DE3832785A1

DE3832785A1 - Verfahren zur gewinnung von p-adhaesin

Info

Publication number: DE3832785A1
Application number: DE3832785A
Authority: DE
Inventors: Klaus Prof Dr Jann; Heinz Dipl Chem Dr Hoschuetzky
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1988-09-27
Filing date: 1988-09-27
Publication date: 1990-04-19

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von P-Adhäsin aus uropathogenen E. coli-Stämmen sowie die Verwendung des P-Adhäsin.

Harnwegsinfektionen sind weit verbreitet. Sie werden zu einem großen Teil von Bakterien der Gattung Escherichia coli verursacht. Die Infektion durch diese Bakterien beginnt dabei damit, daß sich die Bakterien an der Schleimhautoberfläche oder an dem epithelialen Schleim anheften über Oberflächenproteine. Diese Proteine, die als Adhäsine bezeichnet werden, sitzen in der Regel auf Fimbrien oder Pili. Die Proteine weisen eine Spezifität für bestimmte Zucker auf. Näher untersucht wurde bisher das als S-Adhäsin bezeichnete Protein, das für -Sialin- β-2,3-Galactosylsaccharide spezifisch ist. Die meisten uropathogenen E. coli weisen jedoch ein -Galactosyl- 1,4-β-Galactosyl-spezifisches Adhäsin, das als P-Adhä sin bezeichnet wird, auf. Die Sequenz dieses Proteins wurde bereits von Lund et al. postuliert (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5898-5902), konnte jedoch bisher nicht bestätigt werden. Eine Gewinnung des Proteins war bisher nicht möglich.

Da Harnwegserkrankungen weit verbreitet sind und ande rerseits nur durch unspezifische Antibiotikabgaben be handelt werden können, war es wünschenswert, das Pro tein, mit dem sich die E. coli-Bakterien anheften, zu isolieren, um auf diese Weise eine Möglichkeit der Diagnostik und Therapie von Harnwegsinfektionen zu schaffen.

Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, um das P-Adhasin zu isolieren. Weiterhin war es Aufgabe der Erfindung, eine Möglichkeit zur Diagnose und Behandlung von durch uro pathogene E. coli-Bakterien verursachten Harnwegsinfek tionen zu finden.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Gewinnung von P-Adhäsin aus, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

1) einen uropathogenen E. coli-Stamm züchtet,
2) die erhaltene Bakteriensuspension auf eine Tempera tur im Bereich von 60 bis 70°C erhitzt oder mit einer detergenshaltigen Lösung inkubiert und anschließend die festen Bestandteile von der flüssigen Phase trennt,
3) den Fimbrien-Adhäsion-Komplex enthaltenden Über stand erhitzt auf eine Temperatur im Bereich von 60 bis 80°C in Gegenwart eines zwitterionischen Detergenzes bei einem pH im Bereich von 7 bis 9,
4) in der Lösung vorhandene Fimbrien-Anteile mit Lithiumchlorid ausfällt und
5) im Überstand enthaltenes P-Adhäsin an einem Anionen austauscher in Gegenwart von Harnstoff aufreinigt.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelingt es, das P-Adhäsin bzw. die beiden Verbindungsstücke, die das P-Adhäsin mit dem Fimbrium verbinden und auch immunolo gische Aktivität aufweisen, aus E. coli zu isolieren.

Im folgenden soll unter P-Adhäsin sowohl das P-Adhäsin selbst, als auch die beiden Verbindungsstücke, die als papE und papF bezeichnet werden und das P-Adhäsin mit den Fimbrien verbinden, verstanden werden.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verfügung ge stellt, mit dem das P-Adhäsin aus uropathogenen E. coli-Bak terien isoliert werden kann. Dazu werden die E. coli in an sich bekannter Weise gezüchtet. Praktisch jeder uropathogene E. coli-Stamm besitzt das P-Adhäsin und kann daher nach an sich bekannten Methoden gezüchtet werden. Bevorzugt werden E. coli-Stämme verwendet, die durch gentechnologische Manipulation das P-Adhäsin besonders stark exprimieren, da dann eine höhere Aus beute erreicht werden kann.

Die Bakterien werden auf bekannten Nährböden gezüchtet. Bevorzugt erfolgt die Züchtung auf festen Nährböden. Bei Züchtung in Flüssignährböden bilden sich neben den das P-Adhasin tragenden Fimbrien noch Fimbrien vom Typ 1, die bei der Aufarbeitung stören. Bei einer Züch tung auf festen Nährböden tritt diese Störung nicht auf und die Ausbeute an P-Adhäsin tragenden Bakterien ist höher.

