシルセラミド（ＣＭＨ）　、ラクトシルセラミド（ ＣＤＨ）、トリへキソシルセラミド（ＣＴＨ）　、グロボシド（ＧＬ４）　、フ ナルスマン糖脂質（ＦＯＲ５）及びガングリオシドＣＧＭ３．ＧＭ２．ＧＭ１． ＧＤ３．ＧＤｌａＧＤｌｂ及びＧＴｌｂ）。レーン２は、アンアローＧＭ１　１ μｇ；レーン３はバラグロボシド１μｇ；レーン４．５．６．７．８及び９はそ れぞれバラグロボシド０．５．０．２５．０１２５．０．０６２．０．０３１及 び０．０１６μｇを示す。

図４は、Ｐｓｅｕｄｏｗｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＣＴ　４の薄層クロマ トグラフで分離した、糖脂質に対する結合を示す。糖脂質を、アルミニウム板に シリカゲルを塗ったＨＰＴＬＣプレート上で、クロロホルム／メタノール領　２ ５％ＫＣＩ水溶液をそれぞれ５・４：１の割合て含む溶液の中で展開した。二の プレートを、ポリイソブチルメタクリル酸でコートしトリスＢＳＡに浸し、１％ のＢＳＡを含むトリスＢＳＡに懸濁した１２５１でラベルしたＰ、　ａｅｒｕｇ ｉｎｏｓａと共に２５℃で２時間インキュベートした。図４Ａは、オルシノール 剤で検出した［準糖脂質を示す。図４Ｂは、放射ラベルした微生物をオーバーレ イし、オートラジオグラム（１８ｈ）することによって検出した糖脂質受容体を 示す。レーン１は、ガラクトシルセラミド（ＣＭＨ）　、ラクトシルセラミド（ ＣＤＨ）、スルファチド（ＳＦＴ）、グロブトリアオシルセラミド（ＣＴＨ）　 、グロボシド（ＧＬ４）及びガングリオシド（ＧＭ３，０Ｍ２．ＧＭＩ、ＧＤｌ ａ、ＧＤｌｂ及びＧＴｌｂ（それぞれの糖脂質１μｇ））を示す。レーン２はガ ングリオトリアオンルセラミド（アジアローＧＭ２．１μｇ）及びガングリオテ トラオシルセラミド（アシアロ−ＧＭＩ。

１μｇ）及びレーン３はラクト−Ｍ−テトラオシルセラミドダブレ・ノドを示す （バラグロボシド、２μｇ）ａ 発明の詳細な説明 本発明の良好な実施形態を詳細に述べてゆくが、これは以下の例示とともに本発 明の詳細な説明するものである。

この発明は、病原体又は日和見感染微生物に対するユニノく−サルな接着受容体 に結合する微生物アトへシンタンパク、及びポリペプチド、タン／くり質をコー ドするＤＮＡ、及びこれらの物質を使用する方法に関連する。ここで用いるアト へシン受容体又は受容体なる用語は、１つか又はそれ以上のタイプの微生物に対 して特異的な親和性及び選択的な結合性を有する化合物を意味する。

受容体は、様々な種類の微生物に対するアトへシン受容体として機能するラクト 系糖脂質及びその誘導体からなる。糖脂質の１つは、ラクトトリアオシルセル（ ラクトトリアオシルセラミド、Ｎ−アセチルグルコサミン−ベータ１−３−ガラ クトース−ベーター１−４−グルコース−ベータ１−１−セラミド）である。

それは次の式で示される。

ＧＩｃＮＡｃＢｌ−３ＧａｌＢｌ−３ＧａｆＢｌ−４ＧｌｃＢ１−１ｃｅｒ２つ 目はバラグロボシド（ラクトネオテトラオシルセラミド、ガラクトース−ベータ ー１−４−Ｎ−アセチルグルコサミン−ベーター１−３−ガラクトース−ベータ １−４−グルコース−ベーター１−１−セラミド）であり、それは次の式％式％ ３番目はバラグロボシドの異性体、それは次の式に示される。

Ｇａ１Ｂ１−３ＧＩｃＮＡｃＢｌ−３ＧａｌＢｌ−４ＧＩｃＢｌ−ＩＣｅｒ（通 称名及び構造は、参考文献３８及びここて挙げた参考文献の例に従った。

二の申請書の式で用いられているように、Ｅはベータのことである）。加えて、 本発明の受容体は、セラミドの部分の脂肪酸を除去した上記化合物を含む。最後 に本発明の受容体は、上記構造及びそのある残基の炭水化物の部分を含む。それ らは次式に示される。

Ｇａ１Ｂｌ−４ＧＩｃＮＡｃＢ１−３ＧａｌＢｌ−４ＧｌｃＧａｌＢＩ−３ＧＩ ｃＮＡｃＢｌ−３ＧａｌＢｌ−４ＧｌｃＧＩｃＮＡｃＢｌ−３ＧａｌＢｌ−４Ｇ ＩｃＧａｌＢ１−４ＧＩｃＮＡｃＢｌ−３ＧａｌＧａ１Ｂ＋、−３ＧＩｃＮＡｃ Ｂｌ−３Ｇａｌこの引用した受容体の構造は、ＧＩｃＮＡｃＢｌ−３ＧａｌＢｌ −４ＧｌｃＢ１−１ｃｅｒすなわち、本発明の受容体は、次の群から選ばれる十 分に純粋な化合物である。

Ｇａ１Ｂ１．−４ＧＩｃＮＡｃＢｌ−３ＧａｌＢｌ−４ＧＩｃＢｌ−１−Ｘ（Ｒ ）、Ｇａ１Ｂｌ−３ＧＩｃＮＡｃＢｌ−３ＧａｌＢＩ−４Ｇ撃モaＩ−１−Ｘ（ Ｒ）、　ＧＩｃＮＡｃＢｌ−３ＧａｌＢｌ−４０＋ｃＢｌ−１−Ｘ（Ｒ）、　Ｇ ａ１Ｂ１−４ＧＩｃＮＡｃＢｌ−３ＧａｌＢ１−４Ｇｌｃ、@Ｇａ１Ｂ１−３Ｇ ｌｃＮＡｃＢ１．−３ＧａｌＢ１−４ＧＩｃ、　ＧｌｃＮＡｃＢｌ−３ＧａｌＢ ｌ−４ＧＩｃ、　Ｇａ１Ｂｌ−４ＧｌｃＮＡｃＢ［−３Ｇａ結yびＧａ１ Ｂｌ−３−ＧｌｄＡｃＪ３１−３Ｇ、＋Ｉ　ここで、Ｘはスフィンゴシン、ヒト ロキシスフィンコ゛シン又は飽和スフィンゴシンを示し、またＲは、Ｈか又はＸ のＮ−アンル脂肪酸誘導体であり、例えば、Ｘ　（Ｒ）はセラミドである。

本発明の受容体は、少なくとも充分に純粋が好ましい程度に純粋である。ここで 用いられる、十分に純粋、及びこれと似た言葉は、化合物が重量にして８ｏ９６ 純枠であることを意味する。すなわち、この化合物は、重量にして２０％以上の 他の化合物を含まない。ユニで用いる、純粋な、及びこれに関連した言葉は、薄 層クロマトグラフや、こ二で引用した参考文献９に示されている方法に従って化 学的に染色した場合、たな一つのみのバンドを与える二止を意味する。もし必要 なら、この化合物を既知の方法で更にＩｖ製する。このようにして、受容体化合 物は少なくとも９０？６の、好ましくは少なくとも９５０６の、最も好ましくは 少なくとも９８９６の純度になる。

既に述べたように、本発明の受容体は、広範囲の病原体又は日和見感傷微生物に 対する接着受容体として機能する。ここでいう微生物とは、細菌、ウィルスマイ コプラズマ、カビ、リヶノチ乙及び原生動物を含む。好ましくは、微生物は細菌 である。ここで用いる病原性微生物とは、ヒト又は動物宿主に病気（感染を含む ）や病的症状を惹き起こす微生物を意味する。ここで用いる日和見感染微生物と は、通常は病気又は感染を惹き起こさないが、宿主は免疫応答が弱まったなどの ストレスがかかったある状況下では病原性になることを示す。好ましくは、本発 明の受容体は次の種のｆ８菌に結合する。

５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　、　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、　Ｃ１ｏｓ ｔｒｊｄｉｕ＊　、　Ｂｏｒｒｅｌｉａ、　Ｈａｅｍｏｐｈ鰍撃浮刀@。

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　、　Ｎｅ１ｓｓｅｒ４ａ　、　Ｃｏｘｉｅｌｌａ、　 Ｓｈｉｇｅｌｌａ最も好ましいことは細菌は５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎ ｅｕ＠ｏｎｌａｅ、　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃことである。

また別の面から好ましいことは微生物がレトロウィルスであることである。

三糖類であるＣＩｃＮＡＣＢｌ−３ＧａｌはＳ、　ｐｎｅｕｓｏｎｌａｅに対す る受容体であるが上に挙げた他のどの微生物に対する受容体でもないと報告され ていた。しカ化驚くべきことに本発明者はこの三糖類が上に挙げた微生物に対す る受容体としても機能することを発見した。このように本発明がＳ、　ｐｎｅｕ ■ｏｎｉａｅ以外の微生物に対して用いられる受容体及び方法を含有する組成物 を含む。

本発明の受容体は、ここで示す方法と共に、既知の方法によって得られる。バラ グロボシドは、参考文献９に示すように、赤血球ジアリルバラグロボシドを、１ Ｍギ酸で１００℃６０分処理することによって脱シアル化することで得られる。

ラクトトリアオシルセルは、参考文献１４の中のアシアロ−ＧＭ１〜アンアロー ＧＭ２を得る方法として表されている方法に従って、ベータガラクトシダーゼに よってバラグロボシドを切断して得られる。これらのリソ誘導体は、ここで引用 したＢａ５ｔａ、　Ｍ、、　Ｋａｒｍａｌｉ、　Ｍ、、及びＬｉｎｇｗｏｏｄ、 　Ｃ，（１９８９）　Ｊ、　Ｃｈｉ、　Ｍｉｃｒｏｂｌｏ１２７・１Ｂ＋７−１ ８２２の中に示されている。これら糖脂質の炭水化物の部分の誘導体は、ここで 引用したＭｉｌｊｋｏｖｉｃ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｓｃｈｅｎｇｒｕｎｄ　（１９８ ６）　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅｓ、　１５５：　P ７５−１８１；　ｔｔｏ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｙａｍａｇａｔａ、　Ｔ、（１９８ Ｂ）　Ｊ、　１３ｉｏ１．　Ｃｈｅｗ、　２６１：　１４２V１１−１４２８２ 又はＫａｎｆｅｒ、　Ｊ、Ｎ、　ａｎｄ　ｔｌａｋｏｍｏｒｉ、　Ｓ−ｉ　（１ ９８３）　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏ「Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅ５ｅａ窒モ■B Ｓｐｈｉｎｇｏｌｌｐｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｌｌ、、　Ｐｌｅｎｕｉ　Ｐｒｅｓｓ 、　ＮＹの方法に従ってセラミドの部位を除去するか、又はこ二で引用した１９ ８４年１１月２１に発行した（Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、　０．Ｌ２８． ０４３）　５ｖｅｎｓｋａＳｏｃｋｅｒｒａｂｒｉｋｓ　Ａｂのヨーロッパ特許 公報の方法に従一つで直接合成することによって得られる。受容体のＧｌｃＮＡ ｃＢＩ−３ＧａｌＢｌ−４Ｇｌｃは、後に述べる方法に従って合成される。

