JP2009174871A - 免疫学的検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の課題は簡易、迅速、かつ高感度の免疫学的検出方法を提供することにある。
【解決手段】免疫学的検出方法であって、
ａ）検体または検体を含む試料に、酵素標識により修飾された検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第一の蛋白質（Ｙ）を作用させ、前記分析対象物および前記Ｙを含む複合体を形成させる工程、ｂ）前記工程において生じた前記複合体と分析対象物と複合体を形成しなかった前記標識を含む第一の蛋白質Ｙとを分離する工程、ｃ）前記複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を作用させる工程、および、ｄ）前記ＣＤおよび前記Ｃｐより生じた色素を検出する工程を有する。
【選択図】なし

Description

本発明は、分析対象物を含む試料を、簡易、迅速、高感度で検知することができる免疫学的検出方法に関する。特に発色反応を用いて高感度で分析対象物を検出する免疫学的検出方法に関する。

天然物、毒素、ホルモン、又は農薬等の生理活性物質又は環境汚染物質の中には、極微量で作用するものが非常に多い。従って、これらの物質の定性的及び定量的測定には、従来、高感度分析が可能な機器分析法が広く用いられてきた。しかし、機器分析法は、特異性が低く、試料の前処理工程を含め、分析に時間を要する上、操作が煩雑なため、近年要求されている迅速簡便測定目的には不都合である。一方、免疫学的測定法は、特異性も高く、操作も機器分析よりはるかに簡便であることから、生理活性物質又は環境汚染物質の測定分野に徐々に普及してきた。この中にはラテックス凝集法、ＲＩＡ法あるいはＥＩＡ法（酵素免疫測定法）といった免疫学的測定法があるが、ラテックス凝集法は必ずしも測定の迅速簡便性あるいは検出感度を満たすものではなく、ＲＩＡ法は標識物質に放射性同位元素を使用するので、特殊な環境が必要である。

酵素免疫測定法は、人体に対して危険性の少ない免疫測定法として開発され、種々の物質の測定系に利用されている。しかしながら、臨床化学分析においては、その測定対象が生体試料（主として血清、尿等）であり、その測定値は病態の診断又は経過観察等に用いられることが多く、そのためのより高感度及び高感度な測定の要求を比色法で完全に満足させることは難しい。この要求を満たすことを目的として化学発光酵素免疫法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。化学発光酵素免疫測定法は、酵素の触媒活性によって化学発光性物質が中間体を経て励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光量を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する測定対象物質の量を定量する方法である。この方法においては、化学反応により化学発光性物質を発光させるため光源が不要であり、光源に起因するバックグラウンドの上昇等がないため測定の高感度化が可能である。

しかしながら、ウイルスのような増殖する分析対象物の場合、より早い段階、すなわち感染初期の少ないウイルス量での検出が必要であり、さらに高感度で簡便な免疫学的検出方法が望まれていた。
特開２０００−１４６９６８号公報

本発明は、分析対象物を含む試料を、簡易、迅速、高感度で検知することができる免疫学的検出方法を提供することにある。

本発明の上記課題は、下記の手段により解決された。

＜１＞ 免疫学的検出方法であって、
ａ）検体または検体を含む試料に、酵素標識により修飾された検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第一の蛋白質（Ｙ）を作用させ、前記分析対象物および前記Ｙを含む複合体を形成させる工程、
ｂ）前記工程において生じた前記複合体と分析対象物と複合体を形成しなかった前記標識を含む第一の蛋白質Ｙとを分離する工程、
ｃ）前記複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を作用させる工程、および、
ｄ）前記ＣＤおよび前記Ｃｐより生じた色素を検出する工程を有することを特徴とする免疫学的検出方法。
＜２＞ 前記還元剤が下記一般式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする＜１＞に記載の免疫学的検出方法：

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３及びＲ_４はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を表し、Ｒ_５及びＲ_６はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、アシル基、又はスルホニル基を表し、置換基を有してもよく、またＲ_１とＲ_２、Ｒ_３とＲ_４、Ｒ_５とＲ_６、Ｒ_２とＲ_５、又はＲ_４とＲ_６とが互いに結合して５員〜７員の環を形成してもよい。）。
＜３＞ 前記Ｃｐが下記一般式（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｃ−３）、（Ｍ−１）、（Ｍ−２）、（Ｍ−３）、（Ｙ−１）、（Ｙ−２）および（Ｙ−３）よりなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を含有することを特徴とする＜１＞又は＜２＞に記載の免疫学的検出方法：

（式中、Ｘ_１は水素原子または離脱基を表し、Ｙ_１およびＹ_２は電子求引性の置換基を表し、Ｒ_１はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。）；

（式中、Ｘ_２は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_２はアシルアミノ基、ウレイド基またはウレタン基を表し、Ｒ_３は水素原子、アルキル基またはアシルアミノ基を表し、Ｒ_４は水素原子、または置換基を表す。Ｒ_３とＲ_４が互いに連結して環を形成してもよい。）；

（式中、Ｘ_３は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_５はカルバモイル基またはスルファモイル基を表し、Ｒ_６は水素原子または置換基を表す。）；

（式中、Ｘ_４は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_７はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ_８は置換基を表す。）；

（式中、Ｘ_５は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_９はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ_１０は置換基を表す。）；

（式中、Ｘ_６は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_１１はアルキル基、アリール基、アシルアミノ基またはアニリノ基を表し、Ｒ_１２はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。）；

（式中、Ｘ_７は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_１３はアルキル基、アリール基、又はインドレニル基を表し、Ｒ_１４はアリール基またはヘテロ環基を表す。）；

（式中、Ｘ_８は水素原子または離脱基を表し、Ｚは５〜７員の環を形成するのに必要な２価の基を表し、Ｒ_１５はアリール基またはヘテロ環基を表す。）；

（式中、Ｘ_９は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_１６、Ｒ_１７およびＲ_１８はそれぞれ置換基を表し、ｎは０〜４の、ｍは０〜５のいずれかの整数を表す。ｎまたはｍが２以上のとき、複数のＲ_１６およびＲ_１７はそれぞれ同一の基であってもよいし、異なる基であってもよい。）。
＜４＞ 前記複合体を形成する工程が、さらに検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第二の蛋白質（Ｘ）を含み、前記Ｙ、前記Ｘおよび前記分析対象物を同時にまたは段階的に作用させ、前記Ｘ、前記分析対象物および前記Ｙを含む複合体を形成する工程であることを特徴とする＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
＜５＞ 前記酵素がペルオキシダーゼであることを特徴とする＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
＜６＞ 前記分析対象物が抗原であり、前記分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質が抗体であることを特徴とする＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の免疫学的検出方法。
＜７＞ 前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする＜６＞に記載の免疫学的検出方法。
＜８＞ 前記分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質が不溶性担体に坦持されていることを特徴とする＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の免疫学的検出方法。

本発明により、試料中に含まれる分析対象物を、簡易、迅速、高感度で検知することができる免疫学的検出方法が提供される。特に増幅された発色反応を用いて分析対象物を高感度で検出する免疫学的検出方法が提供される。
本発明は、抗原抗体反応などの免疫学的反応を増幅して検出する手段として、酵素を利用し、さらに発色反応を誘導し発色した色を検知することにより、簡便に高感度で検出するものである。また、分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質の１つを基質に固定化して、クロマトグラフによりさらに簡便に高感度で検出することもできる。

本発明の免疫学的検出方法は下記の工程を含む。
ａ）検体または検体を含む試料に、酵素標識により修飾された検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第一の蛋白質（Ｙ）を作用させ、前記分析対象物および前記Ｙを含む複合体を形成する工程

