JPH03254697A - 分析方法、それに使用する試薬及び分析素子 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、特定成分の分析方法に関し、特にペルオキシ
ダーゼの酵素反応を用いる特定成分の分析方法、それに
使用する発色試薬及び分析素子に関する。

〔従来の技術〕

生体成分などの特定成分を検出する各種の分析方法が開
発されて来ているが、それらの方法の中量も精度の高い
方法として、該特定成分とこれに対して特異的に結合し
うる物質（以後、特異結合物質と称する）、例えば抗原
と抗体、ある種の糖鎖とレクチン、ビオチンとアビジン
、プロティンＡとＩｇＧ　、ホルモンとレセプタ、酵素
と基質等の間の特異的結合反応を用いる方法が知られて
いる。

一般的には何らかの標識（ラベル）を付した特異結合物
質（以後、標識体と称する）を用い特定成分に応じて変
化した該標識のシグナルを検出することにより特定成分
の分析が行われる。

特に支持体に直接的に又は間接的に担持させた特定成分
を標識体と反応させ、両者の複合体として標識体を固定
し、実質的に特定成分に応じた標識からのシグナルを検
出する方法が適宜用いられる。

例えば電気泳動したタンパク質生体成分（特定成分〉を
ゲルからニトロセルロース膜上に転写担持し、標識体、
例えば抗体標識体と反応させシグナルを検出する方法、
ＴＬＣプレート上に展開した脂質等の特定成分に標識体
を反応させシグナルを検出する方法、膜上でＤＮＡと該
ＤＮＡに対する標識した相補的ＤＮＡとを反応させシグ
ナルを検出する方法又は免疫組織化学染色法などである
。

これらの方法により、特定成分の定量や特定成分の特異
結合物質との反応性だけでなく、特定成分若しくは特異
結合物質の性質、存在状態などに対する多大な情報を得
ることができる。

例えば電気泳動後膜上に転写、担持されたタンパク質や
核酸、又はＴＬＣ上に展開した脂質成分等の生体の特定
成分と該特定成分に対する標識体とを結合させた複合体
上にシグナルを検出する方法においては特定成分のシグ
ナルの位置、移動度から該特定成分の分子量、等電点又
は極性等の情報が得られる。

また免疫組織化学染色法においては、組織上の目的とす
る特定成分の存在場所、状態等の情報が得られる。

前記した、支持体上に直接又は間接的に担持させた複合
結合体上に実質的に特定成分量に応じてシグナルを検出
する特定成分の測定では対象とする特定成分が微量であ
るため標識が高感度に検出されること、また特定成分に
対するより多くの情報を得るため標識の検出法が高い分
解能をもったものであることが必須である。

特異結合物質の標識としては、放射性同位元素、蛍光物
質、発光物質、酵素等が用いられている。

放射性同位元素は放射活性の減衰や廃棄、被ばく又は設
備に巨費を要する等の問題があり、更に支持体に担持さ
せた標識体上にシグナルを検出する煩雑な操作を要する
欠点がある。

蛍光物質若しくは発光物質は特殊な装置、設備が必要で
ある。

一方、酵素を用いた場合、操作も比較的簡単で生成色素
はたやすく可視化でき、定量も可能である。従来、標識
酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ
、β−ガラクトシダーゼ等が用いられてきた。支持体上
に担持させた複合結合体上に酵素反応により色素を生成
、沈着させる方法において、標識酵素としてペルオキシ
ダーゼが主として用いられ、その際、基質として、従来
ジアミノベンジジン、○−ジアニシジン、４−クロロ−
１−ナフトール等が使用されてきた。

〔発明が解決しようとする課題〕

ジアミノベンジジンやＯ−ジアニシジンは毒性が強くバ
ックグランドが出やすい欠点がある。

４−クロロ−１−ナフトールは他に比べやや感度が高い
が、より微量の特定成分を測定するため、若しくは、特
定成分に対するより多くの情報を明確に得るには、感度
は充分とは言えない。

その他、従来公知の各化合物、あるいはそれらの組合せ
を用いる方法も有用ではあるが、例えば、生物学的流体
試料（例えば血清）中に存在する低レベルの尿酸、クレ
アチニン、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナー
ゼ（ＧＯＴ）グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナー
ゼ（ＧＰＴ）等を過酸化水素に導いて定量する際には、
定量すべき過酸化水素の濃度が非常に低いため、これら
の定量に対する識別感度としてはまだ充分とは言い難い
。

本発明の目的は、過酸化作用を有する物質の存在下での
過酸化水素又は過酸化水素を生成する物質の定量におい
て、簡易に且つ高感度、高分解能でありしかも迅速な特
定成分の分析方法、それに使用する発色試薬、及び分析
素子を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は特定成分の
分析方法に関する発明であって、分析対象の特定成分を
、ペルオキシダーゼを標識として有している標識体を用
い、ペルオキシダーゼの酵素反応にまり生成した色素量
によって測定する該特定成分の分析方法において、該酵
素反応の基質として、過酸化水素、芳香族第一級アミン
化合物、及び下記一般式〔Ｉ〕　：〔式中、Ｒは置換基
を表わし、ｍは０又は１〜６の整数を表わす。ｍが２〜
６の整数のとき、複数のＲは同じであっても異なってい
てもよい。

Ｙ及び２はハメットの置換基定数σｐが０．３　ＪＪ上
１．５以下の置換基であり、Ｙと２は同じであっても異
なっていてもよい。Ｘは水素又は芳香族第一級アミン化
合物の酸化体との反応により離脱する置換基を表わす〕
で表わされる化合物を用いることを特徴とする。

また、本発明の第２の発明は発色試薬に関する発明であ
って、芳香族第一級アミン化合物、及び上記第１の発明
における一般式〔Ｉ〕で表わされる化合物からなること
を特徴とする。

更に、本発明の第３の発明は、過酸化水素分析用発色試
薬に関する発明であって、過酸化作用を有する物質、及
び上記第２の発明の発色試薬からなることを特徴とする
。

更にまた、本発明の第４の発明は、別の過酸化水素分析
用発色試薬に関する発明であって、過酸化水素を生成す
る物質、及び上記第３の発明の発色試薬からなることを
特徴とする。

そして、本発明の第５の発明は、分析素子に関する発明
であって、支持体上に、少なくとも試薬層と、その上方
に展開層を有する、前記第１の発明の分析方法に使用す
る分析素子において、該分析素子が、上記第４の発明の
発色試薬の各成分を、同一又は異なるいずれかの層に含
有していることを特徴とする。

次に本発明の詳細な説明する。

本発明において、特定成分は支持体に物理的吸着、化学
的結合等により直接的に担持されてもよく、１つ以上の
特異結合物質を介して間接的に担持されてもよい。また
、特定成分を支持体上に直接若しくは間接的に担持させ
た後、前記標識体を反応させ前記複合結合体を形成させ
てもよいし、あるいは複合結合体を形成させた後に該複
合結合体を支持体上に直接若しくは間接的に担持させて
もよい。更にｓｉａ体は該特定成分と複合結合体を形成
し、支持体に担持されるが、特定成分と標識体は直接結
合してもよく、１つ以上の特異結合物質を介して結合し
てもよい。