本発明の受容体は、疑わしきサンプル中の病原体又は日和見感染微生物の存在を 険出することに宵効である。加えて、アトへシンは、いくつかの微生物によって 分泌され得るので、アトへシンの存在は受容体によって検出され得る。もし存在 するなら、微生物及び／又はアトへシンに受容体が結合するのに十分な時間及び 条件下で、本発明の受容体をサンプルと接触させる。かかる時間と条件は、ここ で示した方法によって、ユニの微生物ごとに熟練した技術者によって容易に決定 され得る。そして受容体が、微生物及び／又はアトへシンに結合するか、すなわ ち、微生物と受容体及び／又はアトへシンと受容体複合体が結合されるか百かを 決定される。微生物及び／又はアトへシンの受容体への結合は、ここに示す方法 と、既知の方法によって決定される。好ましくは、受容体は固体マトリックス又 は他の不溶性基質と結合する。微生物か検出されるのに十分な結合の量と方法で 受容体か基質に結合するべきである。好ましくは、受容体は基質表面を十分に覆 う単分子層として結合する。基質に対する実際の受容体の濃度は、検出される個 々の微生物、用いる個々の受容体、また受容体の微生物に対する結合効率によっ てそれぞれ異なるであろう。

受容体は、基質に最も相応しい方法で結合するであろう。共有結合、非共ａ結合 、イオン結合が考えられる。例えば、脂質の部分はあるプラスチック性の基質に 、疎水的に結合するであろう。共存結合によって、直接的に又はユニでフ考文献 として引用したように、Ｘａｌｌｅｎｉｕｓ　ｅｔ　ａｌ、のアメリカ特許Ｎｏ 、４．６５７８４９に示したように、リシカーを介して基質の官能基に受容体か 結合する。また、受容体のリノ誘導体は、１９８９年７月２６日に出願され、１ ９９０年１月３１１１に発表されたヨーロッパ特許公報Ｎｏ、８ＱＩ１．３７８ ５．３　（公表番号０３５２　７６６）に示される方法に従って、固形支持体に 結合するだろう。

受容体はまず、蛋白質などの水溶性の基質に結合され、蛋白質としては事情アル ブミンか好ましい。二の結合物は次いで不溶性の支持部に付着される。

不溶性の基質としては、受容体が結合でき、本発明の検査分析に適して使用され 得るならどのような不溶性の固体物質でもよい。このような基質には、浸透性お よび半浸透性膜、ガラスピーズ、プラスチックビーズ、ラテックスビーズ、プラ スチックのマイクロタイターウェル、アガロース、デキストラン、セファロース 、および珪藻土などがある。受容体はまた、スクリーンやネットなどの多孔性あ るいは液体浸透性物質に結合されてもよい。微生物を捕らえようとする受容体の 性質を妨害しない限り、結合剤が用いられてもよい。

ある実施例では、受容体はリポソームの中に組み入れられる。このリポソームは 、二こに引例として添付されるｇｒｕｎｅｒ他による方法（生化学、２４　：　 ２８３３−２８４２）で生成され、一般的な方法を用いて受容体はリポソーム内 に取り込まれる。これら受容体は基本的に、リポソームと接触したならリポソー ムの脂質層の中へと自然に混合する。脂肪酸部分は脂ｗＩｌｌＩＯ中へと入り、 炭水化物部分は膜の外、リポソームの内部か外部に突出する。

微生物が十分に受容体に結合されるまで、サンプルを受容体を含む基質に接触さ せた後、このような結合は適切な検出手段を用いて検出される。基本的には、受 容体と、二の受容体に結合したと思われる微生物とを含む基質は、特に険出され るべき微生物に結合する物質と接触される。このような物質には、例えば、特定 の微生物に対する（特に表面蛋白質に対する）抗体、あるいは特定的に検出され るべき微生物に結合する受容体がある。通常、結合されなかった物質すべてを除 去するために、基質は洗浄される。検出検査には、免疫測定検査、凝集検査、薄 膜色層分析検査、細胞障害検査かあり、免疫測定検査の中には、Ｘ線免疫検査、 酵素結合免疫吸着剤検査（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンプロット、免疫蛍光検査、 化学発光検査、生物発光検査がある。結合剤の度数あるいは量は、サンプル中の 微生物の量（あるいは濃度）の測定を行って、周知の方法を用いて決定される。

抗体あるいは炭水化物受容体は、容易に検出される物質を用いて識別される。

このような検出可能の物質として、酵素、放射性物質、蛍光性物質、ｆＬ学発光 性物質かある。検出されるべき微生物の表面抗原に対する第１の抗体は、この第 １抗体にχすする識別された第２の抗体と共に使用される。第１の抗体は基質と 接触され、この基質上の受容体に結合されるいかなる微生物とも結合する。この 基質は洗浄されて今度は第２の抗体に接触され、これが検査されて基質上の微生 物の存在を示す。

このような検査、および検査方法、あるいはこれらを用いる条件下での種々の検 査において使用される抗体もしくは受容体を識別するための検出体については、 この分野の当業者にとって周知である。例えば、　Ｄａｖｉｄ他による米国特許 第４．４８６．５３０号（１，９１１４年１２月４日発行）　、ＭＯｎｔａｇｎ ｉｅｒ他による米国特許第４．７０１１．８１８号（１９８７年１１月２４日発 行）　、Ｂｅ１ｔｚ他による米国特許第４．７５３．８７３号（１９８８年６月 ２８日発行）などがそうである。本発明の受容体を組み込んだ特定の検査法は、 Ｂａ、１他によるｒジュール臨床微生物学Ｊ　（２７：１８１７−１８２２．１ ９８９年刊）に開示されている。

本発明によれば、種々のタイプのサンプルで病原性あるいは日和見性の微生物（ 細菌）の存在を検査する二とが可能である。サンプルは、疾患者あるいは疾患動 物から抽出された体液もしくは繊維組織を含む生物サンプルでもよい。このサン プルは通常、生理食塩水などの適切な水溶液で希釈され、綿棒などを使って微生 物（細菌）は採集される。綿棒は次いて無菌水溶液中に浸され、集めた微生物を 水溶液中に解放する。この水溶液が本発明にしたがって検査されるわけである。

本発明はまた、病院の手術室、薬品／医療器機製造工場、食品製造工場など、無 菌であるべき環境での微生物の検出検査にも使用される。微生物自体は当業者に 周知である多様な方法で採集され、このような微生物を含む液体サンプルが作ら れる。

本発明はさらに、斜字研究、臨床診断、食品安全処理などで使用される、病原性 ／日和見性の微生物テストのための器具を提供する。この器具は、（１）本発明 の受容体が付着できる固体支持部、もしくはその他の不溶性の基質を保持する容 器と、（２）微生物（付着体）と受容体との合成組成物を検出もしくは測定する ための手段、とを有する。受容体はサンプルを入れた容器壁に付着することも可 能である。不溶性の基質は滴定用の微量皿でもよい。検出測定手段は、検出体を 含み微生物と結合可能な試薬でもよい。試薬は、検出体と共役される本発明の受 容体でもよいし、また、酵素など、検出体に結合される微生物の表面抗原に対す る抗体でもよい。別の実施例では、前記検出測定手段は、バクテリアの表面抗原 に対する第１の抗体と、この第１の抗体に対する第２の抗体とからなり、ここで は第２の抗体が検出体に結合する。第２抗体の例として、ベルオキシダーゼを用 いでぶ別されるヤギの免疫グロブリングアニンがある。

本発明はまた、液体から病原性もしくは日和見性の細菌を取り除く方法および装 置を提供する。液体は、細菌が受容体に十分結合できる条件下で、しばらくの間 、即時受容体と接触される。次いて、この液体と受容体は分離され、必要とされ る程度に応して、細菌を含まない液体もしくは含まれる細菌量が著しく少ない液 体が生成する。先にも述べたように、受容体は固体支持部に付着され、液体がこ の受容体に衝突して流れることが好ましい。

この装置は、液体を導入するための引込口と液体を取り除く引出口とを俺えた容 器を有する。また、容器には、受容体が固体支持部に付着されて入れられるが、 受容体は液体に接触する容器表面に付着されてもよい。容器は、本発明の受容体 が付着てきる固体相格子（フェイズマトリクス）を含む色相分析柱であるのがよ い。受容体は例えば、エポキシ活性されたセファローズ（薬物名；セファローズ ４．８）あるいは同様のアガローズベースのマトリクスに、電子対を共有して結 合される。親和性容器の上部から液体が容器内に注がれ、容器底部にたまってゆ くにしたがって微生物は分離除去される。

別の実施例では、受容体付着のための固体支持部の代わりに、膜組織、好ましく は半浸透性膜もしくはリポソームが用いられる。液体がこの膜を通過するにつれ て、微生物が液体から取り除かれる。

この受容体は、病原性あるいは日和見性の細菌によって引き起こされたホスト（ 宿主）の疾患あるいは感染の治療、予防、改善に使用される。一般に、受容体は 、薬剤的に融和性のキャリヤの中で投与される。したがって本発明は、動物、特 に哺乳類、なかんずく人間の疾患あるいは感染の治療、予防、改善のための薬物 化合物をも提供し、このような薬物化合物は、薬剤として許容されるキャリヤ内 に、治療、予防、改善のための本発明の受容体の効果量をａ合したちのである。

受容体はキャリヤとの／Ｎ、合剤あるいはキャリヤと結合されたものでもよい。

例えば、受容体は高分子のキャリヤと結合され得るし、リポソーム内にあっても よい。

上記のような化合物は、ここでの教示を用いるならば、当業者に周知の方法で作 られる。受容体は、賦形剤（薬をのみやすくするもの）、安定剤、溶解剤、ある いは不活性希釈剤など製薬的に通例となっている添加剤と混合され、やはり通例 の方法で、適切な投与形部、例えば、錠剤、カプセル剤、水薬、懸濁剤、乳剤な どに加工される。受容体が高分子のキャリヤと結合される場合は、このキャリヤ は天然あるいは人工のポリマーであるのが好ましい。このようなポリマーとして 、牛血清アルブミンあるいはポリサツカロイトなどのポリペプチドがある。実施 例としては、受容体は前述のようにリポソーム内に含まれる。

本発明の薬剤は、注射、局所塗布、静脈注射、口径投与、皮内、皮下、眼内、結 膜下、筋向、包膜内投与なとによって、局部的に投与される。投与の様式は疾患 の種類とそこに含まれる微生物（細菌）によって異なる。

化合物の適量かホストく宿主）もしくは密告に投与される。ポストもしくは密告 は、動物、特に哺乳類、なかんずく人間である。投与されるべき受容体の実際量 は、治療されることになる特定の疾患によって決定される。二のような決定は、 治療投薬（調剤）に関わる当業者によって通常になされ、特別の実験なしに日常 の業務の範囲内でなされる。

本発明の受容体は、病原性あるいは日和見性の微生物が、動物特に哺乳類の細胞 へ付着するのを抑制腰これら細胞から微生物を取り除くために使用される。

細胞は培養組織あるいは宿主の細胞である。このような細胞に、微生物の癒着の 抑制あるいは排除するための本発明の受容体が十分量投与される。受容体は、生 理学的にこれら細胞と融和性の溶液内に溶解もしくは懸濁される。