Die erhaltene Bakteriensuspension wird erhitzt auf eine Temperatur im Bereich von 60 bis 70°C. Die Erhitzung erfolgt bevorzugt in einer annähernd isotonischen Kochsalzlösung, d.h. einer Lösung, die ca. 60 bis 90 mmol/l Natriumchlorid enthält. Die Dauer der Er hitzung ist nicht kritisch und wird so ausgewählt, daß alle Fimbrien von den Bakterien getrennt werden. Dies ist in der Regel nach einem Zeitraum von ca. 20 bis 50 Minuten der Fall. Anschließend an die Erhitzung wer den die feste Phase und die Lösung voneinander getrennt. Die feste Phase enthält die Bakterien sowie Debris, der Überstand enthält den Fimbrien-Adhäsin-Komplex. Die Ab trennung erfolgt durch an sich bekannte Maßnahmen wie Filtrieren oder Abzentrifugieren.

Der erhaltene Überstand wird weiter verarbeitet. Im nächsten Schritt erfolgt die Trennung des Fimbrien-Ad häsin-Komplexes in Fimbrienanteile und P-Adhäsin (ein schließlich der beiden Verbindungsstücke). Dazu wird die den Fimbrien-Adhäsion-Komplex enthaltende Lösung mit einem zwitterionischen Detergens versetzt und auf eine Temperatur im Bereich von 60 bis 80°C erhitzt. Dieser Temperaturbereich muß eingehalten werden, da bei zu niedriger Temperatur die Dissoziation des Komplexes nicht in ausreichendem Maße abläuft und bei zu hohen Temperaturen die Aktivität des P-Adhäsins verloren geht. Die Erhitzung wird so lange durchgeführt, bis sich Fimbrien und P-Adhäsin getrennt haben. Dies ist in der Regel nach 20 bis 60 Minuten der Fall. Das zwitter ionische Detergens wird bevorzugt in einem Verhältnis von Protein zu zwitterionischem Detergens von 10:1 bis 1:1 eingesetzt. Bevorzugt wird als zwitterionisches Detergens Zwittergent 3-16 (vertrieben von Calbiochem) verwendet.

Die Lösung kann weiterhin noch abgepuffert sein mit einem geeigneten Puffer wie z.B. Tris-Puffer.

Durch diese Behandlung erfolgt die Dissoziation des Komplexes in Adhäsin und Fimbrien. Nach Abkühlen der Lösung kann der Fimbrienanteil, der durch Zugabe von Lithiumchlorid ausgefällt wird, in an sich bekannter Weise abgetrennt werden, z.B. durch Filtrieren oder Abzentrifugieren. Im Überstand sind das P-Adhäsin und die Verbindungsstücke papE und papF sowie weitere Proteine enthalten.

Der Überstand enthält neben den gewünschten Proteinen noch Membran-Proteine und Endotoxine, die noch abge trennt werden müssen. Dazu wird die Lösung mit Harnstoff versetzt und über ein Anionen-Austauscherharz gegeben, wobei P-Adhäsin und papE und papF gebunden werden. Die Trennung der Proteine erfolgt in an sich bekannter Weise, bevorzugt unter Verwendung von HPLC oder FPLC. Die Elution erfolgt in einer Pufferlösung, unter Anwen dung eines Lithiumchlorid-Gradienten, wobei die Lithium konzentration bis zu 1 M ansteigt. Dabei werden P-Adhä sin, papE und papF nacheinander abgelöst. Die Frak tionen, die Proteine enthalten und Erythrozyten agglu tinieren, werden gesammelt, gegen 50 mmol Ammoniumbi carbonat dialysiert und anschließend lyophilisiert. Das so erhaltene reine P-Adhäsin bzw. reine papE oder papF ist begrenzt wasserlöslich und bei -20°C sehr lange haltbar.

