CN104955810A - 用于确定fkbp结合的免疫抑制药的化合物和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了用于在疑似含有FKBP结合的免疫抑制药的样品中从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的组合物。该组合物包括在西罗莫司分子的三烯部分中用庞大有机基团改性的西罗莫司衍生物。该组合物可以与在疑似含有FKBP结合的免疫抑制药的样品中对该药物的测定结合使用。

Description

用于确定FKBP结合的免疫抑制药的化合物和方法
背景
本发明涉及用于确定已知或疑似含有此类FKBP结合的免疫抑制药的样品，如患者样品中的FKBP结合的免疫抑制药，如西罗莫司（sirolimus）化合物和他克莫司（tacrolimus）化合物的化合物、方法和试剂盒。
身体依靠复杂的免疫响应系统区分自身与非自身。有时，必须控制身体的免疫系统以增强不足的响应或抑制过度响应。例如，当器官，如肾、心、心肺、骨髓和肝被移植到人体中时，身体通常会通过被称作同种异体移植排斥（allograft rejection）的过程排斥移植的组织。
在同种异体移植排斥的治疗中，常常借助药物疗法以受控方式抑制免疫系统。小心地将免疫抑制药给药至移植受者以助于防止非自身组织的同种异体移植排斥。为防止移植患者的器官排斥，两种最常给药的免疫抑制药是环孢霉素（CSA）和FK-506（FK或他克莫司）。在美国和其它国家发现用作免疫抑制剂的另一种药物是西罗莫司，也称作雷帕霉素。西罗莫司的衍生物也据说可用作免疫抑制剂。此类衍生物包括例如依维莫司（Everolimus）。
可通过小心控制患者体内存在的药物水平来部分控制与一些免疫抑制药相关的副作用。由于免疫抑制药的分布和代谢在患者间可极为不同并且由于不良反应的宽范围和严重性，推荐对接受免疫抑制药的所有患者，尤其是小儿患者和肝损伤的那些患者进行精确监测药物水平（治疗药物监测或TDM）。当共同给药酶CYP3A4的有力的诱导剂或抑制剂时，也推荐TDM。此外，如果西罗莫司或其衍生物与环孢霉素同时给药，推荐TDM，因为药代动力学在共同给药过程中改变。例如，如果西罗莫司与环孢霉素同时给药而非间隔4小时给药，西罗莫司波谷浓度提高。为此原因，以及为了限制某些副作用，TDM应能在所选情况下实现更好的临床结果。
西罗莫司和他克莫司是用于人体器官移植的最重要的免疫抑制药。需要对血液中的西罗莫司、他克莫司和其它相关免疫抑制药的浓度进行治疗监测以优化给药方案，以确保在最低毒性下的最大免疫抑制。尽管西罗莫司和他克莫司是非常有效的免疫抑制剂，但必须小心地管理对它们的使用，因为有效剂量范围窄并且过大的剂量会造成严重的副作用。另一方面，西罗莫司或他克莫司的剂量过小可造成组织排斥。
用于免疫抑制药，例如西罗莫司化合物和他克莫司化合物的许多全血测定需要使用试剂从血液成分中提取（释放或置换）该药物的步骤。西罗莫司和他克莫司的化学结构在图1中示出。这些分子——它们各自的化学结构有一部分是共通的——结合到内源性特异性结合物质，例如内源性特异性结合蛋白，例如FK-结合蛋白（FKBPs）。如果必要，应该从内源性结合物质离解西罗莫司或他克莫司药物分子和药物代谢物分子，特别是为了进行这些物质的测定。重要的是提供与FKBP结合的免疫抑制药竞争结合到内源性结合物质上的释放试剂并由此释放游离的FKBP结合的免疫抑制药分子以在测定中检测。游离的FKBP结合的免疫抑制药分子的释放带来更好的测定灵敏度（assay sensitivity）。西罗莫司和FK-506酯（FKE）已用作用于他克莫司测定的释放试剂以从内源性结合蛋白释放他克莫司化合物。但是，FK-506酯已表现出与他克莫司测定中所用的抗体的交叉反应性。此外，由于在相同仪器中并列进行西罗莫司和他克莫司免疫测定时的残留（carry-over）问题，使用西罗莫司作为释放试剂是成问题的。
因此，仍然需要开发用于测量患者体内的FKBP结合的免疫抑制药的水平的快速、精确和灵敏的诊断方法。该方法应使用与该药物测定中所用的FKBP结合的免疫抑制药的特异性结合成员（例如抗体）具有最低限度的交叉反应性的用于FKBP结合的免疫抑制药的释放剂。
概述
根据本文描述的原理的一些实例涉及用于在疑似含有FKBP结合的免疫抑制药的样品中从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的组合物。所述组合物在缓冲介质中包含式I的化合物：
或式II的化合物：
或其混合物，
其中：
R1、R2和R3各自独立地为H或低级烷基；
R4和R5各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R6和R7各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R8和R9各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R10和R11各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R12是H、非庞大烃基或庞大有机基团；
其中R8、R9、R10、R11或R12中的至少一个是庞大有机基团；
p是1、2或3；
a是0或1；且
D是N、O或CH，条件是当D是O时，a是0。
在根据本文描述的原理的一些实例中，用于从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的上述组合物包含式III的化合物：
或式IV的化合物：
或其混合物，
其中：
R1、R2和R3各自独立地为H或低级烷基；
R4和R5各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R6和R7各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R8和R9各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R10和R11各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R12是H、非庞大烃基或庞大有机基团；
其中R8、R9、R10、R11或R12中的至少一个是庞大有机基团；
p是1、2或3；
a是0或1；且
D是N、O或CH，条件是当D是O时，a是0。
在根据本文描述的原理的一些实例中，用于从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的上述组合物包含式V的化合物：
或式VI的化合物：
或其混合物。
根据本文描述的原理的一些实例涉及在疑似含有FKBP结合的免疫抑制药的样品中从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的方法。提供了一种组合，其包含所述样品和足以从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的量的式I的化合物：
或式II的化合物：
或其混合物，
其中：
R1、R2和R3各自独立地为H或低级烷基；
R4和R5各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R6和R7各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R8和R9各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R10和R11各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R12是H、非庞大烃基或庞大有机基团；
其中R8、R9、R10、R11或R12中的至少一个是庞大有机基团；
p是1、2或3；
a是0或1；且
D是N、O或CH，条件是当D是O时，a是0。在足以从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的条件下培养所述组合。
根据本文描述的原理的一些实例涉及确定疑似含有FKBP结合的免疫抑制药的样品中FKBP结合的免疫抑制药的存在和/或量的方法。在所述方法中，在介质中提供组合。所述组合包含所述样品和用于从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的释放剂。所述释放剂是式I的化合物：
或式II的化合物：
或其混合物；
其中：
R1、R2和R3各自独立地为H或低级烷基；
R4和R5各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R6和R7各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R8和R9各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R10和R11各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R12是H、非庞大烃基或庞大有机基团；
其中R8、R9、R10、R11或R12中的至少一个是庞大有机基团；
p是1、2或3；
a是0或1；且
D是N、O或CH，条件是当D是O时，a是0。在用于从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的条件下培养所述介质。将用于确定样品中FKBP结合的免疫抑制药的存在和/或量的试剂添加到所述介质中。所述试剂包含FKBP结合的免疫抑制药的至少一种特异性结合成员。检查所述介质是否存在包含FKBP结合的免疫抑制药和西罗莫司或他克莫司的特异性结合成员的复合物。所述复合物的存在和/或量指示所述样品中FKBP结合的免疫抑制药的存在和/或量。
附图简述
图1是对西罗莫司的化学式的描绘。
图2是对他克莫司的化学式的描绘。
图3是根据符合本文描述的原理的实例的组合物和方法中所用的化合物的合成的示意图。
图4是根据符合本文描述的原理的实例的组合物和方法中所用的化合物的合成的示意图。
图5是根据符合本文描述的原理的实例的组合物和方法中所用的化合物的合成的示意图。
图6描绘了不符合本文描述的原理但出于比较目的而提供的化合物。
图7描绘了不符合本文描述的原理但出于比较目的而提供的化合物。
具体实施方案详述
一般论述
公开了用于在疑似含有FKBP结合的免疫抑制药的样品中从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的组合物。该组合物包括在西罗莫司分子的三烯部分中用庞大有机基团改性的西罗莫司衍生物。该组合物可以与在疑似含有FKBP结合的免疫抑制药的样品中对该药物的测定结合使用。
根据本文描述的原理的一些实例涉及式I和式II的化合物、涉及式III和式IV的化合物并涉及式V和式VI的化合物。该化合物可用于从样品中可能存在的内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药。然后可以在对FKBP结合的免疫抑制药的测定中检测到释放的FKBP结合的免疫抑制药。式I、式II、式III、式IV、式V和式VI的化合物作为释放剂表现出与这种测定中所用的FKBP结合的免疫抑制药的特异性结合成员的最低限度的交叉反应性。因此，这种测定提供对样品中存在的FKBP结合的免疫抑制药的存在和/或量的更精确的确定，而不需要在进行测定之前使包含样品的介质与该释放剂分离。在一些实例中，释放功能和测定可以在相同介质中进行而不用从包含释放剂的介质中分离置换出的药物。
