JPS62211559A - 歯根膜病の原因となる微生物の同定に有効なモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この研究は、ナショナル・インスチチュート・オブ・ヘ
ルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ
　１ｌｅａｌｔｈ）のベリオドンタル・デシーズ・クリ
ニカル・センター（Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ　Ｄｉｓｅ
ａｓｅ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ）にて、政府
の支援のもとに行なわれた（グランド番号ＤＥ０４８９
８） 〔産業上の利用分野〕 本発明は、モノクローナル抗体及び抗原に関係しており
、また、ヒトの歯根膜病の病因にかかわる、ある特殊な
微生物の存在及び濃度の検出への、上記抗体及び抗原の
使用に関係している。特別には、本発明は、バクテロイ
デス・ギンギバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ−ｇｉｎ
ｇｉｖａｌｉｓ）由来の抗原に特異的なモノクローナル
抗体に関係しており、一般には、成人の歯根膜病に関係
している。

〔従来の技術〕

歯肉及び歯肉下の歯垢中の、そのような細菌に特異的な
臨床的検定法は、歯根膜病の診断、歯根膜病治療の進行
度の評価及び、引きつづく回復試験での患者の状態の判
断に有効である。そのような微生物を同定する現在用い
られている標準的細菌学的技術は、時間がかかり、経費
が大きく、そして高度の熟練を必要とする。さらに、そ
のようなテストは、望ましい、あるいは必要される正確
さ、もしくは感度を満足しない結果を、与えることが多
い。最近、免疫診断検定技術の利用による、標準細菌学
的技術の改良もしくはこれに代替するものの開発に多く
の努力と提案がなされてきている。このような技術は、
検定すべき抗原物質及び抗体によってできる、その成分
の１部が標識されている複合体の形成に基づくものであ
る。たとえば、標識は、１１！Ｓのような放射性元素（
放射性免疫沈降検定法）、蛍光性を有する物質（免疫蛍
光検定法）、エンザイムーリンクトーイムノソルベント
検定法（イライザ法）もしくは（イムノパーオキシデー
ス検定法）などによるものがあげられる。その複合体の
標識成分は、未結合の抗原もしくは抗体と区別して、複
合体を形成した標識抗原もしくは抗体を検出、あるいは
定性分析することを可能にする。

免疫検定法を使った典型的な競争の中で、テストされる
液体中の抗原物質は、既知量の標識抗原と、綴られた量
の抗体結合部位を争うことになる。

このように、抗体に結合する標識抗原の量は、試料中の
抗原量に反比例する。一方、典型的免疫測定法は標識抗
体を使用している。この検定法では、複合体にかかわる
標識抗体の量は、液体試料中の抗原物質の量と正比例す
る。

現在用いられている細菌学的検出技術をこえた実質的改
良法となりうる免疫診断技術ではあるが、まだまだ改良
すべき点が数多く残されている。例えば、現在使用され
ている免疫診断技術は、抗原及び抗体を未精製のまま使
用するために、種々の結果を生じることがよくある。例
えば、ヒトの口腔内には、３種の血清型のアクチノバチ
ルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓａｃｔｉｎｏｍｙｓｅｔｅｍｃｏｍｉ　ｔ
ａｎｓ）が存在することが知られているが、現在の免疫
診断技術では１種以上の血清型の未検出となることがし
ばしばある。同様に、ヒトの口腔内には少なくとも３種
のＢ、ギンギバリス（ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の血清型
変異体が存在し、それぞれ毒性が異なるので、他の方法
よりも、免疫学的方法によるＢ、ギンギバリス（ｇｉｎ
ｇｉｖａｌｉｓ）の血清型変異体（３８１株に代表され
るＡ群、及びＷＳＯ株及び５ＡＣ７Ａ１−２８株に代表
されるＢ群）の同定は、その検出や定量にかなり利点が
あると言うことができるが、現在の方法では、これらを
区別するには至っていない。歯根膜病の測定に現在使用
されている免疫診断技術は、一般に正確性、感度、及び
特異性に欠ける。

モノクローナル抗体は、既知の技術により作られる単一
のタンパク質と定義することができる。

モノクローナル抗体を作る基本技術は、コラ−（Ｋｏｈ
ｌｅｒ）とミルシュタイン（旧１ｓｔｅｉｎ）が腹水リ
ンパ細胞と、骨髄−次腫瘍の悪性細胞（骨髄腫）とをう
まく融合させた後の１９７０年代中半に開発された（ミ
ルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　、サイエンティフ
ィック・アメリカン（Ｓｃｉ、　Ａｍ、）　　２４３巻
４号６６〜７４頁（１９８０年））。モノクローナル抗
体は単一の特異的抗原決定因子（化学構造）を認識する
。

