JPH03148065A - 免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は免疫学的測定法に関する。より詳細には、主と
して臨床検査の分野での利用を目的とした免疫比濁法又
は免疫比論法による試料中の物質の免疫学的測定法に関
する。

〈従来の技術及び発明が解決しようとする課題〉臨床検
査等の分野では、試料中の測定対象物質（例えば、抗原
、ハプテン、抗体、薬物等）の測定（定量）法として、
測定対象物質と当該対象物質と抗原抗体反応可能な物質
（例えば、測定対象物質が抗原又はハブテンの場合には
抗体、測定対象物質が抗体の場合には抗原等）との抗原
抗体反応を利用した免疫学的測定法が汎用されている。

このような抗原抗体反応による免疫学的測定法としては
、例えば、免疫拡散法（ＳＲＩＤ法）、免疫比濁法、免
疫比論法、担体を用いた赤血球凝集法やラテックス法、
放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ
法）等が挙げられる。これらの方法のうち、５ＲＩＤ法
は測定時間が長い上側定精度があまりよくなく、担体を
用いる方法は試薬の調製が複雑であり、ＲＩＡ法やＥＩ
Ａ法は操作が繁雑で、専用の測定器が必要であり、特に
放射性物質を用いるＲＩＡ法では、放射性廃棄物の処理
や特定の設備が必要となる等の問題があった。

測定対象物質と、測定対象物質と抗原抗体反応可能な物
質を反応させて生ずる抗原抗体複合物の濁度を光学的に
測定することにより、試料中の測定対象物質量を測定す
る免疫学的測定法として、入射光に対する透過光の強度
を測定する免疫比濁法（イムノタービジメトリー）及び
入射光に対する散乱光の強度を測定する免疫比朧法（イ
ムノネフェロメトリー）が知られている（以下、本明細
書においては、便宜上、免疫比濁法と免疫比朧法を合わ
せて、単に「免疫比濁法」と称する）。免疫比濁法は上
述のような欠点がなく、汎用タイプの自動分析装置で多
検体の測定が容易にできるため、最近臨床検査の分野で
もよく用いられるようになった・ しかし、免疫比濁法は抗原抗体反応により生じた抗原抗
体複合物を濁度として定量するという反応原理そのもの
が簡略で、測定操作が簡便であるという利点を有するが
、他の従来法に比べると測定感度が比較的低いため、測
定項目（特に微量物質などにおいて）によっては低値レ
ベルでの測定において十分な精度を得ることが難しいと
いう問題があった。かかる問題を解決するため、例えば
、Ｃ反応性蛋白（以下、ＣＲＰという）の測定において
、加熱変性等の変性処理により高分子化された抗ＣＲＰ
抗体を用いる方法（特開平１−２１３５７３号公報参照
）が知られているが、この方法では変性処理のわずかな
誤差が測定の再現性に影響する問題がある。

更に、免疫比濁法では、目的とする抗原抗体反応のほか
に試料中の補体成分等との非特異的反応による凝集が生
じ易く、測定精度及び信頼性に欠けるという点でも問題
があった。

本発明は、このような従来技術の欠点を解消するために
なされたもので、本発明者らが鋭意研究した結果、従来
の免疫比濁法の問題点を改良して測定感度を上昇させ、
かつ非特異的反応を除去できる方法を見出して完成した
ものである。即ち、本発明は測定精度及び感度に優れ、
臨床検査の分野等で有用に利用できる免疫学的測定法を
提供することを目的とする。

く課題を解決するための手段及び作用〉上記の課題を解
決すべくなされた本発明の免疫学的測定法は、免疫比濁
法において、測定対象物質と抗原抗体反応可能な物質と
して、測定対象物質と免疫学的に反応し得る物質と蛋白
が化学的に結合した物質を用いることを特徴とするもの
であり、更に上記の測定法において、反応系にアミノ酸
又はその塩を添加することを特徴とするものである。

本発明は上記の構成よりなり、本発明においては、試料
中の測定対象物質と免疫学的に反応し得る物質に、予め
化学的結合法で蛋白を結合させて分子量を増大させた物
質が用いられ、この物質と測定対象物質との抗原抗体反
応により生じた抗原抗体複合物の濁度を測定すると、こ
のように蛋白を結合させていない従来の免疫比濁法に比
べて感度を著しく上昇させることができる。更に当該反
応系にアミノ酸又はその塩を添加することにより、試料
中の補体成分等に起因する非特異的反応が抑制され、測
定精度及び感度が改善される。

