JP2851556B2 - 新規なエシェリキア・コリ菌株から単離した１型およびｐ型フィムブリエ−アドヘシン、その製法ならびにその使用 - Google Patents

新規なエシェリキア・コリ菌株から単離した１型およびｐ型フィムブリエ−アドヘシン、その製法ならびにその使用

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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、尿路感染を治療および
予防するのに用いる生成物の技術分野に関する。さらに
詳細には、本発明は、新規なイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）株から高精製状態で単離され、前記目的において、
動物で非常に有効であることが示されたフィムブリエを
提供する。従って、該フィムブリエは、ヒトにおける前
記感染を予防し治療するのに潜在的に有用である。
【０００２】前記の新規なイー・コリ株は、特には、
「特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブ
ダペスト条約」に従い、１９９４年１月１９日に、ユニ
バーシティ・オブ・バレンシア（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ Ｖａｌｅｎｃｉａ）のスパニッシュ・カルチャ
ー・タイプ・コレクション（Ｓｐａｎｉｓｈ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（コレクシ
オン・エスパニョーラ・デ・クルティーボス・ティボ−
ＣＥＣＴ（Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄ
ｅ Ｃｕｌｔｉｖｏｓ Ｔｉｐｏ−ＣＥＣＴ））に本出
願人が寄託したエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）ＣＥＣＴ４４８４株およびエシェリ
キア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＣＥ
ＣＴ４４８５株であり、双方とも寄託時に「適当な培養
培地における再培養」の条件下で生存可能な株であると
判明した。
【０００３】
【従来の技術】イー・コリは、急性および慢性の膀胱
炎、ならびに腎盂腎炎および無症候性細菌尿症の症状を
引き起こす、尿路感染における最もよくある病原因子で
ある［（１）（「スペインにおける尿路感染の問題」
(Ｐｒｏｂｌｅｍ ｏｆ ｕｒｉｎａｒｙ ｉｎｆｅｃ
ｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｐａｉｎ)）、リアド（Ｌｉａｄ
ｅ）、１９８９年；（２）ウッドロー，ジイシイ（Ｗｏ
ｏｄｒｏｗ ＧＣ）、レビネ，エムエム（Ｌｅｖｉｎｅ
ＭＭ）「新世代のワクチン」（Ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａ
ｔｉｏｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ）、１９９０年］。
【０００４】尿路感染が、尿路上皮細胞結合能を有する
アドヘシン（ａｄｈｅｓｉｎ）構造を含むエシェリキア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株により
引き起こされること［（３）ジョンソン，ジェイエム
（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＪＭ）、「Ｅ．ｃｏｌｉ ＵＴＩに
おける病原性因子」（Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏ
ｒｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ＵＴＩ．）、クリニカル・
マイクロバイオロジー・レビューズ（Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ）、１９９１年；第４
巻；８０−１２８頁］、ならびに、該構造が尿路感染に
おけるこれら生物の病原性を引き起こす主要な１つであ
ること（３）は公知である。これらの構造は、そこで受
容体と結合する末端および／または側領域を含有する管
状型のタンパク質サブユニットよりなる［（３）および
（４）ブリントン，シイシイ（Ｂｒｉｎｇｔｏｎ Ｃ
Ｃ）、「グラム陰性菌における細菌線毛の構造、機能、
合成および遺伝的制御ならびにＤＮＡおよびＲＮＡ移行
の分子モデル」（Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎ
ｃｔｉｏｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｔ
ｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐ
ｉｌｉ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌ ｆ
ｏｒ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ
ｉｎ ｇｒａｍ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉ
ａ．）、トランス・ニューヨーク・アカデミック・サイ
エンス（Ｔｒａｎｓ ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、１
９６５年；第２７巻；１００３−１０５４頁］。該構造
は、病原性因子と関連するフィムブリエおよびいくつか
のファミリーと命名された：マンノース抵抗性フィムブ
リエ（Ｐ型：Ｐ、ＦまたはＮＡＰ、Ｘ型またはＤｒ関
連：５Ｍ，６）およびマンノース感受性フィムブリエ
（１型）が同定され（３．）、Ｘ型、ＡＦＡ−Ｉおよび
ＡＦＡ−ＩＩＩマンノース抵抗性アドヘシンはフィムブ
リエ構造と関連がない。尿路病原性イー・コリによる尿
路感染の予防剤および／または保護剤として、双方の型
のフィムブリエが試験されている［（５）ハグバーグ，
エル（Ｈａｇｂｅｒｇ Ｌ）、レッフラー，エイチ（Ｌ
ｅｆｆｌｅｒ Ｈ）、スバンボーグ−エデン，シイ（Ｓ
ｖａｎｂｏｒｇ−Ｅｄｅｎ Ｃ）、「抗生物質によらな
いＵＴＩの防御」（Ｎｏｎ−ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｐ
ｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ＵＴＩ．）：インフェクシ
ョン（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、１９８５年；第１３巻
（第２巻増刊号）：１９６−２００頁；（６）オウヘン
リー，ピイ（Ｏ’Ｈａｎｌｅｙ Ｐ）、ラーク，ディイ