特定の実施例として、受容体は食塩水に溶解された後に、たとえば火傷を負った 人間の皮膚組織など、哺乳類宿主の破傷された繊維組織を洗浄するために使用さ れてもよい。液体での洗浄する二とによって傷に感染する恐れのある細菌を洗い 流すことができる。

本発明の更に別の実施例では、受容体が結合する溶解性の基質は、病原性あるい は日和見性の微生物（細菌）に対抗する薬物化合物である。たとえば、病原性バ クテリアによって引き起こされる疾患の治療に必要とされるが、深刻な副作用を もつ抗生物質などが化合物としてあげられる。二の抗生物質を受容体に結合する 二とによって、抗生物質は問題のバクテリアを的確に標的とする。これによって 宿主に対する治療投薬量を低減し、抗生物質による副作用を低減あるいは解消す る。宿主内の特定の微生物に対する抗生物質の生産を刺激促進する免疫源もまた 、上記化合物となり得る。

本発明は更に、本発明の受容体に結合する病原性あるいは日和見性のバクテリア 表面から得られる、微生物性の分離された接着性蛋白質をも含む。この蛋白質は 、ここに教示されることを参照し、標準的な蛋白質浄化方法を用いて、天然源、 すなわち病原性あるいは日和見性の微生物から得られる。さらに、ここでの教示 を参照し、標準的な遺伝子工学技術を用いて、組み替え蛋白質として蛋白質を得 ることも可能である。

天然のソースから分離蛋白質を生成するための方法は以下の通りである。病原性 あるいは日和見性の微生物膜が標準的な方法で得られ、洗浄剤など、溶解度を高 める化合物を使用して可溶性にされる。粘着蛋白質は可溶性にされた物質内にあ る。この膜から、遠心分離によって、残りの不溶性の物質が分離される。二〇上 清は、本発明の受容体を含む親和性の色相分析柱を通過腰これによって蛋白質か 色を目分析柱の不溶性のマトリクスに捕らえられる。この色相分析柱は適切な緩 衝液中で一同もしくは数回洗われるのがよい。粘着蛋白質は次いて適切な薬剤を 使用して溶離される。適切な薬剤として、溶液中の遊離受容体、あるいはＫＳＣ Ｎ、塩化ナトリウム、キニジン塩酸塩などのカオトロビズムの薬剤かある。溶離 された蛋白質か本発明の受容体に結合したことを確認するために、受容体に接着 した蛋白質が検査される。分離された蛋白質の純度は、５ＤＳ−ＰＡＧＥによっ て分析される。

望ましくは、蛋白質は、前述の発見及び教示に従って修正及び適用された標準的 な蛋白質精製技術の適用により、更に精製され得る。その様な技術は、電気泳動 法、遠心分離法、ゲル濾過法、沈殿法、透析法、クロマトグラフィ　（イオン交 換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、抗体親和性クロマトグラ フィ、逆層高速液体クロマトグラフィ及びケル濾過高速液体クロマトグラフィを 含む）、等電点集積法、及び、それらの変法及び組合わせを含む。好ましい技術 は、参照文献として引用されている、米国特許４．４４６，１２２　（１９８４ ，５，１発行、Ｃｈｕｅｔ、ａｌ、　）に記載されたものと同一の方法を含む。

好ましくは、蛋白質は、更に、レセプター親和性クロマトグラフィにより精製さ れる。

引き続いて、これらの技術の１つ又はそれ以上は、物理化学的性質に従って分子 を分離するような手順に適用される。これらの性質は、蛋白質の疎水性、電荷、 結合能及び分子量を含む。各々の技術によって得られた物質の種々の分画は、本 発明の受容体に対して反応する能力ついて試験される。その様な活性を示すそれ らの分画は、連続的な手順に於ける次の技術に被検され、そして、再び試験され る。

該過程は、受容体に反応性のある唯一の分画が維持され、そして、該分画か、ポ リアクリルアミドゲル電気泳動法で？ｔｉ険された時に一つのバンドを示すまで 繰り返される。

従って、本発明の蛋白質は、本発明の受容体に結合する、実質的に純粋な蛋白質 である。ここで用いられている、「実質的に純粋な」及びこれに関連する語句は 、本発明の蛋白質に対して、天然に於て本発明の蛋白質に会合している他の蛋白 質から単離させた蛋白質を意味する。実質的に純粋な蛋白質とは、少なくとも、 重量として８０％の純粋性、好ましくは、重量として９０％の純粋性である。即 ち、実質的に純粋な蛋白質から成る組成物は、本発明の蛋白質ではない蛋白質を 、重量として２０％以下、好ましくは、重量として１０％以下含んでいる。該蛋 白質は、標準的な技術を適用することにより、更に精製されるかもしれないので 、本発明は、精製された蛋白質を含む。ここで用いられているように、「精製し た」という語句及びそれに関連した語句は、蛋白質は、少なくとも、重量として ９５％の純粋性、好ましくは、少なくとも、重量として９８％の純粋性、そして 、最も好ましくは、少なくとも、重量として９９％の純粋性を意味する。

本発明の蛋白質は、公知の蛋白質変異技術により、変異させても良い。これらは 、参照文献として引用されている、米国特許４．３０２．３８Ｂ（１９８＋、１ １．２４．５ｔｅｖｅｎｓｅｔ、ａｌ　、）に開示された技術を含む。その様な 変異は、免疫原性又は殺菌活性を促進するかもしれないし、又は、その様な活性 には、何の影響も与えないかもじれない。

例えば、数個のアミノ酸残基は、置換又は削除されてもよい。選択的に、本発明 の蛋白質は、免疫原性又は殺菌活性に必要でない一つ又はそれ以上のアミノ酸残 基を含んでいてもよい。

例えば、抗原の特定のエピトープのアミノ酸配列のみが免疫原性又は殺菌活性に 必要であるかもしれない。望ましくない配列は、先行技術に従って周知の技術に より取り除くことができる。例えば、望ましくない配列は、トリプシン又はパパ イン又は関連の蛋白質分解酵素を用いた制限的蛋白質分解により除くことができ る。

このアプローチは、本発明の付着性蛋白質に、特に有用であると期待される。

本発明の受容体は、広範囲の微生物に結合するので、それらの微生物への該蛋白 質の付着は、そのアミノ酸配列により変化するかもしれない。しｈ化ながら、Ｇ ｌｃＮＡｃＢｌ−３ＧａＩＢｌ−４ＧｌｃＢｌ−１ｃｅｒという配列が、ラクト トラオシルサーのような末端配列であるか、又は、パーグロボサイトのような、 内部の配列であるかに拘らず、これらは全て、ＧＩｃＮＡｃＢｌ−３ＧａｌＢＩ −４ＧｌｃＢｌ−ＩＣｅｒという共通配列に結合する。従って、該蛋白質は、全 てに共通のエピトープである、保存部位を有するであろう。

あるいは、また、蛋白質の襟々な免疫的エピトープに相当するポリペプチドは、 先行技術に於ける周知の方法によって、化学的に合成してもよい。これらは、参 照文献として引用されている、米国特許４，２９０，９９４（１９ｇ１．１１． ２２．　Ｇｏｌｄｂｅｒｇ　ｅｔ、ａｌ）に開示されている方法を含む。

従って、本発明の蛋白質は、共通の成分（由来）、膚造及び作用メカニズム（例 えば、免疫原性又は殺菌活性又は本発明の受容体に結合できる性質）を有する、 変異されたポリペプチド（合成により得られる誘導体ペプチド又は蛋白質の断片 ）のグループを含むが、これらは、本発明の範囲に含まれる。なぜなら、本発明 の技術を与えられれば、当業者により調製され得るからである。

更に、一度、該エピトープが特定されれば、当業者は、本発明の蛋白質のエピト ープの変異体又は誘導体を作ることができるので、該変異体又は誘導体が、ヒト 又はその他の動物（特に、哺乳類および霊長類）に対する免疫原性又は殺菌活性 を有していれば、本発明の範囲に含まれる。

従って、該ポリペプチドは、本発明の蛋白質の免疫原性をａする断片又は該ペプ チドに対して実質的にｔ目間性を存する変異体ポリペプチドであってもよい。こ こで用いられている、「実質的にｔ目間性を存するＪという語５７は、免疫学的 に交叉反応性を有する二志を意味する。該ポリペプチドは、本発明の付着性蛋白 質に対する抗体（該抗体は、標準的な技術により調製され得る。）に結合すると いう事実によって特定されるものでもよい。

本発明の蛋白質又は免疫原性を存する断片又はそれらの誘導体ポリペプチドは、 動物（＠乳類、霊長類、ヒトを含む、、）に対する殺菌ワクチンに於ける免疫源 としても有用性を有していると期待される。該ワクチンは、当業者に公知の技術 により調製され得るものであり、例えば、抗原、薬学的に許容される担体、適当 な補助薬及び従来からワクチン中に含ませている他の物質を含む。免疫学的に効 果を有する抗原の量は、先行技術に於て公知の手法により決定される。

本発明の蛋白質及びポリペプチドは、また、本発明の受容体を発現する微生物を 検出するために用いることもてきる。例えば、図３に示されるように、ｖ＝ｇｏ ｎ。

ｒｒｈｏｅａｅは、リポポリサッカライドの一部として、３ＧａｌＢＩ−４Ｇｌ ｃ〜＾１３１−８ＧａｌＢ１．−４ＧＩＣの受容体を含むことか知られていた。

従って、該蛋白質又はポリペプチドは、標準的な技術により、固体の支持体（例 えば、ビーズ又はマイクロタイターウェル）に付着させることかでき、そして、 前述の、該微生物の検出のための方法および器具に適用される。同様に、該蛋白 質又はポリペプチドは、病原性又は日和見感染性微生物を標的とさせるために、 前述のように、薬学的試薬に付着させる二とかできる。

本発明の受容体及び前述の教示か得られれば、当業者は、−知の遺伝子工学の手 法を適用することにより、単離された、又は、実質的に精製された、本発明の蛋 白質をコートするＤＮＡを調製する二とかできる。該技術は、参照文献として引 用されている、ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　ＣｏｌｄＳｐｒｆｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｔ９８２）　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ、ａｔ、 　Ｊに開示されティる技術を含む。

本発明のＤＮＡは、本発明の受容体に結合するポリペプチドをコードする、単離 された、又は、実質的に精製されたＤＮＡ配列（即ち、ポリデオキシリホヌクレ オチド）である。ここで用いられている、「単離されたＪという語句、及び、そ れに関連した語句は、ポリペプチドに一般的に付随している他のポリペプチドを コードするＤＮＡから！Ｉ’−ｊｌｌされたものであることを意味する。

従って、本発明のＤＮＡは、クローンか、一般的に該蛋白質に付随している他の 蛋白質をコードするＤＮＡを含むクローンから単離されていれば、該ＤＮＡが、 プラスミドのような微生物ベクター又はバクテリオファージにより保持されるウ イルスヘクターにクローニングされた場合に、該ポリペプチドをコードするＤＮ Ａを含む。ここで用いられている、「実質的に純粋な」という語句及びそれに関 連する語句は、該ＤＮＡが、本発明の蛋白質をコードしていないＤＮＡ及びＲＮ Ａを実質的に含まないことを意味する。そして、本発明のＤＮＡを含むサンプル に於て、他のＤＮＡ又はＲＮＡが、重量として１ｘ以下、好ましくは、他のＤＮ Ａ又はＲＮＡが、重量として０．２％以下である。