In einer bevorzugten Ausführungsform, die eine noch höhere Reinheit des Produktes liefert und insbesondere zur Abtrennung von Lipiden und Lipopolysacchariden dient, wird zwischen dem zweiten und dritten Schritt noch ein Aufreinigungsschritt eingeschaltet. Dazu wird aus dem im zweiten Schritt erhaltenen Überstand mit Ammoniumsulfat in Gegenwart von Glycin und EDTA der Fimbrien-Adhäsin-Komplex ausgefällt und abgetrennt. Der erhaltene Niederschlag wird anschließend wieder aufge löst und kann dann nochmals zur weiteren Reinigung mit Lithiumchlorid präzipitiert werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform, die zu hochreinen Produkten mit einer Reinheit von 99% führt, wird dieser Nieder schlag in Tris-Puffer unter Zugabe eines Gallensäure salzes suspendiert und anschließend auf ca. 50 bis 70°C über einen Zeitraum von 20 bis 60 Minuten lang erhitzt. Anschließend wird der Fimbrien-Adhäsin- Komplex nochmals mit Lithiumchlorid ausgefällt und der Niederschlag abgetrennt. Der Niederschlag wird dann nach Aufnahme in gepufferter wäßriger Lösung für die dritte Stufe des Verfahrens verwendet.

Das Protein P-Adhäsin befindet sich nicht nur auf den Fimbrien der E. coli-Bakterien, sondern ist auch in der Zellwand enthalten und kann von dort in sehr hoher Aus beute gewonnen werden. Dazu erfolgt in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver fahrens die Aufarbeitung in abgeänderter Form. Es werden wiederum E. coli-Bakterien bevorzugt auf festem Medium gezüchtet. Um nun auch das P-Adhäsin aus der Zellwand zu lösen, wird diese Bakteriensuspension zu erst mit einer detergenshaltigen Lösung bei Raumtempera tur inkubiert. Bevorzugt wird hierzu Octylglukose in einer Konzentration von 0,1 bis 1% verwendet. Außerdem enthält die Lösung vorzugsweise noch 0,1 bis 1% phos phatgepufferte Kochsalzlösung. Wesentlich für die Herauslösung des P-Adhäsins ist es, daß eine Bakterien konzentration von ca. 0,1 bis 1 g Feuchtbakterien pro ml eingehalten wird. Bei höherer Konzentration wird das P-Adhäsin nicht quantitativ herausgelöst und bei zu geringer Konzentration ist das Verfahren unwirtschaft lich. Die Inkubation wird über einen Zeitraum von 20 bis 60 Minuten durchgeführt. Bei einer geringeren Dauer ist wiederum die Herauslösung nicht quantitativ, während eine längere Inkubation keine verbesserten Ergebnisse mehr bringt.

Nach Abtrennen der festen Phase von der Lösung befindet sich die P-Adhäsin-Fimbrien-Adhäsin-Komplex-Mischung im Überstand. Falls die Gewinnung hochreiner Produkte angestrebt wird, kann wiederum fakultativ ein Zwischen reinigungsschritt eingeschaltet werden, wobei aus dem Überstand mit Ammoniumsulfat die gewünschte Fimbrien-Ad häsin-Komplex-Adhäsin-Mischung ausgefällt wird. Bevor zugt wird hier EDTA in Kombination mit Glycin der Lösung vor der Präzipitation zugesetzt. Anschließend wird dann der Niederschlag in Wasser aufgenommen und nach Dialyse gegen eine Pufferlösung, bevorzugt Tris-Puf ferlösung mit einem pH von ca. 8 dialysiert zur Entfer nung noch vorhandenen Detergenzes. Aus der erhaltenen, gegebenenfalls gereinigten Lösung erfolgt dann eine Präzipitation mit Lithiumchlorid. Nach Abtrennung des Niederschlags von der überstehenden Lösung befindet sich im Niederschlag Fimbrien-Adhäsin- Komplex, während im Überstand das aus der Zellwand stammende P-Adhäsin enthalten ist. Der Überstand kann dann, wie bei der 5. Stufe der Gewinnung des P-Adhäsins aus den Fimbrien aufgereinigt werden durch Chromatographie an Anionen austauscherharz und Elution mit Pufferlösung mit einem Lithiumchlorid-Gradienten. Das Sediment, das Fimbrien-Ad häsin-Komplex enthält, kann aufgearbeitet werden wie bei der Gewinnung des Fimbrien-P-Adhäsins ab der 3. Stufe beschrieben.

Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform des erfindungs gemäßen Verfahrens wird eine sehr hohe Ausbeute erhalten.

Das so gewonnene P-Adhäsin kann vielfältig zur Diagnose und Therapie von Harnwegsinfektionen verwendet werden. Daher ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung die Verwendung des P-Adhäsins zur aktiven Immunisierung und zur Herstellung von Anti-P-Adhäsin-Antikörpern.