（Ｌａｒｋ Ｄ）、ファルコウ，エス（Ｆａｌｋｏｗ
Ｓ）、スクールニク，ジイ（Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ
Ｇ）、「Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける上部尿路のＥ．ｃ
ｏｌｉコロニー形成の分子理論」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｏｌｏｎｉｚａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｕｐｐｅｒ ｕｒｉｎａｒｙ
ｔｒａｃｔ ｉｎ Ｂａｌｂ／ｃ ｍｉｃｅ．）、ジ
ャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション
（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、１９８５年；第７
５巻：３４７−３６０頁；（７）ハルグレン，エスジェ
イ（Ｈｕｔｌｇｒｅｎ ＳＪ）、ポーター，ティイエヌ
（Ｐｏｒｔｅｒ ＴＮ）、シェファー，エイジェイ（Ｓ
ｃｈａｅｆｆｅｒ ＡＪ）、ダンカン，ジェイエル（Ｄ
ｕｎｃａｎ ＪＬ）、「底部ＵＴＩに対する、Ｉ型線毛
の役割およびＥ．ｃｏｌｉにより作出される相変化の影
響」（Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｙｐｅ Ｉ ｐｉｌｉ ａｎ
ｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｈａｓｅ ｖａｒｉａｔ
ｉｏｎ ｏｎ ｌｏｗｅｒ ＵＴＩ ｐｒｏｄｕｃｅｄ
ｂｙ Ｅ．ｃｏｌｏ．）、インフェクト・アンド・イミ
ュニティー（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．）、１９８５
年；第５０巻：３７０−３７７頁；（８）シルバーブラ
ッド，エフエス（Ｓｉｌｖｅｒｂｌａｔｔ ＦＳ）、ワ
インステイン，アール（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｒ）、レ
ネ，ピイ（Ｒｅｎｅ Ｐ）、「抗−線毛抗体による実験
的腎盂腎炎に対する保護」（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａ
ｇａｉｎｓｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐｙｅｌｏ
ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔ
ｏ ｐｉｌｉ．）、サイエンス・ジェイ・インフェクト
・ディス（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉ
ｓ．）、１９８２年；第３３巻増刊号：７９−８２
頁］。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、再発
性膀胱炎を発病した女性の尿試料から単離した尿路病原
性イー・コリのフィムブリエ−アドヘシンを精製し同定
し、尿路感染を予防的に治療するための生成物としてそ
れらを使用することにある。
【０００６】尿路感染を予防するためのワクチンとして
用いられるイー・コリのフィムブリエの製造および有効
性について、研究がすでに行われている。従って、ペッ
チャ（Ｐｅｃｈａ）らの刊行物［ペッチャ，ビイ（Ｐｅ
ｃｈａ Ｂ）、ロウ，ディイ（Ｌｏｗ Ｄ．）、オウヘ
ンリー，ピイ（Ｏ’Ｈａｎｌｅｙ Ｐ）、「ネズミ・モ
デルにおいて線毛を有するＥ．ｃｏｌｉによる腎盂腎炎
を阻害するＧａｌ−Ｇａｌ線毛ワクチン」（Ｇａｌ−Ｇ
ａｌ ｐｉｌｉ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｐｒｅｖｅｎｔ
ｐｙｅｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ ｂｙ ｐｉｌｉａｔｅ
ｄ Ｅ．ｃｏｌｉ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅ
ｌ．）、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティ
ゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、１９８
９年；第８３巻：２１０２−２１０８頁］の他、以下の
特許が関連するものとして挙げられる：
【０００７】−イー・コリ細胞からのｐ−アドヘシンの
単離ならびに免疫、抗体産生および診断のためのその使
用に関するＤＥ３８３２７８５。 −ワクチン接種または局所適用によりイー・コリ感染を
予防するための、イー・コリ上にフィムブリエとして発
現される新規なフィブロネクチン結合タンパク質、なら
びに、その配列をコードするハイブリッドＤＮＡに関す
るＥＰ−３４２１７３。 −抗原部位もしくはＦ１１型フィムブリエを含有するイ
ー・コリまたはそれらに対する抗体により、敗血症に対
して、家禽を保護するためのワクチンに関するＥＰ−３
１４２２４。 −感染生物としての当該フィムブリエと同一フィムブリ
エ・ファミリーのフィムブリエとよりなる、尿路感染に
対する免疫用ワクチンに関するＥＰ−２４９７３９号。 −細菌感染に対する免疫、および、感染診断用の抗体の
産生に有用な、ポリペプチド・アドヘシン抗原決定基よ
りなる抗原に関するＥＰ−１７９８８７。 −イー・コリのｇａｌ−ｇａｌ・フィムブリエの断片ま
たはタンパク質を含有する尿路感染に対するワクチンに
関するＥＰ−１６１０９５。 −胃腸炎の予防または治療に薬理学的に用いる、エシェ
リキア・コリからのワクチンの製造に関する特許第０５
４６５８４号。
【０００８】
【課題を解決するための手段】前記に引用した先行技術
とは対照的に、本発明は、さらに示す特定の特徴を有す
る、再発性膀胱炎に発病した女性の尿から単離した新規
なイー・コリ株からの１型およびＰ型のフィムブリエ-
アドヘシンの製法および精製法を提案する。本発明によ
れば、該精製物の目的に影響し得る鞭毛、溶血素および
ＬＰＳのごとき他のタンパク質または構造体から遊離し
た無傷のフィムブリエ−アドヘシンを得ることができる
と共に、注目する生成物と共に存在し得る毒性物質を確
実に除去することができる。
【０００９】一方、単離された１型フィムブリエ−アド
ヘシンとＰ型フィムブリエ−アドヘシンとの間に交差反
応が実際全くなければ、各型のフィムブリエを別々に有
するもの、および、同濃度における２つの型のフィムブ
リエ−アドヘシンを有するものであって、かつ行った実
験において保護能を示した免疫原を製造することが可能
となる。
【００１０】加えて、該フィムブリエに関連するイー・
コリ株の粘着能を検証すれば、そのアドヘシン画分に対
する免疫反応を誘導する物質が、イー・コリの尿路上皮
細胞への付着を引き起こさせるようにすることもでき
る。