本工程においては、分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質を標識化した第一の蛋白質（Ｙ）を準備する。分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質としては、抗原抗体反応を利用する場合、抗体が好ましく用いられる。
検体または検体を緩衝液などに分散した検体を含む測定用試料に、第一の蛋白質（Ｙ）を作用させると、抗原抗体反応などの特異的相互作用により分析対象物と第一の蛋白質（Ｙ）を含む複合体が形成される。

ｂ）前記複合体と前記複合体を形成していない前記第一の蛋白質（Ｙ）とを分離する工程
該分離工程は、前記形成された複合体を複合体を形成していない遊離の第一の蛋白質（Ｙ）から分離する工程である。即ち、該分離工程では検体中に存在する分析対象物の量に対応した量の複合体が分離される。

ｃ）前記分離された複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を作用させる発色工程
複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を作用させると、酵素標識が触媒となって、過酸化物を介した連鎖反応が起こり、還元剤が酸化され、還元剤の酸化体を生成する。続いて還元剤の酸化体と発色素材との発色反応が起こり、発色色素を生成する。生成する色素の量は、複合体量に依存するので、分析対象物の量に相当する。

ｄ）前記発色工程により生成した色素を検出する工程
生成した色素量は、公知の種々の手段により検出することができる。例えば、分析対象物の有無は、発色の有無を視覚的に官能評価することにより、瞬時に判定することができる。色素量を定量的に測定することも、濃度計、或いは分光光度計を用いて行うことが可能である。

該分離工程に用いることのできる複合体の分離手段としては、比重差を利用した遠心分離や超遠心分離法、溶解度差を利用して沈降法、塩析法、濾過法、透析法、限外濾過法、磁気を利用した分離法などの従来公知の分離手段を利用することができる。
本発明で特に有効な分離手段は、分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質を予めメンブレンあるいはクロマトグラフの固定層などの不溶性坦体上に固定化しておき、複合体を形成後、複合体を形成していない検体中の成分や検体試料作製に用いた成分等を洗浄して洗い流すか、あるいはクロマトグラフにより分離する方法である。

また、分離された他方の成分である遊離の第一の蛋白質（Ｙ）の量は、当初含有する第一の蛋白質（Ｙ）の量から複合体を形成した量を差し引いた量に相当するので、この量も検体中に存在する分析対象物の量を反映した量である。従って、複合体量及び遊離の第一の蛋白質（Ｙ）量のいずれも分析対象物の量の検出に利用することができる。高感度かつ簡便に検出するには、複合体を直接検出する手段が好ましい。

分離された複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を作用させる手段としては、過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）のそれぞれを含有するかもしくはこれらの２以上を混合して含有する溶液もしくは分散液の状態で作用させる方法を用いることができる。別の態様として、過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）の少なくとも１つを含有する発色シートを準備し、分離された複合体に該発色シートを重ね合わせて、該複合体と発色剤とを接触させ、発色反応を起こさせる方法である。好ましくは、発色シートが還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を含有し、過酸化物を含有する溶液を該重ね合わせ体に供給する方法である。

本発明においては、好ましくは、酵素標識がペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はグルオキシダダーゼである。特に好ましくは、前記酵素がペルオキシダーゼである。

本発明においては、発色反応には、好ましくは、還元剤の酸化体とカプラーのカップリング反応が用いられる。特に、有機銀塩を用いた熱現像記録材料中で熱現像により効率的にカップリング反応が可能な一般式（Ｉ）で表される還元剤と一般式（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｃ−３）、（Ｍ−１）、（Ｍ−２）、（Ｍ−３）、（Ｙ−１）、（Ｙ−２）および（Ｙ−３）よりなる群より選ばれる少なくとも１種のカプラーが好ましく用いられる。

本発明の好ましい態様は、さらに検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第二の蛋白質（Ｘ）を含み、該第二の蛋白質（Ｘ）を前記分析対象物および前記第一の蛋白質（Ｙ）に同時にまたは段階的に作用させ、前記Ｘ、前記分析対象物および前記Ｙを含む複合体を形成する工程を有する。

好ましくは、前記分析対象物が抗原であり、前記分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質が抗体である。より好ましくは、前記抗体がモノクローナル抗体である。
さらに本発明の好ましい態様は、前記第二の蛋白質（Ｘ）を不溶性担体に坦持し、クロマトグラフにより複合体を分離して検出するイムノクロマトグラフである。

本発明に利用できる免疫反応段階を構成する抗原抗体反応は任意であり、従来公知のいずれの反応も採用することができる。

本発明においては、分離工程に用いられる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管等の種々の形状で用いることができる。
さらに、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法は任意であるが、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。

また、本発明において用いられる抗体類（第一の蛋白質（Ｘ）、第二の蛋白質（Ｙ）は、分析対象によって適当なものを適宜用いることができる。ここで、抗体類としてモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれを使うことも可能であり、その形態としては全抗体又はＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ等の断片を用いることができる。また、抗体の起源は任意であるが、マウス、ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由来する抗体が好適に用いられる。第一の蛋白質および第二の蛋白質の両方または一方がモノクローナル抗体であること、又はＦ（ａｂ’）_２またはＦ（ａｂ’）であることが好ましい。

本発明の抗体とタンパク質との結合は、通常緩衝液中で行なわれる。ここに用いる緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に用いることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜１Ｍの範囲で用いるのが望ましい。また、反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることができる。

本発明における免疫学的検出方法は、分析対象物と該分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質との相互作用による複合体形成工程、該複合体の分離工程、分離された複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）及び発色素材（Ｃｐ）を作用させ発色させる発色工程を有する。複合体形成工程に要する温度及び時間は、用いられる分析対象物と蛋白質の組合せによって異なるが、概ね０℃〜５０℃で、１０秒〜１時間である。また、発色工程に要する温度及び時間は、用いられる複合体、還元剤（ＣＤ）及び発色素材（Ｃｐ）の組合せによって異なるが、概ね５℃〜６０℃で、３０秒〜３０分である。
複合体の分離工程は、分離方法によって、それぞれ好ましい工程所要時間が設定される。
発色の判定時間は任意であるが、上記発色工程の後に、発色濃度が高く維持され、発色が安定した時間を選択することが望ましい。発色の判定時間は、概ね発色工程の後、０〜２４時間が好ましく、より好ましくは０〜２時間、特に好ましくは０〜３０分である。発色工程の後の時間が長すぎると発色した色素の変色や退色が起こるので好ましくない。

（酵素）
本発明においては、抗原抗体反応などの免疫学的反応を増幅して検出する手段として、酵素を利用したものである。
酵素は、各種イムノアッセイの高感度検出を達成しうる反応（蛍光・発色・発光等）触媒として知られている。例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。本発明に於いては、過酸化物を介した連鎖反応を触媒的に誘起する酵素を用いることができ、ペルオキシダーゼが好ましい。その取扱性のよさや入手しやすさ等の点で、特に西洋わさびペルオキシダーゼが好ましい。

（過酸化物）
本発明に用いられる過酸化物は、過酸化水素の金属塩の化学式で表される無機過酸化物やペルオキソ酸化合物、又は過カルボン酸を有する有機過酸化物を用いることができ、過酸化水素又は過酸化水素を放出する化合物が好ましい。過酸化水素を放出する化合物としては過ホウ酸又は過炭酸等が好ましい。この中では過酸化水素が特に好ましい。使用する量は発色するＣｐに対して、同じモル数から１００万倍程度が好ましく。同じモル数から１万倍がさらに好ましい。

