JPH03254698A - 分析方法、それに使用する試薬及び分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、特定成分の分析方法に関し、特にペルオキシ
ダーゼの酵素反応を用いる特定成分の分析方法、それに
使用する発色試薬及び分析素子に関する。

〔従来の技術〕

生体成分などの特定成分を検出する各種の分析方法が開
発されて来ているが、それらの方法の中量も精度の高い
方法として、該特定成分とこれに対して特異的に結合し
つる物質（以後、特異結合物質と称する）、例えば抗原
と抗体、ある種の糖鎖とレクチン、ビオチンとアビジン
、プロティンＡとＩｇＧ　、ホルモンとレセプタ、酵素
と基質等の間の特異的結合反応を用いる方法が知られて
いる。

一般的には何らかの標識（ラベル）を付した特異結合物
質（以後、標識体と称する）を用い特定成分に応じて変
化した該標識のシグナルを検出することにより特定成分
の分析が行われる。

特に支持体に直接的に又は間接的に担持させた特定成分
を標識体と反応させ、両者の複合体として標識体を固定
し、実質的に特定成分に応じた標識からのシグナルを検
出する方法が適宜用いられる。

例えば電気泳動したタンパク質生体成分（特定成分）を
ゲルからニトロセルロース膜上に転写担持し、標識体、
例えば抗体標識体と反応させシグナルを検出する方法、
ＴＬＣプレート上に展開した脂質等の特定成分にＳ識体
を反応させシグナルを検出する方法、膜上でＤＮＡと該
ＤＮＡに対する標識した相補的ＤＮＡとを反応させシグ
ナルを検出する方法又は免疫組織化学染色法などである
。

これらの方法により、特定成分の定量や特定成分の特異
結合物質との反応性だけでなく、特定成分若しくは特異
結合物質の性質、存在状態などに対する多大な情報を得
ることができる。

例えば電気泳動後膜上に転写、担持されたタンパク質や
核酸、又はＴＬＣ上に展開した脂質成分等の生体の特定
成分と該特定成分に対する標識体とを結合させた複合体
上にシグナルを検出する方法においては特定成分のシグ
ナルの位置、移動度から該特定成分の分子量、等電点又
は極性等の情報が得られる。

また免疫組織化学染色法においては、組織上の目的とす
る特定成分の存在場所、状態等の情報が得られる。

前記した、支持体上に直接又は間接的に担持させた複合
結合体上に実質的に特定成分量に応じてシグナルを検出
する特定成分の測定では対象とする特定成分が微量であ
るため標識が高感度に検出されること、また特定成分に
対するより多くの情報を得るため標識の検出法が高い分
解能をもったものであることが必須である。

特異結合物質の標識としては、放射性同位元素、蛍光物
質、発光物質、酵素等が用いられている。

放射性同位元素は放射活性の減衰や廃棄、被ばく又は設
備に６費を要する等の問題があり、更に支持体に担持さ
せた標識体上にシグナルを検出する煩雑な操作を要する
欠点がある。

蛍光物質若しくは発光物質は特殊な装置、設備が必要で
ある。

一方、酵素を用いた場合、操作も比較的簡単で生成色素
はたやすく可視化でき、定量も可能である。従来、標識
酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ
、β−ガラクトシダーゼ等が用いられてきた。支持体上
に担持させた複合結合体上に酵素反応により色素を生成
、沈着させる方法において、標識酵素としてペルオキシ
ダーゼが主として用いられ、その際、基質として、従来
ジアミノベンジジン、０−ジアニシジン、４−クロロ−
ｌ−ナフトール等力使用されてきた。

〔発明が解決しようとする課題〕

ジアミノベンジジンや０−ジアニシジンは毒性が強くバ
ックグランドが出やすい欠点がある。

４−クロロ−１−ナフトールは他に比べやや感度が高い
が、より微量の特定成分を測定するため、若しくは、特
定成分に対するより多くの情報を明確に得るには、感度
は充分とは言えない。

その他、従来公知の各化合物、あるいはそれらの組合せ
を用いる方法も有用ではあるが、例えば、生物学的流体
試料（例えば血清）中に存在する低レベルの尿酸、クレ
アチニン、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナー
ゼ（ＣＵＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナ
ーゼ（ＧＰＴ）等を過酸化水素に導いて定量する際には
、定置すべき過酸化水素の濃度が非常に低いため、これ
らの定量に対する識別感度としてはまだ充分とは言い難
い。

本発明の目的は、過酸化作用を有する物質の存在下での
過酸化水素又は過酸化水素を生成する物質の定量におい
て、簡易に且つ高感度、高分解能でありしかも迅速な特
定成分の分析方法、それに使用する発色試薬、及び分析
素子を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は特定成分の
分析方法に関する発明であって、分析対象の特定成分を
、ペルオキシダーゼを標識として有している標識体を用
い、ペルオキシダーゼの酵素反応により生成した色素量
によって測定する該特定成分の分析方法において、該酵
素反応の基質として、過酸化水素、芳香族第一級アミン
化合物、及び下記一般式ＣＩ］〜〔■〕　：〔式中、Ｒ
は置換基を表わし、ｍは０又は１〜５の整数を表わし、
ｎは０又は１〜３の整数を表わす。ｍ又はｎが２以上の
整数のとき、複数のＲは同じであっても異なっていても
よい。Ｚは５員から７員の含窒素複素環を形成するのに
必要な原子群を示し、Ｘは水素又は芳香族第一級アミン
化合物の酸化体との反応により離脱する置換基を表わす
〕のいずれかで表わされる化合物を用いることを特徴と
する。

また、本発明の第２の発明は発色試薬に関する発明であ
って、芳香族第一級アミン化合物、及び上記第１の発明
における一般式（Ｉ］〜［Ｉｎ［］のいずれかで表わさ
れる化合物からなることを特徴とする。

更に、本発明の第３の発明は、過酸化水素分析用発色試
薬に関する発明であって、過酸化作用を有する物質、及
び上記第２の発明の発色試薬からなることを特徴とする
。

更にまた、本発明の第４の発明は、別の過酸化水素分析
用発色試薬に関する発明であって、過酸化水素を生成す
る物質、及び上記第３の発明の発色試薬からなることを
特徴とする。

そして、本発明の第５の発明は、分析素子に関する発明
であって、支持体上に、少なくとも試薬層と、その上方
に展開層を有する、前記第１の発明の分析方法に使用す
る分析素子において、該分析素子が、上記第４の発明の
発色試薬の各成分を、同一又は異なるいずれかの層に含
有していることを特徴とする。

次に本発明の詳細な説明する。

本発明において、特定成分は支持体に物理的吸着、化学
的結合等により直接的に担持されてもよく、１つ以上の
特異結合物質を介して間接的に担持されてもよい。また
、特定成分を支持体上に直接若しくは間接的に担持させ
た後、前記標識体を反応させ前記複合結合体を形威させ
てもよいし、あるいは複合結合体を形成させた後に該複
合結合体を支持体上に直接若しくは間接的に担持させて
もよい。更に標識体は該特定成分と複合結合体を形威し
、支持体に担持されるが、特定成分と標識体は直接結合
してもよく、１つ以上の他の特異的結合物質を介して結
合してもよい。