また本発明において、８ｉ識体はペルオキシダーゼと抗
ペルオキシダーゼ抗体とで特異結合物質を重複して標識
したものであってもよい。

従来の過酸化水素及び４−クロロ−１−ナフトールを基
質として用いるアナリティ力ル　バイオケミストリー（
＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋１ｓｔｒｙ）
第１１９巻、第１４２〜１４７頁（１９８２）に記載の
方法と比べ本発明の方法は発色時間が短縮され、スポッ
トは鮮明で感度は１０倍以上上昇した。また、その結果
、ペルオキシダー４８１８１体の量を低減することがで
きコスト的にも有利である。

本発明において、対象とする特定成分は、その特定成分
に特異的に結合する特異結合物質が得られる物質又は物
質群である。

例えば、タンパク質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質
、糖脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体等が挙
げられる。

また本発明に使用し得る特異結合物質は、特定成分又は
他の特異結合物質と特異的に結合できる物質であり、特
定成分に応じて適当に選ぶことができる。例えば、タン
パク質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖脂質、多
糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチン、プロテ
ィンＡ１アビジン、ビオチン、レセプター、補酵素、酵
素の基質、毒素、補体及びこれらの複合体等が挙げられ
る。

本発明に使用し得る支持体としては、セルロース、アセ
テート、ニトロセルロース等ノ膜、ポリアクリルアミド
等のゲル状支持体、ＴＬＣプレート等のシリカゲル担体
、プレート状、ビーズ状のプラスチック、ガラス、金属
、繊維等が挙げられる。また組織化学染色においては、
組織そのものも支持体として使用できる。

以下、より具体的に本発明を説明する。

一般式〔Ｉ〕におけるＲ１７）表わす置換基としては、
特に制限はない。代表的には、アルキル、アリール、ア
ニリノ、アシルアミノ、スルホンアミド、アルキルチオ
、アリールチオ、アルケニル、シクロアルキル等の各基
が挙げられるが、この他にハロゲン及びシクロアルケニ
ル、アルキニル、ａｉｍ、スルホニル、スルフィニル、
ホスホニル、アシル、カルバモイル、スルファモイル、
シアノ、アルコキシ、スルホニルオキシ、アリールオキ
シ、複素環オキシ、シロキシ、アシルオキシ、カルバモ
イルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、イミド、ウレイ
ド、スルファモイルアミノ、アルコキシカルボニルアミ
ノ、アリールオキシカルボニルアミノ、アルコキシ力ル
ホニル、アリールオキシカルボニル、複素環チオ、チオ
ウレイド、カルボキシル、ヒドロキシ、メルカプト、ニ
トロ、スルホン酸等の各基、並びにスピロ化合物残基、
有橋炭化水素化合物残基等も挙げられる。

Ｒの表わす置換基のうち、アルキル基としては、炭素数
１〜３２のものが好ましく、直鎮でも分岐でもよい。

アリール基としては、フェニル基が好ましい。

アシルアミノ基としては、アルキルカルボニルアミノ基
、アリールカルボニルアミノ基等が挙げられる。

スルホンアミド基としては、アルキルスルホニルアミノ
基、アリールスルホニルアミノ基等が挙げられる。

アルキルチオ基、アリールチオ基におけるアルキル成分
、アリール成分は上記アルキル基、アリール基が挙げら
れる。

アルケニル基としては、炭素数２〜３２のもの、シクロ
アルキル基としては炭素数３〜１２、特に５〜７のもの
が好ましく、アルケニル基は直鎮でも分岐でもよい。

シクロアルケニル基としては、炭素数３〜１２、特に５
〜７のものが好ましい。

スルホニル基トして、はアルキルスルホニル基、アリー
ルスルホニル基等； スルフィニル基としてはアルキルスルフィニル基、アリ
ールスルフィニル基等； ホスホニル基としてはアルキルホスホニル基、Ｔルコキ
シホスホニル基、アリールオキシホスホニル基、アリー
ルホスホニル基等； アシル基としてはアルキルカルボニル基、アリールカル
ボニル基等； カルバモイル基としてはアルキルカルバモイル基、アリ
ールカルバモイル基等； スルファモイル基としてはアルキルスルファモイル基、
アリールスルファモイル基等；アシルオキシ基としては
アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキ
シ基等；カルバモイルオキシ基としてはアルキルカルバ
モイルオキシ基、アリールカルバモイルオキシ基等； ウレイド基としてはアルキルウレイド基、アリールウレ
イド基等； スルファモイルアミノ基としてはアルキルスルファモイ
ルアミノ基、アリールスルファモイルアミノ基等； 複素環基としては５〜７員のものが好ましく、具体的に
は２−フリル基、２−チエニル基、２−ピリミジニル基
、２−ベンゾチアゾリル基、１−ピロリル基、１−テト
ラゾリル基等；複素環オキシ基としては５〜７員の複素
環を有するものが好ましく、例えば３．４．５．６−テ
トラヒドロピラニル−２−オキシ基、■−フェニルテト
ラゾールー５−オキシ基等； 複素環チオ基としては、５〜７員の複素環チオ基が好ま
しく、例えば２−ピリジルチオ基、２−ベンゾチアゾリ
ルチオ基、２．４−ジフェノキシ−１，３，５−トリア
ゾール−６−チオ基等シロキシ基としてはトリメチルシ
ロキシ基、トリエチルシロキシ基、ジメチルブチルシロ
キシ基等； イミド基としてはコハク酸イミド基、３−ヘプタデシル
コハク酸イミド基、フタルイミド基、グルタルイミド基
等； スピロ化合物残基としてはスピロ［３，３’］へブタン
−１−イル等； 有橋炭化水素化合物残基としてはビシクロ［２，２，１
１へブタン−１−イル、トリシクロＣ３，３，１，１’
′’　］］デカンーｌ−イル７．７−シメチルービシク
ロ［２，２，１）ヘフ９：／−１−イル等が挙げられる
。

Ｒは、前記置換基のうちでも、例えば、アルキル基、ア
リール基、カルボキシル基、オキシカルボキシル基、シ
アノ基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ
基、アミン基、アミド基及びスルホンアミド基、等の多
基及びハロゲン等が好ましい。

ｍは０又は１〜６の整数を表わすが、ｍが２〜６のとき
、複数のＲは同じであっても異なっていても良い。

また複数のＲは、互いに結合して環を形成してもよく、
線環は、飽和又は不飽和の５員環、６員環、７員環及び
８員澁等が好ましく、具体的には、ピリジン環及びキノ
リン環等が挙げられる。