【００１１】発明の名称に示すごとく、本発明は、新規
なイー・コリ株から単離した１型およびＰ型フィムブリ
エ-アドヘシン、それらの製法および使用に関する。
【００１２】本発明の製法は、再発性膀胱炎に発病した
女性の尿から単離し、１型およびＰ型フィムブリエに関
連したアドヘシンの存在が確認されている新規な尿路病
原性イー・コリ株を出発物質として用いた、ブリントン
（４）によりすでに記載されている古典的な製法に基づ
いている。特に、以下の表１にその特性を示す、イー・
コリＣＥＣＴ４４８４株およびＣＥＣＴ４４８５株を用
いた：
【００１３】
【表１】
【００１４】該細菌を、３７℃にて液体培養培地に撒
き、対数増加期開始時の培養（１０8−１０9ｕｆｃ／ｍ
ｌ）を得る。その培養を遠心し、培地およびその中に存
在し得る成分を除去するため、得られた沈殿物を遠心に
より洗浄する。該細菌を含有し、中性ｐＨの塩溶液に懸
濁した該洗浄沈殿物を、２０，０００ないし２５，００
０ｒｐｍの速度にて、２ないし１０分間剪断ホモジナイ
ザー中で冷ホモジナイズする。そのホモジネートを、約
２５，０００−４５，０００×ｇの高速にて、２０−４
５分間遠心し、細菌を含有する沈殿物を捨てる。
【００１５】フィムブリエを含有する上清を収集し、数
回冷塩溶液沈殿を行う（ＭｇＣｌ2または（ＮＨ4）2Ｓ
Ｏ4で行うこともできる）。該沈殿操作は、２時間ない
し一晩の十分な時間で行うことができる。該沈殿物質
は、遠心により収集する。それを中性ｐＨの塩溶液で復
元して、その後に、沈殿に用いた塩の残渣、ならびに、
１０，０００Ｄａ未満の分子を除去する目的でそれを透
析する。その後に、該フィムブリエを、リポ多糖（ＬＰ
Ｓ）を除去する目的で、約８０℃にて５％デオキシコ−
ル酸ナトリウムで処理する。
【００１６】かく得られた物質（無傷のフィムブリエ）
を、セファクリル(Sephacryl)Ｓ-２００を含有するゲル
濾過カラム（アリルデキストランとＮ，Ｎ−メチレンビ
スアクリルアミドとの共有結合により形成され、１，０
００〜８０，０００Ｄａのタンパク質が入り込める孔を
有する２５〜７５μｍの球体形態の強固なメッシュを生
じたクロマトグラフィー用マトリックス）にてのクロマ
トグラフィーに付し、続いて、かく得られた排除容量を
再度、セファロース(Sepharose)4Bカラム（６×１０4〜
２０×１０6Ｄａのタンパク質を封入できる孔が形成さ
れ、わずかな残基と充填物を有する４５〜１６５μｍの
アガロース球体よりなるクロマトグラフィー用マトリッ
クス）にてのクロマトグラフィーに付する。これは、鞭
毛または膜残留物等のごとき非常に大きな物質、あるい
は、該生成物の特性に影響し得る、溶血素、ＬＰＳ等の
ごとき中程度の分子量または低分子量の毒性物質の残留
物を含有しない無傷のフィムブリエを得るためである。
これに加えて、注目する生成物と共に存在し得る毒性物
質が確実に除去される。
【００１７】セファロース４Ｂカラムの包括容量中に含
有されている物質が、２×１０5Ｄａないし２０×１０6
Ｄａの分子量を有する本発明の生成物を構成する。
【００１８】この生成物は、各型のフィムブリエを別々
に有するもの、および同濃度で該２つの型のフィムブリ
エ−アドヘシンを有するものであって、かつ尿路感染し
たマウスの実験系にて保護能を示した免疫原の製造を可
能とする、本発明に従って単離された１型とＰ型のフィ
ムブリエ−アドヘシンの間で、交差反応を実質的に有し
ない。
【００１９】加えて、フィムブリエと関連する該イー・
コリ株の粘着能を検証することにより、そのアドヘシン
画分に対して免疫反応を誘導する物質が、上皮細胞への
イー・コリの付着を引き起こすようにすることができ
る。
【００２０】一旦フィムブリエを得たら、その特性を調
べ、糖還元法［（１０）パーク，ジェイティイ（Ｐａｒ
ｋ ＪＴ．）、ジョンソン，エムジェイ（Ｊｏｈｎｓｏ
ｎＭＪ）、「グルコースの微小定量法」ア・サブミノデ
ターミネイション・オブ・グルコース（Ａ ｓｕｂｍｉ
ｎｏｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓ
ｅ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、１９４９年；第１
８１巻：１４９−１５１頁；（１１）チャップリン，エ
ムエフ（Ｃｈａｐｌｉｎ ＭＦ．）、ケネディー，ジェ
イエフ（Ｋｅｎｎｅｄｙ ＪＦ）、「炭化水素分析」
（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．）ア
・プラクチカル・アプローチ（Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ
ａｐｐｒｏａｃｈ）、アイアールエル・プレス（ＩＲ
Ｌ Ｐｒｅｓｓ．）オックスフォード，ワシントン，デ
ィイ・シイー（Ｏｘｆｏｒｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，
Ｄ．Ｃ．）（１９８６年）］により全糖含量の定量を行
うとともに、サザーランド法［（１２）サザーランド，
イイダブリュ（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ ＥＷ）、コシ，
シイエフ（Ｃｏｓｉ ＣＦ）、ヘイネス，アール（Ｈａ
ｙｎｅｓ Ｒ）、オルソン，エヌエス（Ｏｌｓｏｎ Ｎ
Ｓ）、「高血糖症−糖原症因子のインシュリンおよび胃
粘膜からの精製」（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃ−ｇｌｙｃｏｇｅ
ｎｏｌｉｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｉｎｓｕｌ
ｉｎ ａｎｄ ｆｒｏｍ ｇａｓｔｒｉｃ ｍｕｃｏｓ
ａ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、１９４９年；第１
８０巻；８２５−８３７頁］またはＵＶ分光分析により
全タンパク質含量を定量した。
【００２１】その結果、本発明の製法により得られた該
フィムブリエは、９０−９５重量％のタンパク質および
１−３重量％の糖を有することが判明した。
【００２２】また、ＵＶ領域よりなる波長範囲（３５０
−１９５ｎｍ）における試料の分光分析的測定により、
該フィムブリエの重合度も測定した（４．）。
【００２３】マク・マイケル，（Ｍｃ．Ｍｉｃｈａｅ
ｌ）［（１３）マク・マイケル，ジェイ（Ｍｃ Ｍｉｃ
ｈｅａｌ Ｊ．）、オウ，ジェイティイ（Ｏｕ．Ｊ
Ｔ．）、「イー・コリからの通常の線毛の構造」（Ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｐｉｌｉ ｆｒ
ｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ．）、ジャーナル・オブ・バクテリ
オロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、１９７９年；