また本発明において、標識体はペルオキシダーゼと抗ペ
ルオキシダーゼ抗体とで特異結合物質を重複して標識し
たものであってもよい。

従来の過酸化水素及び４−クロロ−１−ナフトールを基
質として用いるアナリティカル　バイオケミストリー（
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、
第１１９巻、第１４２〜１４７頁（１９８２）に記載の
方法と比べ本発明の方法は発色時間が短縮され、スポッ
トは鮮明で感度は１０倍以上上昇した。また、その結果
、ペルオキシダーゼ標識体の量を低減することができコ
スト的にも有利である。本発明において、対象とする特
定成分は、その特定成分に特異的に結合する特異結合物
質が得られる物質又は物質群である。

例えばタンパク質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、
糖脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体等が挙げ
られる。

また本発明に使用し得る特異結合物質は、特定成分又は
他の特異結合物質と特異的に結合できる物質であり、特
定成分に応じて適当に選ぶことができる。例えば、タン
パク質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖脂質、多
糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチン、プロテ
ィンＡ１アビジン、ビオチン、レセプター、補酵素、酵
素の基質、毒素、補体及びこれらの複合体等が挙げられ
る。

本発明に使用し得る支持体としては、セルロース、アセ
テート、ニトロセルロース等の膜、ポリアクリルアミド
等のゲル状支持体、ＴＬＣプレート等のシリカゲル担体
、ブレード状、ビーズ状のプラスチック、ガラス、金属
、繊維等が挙げられる。また組織化学染色においては、
組織そのものも支持体として使用できる。

以下、具体的に本発明を説明する。

−船式〔Ｉ〕、ＣＨＩ］及び〔■〕におけるＲの表わす
置換基としては、特に制限はない。代表的には、アルキ
ル、アリール、アニリノ、アシルアミノ、スルホンアミ
ド、アルキルチオ、アリールチオ、アルケニル、シクロ
アルキル等の多基が挙げられるが、この他にハロゲン及
びシクロアルケニル、アルキニノペ複素澁、スルホニル
、スルフィニノペホスホニル、アシル、カルバモイル、
スルファモイル、シアン、アルコキシ、スルホニルオキ
シ、アリールオキシ、複素環オキシ、シロキシ、アシル
オキシ、カルバモイルオキシ、アミノ、アルキルアミノ
、イミド、ウレイド、スルファモイルアミノ、アルコキ
シカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ
、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、
複素環チオ、チオウレイド、カルボキシル、ヒドロキシ
、メルカプト、ニトロ、スルホン酸等の多基、並びにス
ピロ化合物残基、有橋炭化水素化合物残基等も挙げられ
る。

Ｒの表わす置換基のうち、アルキル基としては、炭素数
１〜３２のものが好ましく、直鎖でも分岐でもよい。

アリール基としては、フェニル基が好ましい。

アシルアミノ基としては、アルキルカルボニルアミノ基
、アリールカルボニルアミノ基等が挙げられる。

スルホンアミド基としては、アルキルスルホニルアミノ
基、アリールスルホニルアミノ基等が挙げられる。

アルキルチオ基、アリールチオ基におけるアルキル成分
、アリール成分としては上記のアルキル基、アリール基
が挙げられる。

アルケニル基としては、炭素数２〜３２のもの、シクロ
アルキル基としては炭素数３〜１２、特に５〜７のもの
が好ましく、アルケニル基は直鎮でも分岐でもよい。

シクロアルケニル基としては、炭素数３〜１２、特に５
〜７のものが好ましい。

スルホニル基としてはアルキルスルホニル基、アリール
スルホニル基等； スルフィニル基としてはアルキルスルフィニル基、アリ
ールスルフィニル基等； ホスホニル基としてはアルキルホスホニル基、アルコキ
シホスホニル基、アリールオキシホスホニル基、アリー
ルホスホニル基環； アシル基としてはアルキルカルボニル基、アリールカル
ボニル基等； カルバモイル基としてはアルキルカルバモイル基、アリ
ールカルバモイル基等； スルファモイル基としてはアルキルスルファモイル基、
アリールスルファモイル基等；アシルオキシ基としては
アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキ
シ基等；カルバ°モイルオキシ基としてはアルキルカル
バモイルオキシ基、アリールカルバモイルオキシ基等； ウレイド基としてはアルキルウレイド基、アリールウレ
イド基等； スルファモイルアミノ基としてはアルキルスルファモイ
ルアミノ基、アリールスルファモイルアミノ基等； 複素環基としては５〜７員のものが好ましく、具体的に
は２−フリル基、２−チエニル基、２−ピリミジニル基
、２−ベンゾチアゾリル基、１−ピロリル基、１−テト
ラゾリル基等；複素環オキシ基としては５〜７員の複素
環を有するものが好ましく、例えば３，４，５．６−テ
トラヒドロピラニル−２−オキシ基、１−フェニルテト
ラゾール−５−オキシ基等；複素環チオ基としては５〜
７員の複素環チオ基が好ましく、例えば２−ピリジルチ
オ基、２−ベンゾチアゾリルチオ基、２，４−ジフェノ
キシ−１，３，５−トリアゾール−６一チオ基等； シロキシ基としてはトリメチルシロキシ基、トリエチル
シロキシ基、ジメチルブチルシロキシ基等； イミド基としてはコハク酸イミド基、３−ヘプタデシル
コハク酸イミド基、フタルイミド基、グルタルイミド基
等； スピロ化合物残基としてはスピロ［３，３］へブタン−
１−イル等； 有橋炭化水素化合物残基としてはビシクロ［２，２，１
］へブタン−１−イル、トリシクロ［：３．３．１．１
３・７］デカン−１−イル、７．７−ジメチル−ビシク
ロＣ２，２，１〕へブタン−１−イル等が挙げられる。

Ｒは、前記置換基のうちでも、例えばアルキル基、アリ
ール基、カルボキシル基、オキシカルボキシル基、シア
ノ基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基
、アミン基、アミド基及びスルホンアミド基、等の多基
及びハロゲン等が好ましい。

ｍはＯ又は１〜５の整数を表わし、ｎは０又は１〜３の
整数を表わす。ｍ又はｎが２以上の整数のとき、複数の
Ｒは同じであっても異なっていても良い。

また複数のＲは、互いに結合して環を形成していてもよ
く、鉄環は、飽和又は不飽和の５員環、６員環、７員澁
及び８員環等が好ましく、具体的には、ピリジン轟及び
キノリン環等が挙げられる。

上記の基は、更に長鎖炭化水素基やポリマー残基等の耐
拡散性基等の置換基を有していてもよい。

Ｘの表わす芳香族第一級アミン化合物の酸化体との反応
により離脱しろる基としては、例えばハロゲン（塩素、
臭素、フッ素等）及びアルコキシ、アリールオキシ、複
素環オキシ、アシルオキシ、スルホニルオキシ、アルコ
キシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニル、ア
ルキルオキザリルオキシ、アルコキシオキザリルオキシ
、アルキルチオ、アリールチオ、複素環チオ、アルキル
オキシチオカルボニルチオ、アシルアミノ、スルホンア
ミド、Ｎ原子で結合した含窒素複素環、アルキルオキシ
カルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、
カルボキシル等の多基が挙げられる。