上記の基は、更に長鎖炭化水素基やポリマー残基等の耐
拡散性基等の置換基を有していてもよい。

一般式〔Ｉ〕において、Ｙ及びＺの表わす置換基として
はハメットの置換基定数σｐが０．３以上１．５以下の
置換基であり、代表的には、シアノ基、ニトロ基、スル
ホニル基（例えばオクチルスルホニル基、フェニルスル
ホニル基、トリフルオロメチルスルホニル基、ペンタフ
ルオロフェニルスルホニル基等〉、β−カルボキシビニ
ル基、スルフィニル基（例えばｔ−ブチルスルフィニル
基、トリルスルフィニル基、トリフルオロメチルスルフ
ィニル基、ペンタフルオロフェニルスルフィニル基等）
、β、β″−ジシアノビニル基、ハロゲン化アルキル基
（例えばトリフルオロメチル基、パーフルオロオクチル
基、ω−ヒドロパーフルオロドデシル基等）、ホルミル
基、カルボキシル基、カルボニル基（例えばアセチル基
、ピバロイル基、ベンゾイル基、トリフルオロアセチル
基等）、アルキル及びアリールオキシカルボニル基（例
えばエトキシカルボニル基、フェノキシカルボニル基等
）、ｌ−テトラゾリル基、５−クロロ−１−テトラゾリ
ル基、カルバモイル基（例えばドデシルカルバモイル基
、フェニルカルバモイル基等）、スルファモイル基（例
えばトリフルオロメチルスルファモイル基、フェニルス
ルファモイル基、エチルスルファモイル基等〉などが挙
げられる。

これらの置換基の中で好ましいものは、シアノ基、スル
ホニル基、フルファモイル基である。

Ｘの表わす芳香族第一級アミン化合物の酸化体との反応
により離脱しつる基としては、例えばハロゲン（塩素、
臭素、フッ素等）及びアルコキシ、アリールオキシ、複
素環オキシ、アシルオキシ、スルホニルオキシ、アルコ
キシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニル、ア
ルキルオキザリルオキシ、アルコキシオキザリルオキシ
、アルキルチオ、アリールチオ、複素環チオ、アルキル
オキシチオカルボニルチオ、アシルアミノ、スルホンア
ミド、Ｎ原子で結合した含窒素複素溝、アルキルオキシ
カルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、
カルボキシル等の多基が挙げられるが、好ましくはハロ
ゲンである。これらのうち、Ｘで表わされる特に好まし
いものは、水素及び塩素である。

以下に本発明に用いられる化合物の代表的具体例を示す
。

前記本発明の化合物は、ジャーナル・才ブ・オーガニッ
ク・ケミストリー（Ｊ、Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、　）、第
３１巻、第９１９頁（１９６６年）等に記載された合成
法に準じて台底することができる。

本発明において使用し得る芳香族第一級アミン化合物と
しては、〇−又はｐ−アミノフェノール系化合物及び〇
−又はｐ−フェニレンジアミン系化合物及びそれらの塩
が挙げられる。

好ましくはｐ−フェニレンジアミン系化合物であり下記
−毅式〔■〕で示されるものである。

式中、八及びＢは水素又はアルキル基を表わし、ＡとＢ
は窒素原子と共に複素環を形成してもよ＜、Ｄ、Ｅ、Ｇ
又はＪは水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、ア
ルコキシ基、アシルアミド基、アリールスルホンアミド
基、アルキルスルホンアミド基又はアルキル基を表わす
。

八及びＢで表わされるアルキル基としては、炭素数ｌ〜
６のものが好ましく、特に１〜４のものが好ましい。例
えばメチル基、エチル基、ブチル基を挙げることができ
る。これらのアルキル基は置換基を有していてもよく置
換基としては、例えばウレイド基、テトラヒドロフリル
基、カルボキシル基、メタンスルホンアミド基、スルホ
基、メトキシ基、エトキシ基、メトキシエトキシ基、メ
トキシエトキシエトキシ基、メトキシテトラエトキシ基
が挙げられる。

Ｄ、Ｇ及びＪとしては水素、アルコキシ基及びアルキル
スルホンアミド基、アリールスルホンアミド基が好まし
く、更に好ましくは水素である。Ｅとしては水素、アル
キル基、アシルアミド基が好ましく、より好ましくは炭
素数１〜３のアルキル基特にメチル基である。また、殻
式〔■〕で示される化合物の塩としてはｐ−トルエンス
ルホン酸、スルホン酸、スルフィン酸、硫酸エステル、
スルファミン酸、チオ硫酸Ｓ−エステル、カルボン酸、
リン酸エステル、アミドリン酸、リン酸、亜リン酸エス
テル、有機ホウ素化合物、塩酸及び硫酸等の有機酸又は
無機酸の塩を挙げることができ、特にｐ−）ルエンスル
ホン酸塩、塩酸塩及び硫酸塩が好ましい。

以下に本発明に係る芳香族第一級アミン化合物の代表的
具体例を示すが、本発明はこれに限定されるものではな
い。

例示化合物 （ｎ−１）Ｎ、Ｎ−ジエチル−３−メチル−４−アミノ
アニリン （ｎ−２）Ｎ、Ｎ−ジエチル−４−アミノアニリン （Ｉ［−３）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−メチル−４−
アミノアニリン （ＩＩ−４）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−テトラヒドロ
フルフリル−３−メチル−４−アミノアニリン （ｎ−５）Ｎ−エチル−Ｎ−力ルボキシメチル−３−メ
チル−４−アミノアニリン （ＩＩ−６）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−エチル−３−
メチル−４−アミノアニリン （ＩＩ−７）Ｎ−エチル−Ｎ−テトラヒドロフルフリル
−３−メチル−４−アミノフェノール（ＩＩ−８）３−
アセチルアミノ−４−アミノジメチルアニリン （ＩＦ−９）Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンアミ
ドエチル−４−アミノアニリン （ＩＩ−１０）Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンア
ミドエチル−３−メチル−４−アミノアニリ　　ン （ｎ−１１）Ｎ−メチル−Ｎ−β−スルホエチル−ｐ−
フ二二レンジアミン （ｎ−１２）Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−
メチル−４−アミノアニリン （ｎ−１３）Ｎ−エチル−Ｎ−［２−（２−メトキシエ
トキシ〉エチルツー３−メチル−４−アミノアニリン （ｎ−１４）Ｎ−エチル−Ｎ−（２−［２−（２−メト
キシエトキシ）エトキシ］エチル）−３メチル−４−ア
ミノアニリン （ＩＩ−１５）Ｎ−エチル−Ｎ−［２−（２−［２［２
−（２−メトキシエトキシエトキシ）エトキシ〕エトキ
シコエトキシ）エチルツー３−メチル−４−アミノアニ
リン （ＩＩ−１６）　Ｎ、　Ｎ−ジエチル−３−メタンスル
ホンアミドエチル−４−アミノアニリン。

本発明に係る過酸化作用を有する物質としては、種々の
ものを用いることができるが、代表的なものとして例え
ば、ペルオキシダーゼが挙げられる。ペルオキシダーゼ
は、過酸化水素が別の物質を酸化する際の反応を触媒す
る酵素である。このペルオキシダーゼは一般に鉄ポルフ
ィリ゛ンを含有する複合タンパクであり、西洋わさび、
じゃがいも、いちじくの樹液、カブラ（植物のペルオキ
シダーゼ）、牛乳（ラクトペルオキシダーゼ）及び白血
球（ベルドペルオキシダーゼ）中に存在し、また微生物
中にも存在し、抽出又は発酵により得ることができる。