第１３８巻：９６９−９７５頁］に基づいて行われたＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ実験は、２−β−メルカプトエタノール
の存在または不存在においてフィムブリエが異なった電
気泳動移動度を示したため、（膜タンパク質と区別でき
る）フィムブリエ画分が存在すること、ならびに、それ
を異なったフィムブリエ型の間に完全に分類できること
を強調している。
【００２４】ジェイ・モントレール（Ｊ．Ｍｏｎｔｒｅ
ｕｉｌ）らによるレシチンでの免疫検出法による炭化水
素の同定および分類の研究［（１４）モントレール，ジ
ェイ（Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ Ｊ．）、ブカレット，エス
（Ｂｏｕｑｕｅｌｅｔ Ｓ）、デブレイ，エイチ（Ｄｅ
ｂｒａｙ Ｈ）ら、グリコプロテインズ（Ｇｌｙｃｏｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ）エムエフ・チャップリン（ＭＦ Ｃｈ
ａｐｌｉｎ）およびジェイエフ・ケネディー（ＪＦ Ｋ
ｅｎｎｅｄｙ）、カーボハイドレート・アナリシス（Ｃ
ａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）、１９８
６年、アイアールエル・プレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）
オックスフォード、ワシントン、ディイ・シイ（Ｏｘｆ
ｏｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）の第５章］
は、以下の形態を有する該フィムブリエの特定画分に関
連する炭化水素の存在を強調している： −１４〜２０ｋＤａの分子量を有する５つの異なったタ
ンパク質画分の存在を示し、炭水化物と関連する１７−
１８ｋＤａの主要成分（５５％）を有する１型フィムブ
リエ； −１４〜２０ｋＤａの分子量を有する５つのタンパク質
画分の存在を示し、各々１９〜２０ｋＤａおよび１５ｋ
Ｄａの２つの主要成分（３５％および３０％）を有し、
その前者が炭水化物と関連しているＰ型フィムブリエ。
【００２５】スマート・システム（ＳＭＡＲＴ ＳＹＳ
ＴＥＭ）法によるゲル濾過クロマトグラフィーは、ピリ
ンサブユニットが高分子量のフィムブリエを形成する該
ピリンサブユニットの再生能、ならびに、続くその精製
を強調している。
【００２６】レシチンでの免疫同定法による、フィムブ
リエ−アドヘシンに関連する炭水化物の分析は、該炭水
化物が、マンノース−マンノース単位α（１−３）、α
（１−６）またはα（１−２）、シアル酸α（２−６）
またはα（２−３）ガラクトース、ガラクトースβ（１
−３）ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースβ
（１−４）ｎ−アセチルグルコサミンを有することを強
調している。
【００２７】一方、フィムブリエ−アドヘシン、ならび
に、それを構成するタンパク質サブユニットのクロマト
グラフィー分析は、該フィムブリエは水溶液中の懸濁液
で維持でき、該サブユニットが迅速に再集合してフィム
ブリエ・ユニットおよび／または高分子量の同凝集物を
形成すること、ならびに、アルカリ溶液、アニオン性界
面活性剤、または２−β−メルカプトエタノールの存在
中に高温（１００℃の槽）に付すと１４−２０ｋＤａの
サブユニットに再度分離することを示している。
【００２８】また、精製された１型ならびに精製された
Ｐ型のフィムブリエは、それらが、菌体、エス・セレビ
シア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（１型）の血液凝集
反応および凝集反応［（３）および（１５）ドミング，
ジイジェイ（Ｄｏｍｉｎｇｕｅ ＧＪ）、ロバーツ，ジ
ェイエイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ ＪＡ）、ローシリア，アー
ル（Ｌａｕｃｉｒｉａ Ｒ）、「尿路感染におけるＯ線
毛を有するイー・コリの病原性」（Ｐａｔｈｏｇｅｎｉ
ｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ Ｏ．ｆｉｍｂｒ
ｉａｔｅｄ Ｅ．ｃｏｌｉ ｉｎ ｕｒｉｎａｒｙ ｔ
ｒａｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．）、ジャーナル・オ
ブ・ウロロジー（Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ）、１９８５年；
第１３３巻：９８３−９５９頁］ならびにＰＰＡ技術、
「受容体特異的」粒子凝集［（１６）スベンソン，エス
ビイ（Ｓｖｅｎｓｏｎ ＳＢ）、カーレニウス，ジイ
（Ｋａｌｌｅｎｉｕｓ Ｇ）、ムルビー，アール（Ｍｏ
ｌｌｂｙ Ｒ）、ハットベルグ，エイチ（Ｈｕｔｔｂｅ
ｒｇ Ｈ）、ウィンバーグ，ジェイ（Ｗｉｎｂｅｒｇ
Ｊ）、「受容体特異的粒子凝集試験によるＰ線毛を有す
るイー・コリの迅速な同定」（Ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ Ｐ．ｆｉｍｂｒｉａｔｅｄ
Ｅ．ｃｏｌｉ ｂｙ ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｓｐｅｃ
ｉｆｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉ
ｏｎ ｔｅｓｔ．）、インフェクション（Ｉｎｆｅｃｔ
ｉｏｎ）、１９８２年；第１０巻：２０９−２１３頁］
に関しては同一の特性を有する。
【００２９】再発性膀胱炎を発病した女性の尿から単離
した１型フィムブリエを有するイー・コリ株（ＣＥＣＴ
４４８５株）から本発明の製法により得た無傷のフィム
ブリエ−アドヘシンは、免疫原として重要な用途があ
り、ポリまたはモノクローナル抗体を得るための免疫感
作源（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｏｒ）として本発明において
使用する生成物を構成する。
【００３０】該フィムブリエ−アドヘシンの免疫原能
は、特異的抗１型−フィムブリエ−アドヘシン抗体およ
び抗Ｐ型−フィムブリエ−アドヘシン抗体の産生を可能
とするが、一方で、両方のポリおよびモノクローナル抗
体は、実質的に、交差反応を有しない。該抗体は、尿路
病原性イー・コリのフィムブリエ−アドヘシンの型を類
形化する診断試薬として用い得る。一方、無傷のフィム
ブリエ−アドヘシンをＵＴＩに対する保護剤として用い
ることが、該成分での能動免疫化の間に効果的であるこ
とが判明した。特に、尿病原菌イー・コリによりもたら
される尿路感染の予防にて治療的に用いられる該生成物
は：（１）水性懸濁液中の無傷のフィムブリエ（２）水
酸化アルミニウムゲルに弱毒化して吸着させた、混合ア
ジュバントと混合したフィムブリエ、あるいは、（オー
レオボシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂｏｓｉｄｉ
ｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）により産生される線状グル
コース重合体であるプルランのごとき）高分子量多糖に
共有結合したフィムブリエ、ならびに（３）経口的には
ナノメートル程の粒子である。
【００３１】無傷のフィムブリエに対する特異的免疫反
応を誘導する実験により、特異的抗体を産生する体液性
免疫反応において効果的であること、ならびに、組織病
理学的研究の手法により、早期に生来的細胞性免疫反応
が誘導されることが立証された。白血球細胞の蓄積によ
る炎症侵潤の存在により、尿路感染に続く特異的免疫細
胞性反応の開始を想定できる。
【００３２】同様にして、マウスにおけるＵＴＩに先立
って１型およびＰ型フィムブリエで免疫すると、以前に
免疫されているか否かに応じ、実験した感染群の間で顕
著な相違を生じた。従って、この型の能動免疫化は、尿
病原性イー・コリ株により引き起こされるＵＴＩにおい
て特異的保護を引き起こすと結論付けることができる。
【００３３】マウスで得た特異的ポリクローナル（抗−
フィムブリエ）抗体は、１型およびＰ型フィムブリエ−
アドヘシンの粘着能を阻害できる。無傷の免疫原（フィ
ムブリエ）またはアジュバントと混合した免疫原は、
０.１μｇ−１００μｇ／ｋｇ体重の広範囲で有効であ
ることが確認されている水性懸濁液（０.０１％メルチ
オレートで緩衝した生理食塩溶液）の形態で、（１を超
える用量を投与する限りは）最短３０日の時間間隔で投
与する。通常に用いるアジュバントは、水酸化アルミニ
ウムゲル、リン酸カルシウムゲルおよびプルランであ
る。
【００３４】該免疫原は、通常、皮下投与や腹腔内投与
する。いずれにしても、経口、カプセルまたはマイクロ
カプセル中、ならびに懸濁液形態で尿路内に投与するよ
うな投与方法も除外できない。
【００３５】
【実施例】以下の実施例により本発明をさらに説明する
が、これは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３６】株およびその特性 異なるイー・コリ株を、再発性膀胱炎の女性の尿路から
単離し、マンノース存在下あるいは非存在下凝集技術に
よるフィムブリエの存在、ヒトの尿路上皮細胞への付着
能力、特異的な免疫血清の産生および寒天中の血液培養
中で検出可能な溶血素の産生による現在の血清型の特徴
により分類した。最終的に、以下の株が選択された:
【００３７】
【表２】
【００３８】調製および特徴付けの方法 尿路病原性イー・コリの株を栄養培地に接種し、３７℃
において一晩中インキュベートした。これらの培養の１
ｍｌ（１０8〜１０9ｕｆｃ／ｍｌ)を５００ｍｌの栄養
培地に接種し、３７℃にて撹拌することなくインキュベ
ーションを行なった。すでに増殖させた培養を、培養培
地を除去する目的のために、１０，０００−２０，００
０×ｇで２０分間、３回にわたり遠心し、沈澱を滅菌塩
溶液(ＳＳ)(４５ｍｌ／５００ｍｌ培養)に再懸濁した。
ＳＳ中の細菌を機械的剪断ホモジナイザーにより、異な
るパルスの間を３分間の間を空け、１８,７５０ｒｐｍ
における１分間の４パルスで、冷ホモジナイズした(４
℃)。(マクロアセンブラー(ｍａｃｒｏａｓｓｅｍｂｌ
ｅｒ)と剪断機を備えたバーチシェアー（Ｖｉｒｔｉｓ
ｈｅａｒ)−２４ ホモジナイザー。) ホモジナイズし
た材料（細菌および細菌から分離したフィムブリエ)を
１０,０００ｇにおいて２０分間冷遠心した。塩溶液沈
澱により精製されたフィムブリエを含む上清を回収し
た;それは冷ＭｇＣｌ2(２０．３ｇのＭｇＣｌ2・３Ｈ2
Ｏ／上清１リットル)で行った。沈澱した物質を遠心(２
０，０００ｇ、４℃において３０分)により回収し、
０．０２ＭでｐＨ７．４のＰＢＳに再懸濁した。この塩
溶液沈澱は３回繰り返した。該物質(フィムブリエ)は、
最後の沈澱物を蒸留水に対し徹底的に透析膜中で透析し
た後、ＰＢＳに再懸濁した。
【００３９】単離したフィムブリエを８０℃において１
５分間５％デオキシコール酸ナトリウムで処理し、蒸留
水に対し再び透析した。
【００４０】試料をセファクリルＳ−２００ ＨＲカラ
ム(ＸＫ２６／１００ ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ)）に通し、分画回収機(リトリーバー II)を装備
したＩＳＣＯ ＶＡ−５装置でモニターした。５０ｍＭ
のｐＨ８のトリス−塩酸溶出緩衝液を４０ｍｌ／ｈの液
速で用いた。溶出体積に応じた画分を集め、これらを同
じ特性と同じ条件であるが、セファロース４Ｂゲルであ
る点で異なるカラムに付した。
【００４１】回収された物質は包含された体積である。
該物質を蒸留水に対し徹底的に透析し、ひき続いてのす
べての実験の基礎とした。
【００４２】加熱およびＳＤＳにより分離したフィムブ
リエの試料についての糖の定量(１１)(ネオクプロイン
（ｎｅｏｃｕｐｒｏｉｎｅ）試薬による単糖類の定量の
ための糖還元方法)とタンパク質の定量(４)(ウシ血清ア
ルブミン標準でのλ＝２８０ｎｍにおける分光光度によ
る測定)によって、培地１リットル当たり３ないし１０
ｍｇのフィムブリエタンパク質ならびに培地１リットル
あたり０.０３ないし０.５ｍｇの単糖類の糖を含有する
フィムブリエを調製する工程の収率の研究が可能となっ
た。
【００４３】マク・マイケル(Ｍｃ Ｍｉｃｈａｅｌ)ら
の方法(１３)に基づくフィムブリエの処理によって、該
フィムブリエのタンパク質成分の評価が可能となった。
(ｐＨ＝２への試料の酸性化、１００℃において１０分
間の加熱、ｐＨ＝１０への試料のアルカリ性化。遠心と
ｐＨ＝７の中性にした上清の回収。沈澱は硫酸アンモニ
ウムで行い、沈澱物はトリス−塩酸 ０.５Ｍ ｐＨ＝
６.８、ＳＤＳ１０％で２−β−メルカプトエタノール
有りあるいは無しの試料緩衝液中に再懸濁した。試料は
２分間または１０分間で１００℃まで加熱した。
【００４４】１２.５％における不連続ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅシステム中での電気泳動をラエムリー（Ｌａｅｍｍｌ
ｉ）法に基づいて行なった［（１７）Ｌａｅｍｍｌｉ
（ラエムリー） ＵＫ「バクテリオファージＴ4の頭部
の集合の間の構造タンパク質の切断」（Ｃｌｅａｖａｇ
ｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓｄ
ｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ
ｈｅａｄ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ
Ｔ4．）、 ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）１９７０年；第
２７７巻：６８０−６８５頁］。
【００４５】結果として、該試料を２分間加熱した後、