一般式〔Ｉ〕、〔■〕及び〔■〕において、Ｚの表わす
原子群としては特に制限はないが、非金属原子群である
ことが好ましく、更に好ましくはＺの表わす電子群中に
次のユニットが含まれる場合である。

Ｒ′及びＲ′は前述したＲと同様の置換基を表わし、上
記ユニットは複数若しくは連結した形で使用してもよい
。

一般式〔Ｉ〕、［ＩＩ］及び〔■〕のうちより好ましい
ものは一般式［Ｉ］及び［ＩＩ］で示される化合物群で
ある。

以下に本発明に用いられる化合物の代表的具体例を示す
。

−１ −２ −５ −３ −６ −７ ＣＨ．ＣＯＮＨ　　Ｃｌ Ｉ−８ ■ ＮＨＣＯＣＩａＨｓｓ　（１） Ｉ −９ Ｎ）ＩＣＯＣ２ＨＳ ■ Ｃ＋−Ｈ２ｓＳＯ２ＮＨ ■ ■ ［”１ ■ ０゜ Ｃ１１ＨＩ７（ｔ） ■ ■ 　１ ５ＣＨ２ＣＨ３ （１）ＵｓＨ＋ｔＳＬＩＪＨ Ｉ ■ １ ＯＯＨ ■ 　１ −２ Ｉ−４ Ｉ−５ −６ ０゜ Ｃ１，Ｈ２ｓＣＯＮＨ ■ （ｔ）ＣａＬｔＳＯＪＨ ■−３ −７− Ｉ−９ ■　− ｌｌｌ−１ １ｎ−４ −２ Ｉ［［−５ しｌ ｌｌ−３ ＩＩ−６ −７ 本発明において使用し得る芳香族第一級アミン化合物と
しては、〇−又はｐ−アミノフェノール系化合物及び〇
−又はｐ−フェニレンジアミン系化合物及びそれらの塩
が挙げられる。

好ましくはｐ−フェニレンジアミン系化合物であり下記
一般式［ＩＶ］で示されるものである。

Ｂ ＼／ 本発明に係る化合物は、特願昭６　４−９　７　４５６
号明細書に記載されている方法に従って合成できる。

式中、Ａ及びＢは水素又はアルキル基を表わし、ＡとＢ
は窒素と共に複素環を形成してもよく、ＤＳＥＳＧ及び
Ｊは水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、アミン基、アルコ
キシ基、アシルアミド基、アリールスルホンアミド基、
アルキルスルホンアミド基又はアルキル基を表わす。

Ａ及びＢで表わされるアルキル基としては、炭素数１〜
６のものが好ましく、特に１〜４のものが好ましい。例
えばメチル基、エチル基、ブチル基を挙げることができ
る。これらのアルキル基は置換基を有していてもよく置
換基としては、例えばウレイド基、テトラヒドロフリル
基、カルボキシル基、メタンスルホンアミド基、スルホ
基、メトキシ基、エトキシ基、メトキシエトキシ基、メ
トキシエトキシエトキシ基、メトキシテトラエトキシ基
が挙げられる。

Ｄ、Ｇ及びＪとしては水素、アルコキシ基及びアルキル
スルホン了ミド基、アリールスルホンアミド基が好まし
く、更に好ましくは水素である。Ｅとしては水素、アル
キル基、アシルアミド基が好ましく、より好ましくは炭
素数１〜３のアルキル基特にメチル基である。また、船
式［ｒＶ）で示される化合物の塩としてはｐトルエンス
ルホン酸、スルホン酸、スルフィン酸、硫酸エステル、
スルファミン酸、チオ硫酸Ｓ−エステル、カルボン酸、
リン酸エステル、アミドリン酸、リン酸、亜リン酸エス
テル、有機ホウ素化合物、塩酸及び硫酸等の有機酸又は
無機酸の塩を挙げることができ、特にｐ−トルエンスル
ホン酸塩、塩酸塩及び硫酸塩が好ましい。

以下に本発明に係る芳香族第１級アミン化合物の代表的
具体例を示すが、本発明はこれに限定されるものではな
い。

例示化合物 （■−１）Ｎ、Ｎ−ジエチル−３−メチル−４アミノア
ニリン （ＩＶ−２）Ｎ、Ｎ−ジエチル−４−アミノアニリ　ン （ＩＶ−３）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−メチル−４−
アミノアニリン （ｆｆ−４）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−テトラヒドロ
フルフリル−３−メチル−４−アミノアニリン （ｒＶ−５）Ｎ−エチル−Ｎ−カルボキシメチル３−メ
チル−４−アミノアニリン （■−６）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−エチル−３−メ
チル−４−アミノアニリン （ｒＶ−７）Ｎ−エチル−Ｎ−テトラヒドロフルフリル
−３−メチル−４−アミノフェノール（ＩＶ−８）３−
アセチルアミノ−４−アミノジメチルアニリン （ＴＶ−９）Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンアミ
ドエチル−４−アミノアニリン （ＴＶ−１０）Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンア
ミドエチル−３−メチル−４−アミノアニリン （ＴＶ−１１）Ｎ−メチル−Ｎ−β−スルホエチル−ｐ
−フェニレンジアミン （ｒＶ−１２，）　Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル
−３−メチル−４−アミノアニリン （ＩＶ−１３）Ｎ−エチル−Ｎ−［２−（２−メトキシ
エトキシ）エチルヨー３−メチル−４＝アミノアニリン （ＴＶ−１４）Ｎ−エチル−Ｎ−（２−［：２−（２−
メトキシエトキシ）エトキシ］エチル）−３−メチル−
４−アミノアニリン （ＩＶ−１５）Ｎ−エチル−Ｎ−［２−（２［：２−　
［２−（２−メトキシエトキシエトキシ〉エトキシ〕エ
トキシ〕エトキシ）エチルツー３−メチル−４−アミノ
アニリン （１’Ｖ−１６）Ｎ、Ｎ−ジエチル−３−メタンスルホ
ンアミドエチル−４−アミノアニリン。

本発明に係る過酸化作用を有する物質としては、種々も
のを用いることができるが、代表的なものとして例えば
、ペルオキシダーゼが挙げられる。ペルオキシダーゼは
、過酸化水素が別の物質を酸化する際の反応を触媒する
酵素である。このペルオキシダーゼは一般に鉄ポルフィ
リンを含有する複合タンパクであり、西洋わさび、じゃ
がいも、いちじくの樹液、カブラ（植物のペルオキシダ
ーゼ）、牛乳（ラクトペルオキシダーゼ）及び白血球（
ベルドペルオキシダーゼ）中に存在し、また微生物中に
も存在し、抽出又は発酵により得ることができる。

また、「アクタ・ケミ力・スカンジナビ力、（＾ｃｔａ
　Ｃｈｅｍ、５ｃａｎｄ、）第４巻、第４２２〜４３４
頁、１９５０年、セオレル（Ｔｈｅｏｒｅｌｌ）及びメ
ーリイ　（Ｍａｅｈｌｙ）著」に開示されているような
合成ペルオキシダーゼも本発明において用いることがで
きる。ペルオキシダーゼのほかメトヘモグロビン、オキ
シヘモグロビン、ヘモグロビン、アルカリ性ヘマチン、
ヘミン及びヘミン誘導体等も本発明において用いること
ができる。