また、「アクタ・ケミ力・スカンジナビカ、（＾ｃｔａ
　Ｃｈａｍ、　５ｃａｎｄ、）第４巻、第４２２〜４３
４頁、１９５０年、セオレル（Ｔｈｅｏｒａｌｌ）及び
メーリイ（＆１ａｅ　ｈ’　１　ｙ　）著」に開示され
ているような合成ペルオキシダーゼも本発明において用
いることができる。ペルオキシダーゼのほかメトヘモグ
ロビン、オーｔ−シヘモグロビン、ヘモグロビン、アル
カリ性ヘマチン、ヘミン及びヘミン誘導体等も本発明に
おいて用いることができる。

酵素以外に過酸化作用を示すものとして、例えばチオシ
アン酸鉄、スズ酸鉄、フェロシアン酸第１鉄、シリカゲ
ルに吸着させた第ニクロム塩（例えば硫酸クロムカリウ
ム）等も用いることができる。

これらのうちでは、ペルオキシダーゼが好ましい。

本発明の方法において、過酸化水素又は過酸化水素を生
成する物質の作用により生成した過酸化水素は、過酸化
作用を有する物質の作用により、芳香族第一級アミン化
合物を酸化する。

その結果生成した芳香族第一級アミン化合物の酸化体が
本発明に係る一般式［［］で表わされる化合物とカップ
リング反応して、色素を形成する。生成される色素は、
６００〜７００ｎｍに主たる可視吸収を有し、極めて高
感度に発色を呈する。

生成した色素についての情報は、目視にて、若しくは技
術的に公知な方法例えば分光光度計を用いて読み取るこ
とができる。また、適当な有機溶剤を加え、色素を溶解
した後、情報を読み取っても良い。

本発明の分析方法は、例えば次のように実施することが
できる。

流体試料に、一般式〔Ｉ〕で表わされる化合物、芳香族
第一級アミン化合物、及び反応触媒として、過酸化作用
物質を同時に、又は適宜の順序で添加し、混合物を４℃
から４０℃、好ましくは２０℃から４０℃の範囲の温度
及びｐＨ３，０から９．０、好ましくはｐＨ４，５から
８．０の範囲において１分から６０分の時間範囲におい
て発色反応を行い、生成した色素を含有する反応混合物
の吸光度を測定する。

本発明方法は、過酸化水素の微量定量に特に有用である
。流体試料中の過酸化水素濃度は、全発色反応溶液中に
おいて、０．０１〜２００μ８／−であることが好まし
い。

この範囲の過酸化水素濃度において、一般式〔Ｉ〕で表
わされる化合物は、０．１０〜１００μｍｏｌｅ／ｍｆ
、芳香族第一級アミン化合物は、０．１０〜１０μｍｏ
ｌｅ／ｍｆ、過酸化作用物質、好ましくはペルオキシダ
ーゼであるが、０．０１〜１００単位／−の量で用いら
れることが好ましい（全発色反応溶液中において） 一般式［１］で表わされる化合物は、少量の親水性の有
機溶剤例えばメタノール、エタノール、Ｎ、Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）等に溶解して加えてもよい。

一般式〔Ｉ〕で表わされる化合物と芳香族第一級アミン
化合物とのモル比は１対１００から１００対１が適当で
あり、１対１０から１０対１が好ましい。

また、本発明の方法においては、発色試薬として一般式
〔Ｉ〕で表わされる化合物、芳香族第一級アミン化合物
及び過酸化作用物質のほかに、過酸化水素を生成する物
質を組合せることにより、最終的に分析すべき物質を該
物質の作用によって過酸化水素に導くことにより、目的
とする種々の物質の分析が可能となる。

この方法によって、分析が可能となる生物学的流体試料
中の物質としては、グルコース、コレステロール、尿酸
、クレアチニン、トリグリセリド、乳酸、遊離脂肪酸、
グルタミン酸オキザロ酢酸トランスＴミナーゼ（ＧＯＴ
）　　グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（Ｇ
ＰＴ）　　コリンエステラーゼ、クレアチンホスホキナ
ーゼ、乳酸脱水素酵素などが挙げられる。

これらの分析に用いる該物質としては、例えば、グルコ
ースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシ
ダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、グリセリン−３−
リン酸オキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ピルビ
ン駿オキシダーゼ、Ｄ−アスノ〈ラクンオキシダーゼ、
Ｄ（又はＬ）−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−グロノ−Ｔ
−ラクトンオキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ
、Ｌ−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ、６−ヒドロキシ
−Ｄ−ニコチンオキシダーゼ、６−ヒドロキシ−Ｌ−ニ
コチンオキシダーゼ、ピリドキサミンリン酸オキシダー
ゼ、ピリドキシンオキシダーゼ、ヘキソースオキシダー
ゼ、０−アミノフェノールオキシダーゼ、アミンオキシ
ダーゼ（ピリドキサール含有、又はフラビン含有）、キ
サンチンオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、エタ
ノールアミンオキシダーゼ　Ｎ６−メチル−Ｌ−リシン
オキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アシルＣｏＡオキ
シダーゼ、亜硫酸オキシダーゼ等の種々のものが挙げら
れる。

これらの該物質は、いずれの起源のものを用いてもよく
、固体粉末の形でも溶液として用いてもよい。

該物質を用いる場合は、過酸化水素を前もって発生させ
ておいてもよいが、過酸化水素の生成反応と発色反応を
同時に進行させることが好ましい。

該物質を発色試薬溶液に添加する時期は、任意であって
よく、使用量はその種類、目的とする基質に応じて任意
に選択される。

更に、本発明方法の他の実施の例として、般式［Ｉ）で
表わされる化合物、芳香族第一級アミン化合物、及び過
酸化作用物質を含有させた分析素子を挙げることができ
る。

本発明の分析素子は、分析に必要な試薬が素子中に乾燥
状態で組込まれた乾式タイプのものをいう。これらの分
析素子としては、単層のもので試薬を担持する層の材料
としてろ紙、メンブランフィルタ−等を用いるものく特
公昭３６−４１９８号、米国特許３．６０７．０９３号
等〉、また、単なる積層やはく離を前提とした非一体型
多層分析素子としてガラスフィルターやメンブランフィ
ルタ−を用いたり（特開昭４９−１１３９５号）　２枚
のろ紙の上に網をかけたもの（特開昭５４−１５１０９
６号、米国特許３．５２６、４８０号〉等が挙げられる
。

更に、本発明の分析素子として、好ましくは、液体不浸
透性、光透過性支持体上に少なくとも１つの試薬層及び
多孔性展開層を有する一体型多層分析素子（特公昭５３
−２１６７７号、特開昭５５−１６４３５９号、同５５
−９０８５９号、同５７−１９７４６６号、同５７−１
０１７６０号、同５７−１０１７６１号、同５８−９０
１６７号等）が挙げられる。