根据本文描述的原理的化合物的一些实例具有从内源性结合物质中置换多于一种FKBP结合的免疫抑制药的能力。在一些实例中，式I、式II、式III、式IV、式V或式VI的化合物或两种或更多种此类化合物的混合物可用于例如从内源性结合物质中置换西罗莫司化合物或从内源性结合物质中置换他克莫司化合物。也就是说，在一些实例中，来自上述化合物的同一化合物可用作例如对两种或更多种不同的FKBP结合的免疫抑制药或对三种或更多种不同的FKBP结合的免疫抑制药或对四种或更多种不同的FKBP结合的免疫抑制药的单独测定中的释放剂。在一个特定实例中，来自上述化合物的同一化合物可用作对西罗莫司化合物和他克莫司化合物的单独测定中的释放剂。
在根据本文描述的原理的同一释放剂用于多于一种FKBP结合的免疫抑制药的测定的所有上述情况中，该释放剂表现出与不同免疫抑制药的测定中所用的不同特异性结合成员的最低限度的结合或交叉反应性。术语“最低限度的结合”或“最低限度的交叉反应性”是指该释放剂与该FKBP结合的免疫抑制药的测定中所用的特异性结合成员的结合足够低以致这种结合或交叉反应性对该测定的精确度的影响可忽略不计。该释放剂与特异性结合成员的结合不会造成该药物测定中获得的信号的显著提高或降低。在一些实例中，该释放剂与用于FKBP结合的免疫抑制药的特异性结合成员的结合小于约5%、或小于约4%、或小于约3%、或小于约2%、或小于约1%、或小于约0.5%。
术语“内源性结合物质”是指源自并存在于待分析的样品中的物质，该物质在待分析的样品中结合到FKBP结合的免疫抑制药上。内源性结合物质包括内源性特异性结合物质，例如特异性结合蛋白，例如FKBP。术语“FKBP(s)”是指FK结合蛋白或FK-506结合蛋白，其包括，以举例说明的方式但不限于，FKBP12、亲免素和α1酸性糖蛋白。例如，FKBPs是既与西罗莫司化合物结合又与他克莫司化合物结合的内源性蛋白。
术语“FKBP结合的免疫抑制药”是指特异性结合到FKBPs，包括但不限于例如FKBP12、其它FKBPs、亲免素和α1酸性糖蛋白的免疫抑制药。FKBP结合的免疫抑制药包括，但不限于，例如西罗莫司化合物（其包括依维莫司化合物）和他克莫司化合物。
本文所用的术语“西罗莫司化合物（一种或多种）”包括雷帕霉素及其衍生物、西罗莫司族类的其它成员和它们的衍生物，包括例如在西罗莫司分子的一个或多个位置的酯、酰胺、卤代乙酰胺和酰亚胺。西罗莫司的衍生物包括例如依维莫司。雷帕霉素衍生物包括含雷帕霉素核的化合物、雷帕霉素的代谢物和开环雷帕霉素化合物。雷帕霉素衍生物还包括通过将一个或多个羟基酯化成例如羧酸酯、氨基甲酸酯、磺酸酯或酰胺而制成的衍生物。雷帕霉素衍生物还包括由一个或多个羰基碳还原成羟基或一个或多个双键的还原产生的化合物。
本文所用的术语“他克莫司化合物”是指FK-506及其衍生物、他克莫司族类的其它成员和它们的衍生物，包括例如在他克莫司分子的一个或多个位置的酯、酰胺、卤代乙酰胺和酰亚胺。他克莫司衍生物包括含他克莫司核的化合物、他克莫司的代谢物和开环他克莫司化合物。他克莫司衍生物还包括通过将一个或多个羟基酯化成例如羧酸酯、氨基甲酸酯、磺酸酯或酰胺而制成的衍生物。他克莫司衍生物还包括由一个或多个羰基碳还原成羟基或一个或多个双键的还原产生的化合物。
术语“与用于FKBP结合的免疫抑制药的特异性结合成员的最低限度的交叉反应性”是指该释放剂不会通过结合到用于该药物的特异性结合成员而在任何显著程度上干扰对该药物的测定的精确度和灵敏度。例如，该释放剂与此类特异性结合成员的结合小于约1%、或小于约0.5%、或小于约0.2%、或小于约0.1%。
如上所述，根据本文描述的原理的一些实例涉及用于在疑似含有FKBP结合的免疫抑制药的样品中从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的组合物。所述组合物在缓冲介质中包含式I的化合物：
或式II的化合物：
或其混合物；
其中：
R1、R2和R3各自独立地为H或低级烷基；
R4和R5各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R6和R7各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R8和R9各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R10和R11各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R12是H、非庞大烃基或庞大有机基团；
其中R8、R9、R10、R11或R12中的至少一个是庞大有机基团；
p是1、2或3；
a是0或1；且
D是N、O或CH，条件是当D是O时，a是0。
术语“烃基”是指仅由碳和氢构成的有机基团。烃基可以是不饱和的或其可含有一个或多个碳-碳双键或一个或多个碳-碳三键或其混合物。术语“烃基”包括烷基、烯基和炔基。
术语“庞大有机基团”是指就其重量而言表现出大分子尺寸的有机基团。庞大有机基团阻碍特异性结合成员结合到包含该庞大有机基团的分子区域的能力。术语“庞大烃基”是指就其重量而言表现出大分子尺寸的烃基，例如由支链或环状烷基所表现出的烃基。
术语“非庞大有机基团”是指就其重量而言没有表现出大分子尺寸的有机基团。非庞大有机基团不会在显著程度上阻碍抗体结合到包含该非庞大有机基团的分子区域的能力。术语“非庞大烃基”是指就其重量而言没有表现出大分子尺寸的烃基，例如由直链烷基所表现出的烃基。
术语“烷基”是指直链、支链或环状构型的仅由单键合的碳和氢构成的有机基团。该有机基团中的碳原子数为1至50、或1至40、或1至30、或1至25、或1至20、或1至15、或1至10、或1至5、或2至50、或2至40、或2至30、或2至25、或2至20、或2至15、或2至10、或2至5、或5至50、或5至40、或5至30、或5至25、或5至20、或5至15、或5至10。术语“低级烷基”是指其中该有机基团中的碳原子数为1至10、或1至9、或1至8、或1至7、或1至6、或1至5、或1至4、或1至3、或1至2、或2至10、或2至9、或2至8、或2至7、或2至6、或2至5、或2至4、或2至3、或3至10、或3至9、或3至8、或3至7、或3至6、或3至5、或3至4、或4至10、或4至9、或4至8、或4至7、或4至6、或4至5、或5至10、或5至9、或5至8、或5至7、或5至6、或6至10、或6至9、或6至8、或6至7、或7至10、或7至9、或7至8、或8至10、或8至9、或9至10的烷基。
庞大烃基包括支链烃基和环烃基。庞大支链烃基在连接另一分子的碳原子处或附近具有分支。庞大支链烷基的实例包括，但不限于，例如仲丁基、叔丁基、三乙基甲基、二乙基甲基、三丙基甲基和二丙基甲基。环烷基是包含一个或多个环的烷基。环烷基的实例包括，但不限于，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和降冰片烷基。非庞大烷基的实例包括，但不限于，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基。
术语“烯基”是指具有直链或支链构型的含上文规定的碳原子数的烃链并具有至少一个碳-碳双键（其可能出现在沿烃链的任何点）的烃基，其实例包括，但不限于，例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、二甲基戊烯基。
术语“炔基”是指具有含上文规定的碳原子数的烃链并含有至少一个碳-碳三键的烃基，包括，但不限于，例如乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基和2-丁炔基。
术语“低级烃氧基”是指为直链、支链或环状构型的具有上文指定的碳原子数的有机基团的烃基，其中该有机基团包括用于将烃基连接母体化合物的醚氧。
术语“低级烷氧基”是指直链、支链或环状构型的具有上文指定的碳原子数的有机基团，其中该有机基团包括用于将烷基连接母体化合物的醚氧。
本文所用的术语“芳基”是指由芳烃通过除去一个原子而衍生的并含有一个或多个芳环，例如但不限于1至5个芳环、或1至4个芳环、或1至3个芳环、或1至2个芳环、或2至4个芳环、或2至3个芳环的有机基团。芳基的实例包括，但不限于，例如苯基（来自苯）、萘基（来自萘）和蒽基（来自蒽）。该芳基可以是取代或未取代的。“取代芳基”是指包含一个或多个取代基，例如但不限于庞大烃基、非庞大烃基、官能团（例如氯、溴、碘、氟、硝基和砜）的芳基。
本文所用的“芳基烃基”是指具有与芳基相连的低级烃基的有机基团。本文所用的“芳烷基”是指具有与芳基相连的低级烷基的有机基团，例如但不限于，苄基、苯乙基、3-苯基丙基和1-萘基乙基。
在根据本文描述的原理的一些实例中，R1、R2和R3各自独立地为H或甲基或乙基。在根据本文描述的原理的一些实例中，R4和R5各自独立地为H、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基或一起形成连接O的双键。在根据本文描述的原理的一些实例中，R6和R7各自独立地为H、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基或一起形成连接O的双键。在根据本文描述的原理的一些实例中，R8和R9各自独立地为H、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基或一起形成连接O的双键。在根据本文描述的原理的一些实例中，R10和R11各自独立地为H、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基或一起形成连接O的双键。在根据本文描述的原理的一些实例中，R12是H、叔丁基、苯基或苄基。在根据本文描述的原理的一些实例中，a是1且D是N。
根据本文描述的原理的一些实例涉及用于在疑似含有FKBP结合的免疫抑制药的样品中从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的组合物，其中所述组合物在缓冲介质中包含式III的化合物：
或式IV的化合物：
或式III和式IV的化合物的混合物
其中：
R1、R2和R3各自独立地为H或低级烷基；
R4和R5各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R6和R7各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R8和R9各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R10和R11各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R12是H、非庞大烃基或庞大有机基团；
其中R8、R9、R10、R11或R12中的至少一个是庞大有机基团；
p是1、2或3；
a是0或1；且
D是N、O或CH，条件是当D是O时，a是0。
在根据本文描述的原理的一些实例中，组合物在缓冲介质中包含式V的化合物：
。
在根据本文描述的原理的一些实例中，组合物包含式VI的化合物：
。
在根据本文描述的原理的一些实例中，用作FKBP结合的免疫抑制药的释放剂的组合物包括式V和式VI的化合物的混合物。
化合物的制备