好ましくは、該ＤＮＡは、病原性又は日和見感染性微生物のＤＮＡを含む、適当 なゲノムライブラリーをスクリーニングするために、該受容体を使用することに より、得られる。該ライブラリーは、外来ＤＮＡ断片を、一般的には、微生物に 適するプラスミド、コスミド又はファージベクターに組み込むことにより挿入さ れた、一種の微生物、一般的には、Ｅ、ｅｏｌｊ　Ｋ１２（ＨＢＩＯＩ）のよう な細菌のコロニーを構成する。更には、該ライブラリーは、ＤＮＡの異なる配列 か、実施可能に及び回収可能に挿入されたベクターのクローンを構成しており、 各々のベクターは、ＤＮＡの唯一の配列を含む。該ベクターは、プラスミド、コ スミド又はファージゲノムであってもよい。もし、用いられているライブラリー の性質のために必要であれば、ＤＮＡ断片は、適当な条件下（即ち、適当な方向 及び正しい読み枠で、ＲＮＡポリメラーゼの結合配列及びリボゾーム結合配列と 共に適当な発現配列とを含んで）で発現するように、ベクターに挿入する。

該微生物は、Ｅ、ｃｏｌｊ　８８１０１のような、付着性蛋白質を発現しないも のである。

ライブラリーからのクローンは、受容体に結合するクローンを同定するために、 本発明の受容体と接触させられる。好ましくは、該ライブラリーは、微生物のと こが受容体に結合するかを決定するために、薄層クロマトグラフィプレート上に 於て、該受容体に結合させられる。該クローンは、単離され、外来ＤＮＡは、− っのクローンから回収される。該配列は、該蛋白質をコートしているが否かを評 ｉされる。

特に好ましい具体例としては、本発明のＤＮＡは、？照文献として引用されてい る、ｒＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｔｌｌＳ＾、８７：　３３３−３３ ７　（１９９０）　Ｐａｒｕｃｈｕｒｉ　ｅｔ、ａｌ、ｊ■■ 示の適用及び修正により得られる。著者は、付着性蛋白質及び遺伝ｆを同定及び 特徴づけるために、Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの異なる付着性受容体を使用し た。

本発明を適用する際には、Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ種１４ｓＩｌのゲノムラ イブラリーは、ベクターｐ）ＩＳＳ８　（参照文献として引用されている、Ｓｅ ｉ［’ｅｒｔ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ 、８３ニア３５−７３９（１９８８））に於て、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　（ 参照文献として引用されている、５ｅｉｆｅｒｔ、ｅｔ　ａｌ、ｊ、Ｂａｃｔｅ ｒ）ｏｌ、、１７２：４Ｏ−４８（１９９０）　）に於て構築される。

薄層クロマトグラフィ重畳アッセイは、付着性蛋白質を発現するクローンの同定 に使用される。該ＤＮＡは、単離された、又は、実質的に精製された形で得られ る。

他の好ましい具体例としては、微生物性の付着性遺伝子をコードするＤＮＡを含 むコロニーは、参照文献として引用されている、ｒｏｌｓｖｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ 、、２９ｔｈ　ＩｃＡＡＣ，Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘ、１９ｇ９Ｊに従うＤＹＮ Ａピースを用いて検出される。前述のグリコリピドは、トシル化ＤＹＮＡビーズ Ｍ２８０に交叉結合され、これらの受容体含有ピースは、付着性蛋白質を発現す るコロニーを吸着するのに使用される。付着性蛋白質を発現しないコロニーは、 洗浄により取り除かれ、適当な濃縮物が得られるまで、該過程は繰り返される。

付着性蛋白質を発現すると推定されるコロニーは、プレートされ、３５３−メチ オニンにより各々のコロニーを代謝的にラベルし、前述のように、該受容体に結 合するコロニーの活性を試験することにより確認される。付着性のコロニーから のＤＮＡは、共通配列を特定するために比較され、また、これらの共通配列は、 前述のように、更に、サブクローニングされ、特徴付けられる。

他の好ましい具体例としては、特異的にグリコリピドに付着する遺伝子は、特定 の発病原の非付着性の変異体を構築することにより、特徴付は及び特定される。

これは、参照文献として引用されている、ｒＭａｎｏｉｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒ ｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２：８１１２９−８１３３（１ ９１’１５）　Ｊに開示されている、ＴｎＰｈｏＡのようなトランスポゾン成分 を用いることにより変異体を製造する二とにより実行される。アルカリシホスフ ァターゼ陽性変異体は、排出された蛋白質に於ける変異を意味する。各々の発病 原に対するアトへシンは、外膜表面に位置し、排出されるものであると仮定され るので、該変異体の一群には、より還元された変異体か含まれる。これらは、前 述の手順により、結合活性の欠失についてスクリーニングされる。

前述の教示に基づいて、公知の技術により付着性蛋白質をコードするＤＮＡ配列 は、変異させてもよいことは、当業者によって認識されている。例えば、天然の コドンと同しアミノ酸をコートする、異なるコドンに置換することかできる。

また、置換するコドンは、蛋白質の免疫原性又は殺菌活性に影響しないか、又は 、免疫原性又は殺菌活性を向上させなければ、異なったアミノ酸をコードしても よい。例えば、参照文献として引用されている、ｒＢｏｔｓｔｅｔｎ　ａｎｄ　 ５ｈｏｒｔｌｅ、“Ｓｔｒａｔｅｇｊｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ 　ｏｒ　Ｉｎ　Ｖ＋ｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、　”Ｓｃ！ｅｎｃｅ、２ ２９：１X３−１２１０（１ ９８５）Ｊに開示されている、１又は複数の変異体（例えば、置換、挿入、欠失 ）を製造するための、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異法が適用される。

該変異されたＤＮＡは、公知の技術を、上記教示に適用することにより得られる ので、該ＤＮＡは、特許請求された発明の範囲に含まれる。

更に、本発明のＤＮＡ配列（又は該断片）は、公知の一般的な技術を用いること により、穏やかな又は高いストレンジエンシー条件下に於て、該ＤＮＡに対して 、ハイブリダイズする他のＤＮＡ配列を得るために用いることができることは、 当業者によって認識されているので、本発明のＤＮＡは、該ＤＮＡも含む。

本発明のＤＮＡは、公知の技術、好ましくは、上記教示に基づいて修正した技術 に従って、本発明のポリペプチドの発現及び産生のための微生物を形質転換する ために用いられる発現ベクターの構築のために用いてもよい。

該技術は、参照文献として引用されている、「米国特許４．４４０，８５９（１ ９８４，４，３゜発行Ｒｕｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）＝　４．５３０．９０１（ １，９８５，７，２３，発行ｖｅｉｓｓｓ＋ａｎ）、４．５８２．８００（１X ８ Ｂ、４．ｉ５．発行Ｃｒｏｗｌ）、　４，６７７．０６３（１９８７，８，３０ ，発行Ｍａｒｋ　ｅｔ　ａｌ、）、　４，８７８．７５１（P ９ｇ７．７．７．発行Ｇｏｅｄｄｅｌ）、　４．７０４．３６２（１９ｇ７．１ １．３　発行１ｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、）、　４，７１O゜ ４６３　（１９８７，１２，１，発行Ｍｙｒｒａｙ　）、　４．７５７．００６ （１９８ｇ、７．１２　発行Ｔｏｏｌｅ）、４．７６８．０V ５（１，９８８，ｆｌ、２３．発行Ｇｏｅｄｄｅ１．ｅｔ　ａｌ、）、　４，８ １０．８４８（１９ｇ９．３．７．発行５ｔａｌｋｅｒ）にJ 示される技術を含む。

本発明のＤＮＡは、適当な宿主細胞に導入するために、種々の池のＤＮＡ配列に 結合させても良い。相手のＤＮＡは、宿主細胞の性質、宿主細胞へのＤＮＡの導 入方法、及び、遺伝子副体により維持されるものか又はインチクレージョンされ るものであるかに依存する。

一般的には、該ＤＮＡは、発現のための適当な方向及び正しい読み枠でプラスミ ドの様な発現ベクターに挿入される。必要であれば、該ＤＮＡは、発現へフタ− に於て有用である、宿主細胞により認識される転写及び翻訳制御塩基配列に結合 させても良い。該ベクターは、公知の技術により宿主に導入される。一般的には 、すべての宿主かベクターにより形質転換されるのではない。従って、形質転換 する宿主細胞を選択することか必要である。選択する技術は、宿主細胞に於ける 選択可能な特性（例えば、抗生物質耐性）をコードするＤＮＡ配列を発現ベクタ ーに組み込むことが含まれる。そして、該選択可能な特性を有する遺伝子は、他 のベクターに存在するが、該他のベクターは、目的とする宿主細胞を共形質転換 するのに用いられる。本発明に用いられる、好ましい発現ベクターは、５ｔｒａ ｔ。

ｇｅｎｅ、　Ｉ　ｎｃ　からのＢｌｕｅｓｃｒｌｐｔンリーズである。好ましい 宿主細胞は、Ｄ）ｆ５　ａｌｐｈａである。

形質転換された宿主細胞は、本発明の蛋白質又はポリペプチドを発現する。該細 胞は、公知の技術により培養され、該蛋白質又はポリペプチドは、公知の技術に より回収される。用いられる宿主及び発現システムに依存して、組換え蛋白質及 びポリペプチドは、形質転換された宿主細胞により生産される融合蛋白質であっ てもよい。該蛋白質は、公知の技術により回収され、また、望ましくない部分は 、公知の技術により取り除いても良い。そして、融合蛋白質自体は、組換え蛋白 質又はポリペプチド単独のものよりも免疫原的活性が高くてもよいし、また、ワ クチンに使用してもよい。

特に好ましい具体例としては、本発明のワクチンは、本発明のＤＮＡにより形質 転換された、弱毒性（無毒性）微生物から構成され、形質転換された微生物は、 形質転換された、弱毒性（無毒性）微生物を動物又はヒトに導入することで免疫 反応を生ずるように、本発明の蛋白質又はポリペプチドを発現する。一般的には 、外来性抗原決定基は、微生物の表面に発現される。好ましくは、該微生物は、 薬学的に許容され得る担体に存在させる。特に好ましい微生物は、サルモネラ属 であり、該微生物は、参照文献として引用されている、ｒｃｈａＬｒｉｅｌｄ、 ｅｔ　ａｌ、、Ｖａｃｃｌｎｅ、７：４９５−４９ｆｔ（１９８９）Ｊに開示さ れた方法にしたがって、外来性抗原の経口投与のために調製される。

本発明の教示の特定の問題又は環境への適用は、前述の教示を基に当業者により 成し得る範囲内である。本発明の生産物及びそれらの使用の例は、以下の実施例 の通りである。

この実施例は、最小限の炭化水素配列、ＧｌｃＮＡｃＢｌ−３ＧａｌＢ１−４Ｇ Ｉｃを含む乳酸の種類のグリコリピドは、Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに付着し 、該結合は、ｐｉｌｆ、タンパク■（ｐ■）又はリボオリゴサツカライド化Ｏ３ ）に依存しない。興味深いことに、乳酸系の構造は、Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ ｅの外膜に由来する＋、ＯＳにも見られ、該生体に見られる、周知の自己凝集反 応の現象を説明するかもしれない。