抗原はいくつかの決定因子をもちうる。このように、も
し１つのモノクローナル抗体かつかわれるなら、同じ決
定因子が異なる抗原もしくは分子に存在しうろことから
、免疫診断テストは特異性をかくことになり、また、単
一の抗原がくり返し、決定因子を含むようなときは、誤
った測定値を読みとることになる。従来法で作られた抗
原は典型的には多くの決定因子をもつ。本発明以前は、
この問題を解くべく努力は、ことごとく不成功に終った
。複合体中の望ましい分子もしくは構造を認識し、かつ
無関係又は望ましくない複合体中の同じ決定因子は認識
しないモノクローナル抗体の生産が非常の望まれている
。本発明は、歯根膜病とかかわる微生物に対し特異的な
抗原を提供し、これらの抗原のみを認識するモノクロー
ナル抗体、特に、このような抗原をもつ特異内挿又は株
を認識するモノクローナル抗体を供給する。このように
、本発明は、種々の免疫診断検定法の正確性を実質的に
改良する手段を提供している。

〔発明の詳細な記述〕

ヒトの歯根膜病の病因には、特殊な微生物が非常に関連
しており、バクテロイデス・ギンギバリス（Ｂａｃｔｅ
ｒｏｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）はしばしば成人
の歯根膜炎に関係している。本発明のモノクローナル抗
体は、このバクテロイデス・ギンギバリス（Ｂａｃｔｅ
ｒｏｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の特異的なもの
である。

本モノクローナル抗体は、緩衝化食塩水及び保存剤のよ
うな、好ましくは液体の不活性担体を含む試薬として主
に使用される。その担体組成は、適当に細菌を分散させ
、かつ、抗原や補助成分の活性を保存するよう選択する
。Ｂ、ギンギバリス（ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）のような
自己分解酵素を多量に生産する細菌の検出には、適切な
担体の選択も重要な要因となる。

本発明のモノクローナル抗体は歯肉又は歯肉下血清中の
抗原をテスト及び識別するのに有効である。このテスト
及び識別法は、病巣又は他の部位由来の細菌斑試料をバ
クテロイデス・ギンギバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ
　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）上の単一抗原に特異的な既知
量のモノクローナル抗体と接触させ、ひきつづき、形成
した抗原−抗体複合体の数を測定するステップを含んで
いる。

本発明に有効なモノクローナル抗体は、ミルシュタイン
（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）とコラ−（Ｋｏｈ　Ｉｅｒ）によ
り、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　２５６巻、４９５
〜９７頁（１９７５年）に報告された方法により得るこ
とができる。その方法の詳細は、この分野ではよく知ら
れているものである。基本的には、その方法は、免疫原
をネヅミか他の適当な動物に注射して行なわれる。ひき
つづき、その動物を殺し、その腹水から細胞を取り出し
て、骨髄細胞と融合させる。その結果生じた細胞は、試
験管内で増殖するハイブリッド細胞、ハイブリドーマで
ある。ハイブリドーマの集団を、抗原に特異的な単一抗
体を分泌する各クラスの分類するようスクリーニングを
行う。この方法で得られた個々の抗体種は、免疫原物質
により認識される特異的抗原部位に応答して生じた免疫
動物由来の単−Ｂ細胞の生産物である。うまく選択した
モノクローナル抗体は少な（ともモル当り、１０″リツ
トルの応答親和性、好ましときは、少なくともモル当り
１０ｑリツトルの親和性を有する。

〔本発明の詳細な記述と好ましい態様〕バクテロイデス
・ギンギバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｇｉｎｇｉｖ
ａｌｉｓ）の抗原 バクテロイデス・ギンギバリスは、非常に嫌気性の強い
微生物で、その培養は、サンプル・ディスパージョンを
通してのサンプリング、ブレーティング及び培養の間、
厳密な嫌気生活を必要とする。これらの理由から、臨床
試料中のＢ、ギンギバリス軸ｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の信
頼性のある定量は難かしい。一般に、バクテロイデス・
ギンギバリス（ＲａｃＬｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖ
ａｌｉｓ）は、発達する歯槽骨のロスを伴って、歯ａＩ
！嚢から単離する。その第１の口腔内の生態学的ニッシ
ユは歯根膜量であるらしい。