以举例说明而非限制性的方式，参考图3描述制备根据本文描述的原理的化合物的方法的实例。可以使用其它手段形成符合本文描述的原理的化合物。参考图3，在进行狄尔斯-阿尔德加成反应的条件下将西罗莫司化合物VII与环化试剂VIII合并。该条件包括使用无水非极性有机介质，例如但不限于，二氯甲烷、甲苯、己烷、硝基苯和四氯化碳；或极性有机介质，例如但不限于，乙醇、乙腈和甲苯磺酸磷（phosphonium tosylate），和它们的水性混合物。该反应在约15℃至约40℃、或约20℃至约30℃、或约室温（约22℃至约24℃）的温度下进行约15分钟至约45分钟或约30分钟的时间，然后在约50℃至约100℃、或约50℃至约80℃、或约非极性有机溶剂的回流温度的温度下进行约30分钟至约90分钟、或约45分钟至约75分钟、或约60分钟的时间。所得产物通过一种或多种技术，例如但不限于，蒸发、再结晶和色谱法，例如薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、反相液相色谱法（RPLC）、高湍流液相色谱法（HTLC）、气相色谱法提纯。该产物是图3中的化合物I和II所示的两种异构体的混合物，它们可以一起使用或可通过一种或多种用于分离位置异构体的技术，例如但不限于，色谱法（TLC、HPLC、RPLC、HTLC）和气相色谱法分离。
根据本文描述的原理的化合物的实例的另一制备实例举例说明于图4中。参考图4，在与上文描述的制造化合物III和IV的条件类似的进行狄尔斯-阿尔德加成反应的条件下将西罗莫司化合物VII与环化试剂VIII合并。
以举例说明而非限制性的方式，参考图5描述制备根据本文描述的原理的化合物的方法的一个特定实例。可以使用其它手段形成符合本文描述的原理的化合物。参考图5，在进行狄尔斯-阿尔德加成反应的条件下将西罗莫司与环化试剂PTAD合并。该条件包括使用无水非极性有机介质，例如但不限于，二氯甲烷、甲苯、己烷、硝基苯和四氯化碳；或极性有机介质，例如但不限于，乙醇、乙腈和甲苯磺酸磷（phosphonium tosylate），和它们的水性混合物。该反应在约15℃至约40℃、或约20℃至约30℃、或约室温（约22℃至约24℃）的温度下进行约15分钟至约45分钟或约30分钟的时间，然后在约50℃至约100℃、或约50℃至约80℃、或约非极性有机溶剂的回流温度的温度下进行约30分钟至约90分钟、或约45分钟至约75分钟、或约60分钟的时间。所得产物通过一种或多种技术，例如但不限于，蒸发、色谱法，例如薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、反相液相色谱法（RPLC）、高湍流液相色谱法（HTLC）和气相色谱法提纯。该产物是图5中的化合物V和VI所示的两种异构体的混合物，它们可以一起使用或可通过一种或多种用于分离位置异构体的技术，例如但不限于，色谱法（TLC、HPLC、RPLC、HTLC）和气相色谱法分离。
化合物作为释放剂的用途
如上文提到，根据本文描述的原理的一些实例涉及在疑似含有一种或多种FKBP结合的免疫抑制药的样品中从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的方法。提供了一种组合，其包含所述样品和作为预处理释放试剂的、为足以从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的量的上述化合物之一。
待测试的样品可以是非生物或生物的。“非生物样品”是不涉及生物材料的样品，并包括例如，土样、水样、空气样品、其它气体的样品和矿物样品。术语“生物样品”是指任何生物材料，例如体液、体组织、身体化合物和培养基。该样品可以是来自任何来源的固体、半固体或流体（液体或气体）。在一些实施方案中，该样品可以是身体排泄物、身体吸出物（body aspirant）、身体切除物（body excisant）或身体提取物（body extractant）。该身体可以是哺乳动物的或非哺乳动物的。在一些实例中，该身体是人体。身体排泄物是从身体排出的那些物质（尽管它们也可能通过切除或提取获得），例如尿、粪便（feces、stool）、阴道粘液、精液、泪液、呼气、汗、疱液和炎性渗出物。身体切除物是从身体切除的那些材料，例如皮肤、头发和组织样品，包括来自器官和其它身体部分的活体组织切片。身体吸出物是从身体吸出的那些材料，例如粘液、唾液和痰液。身体提取物是从身体提取的那些材料，例如全血、血浆、血清、脊髓液、脑脊髓液、淋巴液、滑液和腹膜液。
为了释放FKBP结合的免疫抑制药，可以在不干扰测定的任何方便的介质中制备该样品；通常使用水性介质，在一些实例中，该介质是随后或同时在其中进行测定的介质。样品部分的尺寸取决于例如该样品的性质、该FKBP结合的免疫抑制药的性质、该测定的性质、用于进行该测定的各种试剂的性质和包含该FKBP结合的免疫抑制药的复合物的性质中的一种或多种。在一些实施方案中，样品部分的体积为例如约1微升至约100微升、或约2微升至约100微升、或约5微升至约100微升、或约10微升至约100微升、或约1微升至约80微升、或约1微升至约60微升、或约1微升至约40微升、或约1微升至约20微升、或约5微升至约50微升、或约10微升至约50微升。
释放剂在该介质中的浓度是足以实现从内源性结合物质中置换基本上所有FKBP结合的免疫抑制药和在一些情况中该FKBP结合的免疫抑制药的代谢物以使该FKBP结合的免疫抑制药和如果需要，其代谢物，可用于结合到该FKBP结合的免疫抑制药和代谢物的特异性结合成员上的所需结果的浓度。术语“置换被内源性结合物质结合的基本上所有FKBP结合的免疫抑制药”是指从内源性结合物质中置换至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少99%或至少99.5%或至少99.9%或100%的FKBP结合的免疫抑制药并在测定过程中可供检测。所用释放剂的量或浓度取决于例如该样品的性质、该FKBP结合的免疫抑制药的性质、该FKBP结合的免疫抑制药的代谢物的性质、其它试剂组分的性质和反应条件中的一种或多种。在一些实例中，释放剂的量为约0.000001%至约0.5%、约0.0001%至约0.4%、约0.001%至约0.3%、约0.01%至约0.2%、约0.1%至约0.3%、约0.2%至约0.5%、约0.1%至约0.2%，等等（百分比是重量/体积）。
在添加释放剂后，将包含该样品的介质在从内源性结合物质中置换基本上所有FKBP结合的免疫抑制药和如果需要，代谢物的条件下培养一段时间。培养长度和条件取决于例如该释放剂的性质、该FKBP结合的免疫抑制药的性质和该FKBP结合的免疫抑制药的怀疑浓度中的一种或多种。在一些实施方案中，该步骤的培养温度可以为例如约5℃至约99℃、或约15℃至约70℃、或约20℃至约45℃。培养期间为例如约0.2秒至约24小时、或约1秒至约6小时、或约2秒至约1小时、或约1至约15分钟。如上文提到，该培养可以在介质中进行，为方便起见，该介质可以是但不必需是如本文论述的测定介质。
根据本文描述的原理的化合物可以直接添加到包含等分试样（sample aliquot）的介质中。另一方面，根据本文描述的原理的化合物可以包括在预处理试剂溶液中并将等分试样添加到该预处理试剂溶液中。在任一情况下，包含样品的介质或预处理试剂溶液本身可包含例如溶血剂、缓冲剂、抗凝血剂和防腐剂中的一种或多种。如果使用上述试剂，其以足以实现所需作用或功能的量存在。
当制备单独的预处理试剂溶液时，其在可以仅是水或可含有约0.1%至约40%、或约0.1%至约30%、或约0.1%至约20%、或约0.1%至约10%、或约0.1%至约5%、或约0.5%至约5%的极性有机溶剂，例如但不限于，醇或醚的水性介质中配制。
在一些实施方案中，使用溶血剂，其是破坏其中可截留FKBP结合的免疫抑制药的细胞膜的试剂。例如，可以通过利用溶血剂从红血球中释放截留在红血球内的FKBP结合的免疫抑制药。溶血剂是破坏红血球的膜的完整性由此置换细胞，特别是红细胞的细胞内的内容物的化合物或化合物混合物。许多溶血剂是本领域中已知的。溶血剂包括例如非离子洗涤剂（detergent）、阴离子洗涤剂、两性洗涤剂、低离子强度水溶液（低渗溶液）、菌剂和造成补体依赖性细胞溶解（complement dependent lysis）的抗体。溶血剂以例如约0.01%至约20%、或约0.1%至约20%、或约0.5%至约20%、或约0.01%至约10%、或约0.1%至约10%、或约0.5%至约10%、或约0.01%至约5%、或约0.1%至约5%、或约0.5%至约5%、或约0.01%至约1%、或约0.1%至约1%、或约0.5%至约1%、或约0.01%至约0.5%、或约0.1%至约0.5%的量存在。
可用作溶血剂的非离子洗涤剂包括合成洗涤剂和天然洗涤剂。合成洗涤剂的实例包括TRITON™ X-100、TRITON™ N-101、TRITON™ X-114、TRITON™ X-405、TRITON™ SP-135、TWEEN® 20（聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯）、TWEEN® 80（聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯）、DOWFAX®、ZONYL®、季戊四醇棕榈酸酯、ADOGEN® 464、ALKANOL® 6112表面活性剂、烯丙醇1,2-丁氧基化物-嵌段-乙氧基化物HLB 6、BRIJ®、乙二胺四(乙氧基化物-嵌段-丙氧基化物)四醇、IGEPAL®、MERPOL®、聚(乙二醇)、2-[乙基[(十七氟辛基)磺酰基]氨基]乙醚、聚乙烯-嵌段-聚(乙二醇)、聚氧乙烯山梨糖醇酐四油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇六油酸酯、TERGITOL® NP-9、GAFAC®（RHODAFAC®，一种烷基聚氧乙二醇磷酸酯，例如α-十二烷基-ω-羟基聚(氧-1,2-乙二基)磷酸酯）和EP110®等。可用作溶血剂的天然存在的洗涤剂包括例如皂苷、钠或钾中和的脂肪酸、中和的磷脂、二酰甘油、中和的磷脂酰丝氨酸、磷脂酸酯、中和的磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱（phosphatidyl choline）、磷脂酰肌醇、卵磷脂（phosphatidylcholine）、胆汁盐、未酯化的胆固醇、中和的鞘氨醇、神经酰胺等。也可以使用一种或多种合成洗涤剂或一种或多种天然存在的洗涤剂的组合或合成洗涤剂和天然存在的洗涤剂的组合。
如果在该介质或预处理试剂溶液中使用缓冲剂，其可以是在对被分析物的测定中所用的缓冲剂。示例性的缓冲剂包括，但不限于，例如硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、巴比妥、PIPES、HEPES、MES、ACES、MOPS和BICINE。用于测定介质或用于预处理试剂溶液的pH例如在约4至约11的范围内，或在约5至约10的范围内，或在约6.5至约9.5的范围内。该pH通常是例如测定所需的pH与达到从内源性结合物质释放或置换FKBP结合的免疫抑制药所需的pH之间的折衷。
该介质还可包含防止血块形成的试剂。此类试剂包括，但不限于，例如乙二胺四乙酸盐（EDTA）、乙二醇四乙酸盐（EGTA）、柠檬酸盐和肝素。抗凝血剂（anti-blood clotting agent）以约0.05%至约10%、或约0.1%至约10%、或约0.05%至约5%、或约0.1%至约5%、或约0.05%至约1%、或约0.1%至约1%、或约0.05%至约0.5%、或约0.1%至约0.5%的量存在。