Ｇｏｎｏｃｏｃｃａｌ　ＬＯ３は、熱フェノール法（１６，１７）により、アセ トン粉末化した生体から単離された。ｌ１ｅｒ＋４ｎｇｃｏｃｃａｌ　ＬＯ９の 血清タイプ３．７．９（１８）に対する免疫１ｇＧモノクローナル抗体４８Ｅ１ ２は、Ｄｒ、Ｗｅｎｅｄｅｌｌ　Ｚｏｌｌｌｎｇｅｒ（Ｖａｌｔｅｒ　Ｒｅｅｄ 　Ａｒｍｙ　Ｉｎ５ｔｌｔｕｔｅ　ｏｒＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ ｎ、Ｄ、Ｃ，）により提供された。親和性により精製された刺激性抗マウスＩｇ Ｍ　（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ 、ＨＤ）は、約２５　Ｃ４／ｌ１ｇの特異的活性を与えるヨードケン法＜１９） により１２５１　（ＩｃＮ　Ｂｉｏｓｅｄｉｃａｌｓ、Ｃｏ５ｔａ　Ｍｅｓａ、 ＣＡ）て標識された（該適用の実施例に於ける測定値として用いられているＵは 、マイクロのことである）。牛Ｂ−ガラクトシダーゼ、ニューロアミラーゼ（Ａ ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）及び牛血清アルブミン（Ｂ Ｓ＾、ＦＲＡＣＴＩＯＮ　Ｖ）は、ベーリンガーマンハイム（ｌｎｄｉａｎａｐ ｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入した。Ｎ−アセチル−Ｂ−Ｄ−へギソサミダーゼは、 Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から購入した。全ての標準のガングリオ シド及び中性ガングリオシドは、バイオカーボ　ケミカルス（Ｌｕｎｇ、Ｓｗｅ ｄｅｎ）から購入した。

アルミニウムーブラック−シリカゲルゲル高速薄層クロマトグラフィプレートは 、メルク（Ｖｅｓｔ　Ｇｅｒ■ａｎｙ）から購入した。アルファー２−３シアリ ルラクトーネオテトラオンルセラミド（シアリバラグロボサイド）は、タイプ０ ヒト赤面球がら単離されたく２０）。ラクト−Ｎ−ネオテトラオシルセラミド（ バラグロボサイド）は、ＩＨホルムアミドと共に、６０分１．００℃に於いて、 赤血球シアリバラグロボサイドをデンアリレーンヨンすることにより調製した。

ラクト−Ｎ−トリアオシルセラミドは、アシアロ−ＧＨＩからアジアａ−０Ｍ２ を調製するために開示（１４）されたように、Ｂ−ガラクトシダーゼによりバラ グロボサイドを分解することにより調製された。Ｔａｂｌｅ　Ｉに記載されたグ リコリピドの濃度は、正確なスタンダードと比較して、オーンノール着色薄層り ０７トグラフイの濃度計（Ｑｕｉｃｋ−ｓｃａｎ、Ｈｅ１ｅｎａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅＳ）により決定された。全てのリピドの純粋性は、中性及び酸性溶液 システムの１層クロマトグラフィにより確認された。

Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの成長及び標１゜Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　Ｎ 及びその変異種は、Ｔａｂ　ｌ　ｅ−旧こ開示されている。微生物は、追加のＧ ＣＢ（Ｄｉｒｃｏ）ブロスで、１５００　ｒｐｍで攪拌しながら、又は、アガー プレート上で、３７℃５％ＣＯ□／９５％ａｉｒで成長させる。（２Ｉ）に開示 されるように、ＧＣＢＣ大寒で好気的に成長した細胞には、硝酸塩が添加される 。

鉄制限条件下で成長したＧｏｎｏｃｏｃｃ　ｔは、（２２）に開示されるように 、２５　ｕＭ　Ｄｅｓｒｅｒａｌ　（ｅｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ）を追加した溶媒を ３回通すことにより処理された。微生物は、寒天プレートからかき集められるか 、又は、遠心分離により収集され、Ｏ，１５Ｍリン酸ナトリウム（１？ＢＳ）を 含む０．ｔｌｌ　Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，４に懸濁させた。微生物は、４ ℃、ｉｏ、ｏｏＯＸｇで遠心分離され、上澄は、ＰＢＳで２回洗浄された。細胞 は、０．４　ａｃｔのＮａ　１２５１　（ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄ４ｃａｌｓ＞を 用いて、（２３）に開示されるように、ヨードラベルされた。ヨード化は、反応 チューブから細胞を取り除き、次に、遠心分離し、そして、Ｉ？ＢＳで２回洗浄 することにより、３分後に終了させた。標識されたＧｏｎｏｃｏｃｃｉは、１％ 牛血清アルブミン（ＨＢＳＳ−ＢＳ＾）を含む、Ｈａｎｋｓ　Ｂａ１ａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ　５ｏｌｕｔｊｏｎ　ｐＨ７，４に於いて、２．５　Ｘ　１０６又は４ 　Ｘ　ｔ０６ｃｐｓ／ｍｌに再懸濁させた。

ｉは、（２３）に開示されるように検出された。ミクロタイタープレート（Ｆａ ｌｃｏｎ　３９１２−１１１１ｒ）に固定され、Ｍ製されたグリコリピドの結合 は、（２３）Ｉこ開示されるように、測定される。

抗〜ＬＯＳモノクローナル抗体で免疫標識されるグリコリピド正確なバラグロボ サイドは、２４時間のオートラジオグラフィによる免疫標識により、薄層クロマ トグラフィ上で検出された（２４）。

異なるＧｏｎｏｃｏｃｃｉの種々の発育過程のもののグリコリピドの特性は、薄 層重畳アッセイにより実行され、Ｔａｂｌｅ−■に要約されている。オーシノー ル試薬で視覚化された同一の薄層プレートと比較されたオートラジオグラフィに より示されるように、Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅは、正確なパラグロボサイド 及びＢ−ガラクトシダーゼ処理により得られる生産物、ラクト−Ｎ−トリアオシ ルセラミド（Ｐｊｇ、ｌＢ、１ａｎｅｓ　３　ａｎｄ４＞に強く結合する。Ｎ− アセチル−Ｂ−へキソサミダーゼ（Ｐｉｇ、ｌＢ、Ｉａｎｅ　５）　（７）処理 の後に得られる、ラクト−Ｎ−トリアオシルセラミドから誘導される、ラクトシ ルセラミド、又は、試験された他の中性グリコリピド（Ｐｉｇ、　ＩＢ、　Ｉａ ｎｅ　ｌ；Ｔａｂｌｅ　Ｉ　）には、結合は全く検出されなかった。これらのデ ータは、Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅは、ラクトへ−トリアオシルセラミド又は ラクト−Ｎ−ネオテトラオシルセラミド（バラグロボサイド）には結合しなかっ たことを示す、５ｔｒｏ＠ｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、（１，２＞の結果と異なって いる。おそらくは、この矛盾は、これらの研究者により使用されたグリコリピド の由来及び／又は脂肪酸含量（１２）に関係している。ある実験では、Ｎ、ｇｏ ｎ。

ｒｒｈｏｅａｅは、シアリルバラグロボサイド（Ｆｊｇ、ｌＢ、１ａｎｅ　２） 及びＧＭＩ（Ｆｉｇ、ｌＢ、１ａｎｅｔ）を含むガングリオシド（Ｔａｂｌｅ　 Ｉ　）に弱く結合する。しかし、この結果は、常に再現されなかったし、ガング リオシドは、ミクロタータープレートに濃度依存性の結合をしなかった（Ｆ［ｇ 、２＞。

Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの固定されたグリコリピドへの量的結合及びグリコ リピドによる結合阻害。

ミクロタイタルプレート上に吸収された、精製したグリコリピドへの、Ｎ、ｇｏ ｎ。

ｒｒｈｏｅａｅの結合は、結合の特性を更に定義するために、及び、乳酸系及び ガングリオ系の受容体の強さを比較するために調べられた。Ｆｔｇ、２に示され るように、Ｇｏｎｏｃｏｃｃｉ　は、バラグロボサイドよりもアンアローＧＭ２ に強く結合し、ンアリバラグロボサイトには、全く結合しない。また、０Ｍ２は 、０．２　ｕｇてｈａｉ「−閂ａｘｉｍｕｍを示し、バラグロボサイド（又はラ クト−Ｖ−トリアオンルセラミド、データは示さず。

）の約７倍高いが、このことは、ガングリオ系のグリコリピドのより高い活性を 示ス。Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＰ◆及びＰ−の各種のアシアロ−ＧＭＩ及 びバラグロボサイドへの結合は、Ｇｏｎｏｃｏｃｃｉか、好気的に及び嫌気的に 成長したときの両グリコリピドに等しく良好に結合するように、微生物の成長条 件の変化、又は、鉄制限条件により影響を受けない（データは示さず）。

また、好中球による食作用に供される。（２Ｇ）これらの細胞のｃｏｎｏｃｏｃ ｃ　ｉへの結合を仲介する受容体は、おそらく、両方の細胞のタイプに実質的な 量で存在しているバラグロボサイド及びラクト−Ｎ−トリアオシルセラミドであ る。（１４，１８，２７）乳酸系は、また、種々の組織及び器官の主なりリコリ ピト成分を構成し、主な血液グループの抗原のグリコリピド前駆体である。興味 深いことに、ＧｌｃＮＡｃＢｌ、−３０ａｌＢ１、−４Ｇｌｃ、　、　、なる配 列は、また、多くのＣｏｎｏｃｏｃｃｉ　ＬＯ９（１５）にも存在する。Ｆｉｇ 、３に示されるように、抗−１、Ｏ３抗体（４８ＥＩ２）　（１ｇ）は、預確な ヒトバラグロボサイドに強く結合し、少なくとも、３０　ｎｇのグリコリピドが 検出される。４．８　ｋＤ　ＬＯ３成分を含むＧｏｎｏｃｏｃｃ　ｉのリポポリ サッカサイドは、モノクローナル抗体４８ＥＩ２に結合し、こうして、このリポ ポリサッカサイドにＧｌｃＮＡｃＢＩ−３ＧａｌＢｌ−４Ｇｌｃ、　、　、なる 配列か存在する二とか確認された（データは示さず）。

二のＬＯ３は、薄りクロマトグラフィ上のバラグロボサイド及びラクト−Ｎ−１ −リアオ／ルセラミトへの欣射線標識されたＰ４−及びＰ−Ｇｏｎｏｃｏｃｃｔ の結合を阻害するだけでなく、また、Ｇａｎｏｃｏｃｃｉによるヒト赤血球の特 異的膠着を強く阻害する（データは示さず）。こうして、周知の現象である、Ｇ ｏｎｏｃｏｃｃ　ｉによる自動膠着性（２９，３０）は、池の器官のＬＯ３に於 けるＧｌｃＮＡｃＢｌ−３ＧａｌＢ！−４Ｇｌｃ、、　、なる配列へ結合する一 つの器官の付着により説明されるかもしれない。微生物のＬＯ３は、セラミドを 含まないから、少なくとも、乳酸系のクリセリビドへのＮ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅ ａｅの結合は、他の微生物において、報告されているように（３１，）、おそら くは、セラミド中の脂肪酸に依存しない。