上記試薬層は水溶性ポリマー又は親水性かつ有機溶媒可
溶性ポリマーをバインダとして支持体上に塗布すること
によって層として設けることができる。水溶性ポリマー
バインダとしてはゼラチン、フタル化ゼラチン等のゼラ
チン誘導体、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシ
メチルセルロースナトリウム塩等の水溶性セルロース誘
導体、ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ−ビニルピロリ
ドン）　　ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド
、アクリルアミドとアクリル酸エステルの共重合体、ポ
リ（モノ又はジアルキル置換）アクリルアミド、ポリ　
（モノ又はジアルキル置換）メタクリル了ミド及びこれ
らの水溶性共重合体等が挙げられ、好ましくはゼラチン
、ポリアクリルアミド及びアクリルアミドとアクリル酸
エステルの共重合体が用いられる。親水性かつ有機溶媒
可溶性ポリマーバインダとしては、ポリ　（Ｎ−ビニル
ピロリドン〉　ポリ　（Ｎ−ビニルイミダゾール）　ポ
リ（Ｎ−ビニルトリアゾール）及びこれらの誘導体又は
それらの共重合体、エチルセルロース、メチルセルロー
ス等のセルロース誘導体等が挙げられる。これらのポリ
マーバインダは主としてアルコール類、例えばエタノー
ル、プロパツール、ブタノール等に溶解し且つ親水性の
高分子物質である。

上記ポリマーバインダは、選ばれる特定成分及びその分
析反応によって任意に選ぶことができる。また、選ばれ
る分析反応が２種以上の試薬から構成されている場合、
この試薬を同一試薬層内に一緒に混合して含有させても
、また、２種以上の試薬を２つ又はそれ以上の別々の試
薬層として含有させてもよい。これらの分析反応自体の
作用機構によって決定されることもあり、好ましくない
影響を及ぼさない限りにおいて、その構成は任意である
。

上記試薬層の膜厚は所望に応じて任意に選択することが
可能であるが、好ましくは１〜２００μｍ１更に好まし
くは５〜１００μｍである。

上記多孔性展開層は、（１）一定容量の流体試料を単位
面積当り試薬層に均一に配布する機能を有するものであ
る。その上、更に、特公昭５３−２１６７７号公報に記
載された性能、すなわち、（２）流体試料中の分析反応
を阻害する物質又は要因を除去する機能及び／又は（３
）分光光度分析を行うときに支持体を経て透過する測定
光を反射するパックグランド作用を行う機能を有するも
のであれば好ましい。したがって、本発明に係る多孔性
展開層は、上記（１）の機能のみを有する層、（１）に
加えて（２）及び／又は（３）の機能を併せて有する層
のいずれかとすることができ、あるいは（１）を包含す
る複数の機能を適宜分離し、各機能ごとに別の層を使用
することも可能である。更に（１）、（２）及び（３）
の機能のうち、２つの機能を有する層と、残りの１つの
機能を有する層を組合せて使用することもできる。例え
ば、前述の特公昭５３−２１６７７号公報に記載された
二酸化チタン及び二酢酸セルロースから戒るプラッシュ
ポリマーと呼称される非繊維多孔質媒体の展開層、特開
昭５５−１６４３５６号公報に記載された親水化処理し
た織物の展開層、特開昭５７−９４６５８号、同５７−
１２８４７号、同５７−１９７４６６号及び同５８−７
０１６１号等の各公報に記載された繊維構造展開層、特
開昭５８−９０１６７号公報に記載された粒子結合体構
造展開層が挙げられる。特に、上記繊維構造展開層及び
粒子結合体構造展開層は、血球部分も速やかに移送する
ことが可能な素材として特に有用である。本発明の分析
素子における展、間層の膜厚は、その空隙率によって決
定されるべきであるが、好ましくは約１００〜６００μ
ｍ１更に好ましくは約１５０〜４００μｍである。また
、空隙率は好ましくは約２０〜８５％である。

上記多孔性展開層には、選ばれる特定成分及びその分析
反応によっては、前述の試薬層の場合と同様、流体試料
中の特定成分と直接的又は間接的に関与する試薬を含有
することができる。

また他の付加的な添加剤として、例えば保恒剤、界面活
性剤等、種々の添加剤も所望に応じて添加することがで
きる。

特に界面活性剤は、流体試料を本発明の分析素子に適用
した際の浸透速度の調節等有効に用いることができる。

使用可能な界面活性剤としては、イオン性（アニオン性
又はカチオン性）、非イオン性を問わず使用することが
可能であるが、非イオン性界面活性剤が有効である。非
イオン性界面活性剤の例としては、例えば２．５−ジ−
ｔ−ブチルフェノキシポリエチレングリコール、ｐ−オ
クチルフェノキシポリエチレングリコール、ｐ−イソノ
ニルフェノキシポリエチレングリコール等のアルキル置
換フェノールのポリアルキレングリコール誘導体、高級
脂肪酸のポリアルキレングリコールエステルなどが挙げ
られる。これらの界面活性剤は流体試料の試薬層への浸
透速度を調節し、同時に好ましからざる「クロマトグラ
フィー現象」発生を抑制する効果を有する。

上記界面活性剤は広範囲に選択された量を用いることが
可能であるが、塗布液の重量に対して２５重量％〜０．
００５重量％、好ましくは１５重量％〜０．０５重量％
用いることができる。

上記の液体不浸透性の光透過性支持体（以下、本発明に
係る支持体と略す）は、液体不浸透性で、かつ光透過性
であればその種類を問わないが、例えば酢酸セルロース
、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート又は
ポリスチレンのような種々の重合体材料のみならず、ガ
ラスのごとき無機材料も用いることが可能である。

本発明に係る支持体の厚さは任意であるが、好ましくは
５〜２５μｍである。また、本発明に係る支持体の観測
側の一側面は、その目的に応じて任意に加工することが
可能である。更に試薬層を積層する側の支持体面に、場
合によっては光透過性の下塗り層を使用して試薬と支持
体との接着性を改良することができる。

上記の一体型多層分析素子は必要に応じて、例えば米国
特許３．９９２．１５８号明細書記載の反射層、下塗り
層、米国特許４．０４２．３３５号明細書記載の放射線
ブロッキング層、米国特許４．０６６、４０３号明細書
記載のバリヤ層、米国特許４．１６６、０９３号明細書
記載のマイグレーション阻止層、特開昭５５−９０８５
９号公報記載のスカベンジャ層、及び米国特許４．１１
０．０７９号明細書記載の破壊性ボッド状部材等を任意
に組合せて本発明の目的に合せて任意の構成とすること
ができる。

これら分析素子の種々の層は、本発明に係る支持体上に
所望の構成に従い、従来写真工業において用いられてい
るスライドホッパ塗布法、押出し塗布法、浸漬塗布法等
を適宜選択して用い、順次積層することで任意の厚みの
層を塗設することができる。