预处理试剂溶液中可用的其它试剂包括溶解性试剂，例如少量有机溶剂，例如甲醇、乙醇、异丙醇、甲氧基丙醇和二甲亚砜（DMSO）；和用于进行蛋白质消化的试剂，例如蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和肽酶。如上文提到，任何上述试剂以足以实现所需作用或功能的浓度存在。
对被分析物的测定的一般描述
任何合适的测定都可用于确定FKBP结合的免疫抑制药的存在和/或量。可以用如上论述的释放剂处理样品的直接的延续的形式对样品进行测定或可以在此后的某一点进行测定。通过在测定介质中将样品与用于确定该样品中FKBP结合的免疫抑制药的量的试剂合并来进行测定。该试剂的性质取决于要进行的测定的特定类型。对该介质中的组合施以使FKBP结合的免疫抑制药结合到用于该药物的特异性结合成员以形成复合物的条件。测量该复合物的量，其中该复合物的量与该样品中FKBP结合的免疫抑制药的存在和/或量相关。
如上所说明的，在许多实施方案中，该试剂包含用于FKBP结合的免疫抑制药的至少一种特异性结合成员。该特异性结合成员是特异性结合对的成员（sbp成员），其是在表面上或空腔中具有特异性结合到另一分子的特定空间和极性组织并由此被定义为与另一分子的特定空间和极性组织互补的区域的两种不同分子之一。特异性结合对的成员通常是免疫对，如抗原-抗体的成员，尽管其它特异性结合对，例如生物素-亲和素（biotin-avidin）、激素-激素受体、酶-底物、核酸双链体、IgG-蛋白质A、多核苷酸对，如DNA-DNA、DNA-RNA不是免疫对但包括在术语“特异性结合成员”或“sbp成员”的范围内。
特异性结合涉及与其它分子的明显较低识别相比，针对两种不同分子之一对另一种的特异性识别。另一方面，非特异性结合涉及相对不依赖于特定表面结构的分子间非共价结合。非特异性结合可能由几种因素产生，包括分子间的疏水相互作用。
如上文提到，根据本文描述的原理的释放剂表现出与这种测定中所用的FKBP结合的免疫抑制药的特异性结合成员，例如抗体的最低限度的交叉反应性。此外，如上文论述，在根据本文描述的原理的同一释放剂用于多于一种FKBP结合的免疫抑制药的测定的情况中，该释放剂表现出与对不同免疫抑制药的测定中所用的不同特异性结合成员的最低限度的结合或交叉反应性。
在根据本文描述的原理的测定的一些实例中，用于FKBP结合的免疫抑制药的特异性结合成员是该FKBP结合的免疫抑制药的抗体，其可以是完整的免疫球蛋白分子或其片段。抗体包括各种种类和同种型，例如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3和IgM。其片段可包括Fab、Fv和F(ab')2、Fab'等。此外，在适当情况下，可以使用免疫球蛋白或其片段的聚集体、聚合物和共轭物，只要保留对FKBP结合的免疫抑制药的结合亲合力。该FKBP结合的免疫抑制药的抗体可通过如下技术制备，例如包括但不限于宿主免疫和收集血清（多克隆）、制备连续杂交细胞系和收集分泌蛋白质（单克隆）或克隆和表达至少为天然抗体的特异性结合所需的氨基酸序列编码的核苷酸序列或其诱变形式。
一般而言，该测定是确定样品中FKBP结合的免疫抑制药的量的方法。该测定可以是免疫测定或非免疫测定。下面举例而非限制性地论述了各种测定方法。被选用于被分析物的免疫测定的抗体例如应特异性地和优先地结合被分析物（如果必要或需要，及其药物活性代谢物）而非其它配体，如其它代谢物或相关物质。
对FKBP结合的免疫抑制药的测定可以在任何测定组分或产物的不分离（均相）或分离（异相）的情况下进行。异相测定通常涉及一个或多个分离步骤。该测定可以是竞争性或非竞争性的。免疫测定可能涉及标记或非标记试剂。涉及非标记试剂的免疫测定通常包括形成相对大的复合物，其涉及由根据本文描述的原理的免疫原性共轭物制成的一种或多种抗体。此类测定包括例如免疫沉淀素和凝集法和相应的光散射技术，例如用于检测抗体复合物的散射测浑法（nephelometry）和比浊法（turbidimetry）。标记免疫测定包括，但不限于，例如化学发光免疫测定、酶免疫测定、荧光偏振免疫测定、放射免疫测定、抑制测定（inhibition assay）、诱导发光测定和荧光氧通道测定（fluorescent oxygen channeling assay）。
可用的一大类免疫测定包括使用有限抗体浓度的免疫测定。另一类免疫测定涉及使用过量的一种或多种主要试剂，例如过量的用于被分析物的抗体。另一类免疫测定包括无分离的均相测定，其中根据本文描述的原理的标记试剂调节根据本文描述的原理的化合物与用于FKBP结合的免疫抑制药的特异性结合成员结合时的标记信号，由此与样品中可能存在的FKBP结合的免疫抑制药竞争。根据要进行的测定的性质，在测定介质中包含其它试剂。
在一些实施方案中，可以使用均相免疫测定；此类测定也可被称作基本无分配（partition-free）的免疫测定。本方法可用于完全自动化的均相测定，其中在该测定之前，不从样品的其它成分（包括被分析物代谢物）中提取或分离被分析物。在“非人工提取（non-manual extraction）”测定中，未在例如有机溶剂中提取的样品，如全血样品在合适的介质中与用于进行对被分析物的测定的试剂合并，并进行该测定。本方法也可用于人工提取（manual extraction）测定。在任一情况中，根据本文描述的原理的化合物可用于从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药被分析物。
均相免疫测定以Rubenstein等人，美国专利No. 3,817,837，第3栏第6行至第6栏第64行中公开的EMIT®测定（Syva Company, San Jose, CA）；免疫荧光法，如Ullman等人，美国专利No. 3,996,345，第17栏第59行至第23栏第25行中公开的那些；酶通道免疫测定（“ECIA”），如Maggio等人，美国专利No. 4,233,402，第6栏第25行至第9栏第63行中公开的那些；和尤其如美国专利No. 5,354,693中公开的荧光偏振免疫测定（“FPIA”）为例。
其它酶免疫测定是例如Ngo和Lenhoff, FEBS Lett. (1980) 116:285-288论述的酶调节介导的免疫测定（“EMMIA”）；Oellerich, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (1984) 22:895-904公开的底物标记的荧光免疫测定（“SLFIA”）；Khanna等人, Clin. Chem. Acta (1989) 185:231-240公开的复合酶供体免疫测定（combined enzyme donor immunoassays）（“CEDIA”）；均相颗粒标记免疫测定，如颗粒增强的比浊抑制免疫测定（“PETINIA”）和颗粒增强的比浊免疫测定（“PETIA”）。
其它测定包括例如溶胶颗粒免疫测定（“SPIA”）、分散染料免疫测定（“DIA”）；金属免疫测定（“MIA”）；酶膜免疫测定（“EMIA”）；发光免疫测定（luminoimmunoassays）（“LIA”）；和使用顺磁颗粒作为固相的吖啶酯标记免疫测定（ADVIA Centaur immunoassays）。另一些类型的测定包括涉及监测在结合疏水药物时抗体固定化表面的光学、声学和电学性质的变化的免疫传感器测定。此类测定包括例如光学免疫传感器测定、声学免疫传感器测定、半导体免疫传感器测定、电化学换能器免疫传感器测定、电位免疫传感器测定（potentiometric immunosensor assays）和安培电极（amperometric electrode）测定。
在本文中论述的用于确定被分析物的许多测定中，使用标记物；该标记物通常是信号发生系统（“sps”）的一部分。标记物的性质取决于特定测定形式。信号发生系统通常包括一种或多种组分，至少一种组分是可检测的标记物，其生成与结合和/或未结合的标记物的量（即结合或未结合到检测的被分析物或反映待检测的被分析物的量的试剂上的标记物的量）有关的可检测的信号。该标记物是产生或可被诱发产生信号的任何分子并可以是例如荧光剂、放射性标记、酶、化学发光剂或光敏剂。因此，根据标记物的性质，通过检测酶活性、发光、光吸收或放射性来检测和/或测量信号。
合适的标记物包括，以举例说明的方式但不限于，酶，如碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（“G6PDH”）、β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶；核酶；用于复制酶，如QB复制酶的底物；促进剂；染料；荧光剂，如荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明化合物、藻红蛋白、藻蓝蛋白（phycocyanin）、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺；复合物，如由被称作量子点的半导体纳米晶体中存在的CdSe和ZnS制成的那些；化学发光剂，例如异鲁米诺（isoluminol）和吖啶酯；敏化剂；辅酶；酶底物；放射性标记，如125l、131l、14C、3H、57Co和75Se；颗粒，如胶乳颗粒、碳颗粒、金属颗粒，包括磁性颗粒，例如二氧化铬（CrO2）颗粒等；金属溶胶；微晶；脂质体；细胞等，它们可进一步用染料、催化剂或其它可检测基团标记。在Litman等人，美国专利No. 4,275,149，第19-28栏和Boguslaski等人，美国专利No. 4,318,980，第10-14栏中公开了合适的酶和辅酶；在Litman等人，美国专利No. 4,275,149，第30和31栏中公开了合适的荧光剂和化学发光剂；这些通过引用并入本文。
标记物可以直接产生信号，且因此不需要额外组分来产生信号。许多有机分子，例如荧光剂能够吸收紫外光和可见光，其中光吸收将能量转移到这些分子并将它们提升至激发能态。随后通过在第二波长的光的发射而耗散该吸收的能量。直接产生信号的其它标记物包括放射性同位素和染料。
可选地，标记物可能需要其它组分来产生信号，信号发生系统随之将包括产生可测信号所需的所有组分。这样的其它组分可包括底物、辅酶、增强剂、附加的酶、与酶产物反应的物质、催化剂、活化剂、辅助因子、抑制剂、清除剂、金属离子和结合信号生成物质所需的特异性结合物质。合适的信号发生系统的详细论述可见于Ullman等人，美国专利No. 5,185,243，第11-13栏，其公开内容通过引用并入本文。
该标记物或其它sps成员可结合到载体。被分析物或被分析物类似物可以以本领域中已知的任何方式结合到固体载体，只要该结合基本不干扰被分析物或类似物与抗体结合的能力。在一些实施方案中，被分析物或被分析物类似物可以直接涂布或共价键合到固相上，或可具有一种或多种载体分子，如聚(氨基酸)，包括蛋白质，如血清白蛋白或免疫球蛋白，或多糖（碳水化合物），例如葡聚糖或葡聚糖衍生物的层。也可以利用连接基团共价偶联固体载体和被分析物。其它结合被分析物的方法也是可行的。例如，固体载体可具有针对小分子的粘合剂，例如亲和素、抗体等的涂层，且小分子，例如但不限于生物素或半抗原可结合在被分析物上，反之亦然。组分可以直接或间接、共价或非共价结合到载体表面上并可通过文献中常见的公知技术实现。参见例如"Immobilized Enzymes" Ichiro Chibata, Halsted Press, New York (1978)和Cautrecasas, J. Biol. Chem., 245:3059 (1970)。