フィムブリエの２個の型とは少し異なる標準とともに、
Ｐ型フィムブリエタンパク質（１８ｋＤａ）だけでなく
１型フィムブリエタンパク質（１９ｋＤａ）も含めた、
全フィムブリエタンパク質の９５％以上に相当する主た
るバンドが示された。
【００４６】試料をより長く熱すると(１０分)、フィム
ブリエの双方の型の電気泳動の標準は明白に異なる。こ
れより、１型のフィムブリエは、２１ないし１３ｋＤａ
の分子量の５個の異なる画分を示し、３３％ないし３１
％であって、１９ないし１５ｋＤａである２個の主たる
バンドを伴う。
【００４７】Ｐ型のフィムブリエは、２０ないし１４ｋ
Ｄａの間からなる５個のバンドを示し、主たる成分は１
８ｋＤａで５３％である。
【００４８】ベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によりデザインされた
方法によるレシチンの免疫検出［グリカン・ディテクシ
ョン・キット（Ｇｌｙｃａｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋ
ｉｔ）およびグリカン・ディファレンシエーション・キ
ット（Ｇｌｙｃａｎ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ）］を用いて明らかにされた、ピリンバンドに
関連する糖タンパク質の検出と区別は、ニトロセルロー
ス膜に固定された分画内において、フィムブリエの双方
の型にみられるピリンバンドに関連する糖の存在を示し
た。用いたレシチンは、マンノースに結合した末端マン
ノース残基α（１−３）、α（１−６）もしくはα（１
−２）、α（２−３）ガラクトースおよびガラクトース
β（１−３）Ｎ−アセチルガラクトサミンに結合したシ
アル酸を認識した。該認識は、中のレベルにおいてと同
様に末端のレベルにおいても、試料が付せられる前処理
により与えられるであろう。
【００４９】２−β−メルカプトエタノール（２βＢ
Ｅ）が存在するか否かは、１型およびＰ型フィムブリエ
にそれぞれ対応する１９ｋＤａあるいは１８ｋＤａの画
分の移動度の修飾を決定する。これは該フィムブリエの
一部を形成するように思われるサブユニットを示す（１
３）。紫外線の領域からなる波長のエレクトロフォトメ
トリック（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ）分
析により、調製の過程で直接単離したフィムブリエ中の
２９０ｎｍの相対最大値の存在と、それがフィムブリエ
の無傷もしくは重合度を特徴付ける分離試薬によって処
理した後に同一波長で消失することを示す。
【００５０】製造者により提案された方法論に従い、ス
ーパーデックス ７５ Ｐｃ ３．２ ゲル（３０）中
の濾過微小カラムでのスマート・システム（ファルマシ
ア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ））による高分解能マイクロクロマトグラフィーを用
いた分析は、水溶性の培地中のピリンサブユニットの凝
集特性を示す。酸−塩基ショック、２−β−メルカプト
エタノール、ＳＤＳ、尿素および／または熱により分離
されたピリンサブユニットは、一旦分離試薬が除去され
てしまった後水性培地中で急速に集合し、マイクロクロ
マトグラフィーの排除体積内で試料が再び回収された
が、これは他の著者（１３）が指摘するようにこれらの
タンパク質の疎水的な性質を示唆する。
【００５１】透過型電子顕微鏡での実験は、調べた２種
のイー・コリの株におけるフィムブリエの存在を示す
（ＣＥＣＴ４４８４およびＣＥＣＴ４４８５）。精製さ
れたフィムブリエの電子顕微鏡写真は、その高純度を示
す（図１および２）。
【００５２】実験的研究 フィムブリエで動物を能動免疫することにより得られた
保護の程度をみることを可能にするモデルを研究する目
的のために、Ｂａｌｂ／ｃマウスについての実験的研究
をデザインした。
【００５３】２０匹の雌のＢａｌｂ／ｃマウスの４バッ
チ（各バッチ）を、プロトコールに表されているように
使用した。
【００５４】（I）血清および尿からの特異的抗体のレ
ベル（力価）を測定するための、丁度ビエルム（Ｂｊｅ
ｒｒｕｍ）らにより論じられているドット−エライサ
（ＤＯＴ−ＥＬＩＳＡ）技術［（１８）ゴードン，ジェ
イ（Ｇｏｒｄｏｎ Ｊ．）、ビリング，ピィ（Ｂｉｌｌ
ｉｎｇ Ｐ．)のドット−イムノブロッティング(Ｄｏｔ
−Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）、一般的原理と方
法。血清と尿からの特異的抗体レベル（力価）の測定の
ためのビエルム，オウジェイ（Ｂｉｅｒｒｕｍ Ｏ
Ｊ．）とヘーガード，エヌエイチ（Ｈｅｅｇａａｒｄ
ＮＨ．）編、「タンパク質のイムノブロッティングのハ
ンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｂ
ｌｏｔｔｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、第１巻、
シーアールシー・プレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、１９
８８年：２７−３０頁］により；（II）解剖断片からの
細菌の単離（６）と同定（ＡＰＩシステム）により実験
の評価を行った。単離されたイー・コリ菌株のフィムブ
リエの型の分類は、イー・コリの各単離菌から得られた
フィムブリエのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより；（III）解剖
断片（膵臓と膀胱）からの組織病理学的研究［（１９）
バンクロフト，ジェイビイ（Ｂａｎｃｒｏｆｔ Ｊ
Ｂ．）、スティーブンス，エイ（Ｓｔｅｖｅｎｓ
Ａ．）編、「組織病理学技術の理論と実際」（Ｔｈｅｏ
ｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１９８２年；
第２版、チャーチル（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ）とリビング
ストーン（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ）、エジンバラ（Ｅ
ｄｉｍｂｕｒｇｈ）］により行った。
【００５５】
【表３】
【００５６】
【表４】
【００５７】
【表５】
【００５８】
【表６】
【００５９】動物免疫−感染モデル対照 尿対照：自然排尿の試料から陽性の尿培養物を有するマ
ウスを捨てる。尿培養培地：マッコンキーおよび栄養寒
天。 感 染：外尿道口を介してカテーテル法を行い、１０9
ｕｆｃ／ｍｌに調節した細菌の懸濁液０．１ｍｌを膀胱
内注入する。 剖 検： 殺す：膀胱感染の７２時間後。 瀉血：麻酔した動物においてパスツールピペットを用い
て内眼角（ｉｎｓｉｄｅ ａｎｇｌｅ ｏｆ ｔｈｅ
ｅｙｅ）を穿刺し、血餅を除去するためにエッペンドル
フ管中に注ぎ、血清を採取する。 試料：皮膚をエタノールで殺菌した後、骨盤から首の器