本発明の一般式［ＩＥで表わされる化合物を、本発明に
係る分析素子を形成するための液に添加する方法は、上
記化合物の化学構造等に応じて、適宜選択することがで
きる。例えば、水、緩衝剤水溶液、有機溶媒等に溶解し
て添加する方法、固体分散法、ラテックス分散法、水中
油滴型乳化分散法等種々の方法を用いることができる。

氷中油滴型乳化分散法は、従来写真工業において公知の
カプラー等の疎水性添加物を分散させる方法が適用でき
、通常、高沸点溶媒及び／又は低沸点溶媒に溶解し、ア
ニオン系界面活性剤及び／又はノニオン系界面活性剤を
含むゼラチン等の親水性コロイドを含む水溶液と混合し
、高速回転ミキサ、コロイドミル、フロージェットミキ
サ、超音波分散装置等で乳化分散して用いることができ
る。

高沸点溶媒としては、例えば有機酸アミド類、カルバメ
ート類、エステル類、ケトン類、尿素誘導体等、特に、
ジ−ｎ−ブチルフタレート、トリクレジルホスフェ−）
、）リフェニルホスフェート、ジイソオクチルアセテー
ト、ジ−ｎ−ブチルセバケート、）リ−ｎ−へキシルホ
スフェート、Ｎ、Ｎ−ジエチルカプリルアミド、Ｎ、Ｎ
−ジエチルラウリルアミド、ｎ−ペンタデシルフェニル
エーテル、ジオクチルフタレート、ｎ−ノニルフェノー
ル、３−ペンタデシルフェニルエチルエーテル、２．５
−ジー５ｅｃ−アミルフェニルブチルエーテル、モノフ
ェニル−ジー０−クロロフェニルホスフェートするいは
、フッ素化パラフィン等が挙げられる。これらの中でも
、ジアルキルフタレート特に炭素数１〜６のアルキル基
を有するものが好ましい。

低沸点溶媒としては、例えば、酢酸メチル、酢酸プロピ
ル、酢酸ブチル、プロピオン酸ブチル、シクロヘキサノ
ール、ジエチレングリコールモノアセテート、ニトロメ
タン、四塩化炭素、クロロホルム、シクロへ牛サン、テ
トラヒドロフラン、メチルアルコール、アセトニトリル
、ＤＭＦ、ジオキサン、メチルエチルケトン等が挙げら
れる。

アニオン系界面活性剤としては、例えばアルキルベンゼ
ンスルホン酸、アルキルナフタレンスルホン酸等が、ノ
ニオン系界面活性剤としてハ、例えばソルビタンセスキ
オレイン酸エステル、ソルビタンモノラウリン酸エステ
ル等が挙げられる。

本発明の分析素子は、前記の過酸化作用を有する物質、
−ａ式〔Ｉ〕で表わされる化合物以外に、分析すべき成
分の種類に応じて、過酸化水素を生成する物質及び他の
酵素、基質、緩衝剤、保恒剤、界面活性剤、硬膜剤等の
種々の試薬を含有することができる。

本発明に係る過酸化作用を有する物質は広範囲に選択さ
れた量を用いることが可能であるが、例えばペルオキシ
ダーゼの場合は、１００〜１、　（１００，０ＯＯＬＩ
／ｆｆ１２、好ましくは１．０００〜１００．０００［
Ｊ／＋ｎ２の範囲で用いることができる。

前述したように、本発明の方法によれば、生成される色
素は、極めて高感度に発色を呈するために、本発明の分
析素子は、流体試料が例えば、人血清中の微量成分（例
えば、尿酸、クレアチニン、ＧＯＴ、ＧＰＴ等）に対し
ても鋭敏に対応し、微量成分の定量に特に有用である。

本発明において、本発明に係る過酸化作用を有する物質
、一般式〔Ｉ〕で表わされる化合物は、例えば、一体型
多層分析素子の場合、試薬層、多孔性展開層及びその他
の層のいずれの層に含有させることもできる。

本発明の分析素子を用いて、過酸化水素又は過酸化水素
を生成する物質を定量するに当っては、分析素子を流体
試料中に浸漬するか流体試料を分析素子上に滴下し、反
射スペクトロホトメ）　＋Ｊ−により初速産性又は反応
終点法に従って測定することができる。このようにして
得られた測定値は、あらかじめ作成しておいた検量線に
当てはめることで過酸化水素又は過酸化水素を生成する
物質の量を決定することができる。

１０発明の分析素子に適用される流体試料と生物学的、
非生物学的流体試料であれ、過酸化水素又は過酸化水素
を生成する物質を含むものであればよい。例えば、血液
（血漿−血清を含む）リンパ液、尿等が挙げられる。

また、用いる流体試料の量は、試験片の場合には試薬を
含む吸収性担体に流体試料が十分含浸される量以上であ
れば任意である。一方、体型多層分析素子の場合も任意
であるが、好ましくは約５０μｌ〜約５μｌであり、更
に好ましくは約２０１Ｊ１〜約５μｍである。通常約１
０μｌの流体試料を適用することが好ましい。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はこれら実施例によりその範囲を限定されるものでは
ない。

実施例１ にトロセルロース膜上での抗原の測定）純水にて洗浄後
、風乾したニトロセルロース膜（バイオラッド社製；厚
み０．４５μｍ）にリン酸緩衝液（以下ＰＢＳと称す）
にて段階希釈したヤギＩｇＧのｌμｌをスポットした。

風乾後１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）　−ＰＢＳ溶液
により４℃にて一晩プロッキングを行い、次いでペルオ
キシダーゼ標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（カッペル社製
；１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液により１５００倍希釈したも
の）と４℃２時間反応させた。

０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０　（ポリオキシ
エチレンソルビタンモノラウレート：和光純薬社製）−
ｐｅｓ溶液にて５回洗浄し発色用基質試液中に浸漬した
。発色用基質試液として次の３種を用い、比較した。

（１）　：　３　ｍｇの４−クロロ−１−ナフトールを
１ｍｅのメタノールに溶解し、５ｍｌの０．０５Ｍ）リ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４，２００ｍＭ　ＮａＣ１含有
；以下ＴＢＳと称す）を加え、更に３％過酸化水素２０
μｌを加える。

（２）：３■の化合物例Ｉ−３を１−のメタノールに溶
解し、５−のＴＢＳを加え、１■の化合物例ｌｌ−１０
（硫酸塩）を加え、更に３％過酸化水素水２０μｌを加
える。

（３）＝（２）の化合物例Ｉ−３、化合物例ｎ−１０（
硫酸塩）の代りに化合物例■−１７、化合物例■−１（
塩酸塩）を使用し、（２）と同様に調製。

（４）：（２）の化合物例Ｉ−３、化合物例ｌｌ−１０
（硫酸塩）の代りに化合物例ｌ−２７、化合物例■−１
６（ｐ−）ルエンスルホン酸塩）ヲ使用シ、（２）と同
様に調製。

１５分間反応後、充分水洗し、風乾した。発色用基質試
液〔１）を用いた場合、スポットは１０ｎｇのヤギＩｇ
Ｇ　Ｌか検出できなかったが、発色用基質試液（２）〜
（４）を用いた場合１ｎｇのヤギ［ｇＧのスポットが検
出可能であった。