在载体可以由有机或无机、固体或流体的水不溶性材料构成，其可以是透明的或部分透明的。该载体可具有各种形状，如颗粒，包括例如珠粒、薄膜、膜、管、井（well）、条、杆、平面表面（例如板和纸）和纤维。根据测定的类型，该载体可悬浮或不可悬浮在其使用介质中。可悬浮载体的实例是聚合材料，例如胶乳、脂双层或脂质体、油滴、细胞（cells）和水凝胶，和磁性颗粒。其它载体组合物包括聚合物，如硝化纤维素、乙酸纤维素、聚(氯乙烯)、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、尼龙和聚(丁酸乙烯酯)，它们独自使用或与其它材料结合使用。
该载体可以是颗粒。该颗粒应具有至少约0.02微米和不大于约100微米的平均直径。在一些实施方案中，该颗粒具有约0.05微米至约20微米、或约0.3微米至约10微米的平均直径。该颗粒可以是有机或无机的、可膨胀或不可膨胀的、多孔或无孔的，优选具有近似水、通常约0.7 g/mL至约1.5 g/mL的密度并由可透明、部分透明或不透明的材料构成。该颗粒可以是生物材料，如细胞和微生物，例如红细胞、白细胞、淋巴细胞、杂交瘤、链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或病毒。该颗粒也可以是例如由有机和无机聚合物、脂质体、胶乳颗粒、磁性或非磁性颗粒、磷脂囊泡、乳糜微粒或脂蛋白构成的颗粒。在一些实施方案中，该颗粒是二氧化铬（铬）颗粒或胶乳颗粒。
该聚合物颗粒可以由加聚物或缩聚物形成。该颗粒在水性介质中将是易分散的并可以是吸附性的或可官能化的以便直接或经由连接基团间接缀合到被分析物上。该颗粒也可以衍生自天然存在的材料、合成改性的天然存在材料和合成材料。例如，在有机聚合物中特别有用的是多糖，特别是交联多糖，如可作为SEPHAROSE®获得的琼脂糖、可作为SEPHADEX®和SEPHACRYL®获得的葡聚糖、纤维素、淀粉等；加聚物，如聚苯乙烯、聚乙烯醇、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的衍生物的均聚物和共聚物，特别是具有游离羟基官能的酯和酰胺。
该标记物和/或其它sps成员可以结合到sbp成员或另一分子。例如，该标记物可以共价键合到sbp成员，例如抗体、抗体的受体、能够结合到与抗体缀合的小分子上的受体、或被分析物类似物。可以通过使标记物的氢原子被替换成连接sbp成员的键的化学反应或可包括标记物与sbp成员之间的连接基团来实现标记物与sbp成员的结合。其它sps成员也可能共价键合到sbp成员上。例如，两个sps成员，如荧光剂和猝灭剂可以各自结合到与被分析物形成特异性复合物的不同抗体上。复合物的形成使荧光剂和猝灭剂十分靠近，由此使猝灭剂能够与荧光剂相互作用以产生信号。缀合方法是本领域中公知的。参见例如Rubenstein等人，美国专利No. 3,817,837，其相关部分通过引用并入本文。
特别可用作标记蛋白的酶是氧化还原酶，特别是脱氢酶，例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和乳酸脱氢酶，和涉及生成过氧化氢并利用过氧化氢将染料前体氧化成染料的酶。特定的组合包括与利用过氧化氢氧化染料前体的酶，即过氧化物酶，如辣根过氧化物酶、乳过氧化物酶、或微过氧化物酶相结合的糖氧化酶，例如葡萄糖和半乳糖氧化酶，或杂环氧化酶，如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶。另外的酶组合是本领域中已知的。当使用单一的酶作为标记物时，可使用其它酶，如水解酶、转移酶和氧化还原酶，优选水解酶，如碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶。可选地，可以使用荧光素酶，如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶。
可用的示例性的辅酶包括，以举例说明的方式但不限于，NAD[H]、NADP[H]、磷酸吡哆醛、FAD[H]、FMN[H]和β-半乳糖苷酶。参见例如美国专利No. 4,318,980，其公开的相关部分通过引用并入本文。
对于标记蛋白，例如酶，分子量范围是约10,000至约600,000，或约10,000至约300,000的分子量。例如，通常每约200,000分子量有至少约1个被分析物类似物，或每约150,000分子量有至少约1个，或每约100,000分子量有至少约1个，或约50,000分子量有至少约1个。在酶的情况下，被分析物类似基团数为例如1至约20、约2至约15、约3至约12、或约6至约10。
术语“非-聚(氨基酸)标记物”包括不是蛋白质（例如酶）的那些标记物。非-聚(氨基酸)标记物能够被直接检测或可通过产生可检测信号的特异性结合反应检测。非-聚(氨基酸)标记物包括例如放射性同位素、发光化合物、载体，例如颗粒、片、珠粒等，多核苷酸等。更特别地，非-聚(氨基酸)标记物可以是同位素或非同位素的，通常非同位素的，并可以是为催化剂、促进剂、染料、辅酶、酶底物、放射性基团、小有机分子（包括例如生物素、荧光分子、化学发光分子等）、可扩增的多核苷酸序列、载体，例如颗粒，如胶乳或碳颗粒或二氧化铬（铬）颗粒、金属溶胶、微晶、脂质体或细胞的多核苷酸的编码，其可以或可不进一步用例如染料、催化剂或其它可检测基团标记。
在一个实施方案中，该测定是名为"Assay Method Utilizing Photoactivated Chemiluminescent Label"（“诱导发光测定”）的美国专利No. 5,340,716（Ullman等人）中描述的诱导发光免疫测定，其公开内容通过引用并入本文。在一种手段中，该测定使用并入光敏剂的颗粒和并入化学发光化合物的标记颗粒。该标记颗粒缀合到sbp成员，例如能与被分析物结合形成复合物或与第二sbp成员结合形成复合物的被分析物的抗体，这与被分析物的量的有关。如果存在被分析物，光敏剂和化学发光化合物变得十分靠近。光敏剂生成单态氧并在这两种标记物十分靠近时激活化学发光化合物。被激活的化学发光化合物随后产生光。产生的光量与形成的包含被分析物抗体的复合物的量相关。
以进一步举例说明而非限制的方式，使用化学发光颗粒，其包含例如通过并入其中或附着到其上而与其联合的化学发光化合物。结合到被分析物上的sbp成员，例如被分析物的抗体，结合到涂布该颗粒的多糖上。结合到被分析物的抗体上的第二sbp成员是生物素缀合物的一部分。链霉亲和素缀合到第二组具有与其联合的光敏剂的颗粒上。链霉亲和素与这种第二组颗粒（光敏剂颗粒）的结合可能涉及或可能不涉及该颗粒上的多糖。将化学发光颗粒与疑似含有被分析物的样品和与光敏剂颗粒混合。培养该反应介质以通过sbp成员结合到被分析物上以形成复合物而使颗粒结合到被分析物并使第二sbp成员结合到该复合物上。然后，用光辐照该介质以激发光敏剂，其在激发态下能将氧激活成单态。由于一组颗粒的化学发光化合物现在依靠被分析物的存在十分靠近光敏剂，其被单态氧激活并发光。然后检查该介质的发光量或发射的光，其存在与被分析物的量相关。
在美国专利No. 5,616,719（Davalian等人）中论述了可用于确定被分析物的测定的另一特定实例，其描述了荧光氧通道免疫测定。
上文论述的测定通常在水性缓冲介质中在中等pH下进行，这通常提供最佳检测灵敏度。测定介质的pH将通常在约4至约11的范围内，或在约5至约10的范围内，或在约6.5至约9.5的范围内。该pH将通常是任何特异性结合对的结合成员的最佳结合和用于该测定的其它试剂，如信号发生系统的成员的最佳pH之间的折衷。可以使用各种缓冲剂实现所需pH并在培养期间保持该pH。示例性的缓冲剂包括，但不限于，例如硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐、三羟甲基氨基甲烷、巴比妥、PIPES、HEPES、MES、ACES、MOPS和BICINE。在该测定方法中可以使用各种辅助材料。例如，除缓冲剂和防腐剂外，该介质可包含用于该介质和所用试剂的稳定剂。在一些实施方案中，除这些添加剂外，还可包括例如蛋白质，如白蛋白；季铵盐；聚阴离子，如葡聚糖硫酸盐（dextran sulfate）；和结合增强剂。所有上述材料以足以实现所需作用或功能的浓度或量存在。
可以以一个或多个间隔，包括对在上文提到的各种试剂的添加之间的任何间隔对该介质施加一个或多个培养周期。通常以足以发生试剂的各种组分的结合的温度和时间培养该介质。通常使用中等温度进行该方法并通常在测量期间恒温，优选室温。培养温度通常为例如约5℃至约99℃，或约15℃至约70℃，或约20℃至约45℃。培养周期为例如约0.2秒至约24小时，或约1秒至约6小时，或约2秒至约1小时，或约1至约15分钟。该周期取决于介质的温度和各种试剂的结合速率。测量期间的温度将通常为约10℃至约50℃，或约15℃至约40℃。
可被测定的被分析物的浓度通常为约10-5至约10-17 M或约10-6至约10-14 M不等。如该测定是定性、半定量还是定量（相对于样品中存在的erythrocytophilic药物被分析物的量）、特定检测技术和被分析物的浓度之类的考虑因素通常决定了各种试剂的浓度。
测定介质中各种试剂的浓度将通常由例如被分析物的相关浓度范围、测定的性质、抗体亲和力（affinity）和亲抗原性（avidity）和抗体片段（fragmentation）来确定。但是，通常凭经验确定各试剂的最终浓度以在整个范围内优化该测定的灵敏度。也就是说，显著的被分析物浓度变化应提供可精确测得的信号差。如信号发生系统的性质和被分析物的性质之类的考虑因素通常决定各种试剂的浓度。
尽管添加次序可广为不同，根据测定的性质存在某些优选。最简单的添加次序是同时添加所有材料并如均相测定中那样确定该测定介质对信号的影响。可选地，可以相继合并试剂。任选地，在如上论述的各添加后可涉及培养步骤。培养周期的长度足以实现所需功能的长度。
对FKBP 结合的免疫抑制药被分析物的测定的具体实施方案
接下来以举例说明而非限制性的方式论述可用于测定样品的测定的具体实施方案。在所有情况中，在进行测定之前并与其分开地，或在进行测定的同时，将根据本文描述的原理的化合物添加到样品中，以从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药。该化合物可包括在包含样品的介质中，或可以将样品添加到单独制备的包含根据本文描述的原理的化合物的预处理试剂溶液中。
在均相测定中，在已合并所有试剂后，确定信号并与样品中被分析物的量相关联。例如，在对被分析物的EMIT®测定中，疑似含有被分析物的样品在水性介质中同时或相继与被分析物的酶缀合物，即被分析物的类似物，和能够识别被分析物的抗体合并。通常，加入该酶的底物，这导致在酶催化的反应下形成发色或荧光产物。优选的酶是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和碱性磷酸酶，但也可以使用其它酶。被分析物和酶缀合物的部分竞争抗体上的结合位点。然后通常通过分光光度手段测量该介质中的酶活性。
“被分析物类似物”或“被分析物的类似物”是与被分析物竞争受体（如被分析物的抗体）的改性被分析物。该改性可提供将被分析物类似物接合到另一分子，例如但不限于载体、标记物、小分子或小分子的结合伴侣的手段。该被分析物类似物与被分析物的区别将通常不只是氢被替换成将被分析物类似物连接枢纽（hub）或标记物的键，但不需要如此。也就是说，被分析物类似物可以直接或借助连接基团间接连接另一分子。被分析物类似物可以是例如在结构上与被分析物有关的分子或经由连接基团缀合到另一分子上的被分析物。