一連の、ヒトの口腔由来のバクテロイデス・ギンギバリ
ス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｔｖａｌｔｓ）
株に対する、ウサギの抗血清を用いて、Ｂ、ギンギパリ
ス（ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）は、バクテロイデス・アサ
ソカロリチカス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ａｓａｃｃ
ｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、バクテロイデス・メラニノ
ゲニカス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｍｅｌａｎｉｎｏｇ
ｅｎｉｃｕｓ）、バクテロイデス・レビイ（Ｂａｃｔｅ
ｒｏｉｄｅｓ　１ｅｖｉｉ）　、バクテロイデス・ロエ
シー（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　１ｏｅｓｃｈｉｔ）及
びバクテロイデス・インンターメデアス（Ｂａｃｔｅｒ
ｏｉｄｅｓ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）を含むその他の
黒色色素バクテロイデス（Ｂａｃｔｅ　−ｒｏｉｄｅｓ
）と比較すると、抗原的に独特のものである一組の抗原
をもつことが分った（ｃ，ムートン（Ｍｏｕｔｏｎ）　
等、アニュマル・マイクロバイオロジー（Ａｎｎ、　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　　（パスツール研究所）、１３
２Ｂ巻、６９〜８３頁、１９８１年）。また、そのよう
な抗原は、一連のその他のダラム陰性及びダラム陽性の
口腔内微生物には存在しないことが分った。Ｂ、ギンギ
バリス（ｇｉｎｇｉｖａ　Ｉ　ｉｓ）には毒性の異なる
、少なくとも２つの抗原型があり、ウサギの抗血清及び
モノクローナル抗体がそれらに対して準備される。血清
型ａは３８１株で代表され、血清型すはＷ２Ｏ、ＷＳ２
及び５ＡＣ７４１−２８で代表される。最後の株は、実
験的＊ｍ、形成において、非常に高い毒性を示す。本発
明のモノクローナル及びポリクローナル試薬は、バクテ
ロイデス・ギンギバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇ
ｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の免疫学的検出、及び特異的抗体
の使用による、毒性の異なる抗原的に異なる株の同定を
可能にする。

■−生 バクテロイデス・ギンギバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅ
ｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）に対するモノクローナル抗体
を作り、次の操作によってＢ、ギンギバリス（ｇｆｎｇ
ｉｖａｌｉｓ）の種々の抗原調整物との反応性に対しス
クリーニングを行った。ＢＡＬＢ／Ｃネヅミをバクテロ
イデス・ギンギバリス（ＢａｃＬｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓ）３８１株の細胞そのもので免疫化し
た。肺臓を取り出し、ポリエチレングリコール（Ｐ　Ｅ
　Ｇ　−１０００）を用いて、５Ｐ−２骨髄腫細胞と融
合した。望ましいハイブリッド細胞を培地にヒボキサン
チン−アミノプテリン−チミジンを加えることによって
選択した。マイクロプレートの各ウェル中に入れた生残
ったハイブリッドクローンを、抗原として、Ｂ、ギンギ
バリス（ｇｉｎｇｉｖａｌｔｓ）細胞そのものを使った
イライザ法を用いて、抗体産生能をテストした。全ての
クローンを、バクテロイデス・ギンギバリス（Ｂａｃｔ
ｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の細胞に対し
て検定を行い、３０個が、バクテロイデス・ギンギバリ
ス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）
細胞と反応し、一連の大多数のロ腔内ダラム陰性又はグ
ラム陽性生物とは、反応を起こさないことが分った。さ
らに、Ｂ、ギンギバリス（ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）特異
的クローンを、種々の調製物に対してテストし、そのモ
ノクローナル抗体が反応する抗原を特徴づけた。ここら
の中で、クローンＢＢＧ−１，ＢＢＧ−６゜ＢＢＣ−８
，ＢＢＧ−１０，８ＢＧ−１１及びＢＢＧ−１２は、高
い活性を有し、テストした全てのＢ、ギンギバリス軸ｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓ）と強く反応することが分った。さら
に、これらのクローンを、イムノプロット法及び５ＤＳ
−ＰＥＧＥを用いたウェスタン・プロット技術によりテ
ストを行ない、リボプロティン膜（ＬＰ）と反応するこ
とが分った。ＬＰは、エントキシンと区別されることが
判明した。これら６種のクローンをブリスクン・プライ
ムド・マイス（ｐｒｉｓｔａｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ　ｍ１
ｃｅ）に注射し、腹水液を調製し、得られた腹水液をテ
ストし、培養液と比較される様に反応させた。Ｌ　Ｉ）
抗原と反応する６種の全腹水モノクローナル抗体はＩｇ
Ｃ；２ｂアイソタイプである。