アンアローＧＭ２は、ヒト子宮頚内膜細胞の培養物（１２）、及び、感染のため の適切な標的組織について生ずることか報告されており、低い量であるが（１４ ，３２，３３）、他のヒト組織に於いても生じている。しかし、アジアローＧＭ Ｉ及びアシアロ−０Ｍ２は、Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ、ｅに最も強く結合する 。（Ｆｔｇ、２）　ＰａｒｕｃｈｕｒＩ　ｅｔ　ａｌ、（３４）は、アシアロ− ＧＨＩ及びアシアロ−０Ｍ２に結合する付着性物質をコードする遺伝子を特定し 、付着性物質は、３．６　ＫＤであり、ｇｏｎｏｃｏｃｃａｌ　ｐｔｌｌには結 合しないことか示された。

該付着物質を発現しない変異体は、ヒト赤血球を膠着する性質（３４）を維持し ており、この付着は、おそらく、私達かここで開示する、バラグロボサイド結合 特異性とは異なるものである。こうして、１つ以上のＧｏｎｏｃｏｃｃ１の付着 のタイプは、異なるヒト細胞タイプへの結合を媒介するかもしれないし、又は、 個人的に、又は、同等に、病気の病原体の一員となる。

れた。リポオリゴサンカライド（ＬＯ３）及びプロティン■を欠損するＧｏｎｏ ｃｏｃｃｉたけてなく、血清耐性単離物であり、毛状及び非毛状の種々の発育過 程のものは、１２５■標鷹された微生物重畳グリコリピドクロマトグラムにより 測定されるように、乳酸系のグリコリピドに於ける、末端及び内部のＧｌｃＮＡ ｃＢｌ−３ＧａｌＢ１．−４Ｇｌｃという配列に特異的に結合する。結合活性は 、嫌気的又は、寒天上又はブロス内て弱好気的に、又は、鉄制限条件下で成育し たときに、Ｇｏｎｏｃｏｃｃ　ｊがグリコリピドに結合するように、微生物の成 育条件の変化により影響されない。Ｇｏｎｏｃｏｃｃｉは、Ｎ−１−リアオシル セラミド又はアンアロ〜Ｇ！４２から誘導されたラクトシルセラミド（ＧｌｃＮ ＡｃＢｌ−３ＧａｌＢｌ−４ＧＩｃ）、又は試験された他のグリコリピドには、 結合しなかった。

Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅは、固層アッセイに於ける薄層クロマトグラム上で 、シアリパラグロボサイド及びＧＭＩを含むガングリオシドには弱く結合するが 、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅは、一般的な程度で、ＧＩｃＮＡｃＢＩ−３ＧａｌＢ ｉ−４Ｇｌｃという配列に結合し、ガングリオシドには、結合しない。興味深い 二とに、ラクト−■−ネオテトラオーゼ（ＧａｌＢｌ−４ＧｌｃＮＡｃＢ１−３ ＧａｌＢｌ−４Ｇｌｃ）を含む、Ｇｏｎｏｃｏｃｃｉ　ＬＯ３の４．８ｋＤの成 分は、Ｇｏｎｏｃｏｃｃｉによるヒト赤血球の特異的膠着を阻害し、薄層クロマ トグラム上のヒトバラグロボサイド及びラクト−Ｎ−トリアオシルセラミドへの 、標識された微生物の結合を阻害する。おそらくは、この結合の特異性は、Ｇｏ ｎｏｃｏｃｃ！のＩｎ　ｖｉＬｒｏに於ける自動膠着性を説明するであろう。

種々の他の微生物は、本発明の受容体への結合活性を決定するために、実施例１ の方法にしたがって試験された。これらの微生物物は、Ｔａｂｌｅ　ｍに開示さ れている。該微生物は、実施例１において、Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅが受容 体に結合したように、ある範囲の親和性で受容体に結合した。Ｆｉｇ、４は、代 表的な例を示しており、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｆｎｏｓａのｐａ ｒａｇｌｏｂｏｓｆｄｅへの結合を示している。

実施例３ 該実施例は、本発明の受容体へ結合する、精製された、細菌の付着性蛋白質を得 る方法を示している。該過程は次の通りである。

１、微生物の成育、メチオニン濃度の低い、特別に定義された溶媒を用意し、１ ００　ｍｌのガラス性殺菌ビンに入れた該新鮮な溶媒、７５１を微生物表共に培 養する。その後、３５Ｓ−メチオニン、０．５　ｍｃｉを加える。微生物は、３ ７℃、５％ＣＯ２で、２４時間成育させる。

２、微生物の回収、２４時間後、微生物は、１０．０００　Ｘ　ｇ　、ｉｏ分間 ４℃で遠心分離する。沈殿物は、１０　ｓＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ７，４５ａｌｉ ｎｅの２０１１中に再懸濁させ、水上に置く。

３、０ｔｘｐｓの調製、再懸濁させた微生物は、Ｂｒｏｎｓｏｎ超音波処理機上 で氷上で、各々３０秒間、６回、超音波処理する。破砕された微生物は、１０， ０００　Ｘ　ｇ　、１０分間４℃で遠心分離する。上澄液は、１００，０００　 Ｘ　ｇ　、３０分間４℃で遠心分離する。得られる沈殿物は、０ｓｐｓと呼ばれ る。プロテアーゼ阻害剤が加えられ（Ｐｌｃｌ＋１１）、４℃で２週間保存され る。

て再懸濁され、５分間、超音波処理され、室温で３０分間、培養する。

５、　付１を性ｆｆｌ白！（７）ｍｕ、付着物ハ、５０　ｓＭ　Ｔｒｌｓ−ｔｌ ｃｌ　ｐＨ７，Ｌｉ２ＯｓＭ　ＮａＣｌ、１０％ＢＳＡ中で、１／１ｏに希釈す ることにより、ｏｃｔｙｌｇｌｕｃｏｐｕｒｏａｎｏｓｌｄｅの上澄から精製さ れ、０．８　ｕｇ／ｗｅｌｌの受容体を含むＥｌ、ＩＳＡプレートの予めブロッ クされたウェルに於いて、２時間、室温で培養した。ウェルは、ｃｏｌｄ　ｎｏ ｒｍａｌ　５ａＩｉｎｅで４回、洗浄され、６０℃、１０　ｗＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ、ｐＨ８，０，５ａｌｉｎｅ、Ｑ、１％ＳＤＳの３０　ｕｌが各々のウェル に加えられ、３０分間、３７℃でインキュベージコンする。そして、付着物は、 アガロース　ビーズのように、受容体が不溶性支持体として固定される、受容体 親和性カラム知マドグラフィにより、精製される。ＳＯ３溶出バッファーは、適 用なウェルから取り除かれ、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィ上で解 析される。

薄層クロマげラム　上のＮ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　ｌ二文打るグリコ１）ビ ドの結合能力のＵトリへギソサイトであり、ＧＬ４はグロボサイドである。

本実験で６１１目されたＮ、ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　１１１及びそれらのグワ コリビドの挙吉合特性結合の対象 種　（３，考文献）　発現型ｂ　ＴｌアトＧＭＩ　バｙｆロＮ４Ｆ−５１１瞳（ μＪ　Ｐ−、Ｐｌ！−神 ＦＡ５＋ＯＯ（３５）　ＬＣ１’！−／ＸＡｂ　（不活性）　→■・５２　（３ ６）　抗血清　→ ｂ　Ｐ＋はビリエイト（ｐｌ　ｌ　ｆａｔｌｌｌｄｌされていること、Ｐ−はビ リエイトされていない（ｎｏｎｐｌ　ｌ　ｆａｔｅｄ）こと、Ｐｒ１−はクンバ ク目の欠乏を、ＬＯ５−はりボオリゴサノカライドの欠乏を、ＭＡｂはモノクロ ナール抗体を表している。

受容体５り）’ＨｔンＭう及びパ５り０５号（Ｆの結合する他の病原性及び日和 見性の微生物置Ｉ山ミ慕纏慇鉱五−社（す、１３　胆Ｊ匡コミ！社山−蝕匡紅り 一瓢ヒｂ二（Ｌ声吟直）　蝕紅鮎ムーコ！…蝕＝材出辺１虹仕±Δ＝肚　Ｐｌ〜 −一１１曳由−二ｊ参照文献 １、　Ｓａｖａｇｅ、Ｄ、Ｃ，（１９７７）＾ｎｎυ、Ｒｅｖ、ＨＩｃｒｏｂｉ ｏ１．３１＋１０７−１３３２、　Ｂｅａｃｈｅｙ、　Ｅ、ｈ、、（ｅｒａ）　 （１９１１０＞　Ｂａｃｔｅｒｊａｌ　Ｍｈｅｒｅｎｃｅ。

Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、５ｅｒｉｅｓ　Ｂ、Ｖ ｏｌ、Ｉｔ、Ｃｈａｐｍａｎａｎｄ　Ｈａｌ　１．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ３、Ｊｏｎ ｅｓ、Ｇ、Ｗ、、ａｎｄ　１ｓａａｃｓｏｎ、Ｅ、　（１９８３）　Ｃｌ１ＣＣ ｒ１ｔ、Ｒｅｖ。

Ｍ！ｃｒｏｂｉｏ１．３４：２２８−２８０゜４、　Ｃａ１ａｎｄｅｒ、　Ｎ、 、　Ｋａｒｌｓｓｏｎ、　Ｋ、Ａ、、　Ｎｙｈｏｌｍ、　Ｐ−Ｇ　ａｎｄ　Ｐａ ５ｃｈｅｒ、　ｌ。

＜１９８８＞　Ｂｉｏｃｈｉｔａｉｅ　７（１：１８７３−１６８２゜５、　Ｂ ｏｃｋ、　Ｋ、、Ｂｒｅｉｗｅｒ、　Ｍ、Ｅ、、　Ｂｒ［ｇｎｏｌｅ、　Ａ、、 　Ｈａｎｓｓｏｎ、　Ｇ、Ｃ，。

Ｋａｒｌｓｓｏｎ、　Ｋ、Ａ、、　Ｌａｒｓｏｎ、　Ｇ、、　［、ｅ「ｆ’ｌｅ ｒ、　Ｈ，、Ｓａ＊ｕｅｌｓｓｏｎ。

Ｂ、Ｅ、、、　Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ、　Ｎ、、　Ｓｖａｎｂｒｏｎｇ−Ｅｄｅｎ 、　Ｃ，、ａｎｄ　Ｔｈｕｒｌｎ。

Ｊ、、（１９８５）　Ｊ、Ｂｌｏｔ、Ｃｈｅｗ、２６０：８５４５−８５５１゜ ８、　Ｓｔｒｏｗｂｅｒｇ、　Ｎ、、　Ｒｙｄ、　Ｍ、、　Ｌｉｎｄｂｅｒｇ、 　Ａ、＾、、、ａｎｄ　ＫａｒｌｓＯｎ、　Ｋ、＾（１９８８）　ＦＥＢＳ　Ｌ ｅｔｔ、　２３２：１９３−１９８゜７、５ｔｒａ信ｂｅｒｇ、　Ｎ、、　ａｎ ｄ　Ｋａｒｌｓｓｏｎ、　Ｋ、＾（１９９０）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ。