（還元剤）
本発明に用いられる還元剤は、その酸化体が発色素材とカップリングして色素を形成し得る還元剤（ＣＤ）である。

（還元剤：一般式（Ｉ）で表される化合物）
本発明に用いられる好ましい還元剤の１つの態様は、下記一般式（Ｉ）で表される還元剤である。

式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３及びＲ_４はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を表し、Ｒ_５及びＲ_６はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、アシル基、又はスルホニル基を表し、Ｒ_１とＲ_２、Ｒ_３とＲ_４、Ｒ_５とＲ_６、Ｒ_２とＲ_５、及びＲ_４とＲ_６の少なくとも一組は互いに結合して５員、６員又は７員の環を形成してもよい。

以下に、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物について詳しく説明する。Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３及びＲ_４はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を表す。Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３及びＲ_４で表される置換基としては、ハロゲン原子、アルキル基（シクロアルキル基、ビシクロアルキル基を含む）、アルケニル基（シクロアルケニル基、ビシクロアルケニル基を含む）、アルキニル基、アリール基、ヘテロ環基、シアノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、カルボキシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、シリルオキシ基、ヘテロ環オキシ基、アシルオキシ基、カルバモイルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシカルボニルオキシ、アミノ基（アニリノ基を含む）、アシルアミノ基、アミノカルボニルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、アリールオキシカルボニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、アルキル及びアリールスルホニルアミノ基、メルカプト基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ヘテロ環チオ基、スルファモイル基、スルホ基、アルキル及びアリールスルフィニル基、アルキル及びアリールスルホニル基、アシル基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、アリール及びヘテロ環アゾ基、イミド基、ホスフィノ基、ホスフィニル基、ホスフィニルオキシ基、ホスフィニルアミノ基、及びシリル基が挙げられる。

更に詳しくは、ハロゲン原子（例えば、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、アルキル基〔直鎖、分岐、環状の置換もしくは無置換のアルキル基を表す。アルキル基（好ましくは炭素数１から３０のアルキル基、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ｎ−オクチル、エイコシル、２−クロロエチル、２−シアノエチル、又は２−エチルヘキシル）、シクロアルキル基（好ましくは、炭素数３から３０の置換又は無置換のシクロアルキル基、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、又は４−ｎ−ドデシルシクロヘキシル）、ビシクロアルキル基（好ましくは、炭素数５から３０の置換もしくは無置換のビシクロアルキル基、つまり、炭素数５から３０のビシクロアルカンから水素原子を一個取り去った一価の基である。例えば、ビシクロ［１，２，２］ヘプタン−２−イル、ビシクロ［２，２，２］オクタン−３−イル）、更に環構造が多いトリシクロ構造なども包含する。

以下に説明する置換基の中のアルキル基（例えばアルキルチオ基のアルキル基）もこのような概念のアルキル基を表す。］、アルケニル基［直鎖、分岐、環状の置換もしくは無置換のアルケニル基を表す。アルケニル基（好ましくは炭素数２から３０の置換又は無置換のアルケニル基、例えば、ビニル、アリル、プレニル、ゲラニル、又はオレイル）、シクロアルケニル基（好ましくは、炭素数３から３０の置換もしくは無置換のシクロアルケニル基、つまり、炭素数３から３０のシクロアルケンの水素原子を一個取り去った一価の基である。例えば、２−シクロペンテン−１−イル、２−シクロヘキセン−１−イル）、ビシクロアルケニル基（置換もしくは無置換のビシクロアルケニル基、好ましくは、炭素数５から３０の置換もしくは無置換のビシクロアルケニル基、つまり二重結合を一個持つビシクロアルケンの水素原子を一個取り去った一価の基である。例えば、ビシクロ［２，２，１］ヘプト−２−エン−１−イル、ビシクロ［２，２，２］オクト−２−エン−４−イル）を含む］、アルキニル基（好ましくは、炭素数２から３０の置換又は無置換のアルキニル基、例えば、エチニル、プロパルギル、トリメチルシリルエチニル基）、又はアリール基（好ましくは炭素数６から３０の置換もしくは無置換のアリール基、例えばフェニル、ｐ−トリル、ナフチル、ｍ−クロロフェニル、又はｏ−ヘキサデカノイルアミノフェニル）、ヘテロ環基（好ましくは５又は６員の置換もしくは無置換の、芳香族もしくは非芳香族のヘテロ環化合物から一個の水素原子を取り除いた一価の基であり、更に好ましくは、炭素数３から３０の５もしくは６員の芳香族のヘテロ環基である。例えば、２−フリル、２−チエニル、２−ピリミジニル、又は２−ベンゾチアゾリル）、シアノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、カルボキシル基、又はアルコキシ基（好ましくは、炭素数１から３０の置換もしくは無置換のアルコキシ基、例えば、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−オクチルオキシ、又は２−メトキシエトキシ）、

アリールオキシ基（好ましくは、炭素数６から３０の置換もしくは無置換のアリールオキシ基、例えば、フェノキシ、２−メチルフェノキシ、４−ｔ−ブチルフェノキシ、３−ニトロフェノキシ、又は２−テトラデカノイルアミノフェノキシ）、シリルオキシ基（好ましくは、炭素数３から２０のシリルオキシ基、例えば、トリメチルシリルオキシ、ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）、ヘテロ環オキシ基（好ましくは、炭素数２から３０の置換もしくは無置換のヘテロ環オキシ基、１−フェニルテトラゾール−５−オキシ、又は２−テトラヒドロピラニルオキシ）、アシルオキシ基（好ましくはホルミルオキシ基、炭素数２から３０の置換もしくは無置換のアルキルカルボニルオキシ基、炭素数６から３０の置換もしくは無置換のアリールカルボニルオキシ基、例えば、ホルミルオキシ、アセチルオキシ、ピバロイルオキシ、ステアロイルオキシ、ベンゾイルオキシ、又はｐ−メトキシフェニルカルボニルオキシ）、カルバモイルオキシ基（好ましくは、炭素数１から３０の置換もしくは無置換のカルバモイルオキシ基、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイルオキシ、Ｎ，Ｎ−ジエチルカルバモイルオキシ、モルホリノカルボニルオキシ、Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−オクチルアミノカルボニルオキシ、又はＮ−ｎ−オクチルカルバモイルオキシ）、アルコキシカルボニルオキシ基（好ましくは、炭素数２から３０の置換もしくは無置換アルコキシカルボニルオキシ基、例えばメトキシカルボニルオキシ、エトキシカルボニルオキシ、ｔ−ブトキシカルボニルオキシ、又はｎ−オクチルカルボニルオキシ）、アリールオキシカルボニルオキシ基（好ましくは、炭素数７から３０の置換もしくは無置換のアリールオキシカルボニルオキシ基、例えば、フェノキシカルボニルオキシ、ｐ−メトキシフェノキシカルボニルオキシ、又はｐ−ｎ−ヘキサデシルオキシフェノキシカルボニルオキシ）、

アミノ基（好ましくは、アミノ基、炭素数１から３０の置換もしくは無置換のアルキルアミノ基、炭素数６から３０の置換もしくは無置換のアニリノ基、例えば、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、アニリノ、Ｎ−メチル−アニリノ、又はジフェニルアミノ）、アシルアミノ基（好ましくは、ホルミルアミノ基、炭素数１から３０の置換もしくは無置換のアルキルカルボニルアミノ基、炭素数６から３０の置換もしくは無置換のアリールカルボニルアミノ基、例えば、ホルミルアミノ、アセチルアミノ、ピバロイルアミノ、ラウロイルアミノ、ベンゾイルアミノ、又は３，４，５−トリ−ｎ−オクチルオキシフェニルカルボニルアミノ）、アミノカルボニルアミノ基（好ましくは、炭素数１から３０の置換もしくは無置換のアミノカルボニルアミノ、例えば、カルバモイルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノカルボニルアミノ、又はモルホリノカルボニルアミノ）、アルコキシカルボニルアミノ基（好ましくは炭素数２から３０の置換もしくは無置換アルコキシカルボニルアミノ基、例えば、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ、ｎ−オクタデシルオキシカルボニルアミノ、又はＮ−メチルーメトキシカルボニルアミノ）、アリールオキシカルボニルアミノ基（好ましくは、炭素数７から３０の置換もしくは無置換のアリールオキシカルボニルアミノ基、例えば、フェノキシカルボニルアミノ、ｐ−クロロフェノキシカルボニルアミノ、又はｍ−ｎ−オクチルオキシフェノキシカルボニルアミノ）、