官付着部までの切開を行い、足まで広げる。さらに、腹
腔に近づくために切開を行う。 無菌尿の採取：直径０．５ｍｍの針で膀胱を穿刺し、次
のその培養のために１ｍｌの注射器で吸引し、抗体を同
定する。 膀胱の採取：尿を除去した後、膀胱を区分し、その器官
付着部で取り出し、緩衝化ホルモルを有するバイアル中
に移し、組織病理学を研究する。 腎臓の採取：両方の腎臓を切開し、取り出し、２つの同
等な部分における腎盂レベルで該腎臓を矢状切断する。
マッコンキー寒天を有するプレート上で該切片の表面の
塗抹標本によって微生物学的分析し、３７℃／２４時間
インキュベートする。組織病理学的分析する。
【００６０】
【表７】
【００６１】組織病理学的研究から、尿道を介する雌性
マウスの接種が腎盂炎、尿道炎または急性膀胱炎を生じ
ることが判明した。すべての場合、炎症現象は、腎杯の
移行上皮およびそれに隣接する連結組織に限定され、尿
道の近位部分の部分炎症現象が少ない程度に観察され
る。柔組織には感染の主患部はない。
【００６２】フィムブリエ抗原による免疫化に対するマ
ウスの免疫応答の研究 ゴードンら（１８）によって開示されたＤＯＴ−ＥＬＩ
ＳＡ法、ムニョスら［（２０）ムニョス，（Ｍｕｎｏｚ
Ｃ）、ニエト，ア（Ｎｉｅｔｏ Ａ）、ガヤ，ア（Ｇ
ａｙａ Ａ）、マルティネス，ホタ（Ｍａｒｔｉｎｅｚ
Ｊ．）、ビベス，ホタ（Ｖｉｖｅｓ Ｊ）、「ＥＬＩ
ＳＡにおける固相抗原濃度および安定性の最適化のため
の新しい実験的規準」（Ｎｅｗ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚａｔ
ｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ａｎｔｉｇｅ
ｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉ
ｌｉｔｙ ｉｎ ＥＬＩＳＡ）、ジャーナル・オブ・イ
ムノロジカル・メソッズ（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ）１９８６年；第９４巻：１３７−１４４頁］
に基づいたＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥイムノブ
ロッティング［（２１）トウビン，エイチ（Ｔｏｗｂｉ
ｎ Ｈ）、ステヒリン，アイ（Ｓｔａｅｈｉｌｉｎ
Ｉ）、ゴードン，ジェイ（Ｇｏｒｄｏｎ Ｊ）、「ポリ
アクリルアミドゲルからニトロセルロースシートへのタ
ンパクの電気泳動移動：方法および用途」（Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄ
ｅ ｇｅｌｓ ｔｏ ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ
ｓｈｅｅｔ：ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ ｓｏｍｅ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、プロシーディングズ・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユ
ー・エス・エイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ）１９７９年；第７６巻：４３５０−４３５
４頁］によって特異的抗体の力価および特徴を測定する
ことにより体液性免疫反応を研究した。
【００６３】マルティネスら［（２２）マルティネス，
ホタ（Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｊ）、ニエト，ア（Ｎｉｅｔ
ｏ Ａ）、ビベス，ホタ（Ｖｉｖｅｓ Ｊ）、トルレ
ス，ホタエメ（Ｔｏｒｒｅｓ ＪＭ）、「免疫診断のた
めのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）抗原標
準化に対するＥＬＩＳＡ阻害の適用」（Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ＥＬＩＳＡ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
ｔｏ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｔ
ａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｄ
ｉａｇｎｏｓｉｓ）、Ｊ．Ｍｅｄ Ｖｅｔ Ｍｉｃｏ
ｌ、１９８５年；第２３巻：３１７−３２０頁］によっ
て記載されている方法に準じ、ＥＬＩＳＡ阻害によっ
て、１型およびＰ型フィムブリエ間の交差反応性の研究
を行った。
【００６４】結果は、全ての個体において免疫化前の負
の値から、半月おきに３回免疫化した後に１，２８０以
上の力価（ＤＯＴ−ＥＬＩＳＡ）までであった特異的抗
体の力価の明らかな増加および１／１，０００の血清希
釈度で１．５の吸光度差異を示した。
【００６５】イムノブロッティングは、フィムブリエの
基本的な成分に対応する１７ｋＤａ（１型）および１９
ｋＤａ（Ｐ型）の画分に対する抗体自体の反応の特異性
を示した。
【００６６】ＥＬＩＳＡによる交差反応性の研究は、有
意な交差反応性を示さなかった。
【００６７】「図３」および「図４」のグラフから分か
るように、１型フィムブリエ（固相）およびＰ型フィム
ブリエ（阻害相）の間では、交差反応は、全く観察され
なかった。Ｐ型フィムブリエ（固相）および１型フィム
ブリエ（阻害相）の間で、２％未満であって、かつ、５
×１０3よりも高い両系のＡｇ50の差異を有するという
ように非常に不十分な交差反応性しか検出されなかっ
た。
【００６８】
【表８】
【００６９】
【表９】
【００７０】（「マウスの種々のバッチにおける実験的
感染の研究の全結果」と題した）前記表に示した統計学
的分析は、感染していない対照バッチ、感染したバッチ
および感染前に免疫化されたバッチの間で有意な差異の
存在を示した。
【００７１】毒性試験 「セントゥロ・デ・インベスティガガシオン・イ・デサ
ルロリョ・アプリカド，エセ・ア・エレ」（Ｃｅｎｔｒ
ｏ ｄｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ ｙＤｅｓａｒ
ｒｏｌｌｏ Ａｐｌｉｃａｄｏ，Ｓ．Ａ．Ｌ．）（リサ
ーチ・アンド・アプライド・ディベロープメント・セン
ター，リミテッド）（承認された）によって行われた標
準的なプロトコールに従って、モルモット（腹腔内投
与）に対して異常毒性試験を、マウスに対して皮下的局
所耐性を、ならびに、マウス（腹腔内投与）において異
常毒性を行った。
【００７２】結果は、許容されない生成物として含むよ
うな欧州薬局方の規定に抵触した要素を示さなかった。
【００７３】
【発明の効果】本発明によれば、エシェリキア・コリに