この一連の実験は、はとんどのＢ、ギンギバリス（ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓ）には見られるが、歯根膜炎患者の病
巣中の歯垢中に発見されるであろう他の口腔内微生物に
は、共有されていない特異的Ｂ、ギンギバリス（ｇ　ｉ
ｎｇ　ｉｖａ　１　ｉｓ）抗原ＬＰによるモノクローナ
ル抗体の産生へと導いた。同時に、本抗原は、他の微生
物により共有されていない独特な抗原決定因子を有して
おり、歯根膜病巣又は他の部位から取り出された細菌試
料中のＢ、ギンギバリス（ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の特
異的検出を可能にする。

もう−組のクローンは、毒性の異なるＢ、ギンギバリス
（ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の血？Ｒ型を区別する抗体を
生成した。このクローンは、血清学的抗原（ＳＡ）を指
図しており、クローンＢＢＧ−１２とＢＢＧ−４２と命
名した。Ｂ、ギンギバリス（ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の
“毒性”　（Ｗ２Ｏ）及び“弱毒性”　（３８１ｐ）株
とそれらとの反応性を表１に示した。

表　　　１ Ｂ、ギンギバリスの毒性株を判別するクローン（ａ）　
　Ｂ、ギンギバリスの代表株の細胞に関し、間接免疫蛍
光法により求めた。

ウェスタン・プロット技術により、他のクローンが、Ｂ
、ギンギバリス（ｇｉＢｉｖａｌｉｓ）の４２にフィン
プリア成分と反応することが分った。これら′のクロー
ン、ＢＢＧ−３０及びＢＢＧ−３１は４３に抗原である
Ｂ、ギンギバリス（ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）のフィンブ
リアに強い親和性を示し、間接免疫蛍光テストにおいて
、Ｂ、ギンギバリス（ｇｉｎｇｉ　−νａ　Ｉ　ｉｓ）
細胞と強く反応することが分った。また、それらの抗体
は、４３にフィンブリア抗原の各々に特有なものである
ので毒性株の区別に有効である。

ＬＰ、４３にフィンブリア及び血清型（ＳＡ）抗原を区
別できるクローンＢＢＧ−１２及びＢＢＧ−４２に対す
るこれらのモノクローナル抗体の、歯根膜病巣から取り
出された細菌を塗ったスライドの間接免疫蛍光テストへ
の使用は、バクテロイデス・ギンギバリス（Ｂ’ａｃｔ
ｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の細胞形態を
もつ微生物の細胞表面成分と、それら全てが反応し、歯
根膜病巣からの細菌塗布試料中に存在する多くの他の形
態生物とは反応しないことを示した。その反応は、Ｂ、
ギンギパリス（ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の純粋培養塗布
試料、又は、多くの他の口腔内微生物の純粋培養物と人
為的に混ぜ合せた、Ｂ、ギンギバリス（ｇｉｎｇｉｖａ
ｌｉｓ）の純粋培養塗布試料でみられたものと同一なも
のである。それ故、歯根膜病巣から取られた細菌試料の
このテストは、イライザ法、イムノプロット法、ウェス
タンプロット法、免疫蛍光法及びゲル沈降テストで確認
した特異性と一致した。

クローンＢＢＧ−１、ＢＢＧ−６、ＢＢＧ−８、ＢＢＧ
−１０、ＢＢＧ−１１、ＢＢＧ−１２、ＢＢＧ−３０、
ＢＢＧ−３１及びＢＢＧ−４２を単独もしくは組合せて
用いた免疫蛍光検定法は、多数の他の微生物の存在下で
、そのサスペンションの中のＢ、ギンギバリス（ｇｉｎ
ｇｉｖａｌｉｓ）独特の表面抗原を検出し、病巣から取
り出されたＢ、ギンギバリス（ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）
試料の検出及び定量に有効である。

クローンＢＢＧ−１、ＢＢＧ−６、ＢＢＧ−８、ＢＢＧ
−１０、ＢＢＧ−１１、ＢＢＧ−１２、ＢＢＧ−３０Ｓ
ＢＢＧ−９３１及びＢＢＧ−４２は、マイアミ・アン・
アーバー（Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ）、ジャクソン通り７８
８５、ビトロ・インターナショナル・インコボーレショ
ン（Ｖｉｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ＋　Ｉｎ
ｃ、）に保管、登録されている。

テ　　ス　　　１・ 本発明のモノクローナル抗体を一連の免疫学的検定法で
テストし、目的とする微生物の検出に対する特異性が示
された。このテストの中で、バクテロイデス・ギンギバ
リス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
）−。