スルファモイルアミノ基（好ましくは、炭素数０から３０の置換もしくは無置換のスルファモイルアミノ基、例えば、スルファモイルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニルアミノ、又はＮ−ｎ−オクチルアミノスルホニルアミノ）、アルキル及びアリールスルホニルアミノ基（好ましくは炭素数１から３０の置換もしくは無置換のアルキルスルホニルアミノ、炭素数６から３０の置換もしくは無置換のアリールスルホニルアミノ、例えば、メチルスルホニルアミノ、ブチルスルホニルアミノ、フェニルスルホニルアミノ、２，３，５−トリクロロフェニルスルホニルアミノ、又はｐ−メチルフェニルスルホニルアミノ）、メルカプト基、アルキルチオ基（好ましくは、炭素数１から３０の置換もしくは無置換のアルキルチオ基、例えばメチルチオ、エチルチオ、又はｎ−ヘキサデシルチオ）、アリールチオ基（好ましくは炭素数６から３０の置換もしくは無置換のアリールチオ基、例えば、フェニルチオ、ｐ−クロロフェニルチオ、又はｍ−メトキシフェニルチオ）、ヘテロ環チオ基（好ましくは炭素数２から３０の置換又は無置換のヘテロ環チオ基、例えば、２−ベンゾチアゾリルチオ、１−フェニルテトラゾール−５−イルチオ）、スルファモイル基（好ましくは炭素数０から３０の置換もしくは無置換のスルファモイル基、例えば、Ｎ−エチルスルファモイル、Ｎ−（３−ドデシルオキシプロピル）スルファモイル、Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファモイル、Ｎ−アセチルスルファモイル、Ｎ−ベンゾイルスルファモイル、Ｎ−（Ｎ’−フェニルカルバモイル）スルファモイル）、スルホ基、アルキル及びアリールスルフィニル基（好ましくは、炭素数１から３０の置換又は無置換のアルキルスルフィニル基、６から３０の置換又は無置換のアリールスルフィニル基、例えば、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、フェニルスルフィニル、又はｐ−メチルフェニルスルフィニル）、

アルキル及びアリールスルホニル基（好ましくは、炭素数１から３０の置換又は無置換のアルキルスルホニル基、６から３０の置換又は無置換のアリールスルホニル基、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、フェニルスルホニル、又はｐ−メチルフェニルスルホニル）、アシル基（好ましくはホルミル基、炭素数２から３０の置換又は無置換のアルキルカルボニル基、炭素数７から３０の置換もしくは無置換のアリールカルボニル基、例えば、アセチル、ピバロイル、２−クロロアセチル、ステアロイル、ベンゾイル、又はｐ−ｎ−オクチルオキシフェニルカルボニル）、アリールオキシカルボニル基（好ましくは、炭素数７から３０の置換もしくは無置換のアリールオキシカルボニル基、例えば、フェノキシカルボニル、ｏ−クロロフェノキシカルボニル、ｍ−ニトロフェノキシカルボニル、又はｐ−ｔ−ブチルフェノキシカルボニル）、

アルコキシカルボニル基（好ましくは、炭素数２から３０の置換もしくは無置換アルコキシカルボニル基、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、又はｎ−オクタデシルオキシカルボニル）、カルバモイル基（好ましくは、炭素数１から３０の置換もしくは無置換のカルバモイル、例えば、カルバモイル、Ｎ−メチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−オクチルカルバモイル、Ｎ−（メチルスルホニル）カルバモイル）、アリール及びヘテロ環アゾ基（好ましくは炭素数６から３０の置換もしくは無置換のアリールアゾ基、炭素数３から３０の置換もしくは無置換のヘテロ環アゾ基、例えば、フェニルアゾ、ｐ−クロロフェニルアゾ、又は５−エチルチオ−１，３，４−チアジアゾール−２−イルアゾ）、イミド基（例えば、Ｎ−スクシンイミド、Ｎ−フタルイミド）、ホスフィノ基（好ましくは、炭素数２から３０の置換もしくは無置換のホスフィノ基、例えば、ジメチルホスフィノ、ジフェニルホスフィノ、又はメチルフェノキシホスフィノ）、ホスフィニル基（好ましくは、炭素数２から３０の置換もしくは無置換のホスフィニル基、例えば、ホスフィニル、ジオクチルオキシホスフィニル、又はジエトキシホスフィニル）、ホスフィニルオキシ基（好ましくは、炭素数２から３０の置換もしくは無置換のホスフィニルオキシ基、例えば、ジフェノキシホスフィニルオキシ、又はジオクチルオキシホスフィニルオキシ）、ホスフィニルアミノ基（好ましくは、炭素数２から３０の置換もしくは無置換のホスフィニルアミノ基、例えば、ジメトキシホスフィニルアミノ、ジメチルアミノホスフィニルアミノ）、シリル基（好ましくは、炭素数３から３０の置換もしくは無置換のシリル基、例えば、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、又はフェニルジメチルシリル）が挙げられる。

Ｒ_１〜Ｒ_４で表される基が更に置換可能な基である場合、Ｒ_１〜Ｒ_４で表される基は更に置換基を有してもよく、その場合の好ましい置換基はＲ_１〜Ｒ_４で説明した置換基と同じ意味の基を表す。２個以上の置換基で置換されている場合には、それらの置換基は同一であっても異なっていてもよい。

Ｒ_５及びＲ_６はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、アシル基、アルキルスルホニル基、又はアリールスルホニル基を表し、そのアルキル基、アリール基、ヘテロ環基、アシル基、アルキルスルホニル基、及びアリールスルホニル基の好ましい範囲については、前記のＲ_１〜Ｒ_４で表される置換基で説明したアルキル基、アリール基、ヘテロ環基、アシル基、アルキルスルホニル基、及びアリールスルホニル基と同じ意味の基を表す。Ｒ_５及びＲ_６で表される基が更に置換可能な基である場合、Ｒ_５及びＲ_６で表される基は更に置換基を有してもよく、その場合の好ましい置換基はＲ_１〜Ｒ_４で説明した置換基と同じ意味の基を表す。２個以上の置換基で置換されている場合には、それらの置換基は同一であっても異なっていてもよい。

Ｒ_１とＲ_２、Ｒ_３とＲ_４、Ｒ_５とＲ_６、Ｒ_２とＲ_５、又は／及びＲ_４とＲ_６とが互いに結合して５員、６員又は７員の環を形成してもよい。

以下に、一般式（Ｉ）で表される化合物の好ましい範囲について説明する。Ｒ_１〜Ｒ_４は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アシルアミノ基、アルキル及びアリールスルホニルアミノ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、シアノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホ基、ニトロ基、スルファモイル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、及びアシルオキシ基が好ましく、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アシルアミノ基、アルキル及びアリールスルホニルアミノ基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、シアノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホ基、ニトロ基、スルファモイル基、アルキルスルホニル基、及びアリールスルホニル基が更に好ましい。特に好ましくは、Ｒ_１〜Ｒ_４の中で、Ｒ_１又はＲ_３のいずれか一方が水素原子である。

Ｒ_５及びＲ_６はアルキル基、アリール基、及びヘテロ環基が好ましく、アルキル基が最も好ましい。

以下に本発明における一般式（Ｉ）で表される化合物の具体例を示すが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