酵素以外に過酸化作用を示すものとして、例えばチオシ
アン酸鉄、スズ酸鉄、フェロシアン酸第１鉄、シリカゲ
ルに吸着させた第ニクロム塩（例えば硫酸クロムカリウ
ム）等も用いることができる。

これらのうちでは、ペルオキシダーゼが好ましい。

本発明の方法において、過酸化水素又は過酸化水素を生
成する物質の作用により生成した過酸化水素は、過酸化
作用を有する物質の作用により、芳香族第一級アミン化
合物を酸化する。

その結果生成した芳香族第一級アミン化合物の酸化体が
本発明に係る一般式〔■〕〜［ＩＩＩ］のいずれかで表
わされる化合物とカップリング反応して、色素を形成す
る。生成される色素は６００〜７００ｒ＋ａ＋に主たる
可視吸収を有し、極めて高感度に発色を呈する。

生成した色素についての情報は、目視にて、若しくは技
術的に公知な方法例えば分光光度計を用いて読み取るこ
とができる。また、適当な有機溶剤を加え、色素を溶解
した後、情報を読み取っても良い。

本発明の分析方法は、例えば次のように実施することが
できる。

流体試料に、一般式〔工〕〜［ＩＩＩ］のいずれかで表
わされる化合物、芳香族第一級アミン化合物、及び反応
触媒として、過酸化作用物質を同時に、又は適宜の順序
で添加し、混合物を４℃から４０℃、好ましくは２０℃
から４０℃の範囲の温度及びｐＨ３，０から９．０、好
ましくはＰＨ４，５から８．０の範囲において１分から
６０分の時間範囲において発色反応を行い、生成した色
素を含有する反応混合物の吸光度を測定する。

本発明方法は、過酸化水素の微量定量に特に有用である
。流体試料中の過酸化水素濃度は、全発色反応溶液中に
おいて、０．０１〜２００μｇ／−であることが好まし
い。

この範囲の過酸化水素濃度において、−船式ＣＩ）〜［
ＩＩＩ］のいずれかで表わされる化合物は、０．１０〜
１００　μｍｏｌｅ／ｍ１、芳香族第一級アミン化合物
は、０．０１〜１０　μｍｏｌｅ／ｍｆ、過酸化作用物
質、好ましくはペルオキシダーゼであるが、０．０１〜
１００単位／ｒｎｌの量で用いられることが好ましい（
全発色反応溶液中において） 一般式〔Ｉ〕〜〔■〕のいずれかで表わされる化合物は
、少量の親水性の有機溶剤例えばメタノール、エタノー
ル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等に溶解して加え
てもよい。−級式〔Ｉ〕〜［［Ｉ］のいずれかで表わさ
れる化合物と芳香族第一級アミン化合物とのモル比は１
対１００から１００対１が適当であり、１対　１０から
１０対１が好ましい。

また、本発明の方法においては、発色試薬として一級式
〔工〕〜［Ｉ［［）のいずれかで表わされる化合物、芳
香族第一級アミン化合物及び過酸化作用物質のほかに、
過酸化水素を生成する物質を組合せることにより、最終
的に分析すべき物質を該物質の作用によって過酸化水素
に導くことにより、目的とする種々の物質の分析が可能
となる。

この方法によって、分析が可能となる生物学的流体試料
中の物質としては、グルコース、コレステロール、尿酸
、クレアチニン、トリグリセリド、乳酸、遊離脂肪酸、
グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ
〉　グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰ
Ｔ）　コリンエステラーゼ、タレアチンホスホキナーゼ
、乳酸脱水素酵素などが挙げられる。

これらの分析に用いる該物質としては、例えば、グルコ
ースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシ
ダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、グリセリン−３−
リン酸オキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ピルビ
ン酸オキシダーゼ、Ｄ−アスパラギン酸オキシダーゼ、
Ｄ（又はＬ）−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ″′′グロノ
−ラクトンオキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ
、Ｌ−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ、６−ヒドロキシ
−Ｄ−ニコチンオキシダーゼ、６−ヒドロキシ−Ｌ−ニ
コチンオキシダーゼ、ピリドキサミンリン酸オキシダー
ゼ、ピリドキシンオキシダーゼ、ヘキソースオキシダー
ゼ、０−アミノフェノールオキシダーゼ、アミンオキシ
ダーゼ（ピリドキサール含有、又はフラビン含有）、キ
サンチンオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、エタ
ノールアミンオキシダーゼ、Ｎ’−メチル−Ｌ−リシン
オキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アシルＣｏＡオキ
シダーゼ、亜硫酸オキシダーゼ等の種々のものが挙げら
れる。

これらの該物質は、いずれの起源のものを用いてもよく
、固体粉末の形でも溶液として用いてもよい。

該物質を用いる場合は、過酸化水素を前もって発生させ
ておいてもよいが、過酸化水素の生成反応と発色反応を
同時に進行させることが好ましい。

該物質を発色試薬溶液に添加する時期は、任意であって
よく、使用量はその種類、目的とする基質に応じて任意
に選択される。

更に、本発明方法の他の実施例として、一般式〔Ｉ〕〜
〔■〕のいずれかで表わされる化合物、芳香族第一級ア
ミン化合物、及び過酸化作用物質を含有させた分析素子
を挙げることができる。

本発明の分析素子は、分析に必要な試薬が素子中に乾燥
状態で組込まれた乾式タイプのものをいう。これらの分
析素子としては、単層のもので試薬を担持する層の材料
としてろ紙、メンブランフィルタ−等を用いるものく特
公昭３６−４１９８号、米国特許３．６０７．０９３号
等）、また、単なる積層やはく離を前提とした非一体型
多層分析素子としてガラスフィルターやメンブランフィ
ルタ−を用いたり（特開昭４９−１１３９５号）　　２
枚のろ紙の上に網をかけたもの（特開昭５４−１５１０
９６号、米国特許３，５２６、４８０号〉などが挙げら
れる。

更に、本発明の分析素子として、好ましくは、液体不浸
透性、光透過性支持体上に少なくとも１つの試薬層及び
多孔性展開層を有する一体型多層分析素子（特公昭５３
−２１６７７号、特開昭５５−１６４３５９号、同５５
−９０８５９号、同５７−１９７４６６号、同５７−１
０１７６０号、同５７−１０１７６１号、同５８−９０
１６７号等）が挙げられる。

上記試薬層は水溶性ポリマー又は親水性かつ有機溶媒可
溶性のポリマーをバインダとして支持体上に塗布するこ
とによって層として設けることができる。水溶性ポリマ
ーバインダとしてはゼラチン、フタル化ゼラチン等のゼ
ラチン誘導体、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキ
シメチルセルロースナトリウム塩等の水溶性セルロース
誘導体、ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ−ビニルピロ
リドン）　　ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミ
ド、アクリルアミドとアクリル酸エステルの共重合体、
ポリ　（モノ又はジアルキル置換）アクリルアミド、ポ
リ　（モノ又はジアルキル置換）メタクリルアミド及び
これらの水溶性共重合体等が挙げられ、好ましくはゼラ
チン、ポリアクリルアミド及びアクリルアミドとアクリ
ル酸エステルの共重合体が用いられる。親水性かつ有機
溶媒可溶性ポリマーバインダとしては、ポリ　（Ｎ−ビ
ニルピロリドン）　ポリ　（Ｎ−ビニルイミダゾール）
　ポリ（Ｎ−ビニルトリアゾール）及びこれらの誘導体
又はそれらの共重合体、エチルセルロース、メチルセル
ロース等のセルロース誘導体等が挙げられる。これらの
ポリマーバインダは主としてアルコール類、例えばエタ
ノール、プロパツール、ブタノール等に溶解し且つ親水
性の高分子物質である。