抗体クローンＢＢＧ−１、ＢＢＧ−６、ＢＢＧ−８、Ｂ
ＢＧ−１０、ＢＢＧ−１１、ＢＢＧ−１２、ＢＢＧＨ−
１２、ＢＢＧ−３０，ＢＢＧ−３１、ＢＢ（、−４２を
、イムノプロット法、ウェスタンプロット法、イライザ
法、Ｆ−イライザ法及び免疫蛍光分析法に使用した。そ
の結果、上記クローンは、テストパネルからの他の微生
物に対しては、観察可能な反応性を示すことなしに、バ
クテロイデス・ギンギバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ
　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）に特異性を示すことが明らか
になった。本発明のモノクローナル抗体にみられるこの
ような特異性は、ネヅミ、ウサギ、ヤギ及びギニア豚由
来の人工のポリクロナール血清によく見られる、強く、
そして予測不能の交差反応とは、全く対照的である。

さらに、一般的に用いられている方法では、非常に高い
特異性を示すポリクローナル抗体を得ることができるけ
れども、ある特別なロットの採血物が涸渇したとき、他
のロフトのものを調製、吸収、及びテストしなければな
らず、そのときでさえ、新しいロットの結果が最初のロ
フトのものと一致いないことがある。必要とされる高い
力価と特異性をもつ、ポリクローナル抗体を調製するよ
う努力しなければならない。本発明のモノクローナル抗
体は、確実性と有効性において実質的利点を主張してい
る。本発明のハイブリドーマは、繰り返し継代培養され
ており、そして、ネヅミ中に多数の腹水液生じさせるこ
とが示されている。

九袋蛍人羅蓋延汰 臨床的研究は、バクテロイデス・ギンギバリス（Ｂａｃ
ｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）に対するモ
ノクローナル抗体を、これらの微生物の細菌培養物に使
用するにより行った。１０人の正常な成人及び１０人の
歯根膜炎患者を含む２０人の被検者をバクテロイデス・
ギンギバうス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖ
ａｌｉｓ）に対してテストした。表２に見られるように
、モノクローナル抗体クローン１３８Ｇ−１２を用いた
免疫蛍光顕微鏡法は、この微生物が、歯肉下歯垢中に少
数存在するときは特に、選択性もしくは非選択性培地中
での細菌培養物中のバクテロイデス・ギンギパリス（Ｂ
ａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）をより
よく検出できるようである。このモノクローナル抗体は
、非選択性培地での培養によっては見い出すことのでき
ない、成人の歯根膜炎患者中の歯肉下歯垢試料中の微生
物を検出する。

その他の種特異的クローンを代表するモノクローナル抗
体（例えば、クローンＢＢＧ−１２）を用いた、Ｂ、ギ
ンギバリス輸ｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の検出のための間接
免疫蛍光顕微鏡法と、選択性及び非選択性培地における
培養には、ある相関関係があるようだ。この生物に対し
て、正確な結果を得るためには、その試料を輸送媒体中
で数分間、処理もしくは、保持しなければならない。生
育性輸送媒体（ＴＭ）は、約０．１から約０．２　Ｍの
塩化ナトリウム、約０．０１から約０．０３Ｍのリン酸
ナトリウム及び約０．５から約２．０重量パーセントの
ホルマリンから成り、ρ１１を約７．４に緩衝化されて
いる。

特に好ましいＴＭは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．
０２Ｍリン酸ナトリウム、２％ホルマリンからなり、ｐ
Ｈ７，４に調整されている。さもないと、抗原の劣化及
び凝集が起ってしまう。種々のバッファ系及び、パラホ
ルムアルデヒド及びグルチルアルデヒドのような保存剤
を含む他の多くの媒体が試されたが、ＴＭ程の有効性は
みられなかった。

我々の方法に従えば、病巣からの細菌試料は、ＴＭ中、
室温で６力月安定である。

表３は、Ｂ、ギンギバリス軸ｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が歯
肉下歯垢中に少数存在するときに、培養法より、免疫蛍
光顕微鏡法の方が、よりよく、この生物を検出できるこ
とを示している。歯肉下歯垢試料数で約２倍、選択性培
地もしくは非選択性培地での培養より、モノクローナル
抗体を使った免疫蛍光法の方が、Ｂ、ギンギバリス（ｇ
ｉｎｇｉｖａｌｉｓ）をとらえることができることを示
している。

非選択性培地での培養法と比べるとＢ、ギンギバリス（
ｇ　ｉｎｇ　ｉｖａ　１　ｉｓ　）の検出に対するモノ
クローナル抗体の感度は９２％であり、その特異性は８
８％、陽性テストの予想値は３８％であり、陰性テスト
の予想値は９９％であった。選択性培地での培養法と、
モノクローナル抗体を用いた免疫螢光顕微鏡法を比較す
ると、感度は９１％、特異性は８９％、陽性テストの予
想値は３５％及び陰性テストの予想値は９６％である。