一般式（Ｉ）で表される化合物のｐＨ１０の水中における酸化電位が５ｍＶ以下（ｖｓＳＣＥ）であることが発色性と保存性を両立できる点で好ましい。

（還元剤の添加方法）
本発明においては、還元剤は、水溶液あるいは有機溶剤に溶解した溶液、乳化分散物、あるいは固体状分散物で用いることができる。

微粒子分散物で用いられる場合の数平均粒子サイズは、０．００１μｍ〜５μｍであることが好ましく、０．００１μｍ〜０．５μｍであることが更に好ましい。

本発明における還元剤の使用量の好ましい範囲は、使用するＣｐ１モルに対して同じモルから１０００倍モルが好ましく、より好ましくは同じモルから１００倍モルが好ましい。

（カプラー）
以下、本発明に用いることの出来るカプラーについて詳細に説明する。
本発明に用いることの出来るカプラーは、本発明の還元剤の酸化体とカップリングして可視部に吸収を持つ色素を形成できる化合物であればいかなる構造をしていてもよい。このような化合物はカラー写真系ではよく知られた化合物であり、その代表例としてピロロトリアゾール型カプラー、フェノール型カプラー、ナフトール型カプラー、ピラゾロトリアゾール型カプラー、ピラゾロン型カプラー、アシルアセトアニリド型カプラーなどが挙げられる。

本発明において好ましいカプラーは一般式（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｃ−３）、（Ｍ−１）、（Ｍ−２）、（Ｍ−３）、（Ｙ−１）、（Ｙ−２）、または（Ｙ−３）で表される構造を有するカプラーである。

式中、Ｘ_１は水素原子または離脱基を表し、Ｙ_１およびＹ_２は電子求引性の置換基を表し、Ｒ_１はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。

式中、Ｘ_２は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_２はアシルアミノ基、ウレイド基またはウレタン基を表し、Ｒ_３は水素原子、アルキル基またはアシルアミノ基を表し、Ｒ_４は水素原子、または置換基を表す。Ｒ_３とＲ_４が互いに連結して環を形成してもよい。

式中、Ｘ_３は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_５はカルバモイル基またはスルファモイル基を表し、Ｒ_６は水素原子または置換基を表す。

式中、Ｘ_４は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_７はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ_８は置換基を表す。

式中、Ｘ_５は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_９はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ_１０は置換基を表す。

式中、Ｘ_６は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_１１はアルキル基、アリール基、アシルアミノ基またはアニリノ基を表し、Ｒ_１０はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。

式中、Ｘ_７は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_１３はアルキル基、アリール基、インドレニル基を表し、Ｒ_１４はアリール基またはヘテロ環基を表す。

式中、Ｘ_８は水素原子または離脱基を表し、Ｚは５員ないし７員の環を形成するのに必要な２価の基を表し、Ｒ_１５はアリール基またはヘテロ環基を表す。

式中、Ｘ_９は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_１６、Ｒ_１７およびＲ_１８はそれぞれ置換基を表し、ｎは０ないし４の、ｍは０ないし５のいずれかの整数を表す。ｎまたはｍが２以上のとき、複数のＲ_１６およびＲ_１７はそれぞれ同一の基であってもよいし、別々の基であってもよい。

一般式（Ｃ−１）において、Ｘ_１は水素原子または離脱基を表し、Ｙ_１およびＹ_２は電子求引性の置換基を表し、Ｒ_１はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、これらの基は置換基を有していてもよい。
Ｘ_１は水素原子または離脱基で、好ましくは離脱基である。
本発明で言う離脱基とは、還元剤の酸化体とカップリングし、色素を形成する際に母核から離脱可能な基を意味する。離脱基としてはハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アシルオキシ基、カルバモイルオキシ基、イミド基、メチロール基、ヘテロ環基等が挙げられる。Ｘ１としてはカルバモイルオキシ基またはベンゾイルオキシ基がより好ましい。Ｙ_１およびＹ_２は電子求引性基を表す。具体的には、シアノ基、ニトロ基、アシル基、オキシカルボニル基、カルバモイル基、スルホニル基、スルホキシド基、オキシスルホニル基、スルファモイル基、ヘテロ環基、トリフルオロメチル基、ハロゲン原子が挙げられる。その中でも好ましくはシアノ基、オキシカルボニル基、スルホニル基で、より好ましくはシアノ基、オキシカルボニル基である。Ｙ_１とＹ_２のいずれか一方がシアノ基であることがさらに好ましく、Ｙ_１がシアノ基であることが特に好ましい。Ｙ_２はオキシカルボニル基であることが好ましく、かさ高い基で置換されたオキシカルボニル基（例えば２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルピペラジニルオキシカルボニル基）が特に好ましい。Ｒ_１は好ましくはアルキル基またはアリール基であり、これらの基は置換基を有していてもよい。アルキル基としては２級または３級のアルキル基が好ましく、より好ましくは３級のアルキル基である。アルキル基としては炭素数の和が３〜１２の範囲であることが好ましく４〜８の範囲であることがより好ましい。アリール基としてはフェニル基が好ましく、置換基を有していてもよいが、炭素数の和が６〜１６の範囲であることが好ましく、６〜１２の範囲であることがより好ましい。一般式（Ｃ−１）のカプラーは分子量が７００以下であることが好ましく、６５０以下であることがより好ましく、６００以下であることがさらに好ましい。

一般式（Ｃ−２）において、Ｘ_２は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_２はアシルアミノ基、ウレイド基またはウレタン基を表し、Ｒ_３は水素原子、アルキル基またはアシルアミノ基を表し、Ｒ_４は水素原子、または置換基を表す。Ｒ_３とＲ_４が互いに連結して環を形成してもよい。
Ｘ_２は水素原子もしくはＸ_１と同様の離脱基であるが、Ｘ_２として好ましいのはハロゲン原子、アリールオキシ基、アルコキシ基、アリールチオ基またはアルキルチオ基で、ハロゲン原子またはアリールオキシ基がより好ましい。Ｒ_２は好ましくはアシルアミノ基またはウレイド基である。Ｒ_２としては炭素数の総和が２〜１２の範囲が好ましく、より好ましくは２〜８の範囲である。Ｒ_３は好ましくは炭素数１〜４のアルキル基または炭素数２〜１２のアシルアミノ基であり、より好ましくは炭素数２〜４のアルキル基または炭素数２〜８のアシルアミノ基である。Ｒ_４は好ましくはハロゲン原子、アルコキシ基、アシルアミノ基、アルキル基であり、より好ましくはハロゲン原子またはアシルアミノ基で、特に塩素原子が好ましい。一般式（Ｃ−２）のカプラーは分子量が５００以下であることが好ましく、４５０以下であることがより好ましく、４００以下であることがさらに好ましい。

一般式（Ｃ−３）において、Ｘ_３は水素原子もしくはＸ_１と同様の離脱基であるが、Ｘ_３として好ましいのはハロゲン原子、アリールオキシ基、アルコキシ基、アリールチオ基またはアルキルチオ基で、アルコキシ基またはアルキルチオ基がより好ましい。Ｒ_５はアシル基、オキシカルボニル基、カルバモイル基またはスルファモイル基が好ましく、カルバモイル基またはスルファモイル基がより好ましい。Ｒ_５として炭素数の和が１〜１２の基が好ましく、より好ましくは炭素数が２〜１０である。Ｒ_６は水素原子もしくは置換基であるが、置換基としては好ましくはアミド基、スルホンアミド基、ウレタン基またはウレイド基であり、アミド基またはウレタン基がより好ましい。置換位置としてはナフトール環の５位または８位が好ましく、５位がより好ましい。Ｒ_６として炭素数の和が２〜１０の基が好ましく、より好ましくは炭素数が２〜６である。一般式（Ｃ−２）のカプラーは分子量が５５０以下であることが好ましく、５００以下であることがより好ましく、４５０以下であることがさらに好ましい。