上記ポリマーバインダは、選ばれる特定成分及びその分
析反応によって任意に選ぶことができる。

また、選ばれる分析反応が２種以上の試薬から構成され
ている場合、この試薬を同一試薬層内に一緒に混合して
含有させても、また、２種以上の試薬を２つ又はそれ以
上の別々の試薬層として含有させてもよい。これらは分
析反応自体の作用機構によって決定されることもあり、
好ましくない影響を及ぼさない限りにおいて、その構成
は任意である。

上記試薬層の膜厚は所望に応じて任意に選択することが
可能であるが、好ましくは１〜２００μｍ１更に好まし
くは５〜１００μｍである。

上記多孔性展開層は、（１）一定容量の流体試料を単位
面積当り試薬層に均一に配布する機能を有するものであ
る。その上、更に、特公昭５３−２１６７７号公報に記
載された性能、すなわち（２）流体試料中の分析反応を
阻害する物質又は要因を除去する機能及び／又は（３）
分光光度分析を行うときに支持体を経て透過する測定光
を反射するバックグランド作用を行う機能を有するもの
であれば好ましい。したがって、本発明に係る多孔性展
開層は、上記（１）の機能のみを有する層、（１）に加
えて（２）及び／又は（３）の機能を併せて有する層の
いずれかとすることができ、あるいは（１）を包含する
複数の機能を適宜分離し、各機能ごとに別の層を使用す
ることも可能である。

更に（１）、（２）及び（３）の機能のうち、２つの機
能を有する層と、残りの１つの機能を有する層を組合せ
て使用することもできる。例えば、前述の特公昭５３−
２１６７７号公報に記載された二酸化チタン及び二酢酸
セルロースから成るプラッシュポリマーと呼称される非
繊維多孔質媒体の展開層、特開昭５５−１６４３５６号
公報に記載された親水化処理した織物の展開層、特開昭
５７−９４６５８号、同５７−１２８４７号、同５７−
１９７４６６号及び同５８−７０１６１号等の各公報に
記載された繊維構造展開層、特開昭５８−９０１６７号
公報に記載された粒子結合体構造展開層が挙げられる。

特に、上記繊維構造展開層及び粒子結合体構造展開層は
、血球部分も速やかに移送することが可能な素材として
特に有用である。本発明の分析素子における展開層の膜
厚は、その空隙率によって決定されるべきであるが、好
ましくは約１００〜６００μｍ１更に好ましくは約１５
０〜４００μｍである。また、空隙率は好ましくは約２
０〜８５％である。

上記多孔性展開層には、選ばれる特定成分及びその分析
反応によっては、前述の試薬層の場合と同様、流体試料
中の特定成分と直接的又は間接的に関与する試薬を含有
することができる。

また他の付加的な添加剤として、例えば保恒剤、界面活
性剤等、種々の添加剤も所望に応じて添加することもで
きる。

特に界面活性剤は、流体試料を本発明の分析素子に適用
した際の浸透速度の調節等有効に用いることができる。

使用可能な界面活性剤としては、イオン性（アニオン性
又はカチオン性）、非イオン性を問わず使用することが
可能であるが、非イオン性界面活性剤が有効である。非
イオン性界面活性剤の例としては、例えば２．５−ジ−
ｔ−ブチルフェノキシポリエチレングリコール、ｐ−オ
クチルフェノキシポリエチレングリコール、ｐ−インノ
ニルフェノキシポリエチレングリコール等のアルキル置
換フェノールのポリアルキレングリコール誘導体、高級
脂肪酸のポリアルキレングリコールエステルなどが挙げ
られる。

これらの界面活性剤は流体試料の試薬層への浸透速度を
調節し、同時に好ましからざる「クロマトグラフィー現
象」発生を抑制する効果を有する。

上記界面活性剤は広範囲に選択された量を用いることが
可能であるが、塗布液の重量に対して２５重量％〜０．
００５重量％、好ましくは１５重量％〜０．０５重量％
用いることができる。

上記の液体不浸透性の光透過性支持体（以下、本発明に
係る支持体と略す）は、液体不浸透性で、かつ光透過性
であればその種類を問わないが、例えば酢酸セルロース
、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート又は
ポリスチレンのような種々の重合体材料のみならず、ガ
ラスのごとき無機材料も用いることが可能である。

本発明に係る支持体の厚さは任意であるが、好ましくは
５〜２５０μｍである。また、本発明に係る支持体の観
測側の一側面は、その目的に応じて任意に加工すること
が可能である。更に試薬層を積層する側の支持体面に、
場合によっては光透過性の下塗り層を使用して試薬と支
持体との接着性を改良することができる。

上記の一体型多層分析素子は必要に応じて、例えば米国
特許３．９９２．１５８号明細書記載の反射層、下塗り
層、米国特許４．０４２．３３５号明細書記載の放射線
ブロッキング層、米国特許４．０６６、４０３号明細書
記載のバリヤ層、米国特許４．１６６、０９３号明細書
記載のマイグレーション阻止層、特開昭５５−９０８５
９号公報記載のスカベンジャ層、及び米国特許４．１１
０．０７９号明細書記載の破壊性ポンド状部材等を任意
に組合せて本発明の目的に合せた任意の構成とすること
ができる。

これら分析素子の種々の層は、本発明に係る支持体上に
所望の構成に従い、従来写真工業において用いられてい
るスライドホッパ塗布法、押出し塗布法、浸漬塗布法等
を適宜選択して用い、順次積層することで任意の厚みの
層を塗設することができる。

本発明の一般式〔４〕〜ＣＩＩＩＩのいずれかで表わさ
れる化合物を、本発明に係る分析素子を形成するための
液に添加する方法は、上記化合物の化学構造等に応じて
、適宜選択することができる。例えば、水、緩衝剤水溶
液、有機溶媒等に溶解して添加する方法、固体分散法、
ラテックス分散法、氷中油滴型乳化分散法等種々の方法
を用いることができる。

水中油滴型乳化分散法は、従来写真工業において公知の
カプラー等の疎水性添加物を分散させる方法が適用でき
、通常、高沸点溶媒及び／又は低沸点溶媒に溶解し、ア
ニオン系界面活性剤及び／又はノニオン系界面活性剤を
含むゼラチン等の親水性コロイドを含む水溶液と混合し
、高速回転ミキサ、コロイドミル、フロージェットミキ
サ、超音波分散装置等で乳化分散して用いることができ
る。