歯肉下歯垢中のＢ、ギンギバリス（ｇｉｎｇｉｖａｌｉ
ｓ）の検出のための、モノクローナル抗体を用いた間接
免疫螢光ｒｊｒ４微鏡法は、ヒトの歯根膜病の診断に有
効である。理論的には何万個の細菌の中からさえも、１
つの非常に強く染色されたＢ、ギンギバリス（ｇｉｎｇ
ｉｖａｌｉｓ）細胞を検出することは可能なので、免疫
螢光検定法の感度は非常に大きい。

フローサイトメトリー 染色した微生物の数えあげは、手作業による読みとりと
計数によってなされるが、ＭＡのウェストウッドのオル
トーインスツラメント（０ｒｔｈ。

Ｉｎｓ　ｔｒｕｍｅｎ　ｔｓ）の製品であるサイトフル
オログラフを用いることによる免疫螢光法の自動化が客
観的で、迅速な微生物の計数を行なうことが可能である
ことが分った。画像解析の使用などのような自動化の他
の方法は、染色した特別な生物の割合を数え上げるのに
必要な労力を軽減するのに有効である。Ｂ、ギンギバリ
ス（ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）　、又はＢ、インターメデ
ィアス（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、もしくは、それら
双方の細菌試料（およそミリリットル当り、細菌１０”
個）を、リン酸緩衝食塩水で３回洗浄し、ペレット化し
、Ｂ、ギンギバリス（ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）　（クロ
ーンＢＢＧ−１２）に対するモノクローナル抗体を含む
６分の１希釈の腹水液１００マイクロリツトルに再懸濁
し、３７℃で３０分間インキュベートする。その細胞を
、ＰＢＳで３回洗浄し、ペレット化し、適正に希釈した
フッオレセイン結合ヤギ抗−ネヅミＩｇＧ溶液１００マ
イクロリットルに再懸濁し、３７℃で３０分間インキュ
ベートした。その細胞を再びＰ、ＢＳで３回洗浄し、ペ
レット化し、１ミリリツトルのＰＢＳに再懸濁し、５２
ミクロンメツシュのフィルターを備えた１８ゲージ針を
通した。その部分標本を、顕微鏡スライドガラス上に置
き、螢光顕微鏡による標識物の　定量を行った。他の部
分標本は、オルト（Ｏｒｔｈｏ）　５０　Ｈ・サイトフ
ルオログラフ（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｈ）を用
いたフローサイトメトリーによる評価をうけた。それら
の試料は、前述の輸送媒体中に保存することが必要であ
る。

フローサイトメトリーによる標識細菌の分析は、目的細
菌数の９５％以上が染色されることを示し、（表３）、
同様の試薬を用いた免疫螢光顕微鏡法との相関を示して
いる（表４）。マイルス（）Ｉｉ　Ｉｅｓ）結合物と細
菌とのインキュベージジンにより示される、非特異的染
色は６４．４％で、一方、細菌の自己螢光は、うまいこ
とに１．９％と低い。非特異的に染色した細胞の割合は
、正のコントロールと著しく異ならないが、ピークにお
ける種類が多く（ある特別な螢光強度の細胞が多数存在
する）、正と負のコントロール間の平均チャンネル値も
まちまちである。両方の負のコントロールは、チャンネ
ル８にピークを示している。正のコントロールのピーク
は、モノクローナル抗体の希釈率に応じて、チャンネル
１４と４１の間にあった。正の培養物の平均値は、平均
チャンネル強度５９．８から１３８．９の範囲にある。

適正なモノクローナル染色は、平均チャンネル強度９０
．７でピークチャンネル４１である１６分の１希釈と、
平均チャンネル強度１３７．９でピークチャンネル３９
の３２分の１希釈の間にある。

これらの試料の螢光顕微鏡分析（表４）は、正及び負の
コントロールには、若干のバリエーションがある。１６
分の１及び３２分の１希釈では、標識細菌の“３＋”反
応があった。

Ｂ、ギンギバリス輸ｉｎｇｉｖａｌｉｓ　）及びＢ、イ
ンターメディアス（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）の液体媒
体中の混合物のフローサイトメトリー分析は、種々の割
合の正の螢光を示し、免疫螢光顕微鏡法によってみられ
る目的細胞の数の（Ｂ、ギンギバリス（ｇｉｎｇｉｖａ
ｌｉｓ）対Ｂ、インターメディアス（ｉｎｔｅｒｍｅｄ
ｉｕｓ）　）の相対的変化と対応している。