一般式（Ｍ−１）においてＸ_４は水素原子もしくはＸ_１と同様の離脱基あるが、Ｘ_４として好ましいのはハロゲン原子、アリールオキシ基、アルコキシ基、アリールチオ基、アルキルチオ基またはヘテロ環基で、ハロゲン原子、アリールオキシ基、アリールチオ基またはヘテロ環基がより好ましい。ヘテロ環基としてはピラゾール基、イミダゾール基、トリアゾール基、テトラゾール基、ベンゾイミダゾール基、ベンゾトリアゾール基等のアゾール基が好ましく、ピラゾール基がより好ましい。Ｒ_７はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基で、これらの基は置換基を有していてもよい。好ましくは２級もしくは３級のアルキル基またはアリール基である。アルキル基としては炭素数が２〜１４の基が好ましく、より好ましくは炭素数３〜１０の基である。アリール基としては好ましくは炭素数が６〜１８の基で、より好ましくは６〜１４の基である。Ｒ_８は好ましくはアルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基またはヘテロ環であり、これらの基は置換基を有していてもよい。アルキル基としては２級または３級のアルキル基が好ましく、より好ましくは３級のアルキル基である。アルキル基としては炭素数の和が３〜１２の範囲であることが好ましく４〜８の範囲であることがより好ましい。アリール基としてはフェニル基が好ましく、置換基を有していてもよいが、炭素数の和が６〜１６の範囲であることが好ましく、６〜１２の範囲であることがより好ましい。アルコキシ基としては炭素数１〜８のアルコキシ基が好ましく、より好ましくは炭素数１〜４のアルコキシ基である。アリールオキシ基としては炭素数６〜１４のアリールオキシ基が好ましく炭素数６〜１０の基がより好ましい。アルキルチオ基、アリールチオ基もそれぞれアルコキシ基、アリールオキシ基と同様の炭素数の基が好ましい。一般式（Ｍ−１）のカプラーは分子量が６００以下であることが好ましく、５５０以下であることがより好ましく、５００以下であることがさらに好ましい。

一般式（Ｍ−２）のカプラーのＸ_５、Ｒ_９およびＲ_１０で表される基はそれぞれ一般式（Ｍ−１）のカプラーのＸ_４、Ｒ_７およびＲ_８で表される基と同様の基で、それぞれの基の好ましい範囲も一般式（Ｍ−１）のカプラーと同様である。

一般式（Ｍ−３）において、Ｘ_６は水素原子もしくはＸ_１と同様の離脱基あるが、Ｘ_６として好ましいのはアルキルチオ基、アリールチオ基またはヘテロ環基で、より好ましくはアリールチオ基またはヘテロ環基である。アリールチオ基としてはフェニル基が好ましく、特に２位にアルコキシ基、アミド基が置換したアリールチオ基が好ましい。アリールチオ基の炭素数の和は６〜１６の範囲が好ましく、７〜１２の範囲がより好ましい。ヘテロ環基としてはピラゾール基、イミダゾール基、トリアゾール基、テトラゾール基、ベンゾイミダゾール基、ベンゾトリアゾール基等のアゾール基が好ましく、ピラゾール基がより好ましい。Ｒ_１１としてはアルキル基、アリール基、アシルアミノ基またはアニリノ基が好ましく、アシルアミノ基またはアニリノ基がより好ましい。最も好ましいのはアニリノ基である。アルキル基としては炭素数１〜８のアルキル基が好ましく、アリール基としては炭素数６〜１４のアリール基が好ましい。アシルアミノ基としては炭素数２〜１４の基が好ましく２〜１０の基がより好ましい。アニリノ基としては炭素数６〜１６の基が好ましく６〜１２の基がより好ましい。アニリノ基の置換基としてはハロゲン原子、アシルアミノ基が好ましい。一般式（Ｍ−３）のカプラーは分子量が７００以下であることが好ましく、６５０以下であることがより好ましく、６００以下であることがさらに好ましい。

一般式（Ｙ−１）において、Ｘ_７は水素原子もしくはＸ_１と同様の離脱基あるが、Ｘ_７として好ましいのはアリールオキシ基、イミド基またはヘテロ環基である。アリールオキシ基としては電子求引性基で置換されたアリールオキシ基が好ましい。イミド基としては環状のイミド基が好ましく、ヒダントイン基、１，３−オキサゾリジン−２，５−ジオン基およびコハクイミド基が特に好ましい。イミド基の炭素数の総和は３〜１５の範囲が好ましく、より好ましくは４〜１１の範囲で、さらに好ましくは５〜９の範囲である。ヘテロ環基としてはピラゾール基、イミダゾール基、トリアゾール基、ベンゾイミダゾール基、ベンゾトリアゾール基が好ましく、イミダゾール基がより好ましい。アゾール基の炭素数の総和は３〜１２の範囲が好ましく、より好ましくは３〜１０の範囲で、さらに好ましくは３〜８の範囲である。Ｒ_１３は好ましくは２級もしくは３級のアルキル基、アリール基またはヘテロ環基である。アルキル基はシクロアルキル基、ビシクロアルキル基であってもよく３級アルキル基がより好ましい。１−アルキルシクロプロピル基、ビシクロアルキル基、アダマンチル基は特に好ましい。Ｒ_１４はアリール基もしくはヘテロ環基で、アリール基がより好ましい。そのなかでも２位にハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基またはアリールチオ基が置換したフェニル基が特に好ましい。Ｒ_１４の炭素数の総和は６〜１８の範囲が好ましく、より好ましくは７〜１６の範囲、さらに好ましくは８〜１４の範囲である。一般式（Ｙ−１）のカプラーは分子量が７００以下であることが好ましく、６５０以下であることがより好ましく、６００以下であることがさらに好ましい。

一般式（Ｙ−２）のカプラーのＸ_８およびＲ_１５で表される基はそれぞれ一般式（Ｙ−１）のカプラーのＸ_７、Ｒ_１４で表される基と同様の基で、それぞれの基の好ましい範囲も一般式（Ｙ−１）のカプラーと同様である。Ｚは５ないし７員の環を形成するために必要な２価の基を表し、この環には置換基があってもよいし、別の環が縮環していてもよい。

一般式（Ｙ−２）のなかでも好ましいのは一般式（Ｙ−３）で表されるカプラーである。
一般式（Ｙ−３）のカプラーにおいて、Ｘ_９は一般式（Ｙ−１）のＸ_７と同義で、好ましい範囲も同じである。Ｒ_１６は好ましくはハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、アシルオキシ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニル基、スルホンアミド基、シアノ基、スルホニル基、スルファモイル基、カルバモイル基またはアルキルチオ基で炭素数１〜４の置換基であることがより好ましい。ｎは好ましくは０〜３の整数で、より好ましくは０〜２、さらに好ましくは０〜１、最も好ましくは０である。Ｒ_１７は好ましくはＲ_１６と同様の基で、より好ましくはハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、アシルアミノ基、スルホンアミド基、アルコキシカルボニル基、スルファモイル基、スルホニル基である。特にＮＨ基に対してオルト位にハロゲン原子、アルコキシ基またはアルキルチオ基であるＲ_１７が置換されていることがより好ましい。最も好ましいのはアルキルチオ基である。一般式（Ｙ−３）のカプラーは分子量が７５０以下であることが好ましく、７００以下であることがより好ましく、６５０以下であることがさらに好ましい。
以下に本発明のカプラーの具体例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。

上記の他に、特開２００４−４４３９に記載の化合物Ｎｏ．ＣＰ１０１〜ＣＰ１１７、ＣＰ２０１〜ＣＰ２２０、およびＣＰ３０１〜ＣＰ３３１なども本発明に用いることが出来る。