可以使用突变葡萄糖-6-磷酸脱氢酶作为酶缀合物的酶进行上述测定。在美国专利Nos. 6,090,567和6,033,890中描述了这种突变酶，它们的相关公开内容通过引用并入本文。此外，可以使用被分析物的抗体和使用如美国专利Nos. 5,328,828和5,135,863中公开的程序进行该测定，它们的相关公开内容通过引用并入本文。
异相测定通常涉及一个或多个分离步骤并可以是竞争性或非竞争性的。在Davalian等人，美国专利No. 5,089,390，第14栏第25行至第15栏第9行中公开了各种竞争性和非竞争性测定形式，其公开内容通过引用并入本文。在一种类型的竞争性测定中，使如本文论述的具有与其结合的被分析物抗体的载体与含有样品和被分析物的适当酶缀合物的介质接触。在分离该载体和该介质后，通过传统技术确定载体或介质的酶活性以确定该测量结果。
在某些实施方案中，除该酶缀合物的酶外还可以使用第二种酶。这对酶中的酶的关联在于，第一种酶的产物充当第二种酶的底物。
测定形式的另一实施方案是捕获测定。在这种测定形式中，使被分析物的抗体共价键合到磁性颗粒上。用这些颗粒培养该样品以使被分析物的抗体结合到被分析物上。随后，用该磁性颗粒培养具有共价连接的被分析物或被分析物衍生物的酶。在洗涤后，测量结合到磁性颗粒的酶量且其与包含被分析物抗体的复合物的量呈负相关。
在一个特定实例中，可以使用诱导发光免疫测定。该诱导发光免疫测定参考美国专利No. 5,340,716（Ullman），其公开内容通过引用并入本文。在一种方法中，该测定使用联合有光敏剂的颗粒，其中FKBP结合的免疫抑制药的类似物结合到该颗粒（光敏剂颗粒试剂）。化学发光试剂包含该FKBP结合的免疫抑制药的抗体。该FKBP结合的免疫抑制药被分析物与光敏剂颗粒试剂竞争结合到FKBP结合的免疫抑制药的抗体。如果存在FKBP结合的免疫抑制药被分析物，十分靠近化学发光试剂的光敏剂颗粒试剂的分子数较少。因此，测定信号将降低。光敏剂生成单态氧并在这两种标记物十分靠近时激活化学发光试剂。被激活的化学发光试剂随后产生光。产生的光量与形成的复合物的量相关，后者进而与样品中存在的FKBP结合的免疫抑制药被分析物的量相关。
在诱导发光免疫测定的另一特定实例中，该测定使用联合有化学发光化合物的颗粒，其中FKBP结合的免疫抑制药的类似物结合到该颗粒上（化学发光颗粒试剂）。光敏剂试剂包含FKBP结合的免疫抑制药的抗体。该FKBP结合的免疫抑制药被分析物与化学发光颗粒试剂竞争结合到FKBP结合的免疫抑制药的抗体。如果存在FKBP结合的免疫抑制药被分析物，十分靠近光敏剂试剂的化学发光颗粒试剂的分子数较少。因此，测定信号将降低。光敏剂生成单态氧并在这两种标记物十分靠近时激活化学发光颗粒试剂的化学发光化合物。被激活的化学发光化合物随后产生光。产生的光量与形成的复合物的量相关，后者进而与样品中存在的FKBP结合的免疫抑制药被分析物的量相关。
在诱导发光测定的另一特定实例中，使用缀合到小分子的结合伴侣，例如亲和素或链霉亲和素（它们是生物素的结合伴侣）上的光敏剂颗粒。也使用包含生物素的FKBP结合的免疫抑制药的类似物（生物素试剂）。使用包含该FKBP结合的免疫抑制药的特异性结合成员的化学发光试剂作为该检测系统的一部分。培养反应介质以借助亲和素与生物素之间的结合使光敏剂颗粒的亲和素或链霉亲和素结合到生物素试剂并使作为化学发光试剂的一部分的该FKBP结合的免疫抑制药的特异性结合成员结合到该FKBP结合的免疫抑制药被分析物或此时附着在光敏剂颗粒上的生物素试剂的被分析物类似物。然后，用光辐照该介质以激发光敏剂，其在激发态下能将氧激活成单态。由于该FKBP结合的免疫抑制药被分析物的存在使得较少的化学发光试剂十分靠近光敏剂，该化学发光试剂较少被单态氧激活且发光较低。然后检查该介质的发光或发射的光的存在和/或量，其存在与该FKBP结合的免疫抑制药被分析物的存在和/或量相关，其中在该FKBP结合的免疫抑制药被分析物存在下观察到信号降低。
在诱导发光测定的另一特定实例中，使用缀合到小分子的结合伴侣，例如亲和素或链霉亲和素（它们是生物素的结合伴侣）上的光敏剂颗粒。缀合物试剂包含缀合到生物素上的FKBP结合的免疫抑制剂药物的特异性结合成员。使用FKBP结合的免疫抑制药的类似物，其中该类似物附着到也使用的化学发光颗粒上（化学发光-类似物试剂）。培养反应介质以借助亲和素与生物素之间的结合使光敏剂颗粒的亲和素或链霉亲和素结合到抗体-生物素试剂并也使该FKBP结合的免疫抑制药的特异性结合成员结合到FKBP结合的免疫抑制药被分析物（如果存在于样品中）和作为化学发光化合物试剂的一部分的被分析物类似物。然后，用光辐照该介质以激发光敏剂，其在激发态下能将氧激活成单态。由于该FKBP结合的免疫抑制药被分析物的存在使得目前较少的化学发光-类似物试剂十分靠近光敏剂，该化学发光试剂较少被单态氧激活且发光较低。然后检查该介质的发光或发射的光的存在和/或量，其存在与该FKBP结合的免疫抑制药被分析物的存在和/或量相关，其中在该FKBP结合的免疫抑制药被分析物存在下观察到信号降低。
以举例说明而非限制性的方式，测定形式的另一实例是ACMIA（Affinity Chromium dioxide Mediated Immuno Assay）。对于ACMIA测定形式，使用被FKBP结合的免疫抑制药的类似物涂布的铬颗粒作为第一组分。第二组分是FKBP结合的免疫抑制药的抗体。将与报告酶（例如β-半乳糖苷酶）交联的该抗体过量添加到反应容器中，即超过结合样品中可能存在的所有FKBP结合的免疫抑制药被分析物所需的量。用FKBP结合的免疫抑制药的抗体处理经受了根据本文描述的原理的释放剂处理的样品，所述抗体结合到样品中的FKBP结合的免疫抑制药。将抗体-酶缀合物与该样品混合以使FKBP结合的免疫抑制药被分析物结合到该抗体。接着，加入铬颗粒试剂以结合任何过量的抗体-酶缀合物。然后，应用磁体，其将所有铬颗粒和过量抗体-酶拉出悬浮液，并将上清液转移到最终反应容器中。将该报告酶的底物添加到最终反应容器中并作为随时间经过的吸光度变化以分光光度法测量酶活性。该信号量与样品中的FKBP结合的免疫抑制药的量相关。
在所有上述测定形式中，使用根据本文描述的原理的释放剂从内源性结合物质中置换FKBP结合的免疫抑制药。如上文论述，可以将释放剂直接或以预处理试剂溶液的形式添加到包含样品的介质中。另一方面，可以将样品添加到包含根据本文描述的原理的化合物的预处理试剂溶液中。
测量步骤
使用免疫测定的根据本文描述的原理的方法包括检查各自的测定介质中包含该FKBP结合的免疫抑制药被分析物的抗体（抗-被分析物抗体）的复合物的量。在根据所用的特定测定培养该测定介质后分别对各测定介质进行测量。
术语“测量被分析物的量”是指对被分析物的定量、半定量和定性确定。定量、半定量和定性的方法以及用于确定被分析物的所有其它方法被视为测量被分析物的量的方法。例如，仅检测疑似含有被分析物的样品中是否存在被分析物的方法被认为包括在本实施方案的范围内。术语“检测”和“确定”以及用于测量的其它常见同义词被预期在本实施方案的范围内。
在许多实施方案中，对该介质的检查包括检测来自该介质的信号。信号量与样品中的被分析物的量相关。特定检测模式取决于信号发生系统的性质。如本文论述，sps的标记物可通过许多方法产生可通过外部手段，合意地通过目视检查检测到的信号，且其包括例如电磁辐射、电化学、热、放射性检测和化学试剂。
信号发生系统的激活取决于信号发生系统成员的性质。对于用光激活的信号发生系统的那些成员，用光辐照该成员。对于在颗粒表面上的信号发生系统成员，添加碱可能导致激活。本领域技术人员可根据本文的公开内容想到其它激活方法。对于一些信号发生系统，不需要激活剂，如涉及放射性标记物、酶等的那些系统。对于酶系统，添加底物和/或辅助因子可能是必要的。
信号量的检查也包括信号的检测，其通常仅是读取信号的步骤。通常使用仪器读取信号，该仪器的性质取决于信号的性质。该仪器可以是例如分光光度计、荧光计、吸收光谱仪、光度计、化学发光计（chemiluminometer）、光能计或摄影仪器。检测到的信号量与样品中存在的FKBP结合的免疫抑制药被分析物的量相关。测量过程中的温度通常为例如约10℃至约70℃，或约20℃至约45℃，或约20℃至约25℃。在一种手段中，使用待筛选的被分析物的已知浓度形成标准曲线；也可以使用校准品和其它对照物。
用于对样品部分进行测定的试剂盒
用于进行特定测定的试剂可存在于可用于方便地进行用于确定FKBP结合的免疫抑制药被分析物的测定的试剂盒中。在一个实施方案中，试剂盒以包装的组合形式包含用于从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药被分析物的根据本文描述的原理的试剂、被分析物的抗体和用于进行测定的其它试剂，其性质取决于特定测定形式。根据试剂的交叉反应性和稳定性，这些试剂可以各自在单独容器中，或各种试剂可以合并在一个或多个容器中。该试剂盒可进一步包括用于进行测定的其它单独包装的试剂，如附加sbp成员、辅助试剂，如辅助酶底物等。
试剂盒中各种试剂的相对量可广为不同以提供明显优化需要在测定方法的过程中发生的反应并进一步明显优化该测定的灵敏度的试剂浓度。在适当的情况下，试剂盒中的一种或多种试剂可以包括赋形剂的干粉（通常冻干）的形式提供，其在溶解时将提供具有适用于进行方法或测定的浓度的试剂溶液。该试剂盒可进一步包括根据如上所述的本实施方案的方法的书面说明。
本文所用的术语“至少”是指指定项目数可能等于或大于所列数值。本文所用的术语“或更大”是指指定项目数可能等于或大于所列数值。本文所用的术语“约”是指所列数值可能相差+或-10%；例如，“约5”是指4.5至5.5的范围。
下列论述以举例说明而非限制的方式地涉及根据本文描述的原理的具体实施例；这些具体实施例无意限制本公开和所附权利要求书的范围。可以在不背离本公开的精神和范围的情况下设计许多修改和替代性的组合物、方法和系统。
实施例
下列实施例以举例说明而非限制性的方式进一步描述本发明的具体实施方案并意在描述而非限制本发明的范围。除非另行指明，本文中公开的份数和百分比按体积计。
定义:
mg = 毫克
g = 克
ng = 纳克
mL = 毫升
µL = 微升
mmol(s) = 毫摩尔
µmol = 微摩尔
℃ = 摄氏度
min = 分钟
sec = 秒
hr = 小时
w/v = 重量/体积
v/v = 体积/体积
TLC = 薄层色谱法
HPLC = 高效液相色谱法
EtOAc = 乙酸乙酯
MeOH = 甲醇
DMF = 二甲基甲酰胺
DMSO = 二甲亚砜
MeOP = 1-甲氧基-2-丙醇
MES = 2-(N-吗啉)乙磺酸
DI = 去离子
EDA = 乙二胺
LOCI = 发光氧通道免疫测定
BSA = 牛血清白蛋白
BGG = 牛γ球蛋白
mIgG = 单克隆免疫球蛋白
MS = 质谱法
SIRO = 西罗莫司
Tacro = 他克莫司
FKE = FK506酯。
除非另有注明，所有化学品可购自Sigma-Aldrich Company (St. Louis MO)。他克莫司可获自Astellas Pharma US. Inc., Deerfield IL。西罗莫司可获自Pfizer Inc., New York NY。4-苯基-1,2, 4-三唑啉-3,5-二酮（PTAD）可获自Sigma-Aldrich Company。偶氮二甲酸二乙酯（DAC）可购自Sigma-Aldrich Company。