Die Immunisierung erfolgt dabei in an sich bekannter Weise, indem P-Adhäsin gegebenenfalls zusammen mit einem geeigneten Adjuvans injiziert wird. Auf diese Weise wird eine Immunantwort und die Bildung von Anti-P-Ad häsin-Antikörpern, die mit den uropathogenen E. coli-Stäm men bindefähig sind, ausgelöst.

Ebenso kann das erfindungsgemäß hergestellte P-Adhäsin zur Herstellung von Antikörpern gegen P-Adhäsin verwen det werden. Auch hierzu wird wiederum P-Adhäsin gegebenen falls zusammen mit einem geeigneten Adjuvans einem zur Bildung von Antikörpern geeigneten Organismus injiziert. Die Injektion kann gegebenenfalls wiederholt werden. Auf diese Weise kann ein Antiserum, das polyklonale Antikörper enthält, gewonnen werden. Dieses Antiserum kann entweder in der gewonnenen Form zur passiven Immu nisierung oder für die Diagnostik eingesetzt werden. Ebenso können aus dem Antiserum monoklonale Antikörper in an sich bekannter Weise gewonnen werden.

Ein so erhaltenes Antiserum kann zur Therapie von Harn wegsinfektionen verabreicht werden. Die Antikörper bin den sich spezifisch an die p-spezifischen Oberflächen proteine der uropathogenen E. coli-Bakterien und verhin dern damit die Anheftung dieser Bakterien an der Schleimhaut, so daß einer aufsteigenden Infektion früh zeitig Einhalt geboten werden kann.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Zellinie mab-F7₁-G : 6B10, die unter der Nummer 88092705 bei ECACC hinterlegt wurde und die monoklonale Antikörper produ ziert, die sehr spezifisch mit P-Adhäsin binden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des P-Adhäsins bzw. der gleichfalls gewonnenen Proteine papE oder papF zur Diagnose von Harnwegsinfektionen. Hierzu wird das P-Adhäsin bzw. papE oder papF in einem immunologischen Verfahren zum Nachweis von Anti-P-Adhä sin-Antikörpern verwendet. Verfahren zum immunologischen Nachweis sind an sich bekannt und bedürfen hier keiner näheren Erläuterung. Geeignet sind beispielsweise homo gene oder heterogene Immunoassays unter Verwendung von markiertem und/oder festphasengebundenem oder immobili sierbarem P-Adhäsin.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Anti-P-Adhäsin-Antikörpern zum Nachweis von E. coli-Bak terien. Der Nachweis erfolgt mit einem immunologischen Verfahren, wie es an sich bekannt ist, unter Einsatz von durch Immunisierung mit P-Adhäsin gewonnenen P-Adhä sin-Antikörpern. Auf diese Weise kann in Körperflüssig keiten bestimmt werden, ob E. coli-Bakterien, die das P-Adhäsin besitzen, vorhanden sind. Da praktisch alle E. coli-Bakterien, die P-Adhäsin an ihrer Oberfläche tragen, uropathogen sind, kann mit diesem Verfahren eine von einem E. coli-Stamm hervorgerufene Harnwegsin fektion diagnostiziert und dann gegebenenfalls durch Geben von mit P-Adhäsin gewonnenem Antiserum bekämpft werden.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, mit dem in sehr hoher Reinheit P-Adhäsin bzw. die eben falls immunologisch aktiven Verbindungsstücke papE und papF isoliert werden können. Die Verwendung des P-Adhä sins und der Verbindungsstücke ist für die Diagnose und Therapie von Harnwegsinfektionen besonders geeignet. Es wird daher auch ein Verfahren zur Diagnose und Therapie von Harnwegsinfektionen zur Verfügung gestellt.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert:

Beispiel 1

Es wurde P-Adhäsin aus dem Fimbrien von E. coli′s iso liert. Dazu wurde ein uropathogener E. coli-Klon, der ein Gen für die Expression von Fimbrien und P-Adhäsin enthielt und unter der Bezeichnung K-12(HB101)pDAL201B bei David A. Low/Medical Center, University of Utah, Salt lake City erhalten wurde, auf Loeb-Agar, der 0,1% Glucose und 100 µg/ml Ampicillin enthielt, als Nährme dium gezogen. Die erhaltene Bakteriensuspension wurde in 75 mmol/l Natriumchlorid 30 Minuten auf 65°C erhitzt. Dabei trennten sich die Fimbrien von den Bakterien. Die erhaltene Aufschlämmung wurde abzentrifugiert, wobei Bakterien und Debris im Sediment blieben, während die Fimbrien, auf denen das P-Adhäsin sitzt, sich im Über stand befanden. Der Überstand wurde anschließend mit Ammoniumsulfat bis zur 10%igen Sättigung sowie mit 20 mmol/l Glycin und 5 mmol/l EDTA versetzt. Dabei wurde Fimbrien-Adhäsin-Komplex ausgefällt. Durch Abzen trifugieren erhielt man den gewünschten Niederschlag.