本発明のカプラーはオイル乳化物あるいは固体微粒子分散物として、例えばゼラチンやポリマーラテックスをバインダーとした塗布膜として用いることができる。このときの塗布量は、好ましくは１×１０^−６モル／ｍ^２〜１×１０^−２モル／ｍ^２が好ましく、さらに好ましくは１×１０^−５モル／ｍ^２〜１×１０^−３モル／ｍ^２で使用することである。

（不活性坦体）
本発明に用いられる不活性坦体（基質）は坦持する抗体蛋白を含むメンブレンや固定層に拡散せず、生成した複合体がメンブレンや固定層に固定もしくは拡散するのを妨害することのない不活性な材料が好ましい。
本発明に用いられる不活性坦体としては、例えば、ニトロセルロースが挙げられる。
本発明に用いられる不活性坦体が発色した色素を観察する背景となる場合は、白色の光反射性基質であることが好ましく、また、不活性坦体を通りして発色した色素を観察する場合は、透明基質であることが好ましい。

以下、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１
１．発色シートの作製
カプラー（ＣＰ−１）４．５ｇ、色像安定剤（ＳＴ−１）１．３ｇ、色像安定剤（ＳＴ−２）０．２２ｇ及び色像安定剤（ＳＴ−３）１．４ｇを溶媒（ＳＯＬ−１）６．７ｇ、溶媒（ＳＯＬ−２）６．７ｇおよび溶媒（酢酸エチル）１９ｇに溶解し、この液を１．０ｇのドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを含む２５質量％のゼラチン水溶液８４ｍＬと混合して、高速攪拌乳化機（ディゾルバー）で乳化分散し、さらに水を加えて２３０ｇの乳化分散物Ａを作製した。
乳化分散物Ａにゼラチン水溶液を加えて、ゼラチン架橋剤（Ｈ−１）を添加し、以下の組成となるように塗布溶液を調製し、これをトリアセチルセルロース（ＴＡＣ）支持体上に塗布し乾燥した。これを５ｍｍ×１８ｍｍのサイズに裁断し、発色シートを作製した。

（ｇ／ｍ^２）
ＣＰ−１ ０．２７
ＳＴ−１ ０．０７９
ＳＴ−２ ０．０１３３
ＳＴ−３ ０．０８５
ＳＯＬ−１ ０．４１
ＳＯＬ−２ ０．４１
ゼラチン ２．２
Ｈ−１ ０．０２６

２．ｈＣＧ検出イムノクロマトキットの作製
（２−１）酵素修飾抗ｈＣＧ抗体の作製
抗原に特異的反応性を有する抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ５００８ ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社、等電点＝７．４）溶液を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）に１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した溶液１ｍＬに、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエステル（ＭＢＳ）の１０ｍｇ／ｍＬの濃度のジメチルホルムアミド溶液０．１ｍＬを添加し、２５℃の温度で３０分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）でゲル濾過を行ない、マレイミド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。

一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１．０ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の１０ｍｇ／ｍＬの濃度のエタノール溶液を添加し、２５℃の温度で３０分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）でゲル濾過して精製、ピリジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する画分を採取し、これをコロジオンバック中において氷冷下に約１０倍に濃縮した。次に、これに０．１Ｍジチオスレイトールを含有する０．１Ｍ酢酸緩衝生理食塩水（ｐＨ４．５）１ｍＬを添加して、２５℃の温度で３０分間攪拌してＨＲＰ分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元した後、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用いてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分を得た。
次に、マレイミド化モノクローナル抗体とチオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷下に４ｍｇ／ｍＬの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で一昼夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＳＥＰＲＡＣＯＲ社）を充填したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオキシダーゼ酵素標識抗体を得た。

（２−２）ペルオキシダーゼ酵素標識抗体保持パットの作製
（２−１）で作製したペルオキシダーゼ酵素標識抗体を、塗布液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌバッファー（ｐＨ８．２），０．０５質量％ＰＥＧ（Ｍｗ．２００００），５質量％スクロース）及び水により希釈した。その際、ペルオキシダーゼ酵素標識抗体が５．０μｇ／ｍＬとなるように希釈した。この溶液を、８ｍｍ×１５０ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ、ミリポア社）１枚あたり０．８ｍＬずつ均一に塗布し、一晩減圧乾燥し、ペルオキシダーゼ酵素標識抗体保持パッドを得た。

（２−３）抗体固定化メンブレン（クロマトグラフ担体）の作製
２５ｍｍ×２００ｍｍに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、品名：ＨｉＦｌｏｗ Ｐｌｕｓ ＨＦ１２０、ミリポア社製）に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作製した。メンブレンの長辺を下にして、該メンブレンの下から８ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した固定化用抗ｈＣＧモノクローナル抗体（品名：Ａｎｔｉ−Ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ ６６０１ ＳＰＲ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製、等電点＝７．４）溶液をインクジェット方式の塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社）を用いて幅１ｍｍ程度のライン状に塗布した。同様に、下から１２ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製したコントロール用抗マウスＩｇＧ抗体（抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），ウサギＦ（ａｂ’）２，品番５６６−７０６２１、和光純薬製）溶液をライン状に塗布した。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で５０℃、３０分間乾燥した。ブロッキング液（０．５質量％カゼイン（乳由来、品番０３０−０１５０５、和光純薬製）含有５０ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８．５））５００ｍＬをバットに入れ、そのまま３０分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液（０．５質量％スクロースおよび０．０５質量％コール酸ナトリウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファー）５００ｍＬに移して浸し、そのまま３０分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で一晩乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。

（２−４）イムノクロマトグラフキットの作製
バック粘着シート（ＡＲｃａｒｅ９０２０、ニップンテクノクラスタ社）に、（２−３）で作製した抗体固定化メンブレンを貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、抗ｈＣＧ抗体ライン側を下側とする。抗体固定化メンブレンの下側に約２ｍｍ重なるように（２−２）で作製したペルオキシダーゼ酵素標識抗体保持パットを貼り付け、約４ｍｍ重なるようにして銀コロイド抗体保持パッド下側に試料添加パッド（１８ｍｍ×１５０ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（品名：Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ、ミリポア社製））を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約５ｍｍ重なるように吸収パッド（８０ｍｍ×１５０ｍｍに切ったセルロース・グラス膜（品番：ＣＦ６、ワットマン社製））を重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材を、部材の長辺側を５ｍｍ幅になるように短辺に平行にギロチン式カッター（品番：ＣＭ４０００、ニップンテクノクラスタ社製）で切断していくことで、５ｍｍ×５５ｍｍのイムノクロマト用ストリップを作製した。これらをプラスチックケース（ニップンテクノクラスタ社）に納め、試験用イムノクロマトキットとした。

（２−５）発色液の作製
８Ｎ水酸化カリウム０．４ｍＬ、炭酸水素カリウム２６．４ｇからなるバッファー水溶液８００ｍＬに亜硫酸カリウム４ｇおよび一般式（Ｉ）の還元剤（１−１２）３．２ｇを添加し、溶解後、全液量が１０００ｍＬとなるように水で希釈し、発色液を作製した。

３．検出ラインでのシグナル増幅
（３−１）検出ラインでの酵素修飾抗ｈＣＧ抗体の吸着処理
１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーにｈＣＧ（リコンビナントｈＣＧ Ｒ−５０６、ロ−ト製薬（株）製）を溶解し、表１に示すように各濃度の試験用ｈＣＧ溶液を作製した。この試験用ｈＣＧ溶液を各試験用イムノクロマトキットの試料添加パッドに１００μＬ滴下し、１０分静置した。