使用可获自Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Newark DE的DIMENSION® RxL分析仪进行测试。使用ACMIA免疫测定技术利用该仪器。在美国专利Nos. 7,842,475、7,186,518、5,147,529、5,128,103、5,158,871、4,661,408、5,151,348、5,302,532、5,422,284、5,447,870和5,434,051中描述了该ACMIA测定方法，它们的公开内容全文通过引用并入本文。在本文中使用和下文更详细论述的ACMIA法的实施方案中，利用铬颗粒上的他克莫司类似物与患者样品中的他克莫司之间对缀合到酶上的他克莫司抗体（“缀合物”）的竞争确定患者样品中的他克莫司量。通过磁力分离除去结合到铬颗粒上的他克莫司类似物的缀合物。测量上清液中剩余的缀合物的酶活性且其与患者样品中的他克莫司量成正比。在所用ACMIA测定形式中，测试不含他克莫司的样品时观察到的酶活性指示没有结合到活性抗体上（即无法结合到铬颗粒上的他克莫司）的酶活性量。不存在铬颗粒时观察到的酶活性指示该缀合物中的酶活性总量。可以使用这些值评估结合到活性抗体的酶活性的百分比。
实施例 1
4- 苯基 -1,2,4- 三唑啉 -3,5- 二酮（ PTAD ）和西罗莫司的狄尔斯 - 阿尔德加合物的制备. 参考图5。在室温（24℃）下将PTAD（38毫克，0.217毫摩尔）在无水CH2Cl2（1毫升）中的溶液添加到西罗莫司（200毫克，0.219毫摩尔）在无水CH2Cl2（7毫升）中的溶液中。PTAD的特征红色消失。将反应混合物在室温下搅拌30分钟并在氮气下在60℃下回流60分钟。对该混合物的TLC分析表明留下极少量的西罗莫司。（TLC条件：己烷/乙酸乙酯/MeOH = 30/65/5 (v/v)）。然后，将5毫克PTAD添加到反应混合物中。将该混合物在24℃下搅拌30分钟。该混合物的TLC分析再次证实，所有的西罗莫司耗尽。该反应中留下PTAD的浅红色，表明PTAD过量。通过旋转蒸发来蒸发大部分CH2Cl2。将残留溶液（0.5毫升）施加到制备的TLC板（20 x 20 cm, 2000 micron；Analtech, Newark DE）上。该板用与上文相同的溶剂体系（己烷/乙酸乙酯/MeOH = 30/65/5 (v/v)）显影。收集含产物的硅带并用MeOH/CH2Cl2（1/9；v/v；40 ml x 3）萃取三次。将合并的有机萃取物蒸发，残留物在高真空中干燥16小时。这产生白色固体形式的所需纯PTAD-西罗莫司狄尔斯-阿尔德加合物III和IV的混合物（220毫克，92%产率）。III/IV的HPLC区域异构体比率为86/14；
。
偶氮二甲酸二乙酯（ DAC ）和西罗莫司的狄尔斯 - 阿尔德加合物的制备. 为了比较，制备并评估不符合本文描述的原理的标题化合物。在室温（24℃）下将DAC（77毫克，0.07毫升，0.438毫摩尔）添加到西罗莫司（200毫克，0.219毫摩尔）在无水CH2Cl2（5毫升）中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌10分钟并在氮气下在60℃下回流16小时。对该混合物的TLC分析显示了留下少量西罗莫司（TLC条件：乙酸乙酯）。因此，使该混合物冷却至室温（24℃）。将DAC（77毫克）添加到反应混合物中。将反应混合物在氮气下在60℃下回流3小时。通过旋转蒸发来蒸发大部分CH2Cl2。将残留溶液（0.5毫升）施加到制备的TLC板（20 x 20 cm, 2000 micron；Analtech）上。该板用相同溶剂体系（乙酸乙酯）显影。收集含产物的硅带并用MeOH/CH2Cl2（1/9；v/v；40 ml x 3）萃取三次。将合并的有机萃取物蒸发，残留物在高真空中干燥16小时。这产生白色固体形式的所需纯西罗莫司狄尔斯-阿尔德加合物IX和X（见图6）（182毫克，76%产率）。HPLC区域异构体IX/X比率为85/15；HPLC-MS (ES): MNa+ 1110.6。
氢化西罗莫司的制备. 为了比较，制备并评估不符合本文描述的原理的标题化合物。以与美国专利No. 5,023,262中描述类似的方式制备氢化西罗莫司，其相关部分通过引用并入本文。概括而言，在氢压下用金属催化剂进行西罗莫司的氢化以将西罗莫司的三烯部分氢化以产生氢化西罗莫司XI（见图7）。
预处理试剂溶液的制备. 制备这种预处理溶液以含有一定量的释放剂、6.8 mg/mL PIPES 1.5钠盐（缓冲剂）、0.3 mg/mL EDTA二钠（抗凝剂）、1.0 mg/mL皂苷（溶血剂）、0.2% Proclin® 300（防腐剂）、0.024 mg/mL硫酸新霉素（防腐剂）和0.99 mg/mL NaN3，pH 为6.5。各预处理试剂溶液中释放剂的量为10 µg/mL。最终反应混合物中的释放剂浓度等于46.7 µg/mL的由样品添加的类似物。
抗 - 西罗莫司抗体 - β - 半乳糖苷酶缀合物的制备. 使用标准异双功能SMCC（反式-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯）连接剂根据已知技术将单克隆抗-西罗莫司抗体（来自Wyeth Pharmaceutical的克隆系155-M1）缀合到β-半乳糖苷酶上。该抗体缀合物溶液含有约7.5 µg/mL抗-西罗莫司抗体-β-半乳糖苷酶缀合物、30 mg/mL无蛋白酶的牛血清白蛋白、0.126 mg/mL MgCl2、0.03 mL/mL乙二醇、35.14 mg/mL PIPES 1.5钠盐、50 mg/mL NaCl和β-gal突变蛋白（灭活β-半乳糖苷酶），pH为 6.5。
抗 - 他克莫司抗体 - β - 半乳糖苷酶缀合物的制备. 使用标准异双功能SMCC（反式-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯）连接剂根据已知技术将单克隆抗-他克莫司抗体（克隆系1H6，参见例如美国专利No. 7,078,495）缀合到β-半乳糖苷酶上。该抗体缀合物溶液含有约7.5 µg/mL抗-他克莫司抗体-β-半乳糖苷酶缀合物、30 mg/mL无蛋白酶的牛血清白蛋白、0.126 mg/mL MgCl2、0.03 mL/mL乙二醇、35.14 mg/mL PIPES 1.5钠盐、50 mg/mL NaCl和β-gal突变蛋白（灭活β-半乳糖苷酶），pH为 6.5。
磁性铬颗粒制备. 通过将西罗莫司–生物素缀合物缀合到链霉亲和素涂布的铬颗粒（以与美国专利No. 7,842,475中描述类似的方式制备），制备西罗莫司铬颗粒（免疫测定固相）。该铬颗粒试剂含有约2.5 mg/mL西罗莫司铬颗粒浆、60.8 mg/mL海藻糖二水合物和7.2 mg/mL CARBOWAX®。
通过将他克莫司-C22琥珀酸盐（以与美国专利No. 7,842,475中描述类似的方式制备）缀合到荧光素（其用于预装饰（pre-decorate）经由戊二醛固定在铬颗粒上的抗-荧光素抗体），制备他克莫司铬颗粒（免疫测定固相）。该铬颗粒试剂含有约2.5 mg/mL他克莫司铬颗粒浆、60.8 mg/mL海藻糖二水合物和7.2 mg/mL CARBOWAX®。
样品的制备. 在全血池的等分试样中掺入一定量的西罗莫司以使在校准品中全血样品中的所得西罗莫司浓度如表1中所述（0.0、5.1、10.1、20.6和31.6 ng/mL）。在全血池的等分试样中掺入一定量的他克莫司以使在校准品中全血样品中的所得他克莫司浓度如表2中所述（0.0、2.6、5.3、11.6和30.1 ng/mL）。
样品的预处理. 如下处理一组样品：向各样品中加入一定量的来自上文的预处理试剂溶液以从内源性特异性结合蛋白中置换样品中的西罗莫司。该样品在37℃下培养140分钟。随后，对各样品施以上述测定，下面将进一步描述；测量信号（mAU）并与被分析物的浓度相关联，其代表样品中的游离被分析物（没有被内源性结合物质结合的被分析物+从内源性结合物质中置换出的被分析物）的量。
测定. 如下进行西罗莫司的ACMIA测定：在Dimension® RxL分析仪上的容器中，将15微升来自上文的全血样品与来自上文的预处理试剂溶液（置换剂）（表1）混合。通过首先用超声样品探针混合血液，从标准杯中对全血采样。
接着将抗-西罗莫司抗体-β-半乳糖苷酶缀合物（50微升）添加到各反应容器中并将该混合物在43℃下保持一段时间（10至15分钟）以使西罗莫司（如果存在）与抗体试剂反应。将具有固定的西罗莫司-生物素至链霉亲和素涂布的铬颗粒的缀合物的铬颗粒添加（50微升）到各反应容器中并使它们结合未结合的缀合物。在对上述反应混合物施加磁场以将该溶液与铬颗粒分离时，西罗莫司结合的抗-西罗莫司抗体-β-半乳糖苷酶缀合物不结合到铬颗粒上，而是留在上清液中。通过将来自各反应容器的上清液转移到测光比色皿中并在氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷（CPRG）存在下测量该缀合物的酶催速率（enzymatic rate），检测西罗莫司结合的缀合物。在577和700 nm下双色地（bichromatically ）测量各个反应容器的速率。结果概括在表1中的类目：对校准品观察到的仪器信号、以ng/mL测得的药物浓度、 相比于SIRO的置换百分比(%)和计算抗体交叉反应性（百分比(%)乘以100）下。交叉反应性基于下列：
1) 相对于15微升样品，将70微升预处理试剂溶液添加到反应介质中，总反应混合物体积 = 305微升。
2) 10 µg/mL的SIRO类似物在该预处理试剂溶液中。
3) 来自预处理试剂的10 µg/mL的SIRO类似物等于由样品添加的46.7微克/毫升SIRO类似物（计算：70 µL x 10 µg/mL/15 µL= 46.7 µg/mL）
4) 在0 ng/mL校准品下的测量的西罗莫司值
5) 测量值/46.7是%交叉反应性。
表 1
对校准品观察到的仪器信号
以ng/mL测得的药物浓度
相比于SIRO的置换百分比(%)
在校准品中0 ng/mL浓度的药物浓度下测得的经计算的抗体交叉反应性（百分比(%)乘以100）
。
对含有他克莫司的样品重复用于释放被分析物（使用所示释放剂（置换剂）的浓度）和进行对被分析物的测定的上述形式。结果概括在表2中。
表 2
对校准品观察到的仪器信号
以ng/mL测得的药物浓度
相比于SIRO的置换百分比(%)
在校准品中0 ng/mL浓度的药物浓度下测得的经计算的抗体交叉反应性（百分比(%)乘以100）
。
结果证实，根据本文描述的原理的化合物的实施例（V和VI的混合物）适合在对西罗莫司和他克莫司的单独测定中作为西罗莫司和他克莫司被分析物的释放剂。不符合根据本文描述的原理但为了比较进行测试的化合物（IX和X的混合物、XI、SIRO、Tacro和FKE）表现出比根据本文描述的原理的化合物低的置换效力。IX和X的混合物和化合物XI都表现出较高的与西罗莫司测定抗体的交叉反应性，并因此不适合用作西罗莫司免疫测定中的释放剂。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文如同各个单独的出版物或专利申请被明确并单独地指明通过引用并入本文。