Der Niederschlag wurde in 50 Vol-% Ethanol aufgelöst und Fimbrin-Adhäsin-Komplex nochmals mit Lithiumchlo rid mit einer Konzentration von 250 mmol/l ausgefällt. Der nach Zentrifugation erhaltene Niederschlag wurde suspendiert in 10 mmol/l Tris-Pufferlösung (pH 7,8) unter Zugabe von 0,5% Deoxycholat. Die Suspension wurde 30 Minuten auf 60°C erhitzt. Anschließend an die Erhitzung wurde Fimbrien-Adhäsin-Komplex mit Lithium chlorid einer Konzentration von 250 mmol/l ausgefällt und der Niederschlag wiederum abgetrennt.

Zur Trennung des Komplexes in Adhäsin und Fimbrien wurde der Niederschlag wiederum in 10 mmol/l Tris-Puf fer mit einem pH von 8 aufgenommen und es wurden die ser Lösung Zwittergent 3-16 zugegeben, so daß die Kon zentration dieses zwitterionischen Detergenzes 0,5% war. Das entspricht einem Verhältnis von Protein zu Zwittergent von 5:1. Diese Mischung wurde dann 30 Minu ten lang auf 80°C erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtempe ratur wurden die Fimbrien abzentrifugiert und der Über stand weiter aufgereinigt.

Um die gewünschten Proteine P-Adhäsin bzw. papE und papF in das gewünschte Lösungsmittel zu überführen, wurde ein Lösungsmittelaustausch durchgeführt, indem die erhaltene Lösung an einer Fraktogel-Säule konzen triert, im Batch-Verfahren an DEAE-TSK-Gel absorbiert und mit 1 mol/l Lithiumchlorid das Rohadhäsin eluiert wurde. Das hierbei erhaltene Eluat wurde dann gegen 20 mmol/l Tris/20 mmol/l Glycin, 4 mol/l Harnstoff/0,05% Zwittergent 3-16 chromatographisch an einer Sephadex- Säule ausgetauscht. Die so erhaltene P-Adhäsin enthal tende Lösung wurde dann an einem Ionenaustauscherharz (PW5-DEAE-Säule) über HPLC aufgetrennt. Die Elution erfolgte mit einem Lithiumchloridgradienten bis zu 1 mol/l. Die Fraktionen, die Proteine enthielten und Erythrozyten agglutinieren konnten, wurden gesammelt, gegen 50 mmol/l Ammoniumbicarbonat dialysiert und lyophilisiert. Auf diese Weise wurde reines P-Adhäsin, reines papE und reines papF erhalten. Die Proteine sind begrenzt wasserlöslich und bei -20°C sehr lange haltbar. Auch nach wochenlanger Lagerung war kein Abfall der Aktivität zu erkennen.

Beispiel 2

Es wurde P-Adhäsin aus der Zellwand von E. coli-Bakte rien gewonnen. Dazu wurde derselbe E. coli-Stamm wie im Beispiel 1 gezüchtet. Die Bakterien wurden mit 0,5% PBS, das 0,5% Octylglucose enthielt, 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Bakterien wurden mit einer Konzentration von ca. 1 g Feuchtbakterien pro 3 ml eingesetzt. Nach Abzentrifugieren der Mischung wurde der Überstand weiterbearbeitet. Der Überstand enthielt sowohl P-Adhäsin aus der Zellwand der aufge arbeiteten Bakterien als auch Fimbrien-Adhäsin-Komplex von der Oberfläche der Bakterien. Dem Überstand wurde dann Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 20% sowie EDTA und Glycin zugesetzt. Das nach Abzentrifu gieren erhaltene Sediment wurde dann in Wasser aufge nommen, gegen 10 mmol/l Tris-Pufferlösung mit einem pH von 8 zur Entfernung der Octylglucose dialysiert und anschließend mit Lithiumchlorid bis zu einer Endkonzen tration von 500 mmol/l präzipitiert. Mit Lithiumchlorid wird Fimbrien-Adhäsin-Komplex ausgefällt, während P-Ad häsin im Überstand bleibt. Die Aufarbeitung des Sedi ments sowie des Überstandes erfolgt wie im Beispiel 1 beschrieben, wobei das Sediment durch Behandlung mit zwitterionischem Detergens weiterbehandelt wurde, während der Überstand durch Ionenaustausch-Chromato graphie weiterbehandelt wurde.