本発明の方法における測定対象物質としては、抗原、ハ
プテン、抗体、ホルモン、薬剤などのような臨床検査等
で測定対象とされている種々の物質が挙げられる。より
具体的には、例えば、ＣＲＰ１フィブリン及びフィブリ
ノーゲン分解産物、ＩｇＧＳ　ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ
Ｓ　ＩｇＤ、抗ストレプトリジンＯ，リウマチ因子、ト
ランスフェリン、ハプトグロビン、αｌ−アンチトリプ
シン、α　−アシドグリコプロティン、α２−マクログ
ロブリン、ヘモベキシン、アンチトロンビン−■、α−
フェトプロティン、ＣＥＡ　（カルジノエンブリオニッ
ク抗原）、フェリチン、ＨＢｓ−Ａｇ（Ｂ型肝炎外被抗
原）、Ａｎｔｉ−ＨＢｓ　（抗Ｂ型肝炎外被）　、ＨＢ
ｅ−Ａｇ　（Ｂ型肝炎ｅ抗原）、Ａｎｔｉ−ＨＢｅ（抗
Ｂ型肝炎ｅ　）　、Ａ　ｎ　ｔ　１−ＨＢｃ　（抗Ｂ型
肝炎コア）等を挙げることができる。これらの物質を含
む試料（検体）としては例えば、血清、血漿、尿、髄液
、リンパ液等を挙げることかできる。

上記測定対象物質と免疫学的に反応し得る物質（以下、
免疫反応性物質という）としては、測定対象物質が抗原
、ハプテン等の場合にはその抗体が、測定対象物質が抗
体の場合にはその抗原が用いられる。これら免疫反応性
物質としての抗原及び抗体は慣用の方法にて調製するこ
とができ、また抗体はポリクローナル抗体、モノクロー
ナル抗体の何れであってもよく、更にＦ（ａｂ）２画分
、Ｆ（ａｂ−）２画分等であってもよい。なお、測定対
象物質がハプテン等のような免疫原性のない物質の場合
には、アルブミン、グロブリン、ヘモグロビン等の慣用
のキャリアーと結合させて免疫抗原を調製した後、常法
の抗体産生法により抗体を得ることができる。

免疫反応性物質と化学的に結合される蛋白としては特に
限定されず、免疫反応性物質と結合して分子量の大きな
複合体となり得るものであれば種々の蛋白を用いること
ができる。その−例を示すと、Ｉ　ｇ　Ｇ　ｓ　Ｆ　ａ
　ｂ−画分、ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）等が挙
げられる。

免疫反応性物質と上記の蛋白を結合させる化学的結合法
としては、免疫反応性物質及び蛋白中のアミノ基、チオ
ール基、カルボキシ基等の反応性官能基を直接又は結合
基を介して間接的に結合させる種々の方法を用いること
ができる。その例としては、チオール基とチオール基（
又はアミノ基）とをＮ、Ｎ−−ｏ−フェニレンジマレイ
ミド　ＮｌＮ−−ｍ−フェニレンジマレイミド等のシマ
レイミド類又は４−（マレイミドメチル）シクロヘキサ
ン−１−カルボン酸・１−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル、３−マレイミド安息香酸・１−ヒドロキシスク
シンイミドエステル等のマレイミド誘導体を用いるマレ
イミド法；アミノ基とアミノ基とをグルタルアルデヒド
、マロンジアルデヒド、スクシンジアルデヒド等のジア
ルデヒド類を用いて結合するジアルデヒド法；アミノ基
とアミノ基とをヘキサメチレンジイソシアネート等のジ
イソシアネート類で結合するジイソシアネート法；カル
ボキシ基とアミノ基とをＮ、Ｎ−−ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ゛（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド等のカルボジイミド類で結合
するカルボジイミド法；チオール基とチオール基とをピ
リジンジスルワイドを用いて直接的に結合させるピリジ
ンジスルフィド法などが挙げられる。

免疫反応性物質と蛋白との反応方法は、上記の化学的結
合法の種類に応じて適宜の方法を用いることができるが
、通常、水又は適当な緩衝液（リン酸緩衝液、ホウ酸緩
衝液等）中、室温乃至冷却下に行われる。より具体的な
実施方法は、例えば、千畑編「固定化酵素Ｊ　　（１９
７５年講談社発行）等に詳述されている。