実施例２ （抗体及びハイブリドーマのスクリーニング）Ｃ１−ア
ンチトリプシン５０μｇをフロイントの完全アジュバン
トと共にＢａ１ｂ／［：マウス（雌、６週齢）の腹腔内
に注射した。３週間後、更にαビアンチトリブシン５０
μｇをフロイントの不完全アジュバントと共に腹腔内に
注射し、更に２週間後α１アンチトリプシン３０μｇを
ＰＢＳに溶解し、静脈注射した。最終免疫の３目抜膵臓
細胞を取出し、常法に従い、マウスミエローマ細胞ｘ　
６３．６．５．３と融合した。９６穴プレ一ト５枚に分
配しＨＡＴ選択培地にて培養した。

融合の３週間後ハイブリドーマのコロニーが生成したウ
ェルについて、抗体の測定を以下の方法にて行った。

ニトロセルロースを４ｎｏｎ角の正方形に切断し、各々
にＣ１−アンチトリプシン５０Ｄμｇ　／　ｍｌ　ＰＢ
Ｓ溶液１μｌをスポットした。９６穴マイクロタイター
プレート１穴当り１枚ずつ加え、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶
液にて４℃、−晩ブロッキングした。ＰＢＳにて洗浄後
、ハイブリドーマの培養上清４０μｍを加え、室温にて
２時間反応させた。０，０５％ツイーン−２０−ＰＢＳ
溶液にて３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
マウスイムノグロブリン抗体（カッペル社製；１％ＢＳ
ＡＰＢＳ溶液にて１５００倍希釈したもの）を４０μｌ
加え、室温にて２時間反応させた。０．０５％ツイーン
−２０−ＰＢＳ溶液にて３回洗浄後、発色用基質試液を
加え、ニトロセルロース上に色素１が生成したものを抗
体活性陽性とした。発色用基質試液として（１）：実施
例１の（１）と同様（２）：実施例１の（３）と同様の
２種類を用い比較した。

測定した３５０穴のうち（１）の試液を用いた場合は１
５穴しか抗体活性陽性ハイブリドーマが検出できなかっ
たが本発明の（３）の試液を用いた場合２３穴に抗体活
性陽性ハイブリドーマを検出することができた。

実施例３（発色感度の比較） 流体試料（０，５■／ｒｎｌの過酸化水素溶液）５０μ
ｌに対して、下記の方法によって調製した発色試薬溶液
を５１ｎｌの割合で混合し、室温に５分間放置した後、
生成した色素のλｍａｘにおける吸光度を過酸化水素ブ
ランクを対照にして測定した。

発色試薬溶液の調製 一般式［Ｉ）の化合物Ｑ、５　μｔｎｏ１ｅをＤＭＦ　
１−１一般式〔■〕の化合物１２．５μｍｏｌｅ及びぺ
ルナキシダーゼ１０単位をＰＢＳ　（ｐＨ７，４）　５
−に各々溶解し、次いで両溶液を混合し、発色試薬溶液
とする。

発色試薬　　　吸光度　　検出波長 （ｎｍ） 本発明　Ｉ　−１＋　ｎ　−１０ （硫酸塩）　　１．１６　　　７４０ 比較例　　４−７ミノアンチビリン ＋フエノール　　　　　　　　ＯＪ５　　　　　　　５
０５本発明の発色試薬が、高感度に発色色素を生成して
いることがわかる。

実施例４　グルコースの測定 （１）発色試薬溶液の調製 グルコースオキシダーゼ２０単位、ペルオキシダーゼ７
．５単位、化合物例ｌｌ−１塩酸塩１２．５、ｕｍｏｌ
ｅをＰＢＳ　（ｐＨ７，４）　　５−に、化合物例Ｉ−
７の０．５　μｍｏｌｅをＤＭＦｌｍｆに溶解し、次い
で両溶液を混合し、発色試薬溶液とした。

（２）　グルコース溶液の調製 グルコース１０■をＰＢＳ　（ｐｆｌ　７．４）　　５
−に溶解し、これをグルコース溶液とする。

（３）　　グルコースの測定 発色試薬溶液５ｒｎｌとグルコース溶液４０μｌをとり
、３７℃で１０分間インキコベートした後、グルコース
ブランクを対照として、７４０ｒ＋ｍで吸光度を測定し
、その値は、０．９８であった。

一方、比較として、Ｉ−７、ｎ−１の代りにフェノール
、４−アミノアンチピリン塩酸塩を用いて測定し、その
吸光度は、０．１８であった。

これから明確なように、本発明の方法は、従来の方法に
比べて、著しく感度が高い測定方法である。

実施例５　総コレステロール用分析素子膜厚１８０μｍ
の透明な下引済ポリエチレンテレフタレート支持体上に
以下に示す組成の試薬層、中間層及び展開層を順次設け
、後記表−１に示す本発明の分析素子１〜３及び比較分
析素子−（１）を作成した。

試薬層（Ｒ−１） 化合物例Ｉ　−４４，５９ｇ／ｍ” ジブチルフタレート　　　　　　２ＪＯｇ／ｍ”ゼラチ
ン　　　　　　　　　　　１６．５　ｇ／ｍ”ペルオキ
シダーゼ　　　　　　１２．５００　Ｕ／　ｍ”リン酸
カリウム緩衝液 （ｐＨ６，８）　　　　　　　　　　　　３．２５　ｇ
／　ｍ２トリイソプロピルナフタレン スルホン酸ナトリウム　　　　０．９３ｇ／ｍ”１．２
−ビス（ビニルスルホ ニル）エタン　　　　　　　　０、ｌ１ｇ／ｍ’アジ化
ナトリウム　　　　　　　０．１８ｇ／ｍ’化合物例Ｉ
−４は、酢酸エチル及びジブチルフタレートに溶解後、
トリイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウム及び
ゼラチンの水溶液に加え、超音波分散して使用。

試薬層（Ｒ−２） 化合物例Ｉ−４の代りに、化合物例ｌ−１５の３．８７
ｇ／ａ＋２、ジブチルフタレート１．９４ｇ／ｍ２を用
いた以外は試薬層Ｒ−１と同様に調製。

試薬層（Ｒ−３） 化合物例Ｉ−４の代りに、化合物例ニー１９の４、３８
　ｇ　／　ｔｎ”、ジブチルフタレー）　２．１９ｇ　
／　ｔｎ”を用いた以外はＲ−２と同様に調製。