Auf diese Weise wird P-Adhäsin in großer Ausbeute (10 bis 15 mg/100 g Feuchtbakterien) mit einer Reinheit von ungefähr 99% erhalten.

Beispiel 3

Zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die gegen P-Adhäsin gerichtet sind, wurde gemäß Beispiel 1 gewon nenes P-Adhäsin aus E. coli 21614 (Nummer der Stamm sammlung des MPI für Immunbiologie, Freiburg) als Immunogen hergestellt. Durch Klonieren der Hybridoma zellen und Screening wurden Antikörper, die mit P-Ad häsin binden, hergestellt. Einige der erhaltenen mono klonalen Antikörper waren stark antiadhäsiv und inhibier ten die Adhärenz der P-Adhäsin enthaltenden Bakterien an humane Erythrozyten sowie deren Agglutination durch diese Bakterien. Der erhaltene monoklonale Antikörper reagierte sowohl mit P-Adhäsin, das gemäß Beispiel 1 erhalten wurde, als auch mit P-Adhäsin, das gemäß Beispiel 2 erhalten wurde.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von P-Adhäsin, dadurch gekennzeichnet, daß man

1) einen uropathogenen E. coli-Stamm züchtet,
2) die erhaltene Bakteriensuspension auf eine Temperatur im Bereich von 60 bis 70°C erhitzt oder mit einer detergenshaltigen Lösung inkubiert und anschließend die festen Bestandteile von der flüssigen Phase trennt,
3) den Fimbrien-Adhäsin-Komplex enthaltenden Überstand erhitzt auf eine Temperatur im Bereich von 60 bis 80°C in Gegenwart eines zwitterionischen Detergenzes bei einem pH im Bereich von 7 bis 9,
4) in der Lösung vorhandene Fimbrien-Anteile mit Lithiumchlorid ausfällt und
5) im Überstand enthaltenes Adhäsin an einem Anionenaustauscher in Gegenwart von Harnstoff aufreinigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der uro pathogene E. coli-Stamm auf festem Nährboden gezo gen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem im zweiten Verfahrensschritt erhal tenen Überstand zuerst in Gegenwart von Glycin und EDTA der enthaltene Fimbrien-Adhäsin-Komplex mit Ammoniumsulfat ausgefällt wird und anschließend in einer wäßrigen Lösung, die in einem pH-Bereich von 7 bis 9 gepuffert ist, gelöst wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im dritten Schritt als zwitterionisches Detergens ein Zwittergent-Detergens verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im dritten Schritt das zwitterionische Detergens in einem Verhältnis von Protein zu Detergens im Bereich von 10:1 bis 1:1 eingesetzt wird.

6. Verfahren zur Gewinnung von P-Adhäsin, dadurch gekennzeichnet, daß man

1. einen uropathogenen E. coli-Stamm züchtet,
2. die erhaltene Bakteriensuspension mit einer Bakterienkonzentration von 0,1 bis 1 g Feuchtbakterien pro ml mit einer detergenshaltigen Lösung inkubiert und anschließend die festen Bestandteile von der flüssigen Phase trennt,
3. der erhaltenen Lösung Lithiumchlorid zusetzt und den Niederschlag vom Überstand abtrennt und
4. die Lösung nach dem Verfahren von Anspruch 1, Stufe 3 bis 5 weiterbehandelt.

7. Verwendung des P-Adhäsins zur aktiven Immunisie rung gegen pathogene E. coli-Bakterien.

8. Verwendung des P-Adhäsins zur Erzeugung von Anti körpern, gegen die Oberfläche pathogener E. coli- Bakterien.

9. Verfahren zum Nachweis spezifischer Erreger von Harnwegsinfektionen, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer Körperflüssigkeit uropathogene E. coli unter Verwendung eines Antikörpers, der durch Immuni sierung eines geeigneten Organismus mit P-Adhäsin erhalten wurde, in einem immunologischen Verfahren nachweist.

10. Zellinie mab-F7₁-G : 6B10, ECACC Nr. 8 8092 705.

11. Verfahren zum Nachweis von Harnwegsinfektionen, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer Körperflüssigkeit gegen E. coli gerichtete Antikörper in einem immunologischen Verfahren unter Verwendung von P-Adhäsin nachweist.