本発明の免疫学的測定法は、測定対象物質と抗原抗体反
応可能な物質として、免疫反応性物質と蛋白とが化学的
に結合した物質を用いる以外は、従来の免疫比濁法（即
ち、イムノタービジメトリー及びイムノネフェロメトリ
ー）と実質的に同様な方法で行うことができる。この際
、反応系にアミノ酸又はその塩を添加すると、試料中の
補体底分等に起因する非特異的反応が抑制され、測定精
度及び感度を改善できる。アミノ酸としては各種のアミ
ノ酸が使用し得るが、好ましくはアスパラギン酸、アル
ギニンが用いられる。また、アミノ酸の塩としては、例
えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の
塩基性塩、塩酸塩、酢酸塩、クエン酸塩等の酸性塩が挙
げられる。アミノ酸及びその塩の使用量としては、反応
系における濃度が１０〜１０００ｍＭ程度、好ましくは
３０〜５００ｍＭ程度となるように調製されて使用され
る。

更に、反応系には、必要に応じて、ポリエチレングリコ
ール、デキストラン、ゼラチン、塩化ナトリウム等の慣
用の添加剤を加えてもよい。

次に、本発明の測定法をより具体的に説明する。

まず、その−例として、試料中のＣＲＰを測定対象物質
として、タービジメトリーにて測定（定量）する例をも
って説明すると、慣用の方法により調製された抗ＣＲＰ
抗体に、例えばマレイミド法により、蛋白として例えば
Ｆａｂ”を結合させてお０ き、これを適切な緩衝液（例えばリン酸緩衝液１０〜２
００ｍＭ５ｐＨ６，０〜７．４、好ましくはｐＨ６，０
）を用いて力価を調整し、第二試薬とする。次に、適切
な緩衝液（例えばグツド緩衝液のＨＥＰＥＳ緩衝液１０
〜２００ｍＭ５ｐＨ６，０〜９．０、好ましくはｐＨ７
，８）に、場合によっては、ポリエチレングリコール（
１〜５％）及び／又は塩化ナトリウム（５０〜３００ｍ
Ｍ）を添加したものを第一試薬とする。

次いで、まずＣＲＰを含む試料に第一試薬を添加して、
試料中のＣＲＰ濃度に応じて２０〜８０倍に希釈する。

この希釈液を２〜１０分間、２０〜４０℃に加温後、こ
れに第二試薬を加えて３〜１０分間、２０〜４０℃に加
温する。そして抗原抗体反応により生じた抗原抗体複合
物の濁度を波長３００〜８００ｎｍでの吸光度として測
定し、ＣＲＰ濃度既知の標準試料を用いて予め作成され
た検量線の吸光度と対比することにより、試料中のＣＲ
Ｐ含量を測定する。なお、吸光度の測定は、エンドポイ
ント法及びレートアッセイ法の何れの１ 方法で行ってもよい。

更に、反応系にアミノ酸又はその塩を添加する場合には
、上述の第一試薬に添加するのが好ましく、例えば、ア
スパラギン酸ナトリウムの場合は４０〜２００ｍＭ程度
を添加しておき、上述と同様にして測定すれば、補体成
分等に起因する非特異的反応を抑制することができ、測
定精度及び感度を一層向上させることができる。

なお、本発明の測定法により、ＣＲＰ以外の測定対象物
質を測定する場合、緩衝液、反応時間等を適宜調整し、
上記と実質的に同様な方法で行うことができる。又、上
記の例では、抗原抗体複合物の濁度測定を、吸光度を測
定するタービジメトリーにて行っているが、散乱光を測
定するネフェロメトリーにて行ってもよい。

〈発明の効果〉 本発明の測定法によれば、次の効果を奏する。

■従来の免疫比濁法における測定に比べ感度を３〜２０
倍上昇させることができるため、特に微量物質の測定に
おいて低値の測定レベルを上昇させ、２ 精度よく測定することが可能である。

■自動分析装置を用いた場合、あまり感度が高すぎると
、逆に高値ではスケールオーバーとなり測定が不可能に
なる場合があるが、本発明では試薬濃度や蛋白と免疫反
応性物質との混合比等を調節することにより最適な感度
に設定することができる。