２６５：１１２４４−１１２５（１゜ ８、Ｋｒ１ｖａｎ、　ｌｉ、ｃ、、　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｄ、Ｄ、、　ａｎｄ　 Ｇｉｎｓｂｕｒｇ、　Ｖ、（１９８ｇ）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ　８５：６１５７−６１１８゜９、　Ｋｒ１ｖａｎ、　Ｈ，Ｃ，、０１ｓ ｏｎ、　Ｌ、Ｄ、、　Ｂａｒｉｌｅ、　Ｍ、Ｆ、、　Ｇｉｎｓｂｕｒｇ、　Ｖ。

ａｎｄ　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｄ、Ｄ、　（１９８９）　Ｊ、　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈ ｅｔ　２［１４：９２８３−９２８８゜１、Ｏ，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ、　ｅｔ　 ａｔ、　（１，９８３）　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　５５９−５７０゜ｉＬ、 Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　Ｍｏｎｏｇｒ、＾１１ｅｒ ｇｙ２４＋４０−４５１２、ｓｔｒｏｉｂｅｒｇ、　Ｎ、、　Ｄｅａｌ、　Ｃ， Ｎｙｂｅｒｇ、　Ｇ、、　Ｎｏｒｍａｒｋ、　Ｓ、、　Ｓｏ。

Ｍ、、　ａｎｄ　Ｋａｒｌｓｓｏｎ、　Ｋ、＾、（［９！１８）　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃｄ、　Ｓｃｉ、　８５：４９０２−４９０W゜ １３、Ｐａｒｕｃｈｕｒｊ、　Ｄ、に、、　Ｓｅｉ［’ｅｒｔ、　Ｈ，Ｓ、、＾ ｊｉｏｋａ、　Ｒ，Ｓ、。

Ｋａｒｌｓｓｏｎ、　Ｋ、＾、、　ａｎｄ　Ｓｏ、　Ｍ、　（１９９０）　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｌ　、１！７：３３３−R３７ １４、Ｋｒ１ｖａｎ、　Ｈ，Ｃ，、Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｄ、Ｄ、、　ａｎｄ　Ｖ 、Ｇｉｎｓｂｕｒｇ、（１９８ｇ＞Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　８５．６１５７−６１６１．。

１５、Ｍａｎｄｒｅｌｌ、ＲＰ、、、Ｇｒ［ｒｆｉｓｓ、Ｊ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｍ ａｃｈｅｒ、Ｂ、Ａ。

（１，９８８）　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１６８．　１０７−１２６１Ｂ、Ｂ ｅｒｔｒａｓ、　Ｍ、Ａ、、　Ｇｒｉ「「ｉｓ、　Ｊ、Ｍ、、　ａｎｄ　Ｂｒｏ ｕｄ、　Ｄ、Ｄ、　（１９７６）Ｊ、Ｉａｍｕｎｏｌ、ｌｉＢ、８４２−８４６ ．１７　、１／ｅｓ　Ｌ　ｐｈａ　Ｉ、０．、　ａｎｄ　Ｊａｎｎ、　Ｋ、　（ １９８５）　ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＣｈｅ１１ ｓｔｒｙ　（Ｗｈｉｓｔｌｅｒ、　ｌ？、Ｉｌ、、　ｅｄ、）、　ｐｐ、　８３ −９１゜１１、Ｚｏｌｌｌｎｇｅｒ、、Ｖ、Ｄ、　ａｎｄ　Ｍａｎｄｒｅｌｌ、 　Ｒ，Ｅ、　（１９）ＩＯ）　Ｉｎｒｅｃｔ、ＩｍＬｌｕｎ、２８．S５１−４ ５８゜ １９、Ｆｒａｋｅｒ、　Ｐ、Ｊ、、　ａｎｄ　５ｐｅａｋ　Ｊ、Ｃ，（１９７ｇ ）　Ｂ！ｏｃｈｅｓ、　ＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓ、　Ｃｏｇｍｕｎ、　８０．８４ ９−８５７２０、Ａｎｄｏ、　Ｓ、、　Ｋｏｎ、　Ｋ、、　ｌ５ｏｂｅ、　Ｍ、 、　Ｖａｇａｉ、　Ｙ、、　ａｎｄＹａｗａｋａｗａ、　Ｔ、　（１９７６）　 Ｊ、、Ｂ！ｏｃｈｗ、　（Ｔｏｋｙｏ＞　７９．８２５−５３２゜２１Ｋｎａｐ ｐ、　Ｊ、Ｓ、、　ａｎｄ　ＣＩａｒｋ、　Ｖ、Ｌ、　（１９８４）　Ｉｎｆｅ ｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、４８．１７６６−１８１２２、Ｍｉｃｋｅｔｓａｎ、　Ｐ 、Ａ、、　Ｂｌａｃｋｇａｎ、　Ｅ、、　ａｎｄ　ｓｐａｒｋｌｉｎｇ、　Ｐ、 Ｆ。

（１９ｇ２）　！ｎｒｅｃｔ、　Ｉｍａｕｎ、　３５．９１．５−９２０゜２３ 、Ｋｒ１ｖａｎ、　Ｈ，Ｃ，、Ｇｉｎｓｂｕｒｇ、　Ｖ、、　ａｎｄ　Ｒｏｂｅ ｒｔｓ、　Ｄ、Ｄ、　（１９８８＞Ａｒｃｈ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈ ｙｓ、　２６０．４９３−４９８゜２４、Ｍａｇｎａｎｉ、　Ｊ、Ｌ、、　５ｐ ｔｔａｌｎｉｋ、　Ｓ、Ｌ、、　Ｇｉｎｓｂｕｒｇ、　Ｖ、　（１９８７）Ｍｅ ｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１３８．１９５−２０７゜２５韮５ｅｓａｎ、　Ｇ 、Ｍ、、　ＭｃＮＩｃｏｌ、Ｐ、、　Ｌｊａｎ、　Ｃ，Ｊ、、　ａｎｄ　Ｐｒ１ ｇ＋ｒｏｓｅ。

Ｄ、Ｓ、　＜１９８１）　Ｃａｎ、　Ｊ、　ＭＩｃｒｏｂｉｏｌ、　２７．１０ ３５−１０４３゜２６．３ｈａｆ’ｅｒ、　ｖＵ６．　ａｎｄ　Ｒｅ５ｔ、　Ｉ ？、Ｆ、　（１９８９）　Ａｎｎ、　Ｉ？ｅｖ、ＭｊｃｒｏＭｏｌ、ｌ２ｉ−P ４５ ２７、Ｍａｃｈｅｒ、　Ｂ、Ａ、、　ａｎｄ　Ｋｌｏｃｋ、　Ｊ、Ｃ，（１，９ ８０）　Ｊ、Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｓ、２５５．２０９２−２O９８ ２ｇ、５Ｉｄｄｉｑｕｉ、　Ｂ、、　ａｎｄ　Ｈａｋｏｒｍｏｒｊ、　Ｓ、　（ １９７３）　ＢｔｏｃｈｅｓＢｉｏｐｈｙｓ、ａｃｔａ　３３０，１４７−１５ ５゜２９、Ｓｗａｎｓｏｎ、　Ｊ、Ｌ、、　Ｓｌ、　Ｋｒａｕｓ、　ａｎｄ　Ｅ 、Ｃ，Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ　１９７１゜Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１３４． ８８８−９０８゜３Ｄ、Ｓｗａｎｓｏｎ、ノ、Ｌ、（１９７１ｔ）　Ｉｎｆｅｃ ｔ、Ｉ＋ｎｕｎ、１９．　３２０−３３１゜３１．５ｔｒｏ＊ｂｅｒｇ、　Ｎ、 、　Ｒｙｄ、　Ｍ、、　Ｌｉｎｄｂｅｒｇ、＾、、　ａｎｄ　Ｋａｒｌｓｓｏｎ 。

Ｋ、Ａ）　（１９８ｇ）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２３２．１．９３−１９８゜ ３２．５ｐｉｔａｌｎｉｋ、　Ｐ、Ｆ、、　Ｄａｎｌｅｙ、　Ｊ、Ｍ、、　Ｂｕ ｒｇｅｒ、　Ｓ、Ｒ，、ａｎｄＳｐｉｔａｌｎｉｋ、　Ｓ、Ｌ、　（１９１１９ ）Ａｒｃｈ、　Ｂｆｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２７３．５７８−５９Ｌ ３３、Ｇ１１ｌａｒｄ、　Ｂ、に、、　Ｊｏｎｅｓ、　Ｍ、＾、、　ａｎｄ　Ｍ ａｒｃｕｓ、　Ｄ、Ｍ、　（１９８７）Ａｒｃｈ、　Ｂｌｏｃｈｅｓ、　Ｂｉｏ ｐｈｙｓ、　２５６．４３５−４４５゜３４、Ｐａｒｕｃｈｕｒｌ、　Ｄ、に、 、　５ｅｌｒｅｒｔ、　Ｈ，Ｓ、、　Ａｊｉｏｋａ、　Ｒ，Ｓ、。

Ｋａｒｌｓｓｏｎ、　Ｘ、−＾、、　ａｎｄ　Ｓｏ、　Ｍ、（１９９０）　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃ１．ＵＳＡ　８７．　３３３−３３７３５、Ｓｗａｎｓｏｎ、　Ｊ、　Ｂｒ ｒｅｒａ、　ｏ、、　５ｏｊａ、　Ｊ、、　Ｂｏｓｌｅｇｏ、　Ｊ、　（１９８ ｇ）Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、１６８．２１２１−２１２９゜３Ｂ、５ｈａｆ ｅｒ、　Ｗ、Ｍ、、　Ｊｏｉｎｅｒ、　Ｋ、、　Ｇｕｙｍｏｎ、Ｌ、Ｆ、、　Ｃ ｏｈｅｎ、Ｍ、Ｓ、。

ａｎｄ　Ｓｐａｒｌｉｎｇ　Ｐ、Ｆ、　（１９８４）　Ｊ、　１ｎｆｅｃｔ、　 Ｄｉｓ、　１４９．１７５−１８３゜３７、Ｒｉｃｅ、　Ｐ、Ａ、、　ｌ［ａｓ ｐｅｒ、　Ｄ、Ｌ、　（１９８７）　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　６０ ．１１４９−１１T８゜ ３８．１ＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｊｏｉｎｔ　Ｃｌｕ４ｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｌｏｃ ｈｅｍ、　Ｎｏｍｅｎｃｌ（１，９８８）Ｅｕｒ、ノ、Ｂｉｏｃｈｅｔｇ、１５ ９．　１−８゜Ｇｏｎｏｃｏｃｃｉ　結合　（ｃｐｍ）補正書の写しく翻訳文） 提出！Ｆ（特許法１８４条の８）回 平成　５年　２月　２日

Claims (56)