よる尿路感染疾患を治療し予防できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 イー・コリＣＥＣＴ４４８４株から単離し
た、電子顕微鏡技術により撮影した、精製フィムブリエ
の図面代用の電子顕微鏡写真である。
【図２】 イー・コリＣＥＣＴ４４８５株から単離し
た、電子顕微鏡技術により撮影した、精製フィムブリエ
の図面代用の電子顕微鏡写真である。
【図３】 固相にての、１型フィムブリエを有する尿路
病原菌のＥＬＩＳＡ阻害実験の結果を示したグラフであ
る。
【図４】 固相にての、Ｐ型フィムブリエを有する尿路
病原菌のＥＬＩＳＡ阻害実験の結果を示したグラフであ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 アルベルト・マルティネス・ガラテ スペイン、サントゥルセ（ビスカヤ）、 ホセ・ミゲル・デ・バランディアラン11 番 クアルト・イスキエルダ (72)発明者 ホルヘ・マルティネス・ケサーダ スペイン、ビルバオ、ブルダ・デ・エパ ルサ13番 クアルト・アチエ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/245 A61K 38/02 C12P 21/00 G01N 33/569 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
    （以下、イー・コリという）ＣＥＣＴ ４４８５株から
    単離された１型フィムブリエ−アドヘシンまたはイー・
    コリＣＥＣＴ ４４８４株から単離されたＰ型フィムブ
    リエ−アドヘシンからなるフィムブリエ−アドヘシン生
    成物であって、ここに、該生成物は２×１０5〜２×１
    ０7の分子量を有し、かつ９０〜９５重量％のタンパク
    質および１〜３重量％の糖を含み、該各フィムブリエ−
    アドヘシンは炭水化物に結合する主要成分を含有する５
    種の異なるタンパク質画分を含み、該炭水化物にはマン
    ノース−マンノース単位α（１−３）、α（１−６）ま
    たはα（１−２）、αシアル酸α（２−６）またはα
    （２−３）ガラクトース、ガラクトース（１−３）ｎ−
    アセチルガラクトサミン、ガラクトースβ（１−４）ｎ
    −アセチルグルコサミンが含まれ、該１型フィムブリエ
    の５種のタンパク質画分は１７〜１８ｋＤａの分子量の
    主成分を含む１４〜２０ｋＤａの分子量を有し、該Ｐ型
    フィムブリエの５種のタンパク質画分は１９〜２０ｋＤ
    ａの分子量の第１の主要成分および１５ｋＤａの分子量
    を有し炭水化物に結合していない第２の主要成分を含む
    １４〜２０ｋＤａの分子量を有することを特徴とする該
    フィムブリエ−アドヘシン生成物。
  2. 【請求項２】 静止期の初期における培養が得られるま
    で、約３７℃で液体培養培地にＣＥＣＴ４４８４株およ
    びＣＥＣＴ４４８５株から選択される１種のイー・コリ
    細菌を接種する（１０8〜１０9ｕｃｆ／ｍｌ）第１の工
    程； 第１の工程から得た培養物を遠心し、それによって第１
    の沈殿物を得、該第１の沈殿物を洗浄して洗浄沈殿物を
    得る第２の工程； 該洗浄沈殿物を中性pＨを有する塩溶液に再懸濁して懸
    濁液を得、１０，０００〜２５，０００ｒｐｍの速度で
    ２〜１０分間、剪断型ホモジナイザー中で該懸濁液を冷
    ホモジナイズしてホモジネートを得る第３の工程； 細菌を含有する第２の沈殿物およびフィムブリエを含有
    する上清液体が得られるまで２０〜４５分間、第３の工
    程によって得たホモジネートを２５，０００〜４５，０
    ００×ｇで遠心し、該第２の沈殿物を捨て、該上清液体
    を回収する第４の工程； フィムブリエを含有する該上清液体を、沈殿物が得られ
    るまで２〜１５時間、冷塩溶液沈殿に数回付し、遠心に
    よって該沈殿物を回収して遠心沈殿物を得る第５の工
    程； 該遠心沈殿物を中性pＨの塩溶液中で復元して沈殿物溶
    液を得、該沈殿物溶液を透析してフィムブリエを含有す
    る透析溶液を得る第６の工程； 約８０℃で、該透析溶液を５％デオキシコール酸ナトリ
    ウムで処理して第１のフィムブリエ含有生成物を得る第
    ７の工程；および 該第１の生成物を、クロマトグラフィーに付した生成物
    が得られるまで、アリルデキストランとＮ，Ｎ−メチレ
    ンビスアクリルアミドとの共有結合により形成され、
    １，０００〜８０，０００Ｄａのタンパク質が入り込め
    る孔を有する２５〜７５μｍの球体形態の強固なメッシ
    ュを生じたクロマトグラフィー用マトリックスを含有す
    るゲル濾過カラム中のクロマトグラフィーに付し、さら
    に該クロマトグラフィーに付した生成物（排除容量）
    を、６×１０4〜２０×１０6Ｄａのタンパク質を封入で
    きる孔が形成され、わずかな残基と充填物を有する４５
    〜１６５μｍのアガロース球体よりなるクロマトグラフ
    ィー用マトリックスを含有するカラム中のクロマトグラ
    フィー（包括容積）に付してフィムブリエ−アドヘシン
    を得る第８の工程からなることを特徴とする請求項１記
    載のフィムブリエ−アドヘシン生成物の製法。
  3. 【請求項３】 請求項１記載のフィムブリエ−アドヘシ
    ン生成物を含有するイー・コリによって産生される尿路
    感染症の治療用および予防用の薬剤。
  4. 【請求項４】 請求項１記載のフィムブリエ−アドヘシ
    ン生成物に対する抗体を含有する尿路疾患病原性イー・
    コリの診断用生成物。
  5. 【請求項５】 １型フィムブリエの５種のタンパク質画
    分の中の主要成分が５５％の比率で存在することを特徴
    とする請求項１記載の生成物。
  6. 【請求項６】 Ｐ型フィムブリエの５種のタンパク質画
    分の中の主要成分が３５％の比率で存在することを特徴
    とする請求項１記載の生成物。
  7. 【請求項７】 該第２の主要成分が３０％の比率で存在
    することを特徴とする請求項６記載の生成物。
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US4725435A (en) * 1986-06-18 1988-02-16 Bactex, Inc. Vaccine composition for immunization against urinary tract infection caused by E. coli
WO1990000614A1 (en) * 1988-07-13 1990-01-25 Baylor College Of Medicine Receptor specific proteins and their use in receptor typing
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