（３−２）発色シートおよび発色液によるシグナル増幅
（３−１）の処理を終了した後のイムノクロマトキットのケースからメンブレンを取り出し、さらに吸水パットを取り除いた後に、新たな吸水パットとして５ｍｍ×２０ｍｍ（品名：Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ、ミリポア社製）を取り除いた場所に３枚をセロハンテープで貼り付けた。検出ライン部に発色シートを重ね合わせ、その重ねた部位を２枚のアクリル板で挟み固定した。このメンブレンを、発色液９ｍＬに３０質量％の過酸化水素水を混合した液を２００μＬ入れたマイクロチューブ（ビーエム機器（株）、品番：ＢＭ４０２０）に試料添加パッドが液に漬かるように立てかけた。立てかけた時点を０分として１０分後に取り出し、発色シートを剥がし１％酢酸溶液に１分間浸すことで発色反応を停止させた。

（比較例１）
１．抗ｈＣＧ抗体修飾金コロイドの作製
直径５０ｎｍ金コロイド溶液（ＥＭ．ＧＣ５０、ＢＢＩ社）９ｍＬに５０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４バッファー（ｐＨ７．０）１ｍＬを加えることでｐＨを調整した金コロイド溶液に、５０μｇ／ｍＬの抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ５００８ＳＰ−５、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社、等電点＝７．４）溶液１ｍＬを加え攪拌した。１０分間静置した後、１質量％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ Ｍｗ．２００００、品番１６８−１１２８５、和光純薬）水溶液を５５０μＬ加え攪拌し、続いて１０質量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、品番Ａ−７９０６、ＳＩＧＭＡ）水溶液を１．１ｍＬ加え攪拌した。この溶液を８０００Ｇ、４℃、３０分遠心（ｈｉｍａｃＣＦ１６ＲＸ、日立）した後、１ｍＬ程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、２０ｍＬの金コロイド保存液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．２），０．０５質量％ＰＥＧ（Ｍｗ．２００００），１５０ｍＭＮａＣｌ，１質量％ＢＳＡ，０．１質量％ＮａＮ_３）に分散し、再び８０００Ｇ、４℃、３０分間遠心した後、１ｍＬ程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド（５０ｎｍ）溶液を得た。

２．金コロイド抗体保持パットの作製
上記抗体修飾金コロイドを、金コロイド塗布液（２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌバッファー（ｐＨ８．２），０．０５質量％ＰＥＧ（Ｍｗ．２００００），５質量％スクロース）及び水により希釈し、５２０ｎｍのＯＤが１．５となるように希釈した。この溶液を、８ｍｍ×１５０ｍｍに切ったグラスファイバーパッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ、ミリポア社）１枚あたり０．８ｍＬずつ均一に塗布し、一晩減圧乾燥し、金コロイド抗体保持パッドを得た。

３．イムノクロマトキットの作製と処理
実施例１と同様に上記金コロイド抗体保持パットと上記抗体修飾金コロイドを標識として用いて比較のイムノクロマトキットを作製した。
実施例１と同様に検出ラインでの酵素修飾抗ｈＣＧ抗体の吸着処理を行った。但し、発色シートおよび現像液によるシグナル増幅処理を施さず、検出ラインの観察を行った。

＜検出結果＞
実施例および比較例で得られたメンブレンの検出ラインに接した発色シートの部位もしくはメンブレンの検出ラインを、通常の明るさの蛍光灯を照明とした室内で目視観察した。得られた各イムノクロマトキットの評価結果を表１に示した。
表中、判定基準は下記に従った。
○：コントロール（ｈＣＧ濃度０）の場合と明確に識別できる。
×：コントロールとの識別ができない。

上記表より、本発明の発色シートを用いることで、一般に視認度が高く高感度とされている標識の金コロイドにくらべ、さらに少ない抗原（ｈＣＧ）量でも検出できることが明らかである。
従って、本発明により極めて検出感度が高い免疫学的検出方法が得られる。

Claims (8)

1. 免疫学的検出方法であって、
   ａ）検体または検体を含む試料に、酵素標識により修飾された検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第一の蛋白質（Ｙ）を作用させ、前記分析対象物および前記Ｙを含む複合体を形成させる工程、
   ｂ）前記工程において生じた前記複合体と分析対象物と複合体を形成しなかった前記標識を含む第一の蛋白質Ｙとを分離する工程、
   ｃ）前記複合体に過酸化物、還元剤（ＣＤ）および発色素材（Ｃｐ）を作用させる工程、および、
   ｄ）前記ＣＤおよび前記Ｃｐより生じた色素を検出する工程を有することを特徴とする免疫学的検出方法。
2. 前記還元剤が下記一般式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする請求項１に記載の免疫学的検出方法：
   
   （式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３及びＲ_４はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を表し、Ｒ_５及びＲ_６はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、アシル基、又はスルホニル基を表し、置換基を有してもよく、またＲ_１とＲ_２、Ｒ_３とＲ_４、Ｒ_５とＲ_６、Ｒ_２とＲ_５、又はＲ_４とＲ_６とが互いに結合して５員〜７員の環を形成してもよい。）。
3. 前記Ｃｐが下記一般式（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｃ−３）、（Ｍ−１）、（Ｍ−２）、（Ｍ−３）、（Ｙ−１）、（Ｙ−２）および（Ｙ−３）よりなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を含有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の免疫学的検出方法：
   
   （式中、Ｘ_１は水素原子または離脱基を表し、Ｙ_１およびＹ_２は電子求引性の置換基を表し、Ｒ_１はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。）；
   
   （式中、Ｘ_２は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_２はアシルアミノ基、ウレイド基またはウレタン基を表し、Ｒ_３は水素原子、アルキル基またはアシルアミノ基を表し、Ｒ_４は水素原子、または置換基を表す。Ｒ_３とＲ_４が互いに連結して環を形成してもよい。）；
   
   （式中、Ｘ_３は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_５はカルバモイル基またはスルファモイル基を表し、Ｒ_６は水素原子または置換基を表す。）；
   
   （式中、Ｘ_４は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_７はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ_８は置換基を表す。）；
   
   （式中、Ｘ_５は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_９はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表し、Ｒ_１０は置換基を表す。）；
   
   （式中、Ｘ_６は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_１１はアルキル基、アリール基、アシルアミノ基またはアニリノ基を表し、Ｒ_１２はアルキル基、アリール基またはヘテロ環基を表す。）；
   
   （式中、Ｘ_７は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_１３はアルキル基、アリール基、又はインドレニル基を表し、Ｒ_１４はアリール基またはヘテロ環基を表す。）；
   
   （式中、Ｘ_８は水素原子または離脱基を表し、Ｚは５〜７員の環を形成するのに必要な２価の基を表し、Ｒ_１５はアリール基またはヘテロ環基を表す。）；
   
   （式中、Ｘ_９は水素原子または離脱基を表し、Ｒ_１６、Ｒ_１７およびＲ_１８はそれぞれ置換基を表し、ｎは０〜４の、ｍは０〜５のいずれかの整数を表す。ｎまたはｍが２以上のとき、複数のＲ_１６およびＲ_１７はそれぞれ同一の基であってもよいし、異なる基であってもよい。）。
4. 前記複合体を形成する工程が、さらに検体中の分析対象物を特異的に認識し得る第二の蛋白質（Ｘ）を含み、前記Ｙ、前記Ｘおよび前記分析対象物を同時にまたは段階的に作用させ、前記Ｘ、前記分析対象物および前記Ｙを含む複合体を形成する工程であることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法。
5. 前記酵素がペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法。
6. 前記分析対象物が抗原であり、前記分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質が抗体であることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法。
7. 前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項６に記載の免疫学的検出方法。
8. 前記分析対象物を特異的に認識し得る蛋白質が不溶性担体に坦持されていることを特徴とする請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の免疫学的検出方法。