【特許請求の範囲】
1. １．【配列があります】 から成る群から選ばれる実質的に純粋な成分から成る病原性又は日和見感染性の 微生物の受容体。 （ここで、Ｘは、スフィンゴシン、水酸化スフィンゴシン又は飽和スフィンゴシ ン、Ｒは、水素又はＸから誘導されたＮ−アシル化脂肪酸であり、Ｘ（Ｒ）はセ ラミドである。）
2. ２．病原性又は日和見感染性の微生物が、ストレプトコッカス、スタフィロコッ カス、クロストリジウム、ボレリア、ハーモフィルス、シュードモナス、ネイセ リア、コキシエラ、シゲラ及びロタウイルスから選択されるものである、請求の 範囲第１項に記載の受容体。
3. ３．【配列があります】から成る実質的に純粋な成分及び病原性又は日和見感染 性の微生物が、ストレプトコッカスアガラクチア、スタフィロコッカスアウレウ ス、クロストリジウムパーフリンゲンス、ボレリア、ハーモフィルスインフルエ ンザ、ハーモフィルスパラインフルエンザ、シュードモナスアルギノサ、シュー ドモナスセパシア、シュードモナスマルトフィラ、ネイセリアゴノーホエ、ネイ セリアメニンギチディス、コキシエラバーネッティ、シゲラダイセンテリア及び シゲラフレッキシネリから選択されるものである、請求の範囲第１項に記載の受 容体。
4. ４．請求の範囲第１項に記載の、不溶性又は可溶性の基質に付着する受容体から 成る、病原性又は日和見感染性の微生物の受容体として有用な組成物。
5. ５．不溶性の基質がビーズである、請求の範囲第４項に記載の組成物。
6. ６．受容体がリポソームに付着しているものである、請求の範囲第４項に記載の 組成物。
7. ７．可溶性の基質がポリペプチドである、請求の範囲第４項に記載の組成物。
8. ８．一定の時間、微生物が試料中にあるときに、該微生物が受容体に結合するの に十分な条件下で、請求の範囲第１項に記載の受容体と試料を接触させ、該受容 体が該微生物に結合しているかを決定するステップから成る、該微生物が存在す ると思われる試料中の病原性又は日和見感染性の微生物の存在の検出法。
9. ９．受容体が、不溶性の基質に付着するものである、請求の範囲第８項に記載の 方法。
10. １０．請求の範囲第９項の方法により形成される受容体−微生物の複合体を、抗 原が検出可能な部分で標識されている微生物の表面にある抗原に対する抗体に接 触させ、受容体−微生物−抗体の複合体を形成し、結合していない抗体を取り除 き、そして、該検出可能な部分の存在を検出することから成る方法。
11. １１．不溶性の基質に付着した受容体及び該微生物及び該受容体の複合体の形成 を検出又は測定するための手段から成る、容器内の試料中の病原性又は日和見感 染性の微生物の検出のための診断用器具。
12. １２．不溶性の基質がミクロタイタープレート上のウェルである、請求の範囲第 １１項に記載の器具。
13. １３．測定手段は、検出可能の部分を含む試薬であり、そして、該微生物に結合 可能である、請求の範囲第１１項に記載の器具。
14. １４．検出可能の部分を含む試薬が、検出可能の部分と結合した、請求の範囲第 １項の受容体である、請求の範囲第１３項に記載の器具。
15. １５．検出可能の部分を含む試薬が、酵素と結合した該微生物の表面抗原に対す る抗体である、請求の範囲第１３項に記載の器具。
16. １６．検出又は測定手段が、該細菌の表面抗原に対する第１抗体と、第１抗体に 対する第２抗体を含むことから成り、該第２抗体が、検出可能な部分に結合して いるものである、請求の範囲第１１項に記載の器具。
17. １７．検出又は測定手段が、ラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノソルベント アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及びイムノフルオレッセンスアッセイから成る群から選 択されるイムノアッセイである、請求の範囲第１１項に記載の器具。
18. １８．一定の時間、微生物が試料中にあるときに、該微生物が受容体に結合する のに十分な条件下で、請求の範囲第１項に記載の受容体と液体を接触させ、該液 体を該受容体との接触から取り除くステップから成る、液体から病原性又は日和 見感染性の微生物を取り除く方法。
19. １９．該受容体は、該液体に付着している、請求の範囲第１８項に記載の方法。
20. ２０．該液体を保持するコンテナ手段、該液体をコンテナ手段に導入する入口及 びコンテナ手段から該液体を取り除く出口を有するコンテナ手段から成る、液体 から病原性又は日和見感染性の微生物を取り除く器具。
21. ２１．請求の範囲第１項に記載の受容体が、該液体にされされている該コンテナ 手段の表面に結合している、請求の範囲第２０項に記載の器具。
22. ２２．該受容体が、該コンテナ手段内の固層に結合している、請求の範囲第２０ 項に記載の器具。
23. ２３．該固層が、不溶性マトリックスであり、該コンテナ手段が、クロマトグラ フィックカラムである、請求の範囲第２２項に記載の器具。
24. ２４．薬学的に許容され得る担体と組合わさった、請求の範囲第１項に記載の受 容体の有効量から成る、病原性又は日和見感染性の徴生物により引き起こされる 、哺乳類の疾病又は感染の処置、予防又は回復のための医薬組成物。
25. ２５．担体がリポソームである、請求の範囲第２４項に記載の組成物。
26. ２６．該受容体が、微小担体に結合している、請求の範囲第２４項に記載の組成 物。
27. ２７．該微小担体がポリマーである、請求の範囲第２６項に記載の組成物。
28. ２８．受容体は、殺菌性試薬又は免疫源に対して結合している、請求の範囲第２ ４項に記載の組成物。
29. ２９．請求の範囲第２４項に記載の組成物の有効量を注入することから成る、病 原性又は日和見感染性の微生物により引き起こされる、哺乳類宿主の疾病又は感 染の処置、予防又は回復させる方法。
30. ３０．該微生物の付着を阻害し、該微生物を取り除くために、請求の範囲第１項 に記載の受容体の十分量を供給することから成る、哺乳類細胞への病原性又は日 和見感染性の微生物の付着を阻害するか、又は、該細胞から該微生物を取り除く 方法。
31. ３１．該受容体が、該細胞に生理学的に一致する液体に溶解又は懸濁している、 請求の範囲第３０項に記載の方法。
32. ３２．病原性又は日和見感染性の微生物の膜を溶解して、付着性蛋白質及び不溶 性物質を含む、溶解した物質を生産し、不溶性物質から、溶解した物質を分離し 、請求の範囲第１項に記載の受容体であって、該付着性蛋白質が該受容体に結合 するのに十分な時間、不溶性の固層に付着する受容体と該溶解した物質を接触さ せ、該受容体から該蛋白質を取り除き、単離された形で該蛋白質を回収するステ ップから成る、単離された微生物性の付着性蛋白質を製造する方法。
33. ３３．請求の範囲第３２項に記載のプロセスにより製造される、単離された微生 物性付着性蛋白質。
34. ３４．請求の範囲第１項の受容体に結合する、病原性又は日和見感染性の微生物 の表面から得られた、実質的に精製された、微生物性の付着性蛋白質。
35. ３５．請求の範囲第３項の受容体に結合する、病原性又は日和見感染性の微生物 の表面から得られた、実質的に精製された、微生物性の付着性蛋白質。
36. ３６．哺乳類の宿主に於ける抗原反応、即ち、病原性又は日和見感染性の微生物 により引き起こされる、該細胞の疾病又は感染を予防又は回復させる抗原反応を 引き起こすことができる、請求の範囲第３４項に記載の蛋白質の断片である、実 質的に純粋なポリペプチド。
37. ３７．請求の範囲第３４項に記載のポリペプチドと、免疫学的に交叉反応を起こ す免疫的活性を有するポリペプチド。
38. ３８．該免疫を促進するように改変されたポリペプチドである、請求の範囲第３ ７項に記載のポリペプチド。
39. ３９．請求の範囲第３４項に記載の蛋白質に対する抗体に結合する、実質的に純 粋なポリペプチド。
40. ４０．薬学的に許容され得る担体中に、免疫学的に有効な量の請求の範囲第３４ 項に記載のポリペプチドを含むワクチン。
41. ４１．コンテナ内に、不溶性の基質に付着する、請求の範囲第３４項の蛋白質、 及び、該蛋白質及び該微生物の複合体の形成を検出又は測定するための手段を有 する、請求の範囲第１項に記載の受容体を、その表面に於て発現する、病原性又 は日和見感染性の微生物の試料を検出するための診断用容器。
42. ４２．薬学的に許容され得る担体と組合わさった、請求の範囲第３４項の蛋白質 の有効量から成る、請求の範囲第１項に記載の受容体を、その表面に於て発現す る、病原性又は日和見感染性の微生物により引き起こされる、哺乳類の疾病又は 感染の処置、予防又は回復のための医薬組成物。
43. ４３．病原性又は日和見感染性の微生物のＤＮＡを含むゲノムライブラリーであ って、他のＤＮＡ配列を実施可能及び回収可能に挿入されたベクター、即ち、各 々、該ライブラリーを含むクローンを、該受容体に結合するクローンを同定する 請求の範囲第１項に記載の受容体と接触させることにより、該ＤＮＡの唯一の配 列を含んでいるものであるベクターのクローンから成るライブラリーをスクリー ニングし、該クローンを単離するステップから成る、微生物性の付着性蛋白質を コードする、単離又は実質的に精製されたＤＮＡ配列を製造する方法。
44. ４４．更に、該クローンから外来性ＤＮＡ配列を回収し、該蛋白質をコードして いるかを決定するために該ＤＮＡを溶出させるステップを含む、請求の範囲第４ ３項の方法。
45. ４５．請求の範囲第４３項のプロセスにより製造される、単離されたＤＮＡ配列 。
46. ４６．請求の範囲第１項の受容体に結合する微生物性付着性蛋白質をコードする 、単離又は実質的に精製されたＤＮＡ。
47. ４７．１つ又は複数の変異により、請求の範囲第４５項のＤＮＡ配列から誘導さ れた、単離又は実質的に精製されたＤＮＡ配列。
48. ４８．穏やかなストリンジェンシー条件下で請求の範囲第４５項のＤＮＡ配列と ハイブリダイズするＤＮＡ配列。
49. ４９．形質転換した宿主細胞に於いて、該ＤＮＡ配列の発現の効果を可能にする 適当な制御核酸配列に実施可能に結合された、請求の範囲第４６項のＤＮＡ配列 から成る組換えＤＮＡ配列。
50. ５０．発現のための適用な方向及び正しい読み枠で該ベクターに挿入された、請 求の範囲第４６項のＤＮＡ、及び、原核又は真核細胞を形質転換できる発現ベク ターを含む好ましい宿主細胞中の、請求の範囲第３４項の蛋白質をコードするＤ ＮＡを発現させるための発現ベクター。
51. ５１．請求の範囲第４６項の組換えＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞。
52. ５２．請求の範囲第５１項の形質転換された細胞により生産される組換え蛋白質 。
53. ５３．該形質転換された宿主細胞に於て、該ＤＮＡ配列の発現効果を可能にする 適当な制御核酸配列に実施可能に結合された、請求の範囲第３４項の蛋白質をコ ードするＤＮＡ配列から成る組換えＤＮＡ配列により形質転換された宿主細胞を 培養し、該配列により、発現がコードされるポリペプチドを回収するステップを 含む、請求の範囲第３４項の蛋白質を製造する方法。
54. ５４．請求の範囲第３４項の蛋白質を含む融合蛋白質から成る免疫的ポリペプチ ド。
55. ５５．薬学的に許容され得る担体と組合わさった、請求の範囲第５２項の組換え 蛋白質の免疫的有効量から成るワクチン。
56. ５６．請求の範囲第４９項のＤＮＡにより形質転換された、無毒性又は弱毒性微 生物であって、薬学的に許容され得る担体中に組合わさった、免疫的有効量から 成るワクチン。