尽管为了清晰的理解通过举例说明和实施例的方式已经相当详细地描述了前述发明，但根据本发明的教导对本领域普通技术人员来说将显而易见的是，可以在不背离所附权利要求书的精神或范围的情况下对其做出某些变动和修改。此外，为了解释说明，上述说明书使用具体的术语提供对本发明的透彻理解。但是，对本领域技术人员将显而易见的是，不需要这些具体细节才能实施本发明。因此，对本发明的具体实施方案的上述描述出于举例说明的目的而呈现；它们无意为穷举的或将本发明局限于所公开的确切形式。根据上文的教导可以做出许多修改和变型。选择和描述了实施方案以解释本发明的原理及其实际应用并由此使本领域其它技术人员能够利用本发明。

Claims (20)

1.一种用于在疑似含有FKBP结合的免疫抑制药的样品中从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的组合物，所述组合物包含：
(a) 下式的化合物：
或下式的化合物：
或其混合物；
其中：
R1、R2和R3各自独立地为H或低级烷基；
R4和R5各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R6和R7各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R8和R9各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R10和R11各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R12是H、非庞大烃基或庞大有机基团；
其中R8、R9、R10、R11或R12中的至少一个是庞大有机基团；
p是1、2或3；
a是0或1；且
D是N、O或CH，条件是当D是O时，a是0；和
(b) 缓冲介质。
2.根据权利要求1的组合物，其进一步包含溶血剂。
3.根据权利要求1的组合物，其中所述化合物具有式：
其中：
R1、R2和R3各自独立地为H或低级烷基；
R4和R5各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R6和R7各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R8和R9各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R10和R11各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R12是H、非庞大烃基或庞大有机基团；
其中R8、R9、R10、R11或R12中的至少一个是庞大有机基团；
p是1、2或3；
a是0或1；且
D是N、O或CH，条件是当D是O时，a是0。
4.根据权利要求1的组合物，其中所述化合物具有式：
其中：
R4和R5各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R6和R7各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、或N-烷基或N-O-烷基的双键；
R8和R9各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R10和R11各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R12是H、非庞大烃基或庞大有机基团；
其中R8、R9、R10、R11或R12中的至少一个是庞大有机基团；
p是1、2或3；
a是0或1；且
D是N、O或CH，条件是当D是O时，a是0。
5.根据权利要求1的组合物，其中：
R1是H且R2和R3各自独立地为低级烷基；
R4和R5一起形成连接O的双键；
R6和R7一起形成连接O的双键；
R8和R9一起形成连接O的双键；
R10和R11一起形成连接O的双键；
R12是芳基；
p是1；
a是1；
D是N。
6.根据权利要求1的组合物，其中所述化合物具有式：
。
7.根据权利要求1的组合物，其中所述化合物具有式：
。
8.根据权利要求2的组合物，其中所述溶血剂选自洗涤剂、低离子强度水溶液、菌剂和造成补体依赖性细胞溶解的抗体。
9.根据权利要求2的组合物，其进一步包含抗凝血剂和防腐剂中的一种或多种。
10.一种在疑似含有FKBP结合的免疫抑制药的样品中从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的方法，所述方法包括：
以组合形式提供所述样品和足以从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的量的根据权利要求1的组合物，和
在足以从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的条件下培养所述组合。
11.一种在疑似含有FKBP结合的免疫抑制药的样品中从内源性结合物质上释放FKBP结合的免疫抑制药的方法，所述方法包括：
以组合形式提供所述样品和足以从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的量的根据权利要求5的组合物，和
在足以从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的条件下培养所述组合。
12.一种在疑似含有FKBP结合的免疫抑制药的样品中从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的方法，所述方法包括：
以组合形式提供所述样品和足以从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的量的下式的化合物：
或下式的化合物：
或其混合物；
其中：
R1、R2和R3各自独立地为H或低级烷基；
R4和R5各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R6和R7各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、或N-烷基或N-O-烷基的双键；
R8和R9各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R10和R11各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R12是H、非庞大烃基或庞大有机基团；
其中R8、R9、R10、R11或R12中的至少一个是庞大有机基团；
p是1、2或3；
a是0或1；且
D是N、O或CH，条件是当D是O时，a是0；和
在足以从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的条件下培养所述组合。
13.根据权利要求12的方法，其中所述化合物具有式：
或式：
或其混合物；
其中：
R1、R2和R3各自独立地为H或低级烷基；
R4和R5各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R6和R7各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、或N-烷基或N-O-烷基的双键；
R8和R9各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R10和R11各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R12是H、非庞大烃基或庞大有机基团；
其中R8、R9、R10、R11或R12中的至少一个是庞大有机基团；
p是1、2或3；
a是0或1；且
D是N、O或CH，条件是当D是O时，a是0，和
在足以从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的条件下培养所述组合。
14.根据权利要求13的方法，其中在所述化合物的式中：
R1是H且R2和R3各自独立地为低级烷基；
R4和R5一起形成连接O的双键；
R6和R7一起形成连接O的双键；
R8和R9一起形成连接O的双键；
R10和R11一起形成连接O的双键；
R12是芳基；
a是1；
D是N。
15.一种确定疑似含有FKBP结合的免疫抑制药的样品中FKBP结合的免疫抑制药的存在和/或量的方法，所述方法包括：
(a) 在介质中以组合形式提供：
(i) 所述样品，和
(ii) 用于从内源性结合物质释放FKBP结合的免疫抑制药的释放剂，其中所述释放剂是下式的化合物：
或下式的化合物：
或其混合物；
其中：
R1、R2和R3各自独立地为H或低级烷基；
R4和R5各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R6和R7各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R8和R9各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R10和R11各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R12是H、非庞大烃基或庞大有机基团；
其中R8、R9、R10、R11或R12中的至少一个是庞大有机基团；
p是1、2或3；
a是0或1；且
D是N、O或CH，条件是当D是O时，a是0；
(b) 在用于从内源性结合物质释放所述FKBP结合的免疫抑制药的条件下培养所述介质，
(c) 将用于确定样品中所述FKBP结合的免疫抑制药的存在和/或量的试剂添加到所述介质中，其中所述试剂包含用于所述FKBP结合的免疫抑制药的至少一种特异性结合成员，和
(d) 检查所述介质是否存在包含所述FKBP结合的免疫抑制药和用于所述FKBP结合的免疫抑制药的特异性结合成员的复合物，所述复合物的存在和/或量指示所述样品中所述FKBP结合的免疫抑制药的存在和/或量。
16.根据权利要求15的方法，其中所述释放剂是下式的化合物：
或下式的化合物：
或其混合物；
其中：
R1、R2和R3各自独立地为H或低级烷基；
R4和R5各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R6和R7各自独立地为H、低级烃基或低级烃氧基或一起形成连接O、CH2、N-烷基或N-O-烷基的双键；
R8和R9各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R10和R11各自独立地为H、非庞大有机基团或庞大有机基团，或一起形成连接O或CH2的双键；
R12是H、非庞大烃基或庞大有机基团；
其中R8、R9、R10、R11或R12中的至少一个是庞大有机基团；
p是1、2或3；
a是0或1；且
D是N、O或CH，条件是当D是O时，a是0。
17.根据权利要求15的方法，其中在所述释放剂的化合物中：
R1是H且R2和R3各自独立地为低级烷基；
R4和R5一起形成连接O的双键；
R6和R7一起形成连接O的双键；
R8和R9一起形成连接O的双键；
R10和R11一起形成连接O的双键；
R12是芳基；
a是1；
D是N。
18.根据权利要求15的方法，其中所述释放剂的化合物具有式：
或式：
。
19.根据权利要求15的方法，其中步骤(c)中的试剂进一步包含所述FKBP结合的免疫抑制药的类似物，其包含标记物。
20.根据权利要求15的方法，其中在步骤(c)中，将第二特异性结合成员添加到所述介质中，其中所述第二特异性结合成员结合到所述复合物。
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