高沸点溶媒としては、例えば有機酸アミド類、カルバメ
ート類、エステル類、ケトン類、尿素誘導体等、特に、
ジ−ｎ−ブチルセバケート、トリクレジルホスフェート
、トリフェニルホスフェート、ジイソオクチルアセテー
ト、ジ−ｎ−ブチルセバケート、）！Ｊ−ｎ−へキシル
ホスフェート、Ｎ、Ｎ−ジエチルカプリルアミド、Ｎ、
Ｎ−ジエチルラウリルアミド、ｎ−ペンタデシルフェニ
ルエーテル、ジオクチルフタレート、ｎ−ノニルフェノ
−ル、３−ベンタテシルフェニルエチルエーテル、２．
５−ジー５ｅｃ−アミルフェニルブチルエーテル、モノ
フェニル−ジー〇−クロロフェニルホスフェートあるい
は、フッ素化パラフィン等が挙げられる。これらの中で
も、ジアルキルフタレート特に炭素数１〜６のアルキル
基を有するものが好ましい。

低沸点溶媒としては、例えば、酢酸メチル、酢酸プロピ
ル、酢酸ブチル、プロピオン酸ブチル、シクロヘキサノ
ール、ジエチレングリコールモノアセテート、ニトロメ
タン、四塩化炭素、クロロホルム、シクロヘキサン、テ
トラヒドロフラン、メチルアルコール、アセトニトリル
、ＤＭＦ、ジオキサン、メチルエチルケトン等が挙げら
れる。

アニオン系界面活性剤としては、例えばアルキルベンゼ
ンスルホン酸、アルキルナフタレンスルホン酸等が、ノ
ニオン系界面活性剤としては、例えばソルビタンセスキ
オレイン酸エステル、ソルビタンモノラウリン酸エステ
ル等が挙げられる。

本発明の分析素子は、前記の過酸化作用を有する物質、
一般式［Ｉ］〜〔■〕のいずれかで表わされる化合物以
外に、分析すべき成分の種類に応じて、過酸化水素を生
成する物質及び他の酵素、基質、緩衝剤、保恒剤、界面
活性剤、硬膜剤等の種々の試薬を含有することができる
。

本発明に係る過酸化作用を有する物質は広範囲に選択さ
れた量を用いることが可能であるが、例えばペルオキシ
ダーゼの場合は、１００〜１、０００．０００　Ｕ　／
　ｍ”、好ましくは１．０００〜１００．００００　／
　ｍ’の範囲で用いることができる。

前述したように、本発明の方法によれば、生成される色
素は、極めて高感度に発色を呈するために、本発明の分
析素子は、流体試料が例えば、人血清中の微量成分（例
えば、尿酸、タレアチニン、ＧＯＴ、ＧＰＴ等）に対し
ても鋭敏に反応し、微量成分の定量に特に有用である。

本発明において、本発明に係る過酸化作用を有する物質
、一般式〔Ｉ〕〜［ＩＩＩ］のいずれかで表わされる化
合物は、例えば、一体型多層分析素子の場合、試薬層、
多孔性展開層及びその他の層のいずれの層に含有させる
こともできる。

本発明の分析素子を用いて、過酸化水素又は過酸化水素
を生成する物質を定量するに当っては、分析素子を流体
試料中に浸漬するか流体試料を分析素子上に滴下し、反
射スペクトロホトメ）　ＩＪ−により初速産性又は反応
終点法に従って測定することができる。このようにして
得られた測定値は、あらかじめ作成しておいた検量線に
当てはめることで過酸化水素又は過酸化水素を生成する
物質の量を決定することができる。

本発明の分析素子に適用される流体試料は生物学的、非
生物学的流体試料であれ、過酸化水素又は過酸化水素を
生成する物質を含むものであればよい。例えば、血液（
血漿・血清を含む）、リンパ液、尿等が挙げられる。

用いる流体試料の量は、試験片の場合には試薬を含む吸
収性担体に流体試料が十分含浸される量以上であれば任
意である。一方、一体型多層分析素子の場合も任意であ
るが、好ましくは約５０μｌ〜約５μｌであり、更に好
ましくは約２０μｌ〜約５μｌである。通常約１０μｌ
の流体試料を適用することが好ましい。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はその実施例によりその範囲を限定されるものではな
い。

実施例１ にトロセルロース膜上での抗原の測定〉純水にて洗浄後
、風乾したニトロセルロース膜（バイオラッド社製；厚
み０．４５μｍ）にリン酸緩衝液（以下ＰＢＳと称す）
にて段階希釈したヤギＩｇＧの１μｌをスポットした。

風乾後１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）−ＰＢＳ溶液に
より４℃にて一晩プロッキングを行い、次いでペルオキ
シダーゼ標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（カッペル社製；
１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液により１５００倍希釈したもの
）と４℃２時間反応させた。０．０５％ツイーン（Ｔｗ
ｅｅｎ）２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウ
レート；和光純薬社製）−ＰＢＳ溶液にて５回洗浄し発
色用基質試液中に浸漬した。発色用基質試液として次の
３種を用い、比較した。

（１）　：　３■の４−クロロ−■−ナフトールを１−
のメタノールに溶解し、５ａｆ！の０．０５　Ｍ　）リ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４，２００ｍＭ　ＮａＣ１含有
；以下ＴＢＳと称す）を加え、更に３％過酸化水素２０
μｌを加える。

（２）＝３■の化合物例Ｉ−３を１１ｎｌのメタノール
に溶解し、５ａｆ！のＴＢＳを加え、１■の化合物例ｒ
Ｖ−１０（硫酸塩〉を加え、更に３％過酸化水素水２０
μｌを加える。

（３）＝（２）の化合物例Ｉ−３、化合物例■−１０（
硫酸塩）の代りに化合物例ｎ−４、化合物例ＩＶ−１（
塩酸塩）を使用し、（２）と同様に調製。

（４）＝（２）の化合物例Ｉ−３、化合物例ＴＶ−１０
（硫酸塩）の代りに化合物例ｍ−２、化合物例Ｉ’Ｖ−
１６（ｐ−）ルエンスルホン酸塩）を使用し、（２）と
同様に調製。

１５分間反応後、充分水洗し、風乾した。発色用基質試
液（１）を用いた場合、スポットは１０ｎｇのヤギＩｇ
Ｇ　Ｌか検出できなかったが、発色用基質試液（２）〜
（４）を用いた場合１　ｎｇのヤギＩｇＧのスポットが
検出可能であった。

実施例２ （抗体及びハイブリドーマのスクリーニング）α１−ア
ンチトリプシン５０μｇをフロイントの完全アジュバン
トと共にＢａ１ｂ／Ｃマウス（雌、６週齢）の腹腔内に
注射した。３週間後、更にα１−アンチトリプシン５０
μｇをフロイントの不完全アジュバントと共に腹腔内に
注射し、更に２週間後αｌ−了ンチドリプシン３０μｇ
をＰＢＳに溶解し、静脈注射した。最終免疫の３目抜＊
臓細胞を取出し、常法に従い、マウスミエローマ細胞Ｘ
　６３．６．５．３と融合した。９６穴プレ一ト５枚に
分配しＨＡＴ選択培地にて培養した。融合の３週間後バ
イプリドーマのコロニーが生成したウェルについて、抗
体の測定を以下の方法にて行った。