（表６）例えば、第２の抗体で染色したＢ、ギンギバリ
ス（ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　）　、又は、両方の抗体で
染色したＢ、アサッカロリチカス（ａｓａｃｃｈａｒｏ
ｌｙｔｉｃｕｓ）のような、非特異的反応は、低い染色
強度を示す低１ビークチヤンネル（８５〜１１０）を有
する。

一方、５個の正の反応は、高いピーク値（３７６〜９８
６）を有する。それ故、フローサイトメトリー法では、
強い反応のみ（３００以上のピーク）を真の正の反応と
考えてよい。これがなされる時は、Ｂ、ギンギバリス軸
ｉｎｇｉｖａｌｉｓ　）及びＢ、アサフカロリチカス（
ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ＞の混合物がほぼ理
論的に予想されるように染色されている（表５の最後の
三行参照）。

５ＵＮＹ修正抗原捕獲イライザ法プロトコール上記のよ
うに洗浄 ↓ 上記のように洗浄 ↓ イライザ検定法の感度は、次の修正を行うことにより増
加し、ミリリットル当？５Ｘ１０’個体の範囲で微生物
を測定することができる。

１．０．０５％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用
い、細菌を分解し、可溶性の抗原を放出する。その可溶
性抗原を、イライザ法、Ｆ−イライザ法又はイムノプロ
ット法を用いて検定する。

（この処理は、生物検出最低限度レベルをミリリットル
当り１００万個から１０００個とすることにより、その
感度を１００倍増加させることが分った。） ２、　イライザ法及びＦ−イライザ法は、その細菌に特
異的なポリクローナル抗体（又は、他のモノクローナル
抗体）を、ウェルに吸着し、抗原を加え、さらに、アル
カリホスファターゼに結合する、モノクローナル抗体（
又は、第１ステツプでモノクローナル抗体を用いたとき
には、第２のモノクローナル抗体）に対する抗体を加え
る“抗原捕獲”法を用いて行った。検出感度はミリリッ
トル当り、１０４個体の範囲である。

３、螢光イライザ法の使用において、光吸着リガンド２
−ナフトイル２ルオロアセトンを加え、螢光イライザ法
における螢光性産物の生産をモニターすることにより、
およそもう１０倍その感度が増加する。

４、　アビジン又はストレプトアビジンとビオチンの使
用を含む、検出のための多重ステップの使用；アルカリ
・ホスファターゼと結合する、ヤギの抗・ネヅミＩｇＧ
サブクラス血清及びウサギの抗ヤギ血清を用いた“多層
サンドイッチ”これらの修正は、治療後や唾液中などの
、入手できる細胞が少ない場合、使用するのに必要な検
定感度を増加するのに有効である。例えば治療後、病巣
から回収できるのは、１０６個体が普通である。もしＢ
、ギンギバリス（ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）又はＡ、アク
チノミセテムコミタンス（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍ
−ｃｏｍｉ　ｔａｎｓ）が全細胞数の１％存在するなら
ば、正確な定量のためにミリリットル当り約１０４細胞
の感度が必要とされる。

本発明の標識化モノクローナル抗体は免疫測定法で用い
られるのと同じ標識で与えられよう。これらの中には、
米国特許３，９４０，４７５号で述べられている螢光測
定による検出のための螢光標識物、米国特許３，６４５
，０９０号に述べられている酵素的マーカー、もしくは
ネイチ−１，−（Ｎａｔｕｒｅ）　、１４４巻、９４５
頁（１９６２年）に、ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）とグリ
ーンウッド（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ）が報告した放射性同
位元素がある。

本発明は、液体中の結合した抗体の存在を測定する、こ
の分野でよく知られた種々のテスト操作の使用も考慮し
ている。そのようなテストは、抗原をその上にコートす
るポリ塩化ビニルやポリスチレンのようなプラスチック
表面、ガラス表面及びニトロセルロースの使用を含んで
いる。

本発明の抗体は、歯根膜病原の測定に用いられるモノク
ローナル抗体試薬中、他のモノクローナル抗体とともに
適切かつ効果的に使用することができる。例えば、一般
に、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（
Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔ
ｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）は、幼年性の歯根膜炎と関連し
ており、バクテロイデス・ギンギバリス（Ｂａｃｔｅｒ
ｏｔｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）は、成人の歯根膜
炎と関連しているが、好ましい方法によっては各患者に
おける両方の病原体に対するテストを行うことができよ
う。