試薬層（Ｒ−４） ４−アミノアンチピリン 塩酸塩 １．７−シヒドロキシナフタレン ゼラチン ペルオキシダーゼ リン酸カリウム緩衝液 （ｐＨ６，８） １．５９ １．１８ １６．５ １２．５００ ｇ／ｍ２ ｇ／＋ｎ２ ｇ　／　ｍ　２ Ｕ／ｍ２ ３．２５　　ｇ／ｍ” トリイソプロピルナフタレン スルホン酸ナトリウム ０．９３　　ｇ／ｍ” １．２−ビス（ビニルスルホ ニル）エタン　　　　　　　　０．１１　ｇ／ｍ”アジ
化ナトリウム　　　　　　　０．１８　ｇ／ｍ２中間層
（実施例、比較例に共通）（Ｉ−１）展開層（Ｓ−１） トリオキシエチレンモノ ラウレート 化合物例ｌｌ−１０（硫酸塩） １１．７　　ｇ／ｍ２ ０．１４ｇ／ｍ’ ジメゾン　　　　　　　　　　　　１．７５　ｇ／ｍ’
コレステロールエステラーゼ　２．５００　Ｕ／ｍ２コ
レステロールオキシダーゼ　２．５００口／ｍ２牛血清
アルブミン　　　　　　　２．５　　ｇ／　［＋１”コ
レステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダ
ーゼは、牛血清アルブミンと一緒に水に溶解し、凍結乾
燥後微粉末化したものを使用。

上記展開層はキシレン溶媒にて塗設。

展開層（Ｓ−２’） 実施例試料の展開層（Ｓ−１）から、化合物例■−１０
硫酸塩、ジメゾンを除いた以外は、展開層（Ｓ−１）と
同様に調製。

表 上記本発明の分析素子−１〜３並びに比較分析素子−（
１）に対して、各種総コレステロール濃度のヒト血清を
１０μｌ展開層上に滴下し、３７℃で７分間インキュベ
ーションを行った後、６５０ｎｍ（比較分析素子につい
ては、５４６　ｎｍ）のフィルターを用いて反射濃度を
支持体側から測定し、表−２の結果を得た。

表　　−２ 化合物例Ｉ−８ ジブチルフタレート ゼラチン ペルオキシダーゼ グルコースオキシダーゼ ５．８１ ２．９１ １５．５ ３３．０００ ２１．０００ ｇ／　ｍ　２ ｇ　／　ｍ　２ ｇ　／　ｍ　２ ０７ｍ２ ［１／ｍ２ 上記表−２の結果から明らかなように、本発明の分析素
子１〜３は、比較分析素子−（１）に比し、総コレステ
ロール濃度の差に対して良好な発色濃度差を示し、識別
能力つまり定量感度が高いことがわかる。

実施例６　グルコース用分析素子 膜厚１８０μｍの透明は下引済ポリエチレンテレフタレ
ート支持体上に以下に示す組成の試薬層、中間層、及び
展開層を順次設け、表−３に示す本発明の分析素子−４
，５及び比較分析素子−（２）を作成した。

試薬層（Ｒ−５） アジ化ナトリウム ０．１１　　ｇ／ｍ２ 化合物例Ｉ−８は、実施例５に記載の方法と同様に分散
して使用。

試薬層（Ｒ−６） 化合物例Ｉ−８の代りに、■−２３の４．７５ｇ／ｍ２
、ジブチルフタレー）　２．３８ｇ　／ｌｌＩ２を用い
た以外は、試薬層Ｒ−４と同様に調製。

試薬層（Ｒ−７） ４−アミノアンチピリン塩酸塩　１．７９　ｇ／ｍ２１
．７−シヒドロキシナフタレン　１．３３ｇ／ｃｎ”ゼ
ラチン　　　　　　　　　　１５．５　　ｇ／ｍ’ペル
オキシダーゼ グルコースオキシダーゼ ３３、０００　　Ｕ／　［＋１２ ２１．０００　１Ｊ／ｍ” リン酸カリウム緩衝液 （ｐＨ６，１） ２．８２　　ｇ／ｍ” トリイソプロピルナフタレン スルホン酸ナトリウム アジ化ナトリウム ０．９６ｇ／ｍ’ ０．１１　　ｇ／ｍ’ １．２−ビス（ビニルスル ホニル）エタン　　　　　　　０．１０　ｇ／ｍ２中間
層（実施例、比較例に共通）（Ｉ−２）酸塩）　０．１
５ｇ　／　ａｎ２を使用した以外は、展開層（Ｓ−３）
と同様に調製。

展開層（Ｓ−５） 展開層（Ｓ−３＞から、化合物例Ｉ［−１６、ジメゾン
を除いた以外は、展開層（Ｓ−３）と同様に調製。

表　　−３ 展開層（Ｓ−３） 口紙原材料用繊維 〔東洋口紙■、　４０〜１００メツシユ］　　　９１．
Ｏｇ／ｍ２ト　リ　ト　ン　Ｘ　−１００９，１ｇ／　
ｍ’化合物例■−１６ （ｐ−トルエンスルホン酸塩）　　０．１５８／　ｍ２
ジメゾン　　　　　　　　　　　１．９０　ｇ／ｍ’展
開層（Ｓ−４） 化合物例■−１６の代りに化合物例ｎ−１０（硫上記本
発明の分析素子−４，５並びに比較分析素子−（２）に
対して、各種グルコース濃度のヒト血清を１０μｌ展開
層上に滴下し、３７℃で７分間インキュベーションを行
った後６５０　ｎｍ（比較分析素子については、５４６
　ｎｍ）のフィルターを用いて反射濃度を支持体側から
測定し、表−４の結果を得た。

表　　−４ 上記衣−４の結果から明らかなように、本発明の分析素
子−４，５は、比較分析素子−（２）に比し、グルコー
ス濃度の差に対して良好な発色濃度差を示し、識別能力
つまり定量感度が高いことがわかる。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように、本発明の分析素子では、定
量感度が著しく改善されるという顕著な効果が奏せられ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分析対象の特定成分を、ペルオキシダーゼを標識と
   して有している標識体を用い、ペルオキシダーゼの酵素
   反応により生成した色素量によって測定する該特定成分
   の分析方法において、該酵素反応の基質として、過酸化
   水素、芳香族第一級アミン化合物、及び下記一般式〔
   I 〕： ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔 I 〕 〔式中、Ｒは置換基を表わし、ｍは０又は１〜６の整数
   を表わす。ｍが２〜６の整数のとき、複数のＲは同じで
   あっても異なっていてもよい。Ｙ及びＺはハメットの置
   換基定数σｐが０．３以上１．５以下の置換基であり、
   ＹとＺは同じであっても異なっていてもよい。Ｘは水素
   又は芳香族第一級アミン化合物の酸化体との反応により
   離脱する置換基を表わす〕で表わされる化合物を用いる
   ことを特徴とする特定成分の分析方法。 ２、芳香族第一級アミン化合物、及び請求項１記載の一
   般式〔 I 〕で表わされる化合物からなることを特徴と
   する発色試薬。 ３、過酸化作用を有する物質、及び請求項２記載の発色
   試薬からなることを特徴とする過酸化水素分析用発色試
   薬。 ４、過酸化水素を生成する物質、及び請求項３記載の発
   色試薬からなることを特徴とする過酸化水素分析用発色
   試薬。 ５、支持体上に、少なくとも試薬層と、その上方に展開
   層を有する、請求項１記載の分析方法に使用する分析素
   子において、該分析素子が、請求項４記載の発色試薬の
   各成分を、同一又は異なるいずれかの層に含有している
   ことを特徴とする分析素子。