ニトロセルロースを４社角の正方形に切断し、各々にα
、−アンチトリプシン５００μｇ／ｍｌ。

ＰＢＳ溶液１μｌをスポットした。９６穴マイクロタイ
タープレート１大当り１枚ずつ加え、１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ溶液にて４℃、１晩ブロツキングした。ＰＢＳにて洗
浄後、ハイブリドーマの培養上清４０μｌを加え、室温
にて２時間反応させた。０．０５％ンイーンー２０−Ｐ
ＢＳ溶液にて３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ヤ
ギ抗マウスイムノグロブリン抗体（カッペル社製；１％
ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液にて１５００倍希釈したもの）を４
０μｌ加え、室温にて２時間反応させた。０．０５％ツ
イーン−２０−ＰＢＳ溶液にて３回洗浄後、発色用基質
試液を加え、ニトロセルロース上に色素が生成したもの
を抗体活性陽性とした。発色用基質試液として（ｌ〕：
実施例１の（１）と同様、（２）：実施例１の（２）と
同様の２種類を用い比較した。

測定した３５０穴のうち（１）の試液を用いた場合は１
５穴しか抗体活性陽性ハイブリドーマが検出できなかっ
たが本発明の（２）の試液を用いた場合２３穴に抗体活
性陽性ハイブリドーマを検出することができた。

実施例３（発色感度の比較） 流体試料（０，５■／−の過酸化水素溶液）５０μｌに
対して下記の方法によって調製した発色試薬溶液を５ｒ
ｒｄｌの割合で混合し、室温に５分間放置した後、生成
した色素のλｍａＸにおける吸光度を過酸化水素ブラン
クを対照にして測定した。

発色試薬溶液の調製 −ｍ式〔Ｉ〕〜［ＩＩＩ’］のいずれかの化合物０、５
　μｍｏｌｅをＤＭＦｌｍｆ、一般式［ｒＶ］の化合物
１２．５μｍｏｌｅ及びペルオキシダーゼ１０単位をＰ
ＢＳ　（ｐＨ７，４）　　５ｍｌに各々溶解し、次いで
両溶液を混合し発色試薬溶液とする。

発色試薬　　　吸光度　検出波長 （ｎｍ） 本発明　Ｉ　−１＋ＴＶ−１０１，２８６６０（硫酸塩
） 本発明の発色試薬が、高感度に発色色素を生成している
ことがわかる。

実施例４　（グルコースの測定） （１）発色試薬溶液の調製 グルコースオキシダーゼ２０単位、ペルオキシダーゼ７
．５単位、化合物■−１（塩酸塩）１２、５　μｍｏｌ
ｅをＰＢＳ　　（ｐＨ７，４）　　５ｒｎｌに、化合物
ｌｌ−１のＱ、５　、！Ｊ　ｍｏｌｅをＤＭＦＩ−に溶
解し、次いで両溶液を混合し、発色試薬溶液とした。

（２）グルコース溶液の調製 グルコースｌＯ■をＰＢＳ　（ｐＨ７，４）　　５ｍｆ
に溶解し、これをグルコース溶液とする。

（３）グルコースの測定 発色試薬溶液５−とグルコース溶液４０μｌをとり、３
７℃で１０分間インキュベートした後、グルコースブラ
ンクを対照として、６５０ｎｍで吸光度を測定し、その
値は、１．０５であった。

一方、比較として、ｎ−ｉ、ｒｖ−ｚ塩酸塩）の代りに
フェノール、４−アミノアンチピリン塩酸塩を用いて測
定し、その吸光度は、０．１９であった。これから明確
なように、本発明の方法は、従来の方法に比べて著しく
感度が高い測定方法である。

実施例５　（総コレステロール用分析素子）膜厚１８０
μｍの透明な下引済ポリエチレンテレフタレート支持体
上に以下に示す組成の試薬層、中間層及び展開層を順次
設け、後記表−１に示す本発明の分析素子１〜３及び比
較分析素子−（１）を作成した。

試薬層（Ｒ−１） 化合物例Ｉ　−１０４，３９ｇ／ｍ’ ジブチルフタレー）　　　　　　２．２０ｇ／ｍ’ゼラ
チン　　　　　　　　　１６．５ｇ／ｍ″ペルオキシダ
ーゼ　　　　　１２．５００　Ｕ　／　ｍ’リン酸カリ
ウム緩衝液ＰＨ６，８ ３，２５ｇ／ｍ’ トリイソプロピルナフタレン スルホン酸ナトリウム １．２−ビス（ビニルスルホニル） エタン アジ化ナトリウム 化合物例ｌ−１０は、 ルフタレートに溶解後、 ０．１１ｇ／ｍ” ０、１８　ｇ　／　ｍ’ 酢酸エチル及びジブチ トリイソブロビルナフ ０．９３ｇ／ｍ” タレンスルホン酸ナトリウム及びゼラチンの水溶液に加
え、超音波分散して使用。

試薬層（Ｒ−２） 化合物例ｌ−１０の代りに、化合物例ｎ−５の３．２０
ｇ／ｍ’、ジブチルフタレート１．６０　ｇ／　ｍＩを
用いた以外は試薬層Ｒ−１と同様に調製。

試薬層（Ｒ−３） 化合物例ｌ−１０の代りに、化合物例ｌｌｌ−５の３．
９８　ｇ／ｍ’、ジブチルフタレートの１．９９ｇ／　
ｍＩを用いた以外はＲ−２と同様に調製。

試薬層（Ｒ−４） ４−アミノアンチピリン塩酸塩　１．５９　ｇ　／　ｍ
”１．７−シヒドロキシナフタレン　１．１８　ｇ　／
　ｍ’ゼラチン　　　　　　　　　１６．５　ｇ　／　
ｍ”ペルオキシダーゼ　　　　　１２．５００Ｕ　／　
ｍ”リン酸カリウム緩衝液ｐＨ６，８ ３，２５ｇ／ｒｎ” トリイソプロピルナフタレン スルホン酸ナトリウム　　　０．９３　ｇ　／　ｍ’１
．２−ビス（ビニルスルホニル〉 エタン　　　　　　　　　　０．１１　ｇ　／　ｍ’ア
ジ化ナナトリウム　　　　　０．１８　ｇ　／　ｍ’中
間層（実施例、比較例に共通）（Ｉ−１）Ｎ−ビニルピ
ロリドン−酢酸 ビニル共重合体（重量比２：８） １、３５　ｇ　／　ｍ” 展開層（Ｓ　−１） 口紙原材料用繊維　　　　　９１．０ｇ／ｍ”〔東洋口
紙■、４０〜１００メツシュ〕スチレン−グリシジルメ
タ クリレート共重合体 （重量比９　：　１　）　　　　　　２３．Ｏｇ／ｍ’
トリオキシエチレンモノラ ウレート　　　　　　　　　１１．７　ｇ　／　ｍ”化
合物例ｒＶ−１０（硫酸塩）　　　０．１４ｇ／ｍ’ジ
メゾン　　　　　　　　　　　１．７５　ｇ　／　ｍ’
コレステロールエステラーゼ ５００ Ｕ　／　ｍ’ コレステロールオキシダーゼ ５００ Ｕ　／　ｍ” 牛血清アルブミン　　　　　　２．５ｇ／ｍ”コレステ
ロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼは
、牛血清アルブミンと一緒に水に溶解し、凍結乾燥後微
粉末化したものを使用。