■免疫反応性物質と蛋白とが化学的結合法により結合し
ているので、均−性及び再現性に優れた免疫反応性物質
−蛋白複合体が得られ、測定精度が向上する。

■アミノ酸類の添加により補体成分等の非特異的反応を
抑制できるため、従来の方法に比べ正確に測定対象物質
を定量できる。

〈実施例〉 以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが
、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ ヒト血清中のＣＲＰを測定するため、まず抗ヒ３ ）ＣＲＰ血清を既知の方法でＩｇＧ画分とし、次いで４
−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン
酸φ１−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いた公
知のマレイミド法で、これをマレイミド化１ｇＧとした
。一方、ウサギγ−グロブリンを既知の方法でＩｇＧ画
分とした後、公知のペプシン消化法でＦ（ａｂ−）２と
し、更に公知の方法によりメルカプトエチルアミンを加
えてＦａｂ＝−８Ｈとした。これらマレイミド化ＩｇＧ
とＦａｂ−−５Ｈとを混合し、結合させて抗ヒトＣＲＰ
争１ｇＧ−Ｆａｂ−結合体を作製した。この方法では、
反応試薬（例えば、マレイミド化剤、マレイミド化１ｇ
ＧＳＦａｂ＝−８Ｈ等）の使用量を適宜変更することに
より、ＩｇＧ１分子当り１〜１３分子のＦａｂ−を結合
させることができる。そして得られた抗ヒトＣＲＰ　−
１ｇＧ−Ｆａｂ−結合体をリン酸緩衝液（１００ｍＭ。

ｐＨ６，０）で０．５■／猷力価とし、これを第二試薬
とした。

実施例２ ４ ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭＳｐＨ７，８）にポリエチ
レングリコール３％及び塩化ナトリウム１００ｍＭを添
加し、これを第一試薬とした。次に、所定量のＣＲＰを
含む検体を希釈して、ＣＲＰ濃度が原液の４１５．３１
５．２１５．１１５である希釈液を調製し、試料液とし
た。この試料液を各１５μｇをとり、これに第一試薬４
００μｇを加え５分間３７℃で加温後、混合比（ＩｇＧ
とＦａｂ−とを結合させる際のＩｇＧ１モル当りに対す
るＦａｂ−の仕込みモル数を意味する）の異なる抗ヒト
ＣＲＰ・ＩｇＧ−Ｆａｂ−結合体を含む上述の第二試薬
１００μｇを加えて５分間３７℃で加温した後、波長３
４０ｎｍでの吸光度を測定した。測定結果を第１図に示
す。なお、コントロールとして、Ｆａｂ−の結合してい
ない抗ヒトＣＲＰ　−Ｉ　ｇＧを用いた場合も併せて示
した。

第１図中、−一■はコントロール、Δ−△は混合比１、
ムームは混合比５、ｏ−Ｏは混合比１０、・−・は混合
比２０をそれぞれ示す。

第１図に示されるように、本発明の方法によれ５ ば、蛋白を結合しない従来の方法に比べ高感度にＣＲＰ
を測定することができると共に、ＩｇＧとＦａｂ−の混
合比を変化させ、結合量を調整することにより、感度を
適宜設定できることが明らかとなった。

実施例３ 試料としてヒト血清１０例をとり、それぞれ１５μｇに
前述の第一試薬４００μｇを加え３７℃で５分間加温後
、更に前述の第二試薬（混合比５）１００μｐを加え３
７℃で５分間加温したあと、波長３４０ｎｍでの吸光度
を測定し、ＣＲＰ濃度既知の標準試料を用いて同様な操
作により予め作成した検量線からＣＲＰの値に換算した
（測定Ａという）。

一方、実施例２で作製した第一試薬に、アスパラギン酸
ナトリウム８０ｍＭを加えたものを第三試薬として調製
する。次に、測定Ａにおける第一試薬の代わりに第三試
薬を用いて、同じヒト血清試料を測定Ａと同様に測定し
、ＣＲＰの値に換算した（測定Ｂという）。

６ 更に、測定Ａで用いた同じヒト血清試料を予め５６℃で
３０分間加温して非動化し、補体成分を不活性化したも
のについて測定Ａと同様に測定し、ＣＲＰの値に換算し
た（測定Ｃという）。

これらＡ−Ｃの測定法により得られた結果を第１表に示
す。

第　　１　　表 定Ａよりも低く、また測定Ｂ及びＣの測定値はほぼ一致
していることから、反応系にアミノ酸を添加する本発明
の方法（測定Ｂ）は非特異的な反応を著しく抑制できる
ことが明らかとなった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２におけるＣＲＰ濃度と吸光度との関
係を示す図である。同図中、■−■はコントロール、Δ
−△は混合比１、ムームは混合比５、○−Ｏは混合比１
０、・−・は混合比２０をそれぞれ示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料中の測定対象物質と当該測定対象物質と抗原抗
   体反応可能な物質とを反応させ、生ずる抗原抗体複合物
   の濁度を光学的に測定することにより試料中の測定対象
   物質量を測定する免疫学的測定法において、上記の測定
   対象物質と抗原抗体反応可能な物質として、測定対象物
   質と免疫学的に反応し得る物質と蛋白とが化学的に結合
   した物質を用いることを特徴とする免疫学的測定法。 ２、請求項１記載の免疫学的測定法において、反応系に
   アミノ酸又はその塩を添加することを特徴とする免疫学
   的測定法。