サンプリング・キット 歯根膜生物の免疫学的診断におけるモノクローナル抗体
の臨床的使用のために、キットの形でのテスト手段は歯
肉下歯垢のサンプリングに便利であり、その検定を行う
参照標本ライブラリーにその試料を運ぶ有効な手段を与
える。標準化した試料採取操作を保証するために、キッ
トの中には、明確な説明書を備えていなければならない
。キットの中には、堅い取手のついた１５〜２０鰭の紙
片がうまく入っている。それらは、準備した歯肉下部位
に１０秒間置くという説明とともに、滅菌済の容器に入
れて供給される。

そのキットの重要な要素の１つは、輸送媒体（ＴＭ）で
ある。我々の研究は、Ｂ、ギンギバリス軸ｉｎｇｉｖａ
ｌｉｓ　）の抗原及びＡ、アクチノミセテムコミタンス
（ａｃｔｉｎｏＢｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）のもの
はある程度、水溶液バッファー中、室温に保存すること
で分解することが分っている。特に有効なＴＭは、約０
．５から約３．０重量パーセントのホルマリン、約０．
１から約０．２　Ｍ塩化ナトリウム及び約０．０１から
約０．０３　Ｍのリン酸ナトリウムを含にｐＨ約７゜２
に緩衝化された溶液であることが分った。この輸送媒体
は６ケ月までの間、抗原を保存できる。またこの媒体は
、紙片からの細菌の分散に適している。その結果、塊り
や凝集を最小限におさえた塗布試料の有効なサスベンジ
ンもしくは、免疫螢光分析のためのスライド又は、サイ
トフルオロメーター分析用の試料を作ることができる。

さらに、この媒体は、上述の媒体に０．０５％ＳＤＳを
加えた、イライザ法及び他の検定法のための生物の溶解
も行うことができる。

本発明の修正は、当業者にとって明白なもので　゛あり
、それ故、本発明は、特許請求の範囲によってのみ制限
される。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物バクテロイデス・ギンギバリス（Ｂａｃｔ
   ｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）に特異的な抗
   体を少なくとも１つ含有する病原体の存在及び相対的な
   数を測定するのに有効なモノクローナル抗体試薬。
2. （２）病原体が歯根膜炎病原体である特許請求の範囲第
   １項記載のモノクローナル抗体。
3. （３）微生物バクテロイデス・ギンギバリス（Ｂａｃｔ
   ｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）に特異的なモ
   ノクローナル抗体。
4. （４）歯肉液中のバクテロイデス・ギンギバリス（Ｂａ
   ｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の存在を
   確認する方法であって、 （ａ）上記病原体由来の選択された抗原物質を、上記各
   病原体に特異的なモノクローナル抗体と接触させて上記
   抗原物質と、上記モノクローナル抗体との複合体を形成
   する工程および （ｂ）上記形成複合体中の抗体量を測定することにより
   、上記複合体の量を測定する工程を含む方法。
5. （５）生物学的液体中のバクテロイデス・ギンギバリス
   （Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の
   存在を確認する方法であって、 （ａ）研究すべき生物学的液体の部分標本を提供する工
   程、 （ｂ）上記部分標本を、バクテロイデス・ギンギバリス
   の細胞表面上の個々の抗原決定因子に特異的な一定量の
   抗体と接触させる工程、及び （ｃ）上記抗体との交差反応が起ったかどうかを確認す
   る工程 を含む方法。
6. （６）抗体が標識され、かつその標識抗体が、与えられ
   た光学的刺激に対応するあらかじめ決められた蛍光を示
   す、特許請求の範囲第５項記載の方法。
7. （７）交差反応量を測定し、歯根膜炎病原体の存在を定
   量的に求める、特許請求の範囲第５項記載の方法。
8. （８）測定が、可溶化溶液によって、サスペンションを
   溶菌した後、イライザ法により行なわれる特許請求の範
   囲第５項記載の方法。
9. （９）約０．１から約０．２Ｍの塩化ナトリウム、約０
   ．０１から約０．０３Ｍのリン酸ナトリウム及び約０．
   ５から約２．０重量パーセントのホルマリンからなる、
   病原菌を保存するのに有効な輸送媒体。
10. （１０）病原体が歯根膜炎病原体である特許請求の範囲
    第９項記載の輸送媒体。
11. （１１）媒体がｐＨ約７．４に緩衝化された、特許請求
    の範囲第９項記載の輸送媒体。
12. （１２）媒体が約０．１５Ｍ塩化ナトリウム、約０．０
    ２Ｍリン酸ナトリウム及び約２重量パーセントのホルマ
    リンを含む、特許請求の範囲第９項記載の輸送媒体。