上記展開層はキシレン溶媒にて塗設。

展開層（Ｓ−２） 実施例試料の展開層（Ｓ　−１）から、化合物例■−１
０硫酸塩、ジメゾンを除いた以外は、展開層（Ｓ−１）
と同様に調製。

表−１ 上記本発明の分析素子−１〜３並びに比較分析素子−（
１）に対して、各種総コレステロール濃度のヒト血清を
１０μｌ展開層上に滴下し、３７℃で７分間インキュベ
ーションを行った後、６５０ｎｍ（比較分析素子につい
ては、５４６　ｒ＋ｍ）のフィルターを用いて反射濃度
を支持体側から測定し、表−２の結果を得た。

表−２ 上記表−２の結果から明らかなように、本発明の分析素
子１〜３は、比較分析素子−（１）に比し、総コレステ
ロール濃度の差に対して良好な発色濃度差を示し、識別
能力つまり定量感度が高いことがわかる。

実施例６（グルコース用分析素子） 膜厚１８０μｍの透明な下引済ポリエチレンテレフタレ
ート支持体上に以下に示す組成の試薬層、中間層及び展
開層を順次設け、表−３に示す本発明の分析素子４．５
及び比較分析素子＝（２）を作成した。

試薬層（Ｒ−５） 化合物例Ｉ　−１２４，８４ｇ／ｍ” ジブチルフタレート　　　　　２．４２　ｇ　／　ｍ’
ゼラチン　　　　　　　　　１５．５　ｇ　／　ｍ’ベ
ルオ牛クシダーゼ　　　　３３．００００　／　ｍ’グ
ルコースオキシダーゼ　　２１．０ＯＯＵ　／　ｍ’リ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，１＞ ２、８２　ｇ　／　ｍ’ トリイソプロピルナフタレン スルホン酸ナトリウム　　　０．９６　ｇ　／　ｍ’ア
ジ化ナナトリウム　　　　　０．１１　ｇ　／　ｍ’１
．２−ビス（ビニルスルホニル） エタン　　　　　　　　　　　０．１０ｇ／ｍ’化合物
例ｌ−１２は、実施例５に記載の方法と同様に分散して
使用。

試薬層（Ｒ−６） 化合物例ｌ−１２の代りに、Ｉ［Ｉ−４の３．３６ｇ　
／　ｍ’　ｓジブチルフタレートの１．６８　ｇ　／　
ｍ’を用いた以外は、試薬層Ｒ−４と同様に調製。

試薬層（Ｒ−７） ４−アミノアンチピリン塩酸塩　１．７９　ｇ　／　ｍ
”１．７−シヒドロキシナフタレン　１．３３　ｇ　／
　ｍ”ゼラチン　　　　　　　　　１５．５　ｇ　／　
ｍ’ペルオキシダーゼ　　　　　３３．０ＯＯＵ　／　
ｍ’グルコースオキシダーゼ　　２１．０ＯＯＵ　／　
ｍ’リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，１） ２、８２　ｇ　／　ｍ’ トリイソプロピルナフタレン スルホン酸ナトリウム　　　０．９６ｇ／ｍ’アジ化ナ
トリウム　　　　　　０．１１　ｇ　／　ｍ’１．２−
ビス（ビニルスルホニル） エタン　　　　　　　　　　　０．１０　ｇ　／　ｍ”
中間層（実施例、比較例に共通）（Ｉ−２）Ｎ−ビニル
ピロリドン−酢酸 ビニル共重合体（重量比２：８） １．４０ｇ／ｍ″ 展開層（Ｓ−３） 口紙原材料用繊維　　　　　９１．０　ｇ　／　ｍ’〔
東洋口紙■、４０〜１００メツシュ〕スチレン−グリシ
ジルメタ クリレート共重合体 （重量比９　：　１　）　　　　　　２３．Ｏｇ／ｍ”
ト　リ　ト　ン　Ｘ　　−１００９、１ｇ／ｍ”化合物
例■−１６ 〈ｐ−トルエンスルホン酸塩） ０、１５　ｇ　／　ｍ’ ジメゾン　　　　　　　　　　　１．９０ｇ／ｍ’展開
層（Ｓ−４） 化合物例ＩＶ−１６（ｐ４ルエンスルホン酸塩）の代り
に化合物例ＩＶ−１０（硫酸塩）の０．１５ｇ　／　ｍ
’を使用した以外は、展開層（Ｓ−３）と同様に調製。

展開層（Ｓ−５） 展開層（Ｓ−３）から化合物例ＩＶ−１６（ｐ−トルエ
ンスルホン酸塩）　ジメゾンを除いた以外は、展開層（
Ｓ−３）と同様に調製。

表−３ 上記本発明の分析素子−４，５並びに比較分析素子−（
２）に対して、各種グルコース濃度のヒト血清をｌＯμ
ｌ展開層上に滴下し、３７℃で７分間インキュベーショ
ンを行った後、６５０ｎｍ　（比較分析素子については
、５４６　ｎｍ）のフィルターを用いて反射濃度を支持
体側から測定し、表−４の結果を得た。

表−４ 上記表−４の結果から明らかなように、本発明の分析素
子４．５は、比較分析素子−（２）に比し、グルコース
濃度の差に対して良好な発色濃度差を示し、識別能力つ
まり定量感度が高いことがわかる。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように、本発明の分析素子では、定
量感度が著しく改善されるという顕著な効果が奏せられ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分析対象の特定成分を、ペルオキシダーゼを標識と
   して有している標識体を用い、ペルオキシダーゼの酵素
   反応により生成した色素量によって測定する該特定成分
   の分析方法において、該酵素反応の基質として、過酸化
   水素、芳香族第一級アミン化合物、及び下記一般式〔
   I 〕〜〔III〕： ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔II〕 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・〔III〕 〔式中、Ｒは置換基を表わし、ｍは０又は１〜５の整数
   を表わし、ｎは０又は１〜３の整数を表わす。ｍ又はｎ
   が２以上の整数のとき、複数のＲは同じであっても異な
   っていてもよい。Ｚは５員から７員の含窒素複素環を形
   成するのに必要な原子群を示し、Ｘは水素又は芳香族第
   一級アミン化合物の酸化体との反応により離脱する置換
   基を表わす〕のいずれかで表わされる化合物を用いるこ
   とを特徴とする特定成分の分析方法。 ２、芳香族第一級アミン化合物、及び請求項１記載の一
   般式〔 I 〕〜〔III〕のいずれかで表わされる化合物か
   らなることを特徴とする発色試薬。 ３、過酸化作用を有する物質、及び請求項２記載の発色
   試薬からなることを特徴とする過酸化水素分析用発色試
   薬。 ４、過酸化水素を生成する物質、及び請求項３記載の発
   色試薬からなることを特徴とする過酸化水素分析用発色
   試薬。 ５、支持体上に、少なくとも試薬層と、その上方に展開
   層を有する、請求項１記載の分析方法に使用する分析素
   子において、該分析素子が、請求項４記載の発色試薬の
   各成分を、同一又は異なるいずれかの層に含有している
   ことを特徴とする分析素子。