JPH0351759A - 赤血球溶解及びヘモグロビン変性試薬としてのリチウム塩を用いる分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の１１景 本発明は、血液試料中の赤血球の溶解のための方法及び
試薬に関する。特に本発明は、ヘモグロビン＾ｌｃのよ
うな特定のヘモグロビン誘導体のイムノアッセイ測定の
ための赤血球の溶解によるヘモグロビンの放出及びその
変性に関する。

Ｉｎ　ｖｉｖｏ　（生体内）過程により生成される特定
の誘導体の形態で血流中に存在するヘモグロビンの相対
量の測定は、医学的診断には非常に重要である。そのう
ち特に重要なのは、真性糖尿病における長期に亘る血中
グルコースの制御を査定する糖化ヘモグロビン類の測定
である。糖尿病の処置においておそらく最も重要な糖化
（ｇｌｙｃａｔｅｄ）型ヘモグロビンは、ヘモグロビン
＾ＩＣとして一般に公知の誘導体である。このヘモグロ
ビン誘導体は、グルコースとヘモグロビンタンパク質と
の非酵素反応によって生体内で得られる。グルコースは
、転移形態で、天然ヘモグロビンのベータ鎖のアミノ末
端バリン残基に共有結合するようになる。正常個体は総
ヘモグロビンの約３〜６％がＡｌｃ型であるが、一方、
非処理糖尿病個体は血流中のこのヘモグロビン誘導体レ
ベルが３〜４倍高い、糖化ヘモグロビンの測定のために
、種々の方法が開発されてきた。慣用的に用いられる方
法は、陽イオン交換クロマトグラフィー　電気泳動法、
及び染料複合法（ヒドロキシフルフラル／チオバルビッ
ール酸）のような多様な手法に基づいている。これらの
手法が、時間が掛かり、複雑で、特別の技術的熟練を要
することは良く知られており、そのうえ、不正確且つ非
特異的である。ごく最近、ヘモグロビン＾ｌｅを特徴づ
ける糖化Ｎ−末端ペプチド残基に特異的なモノクローナ
ル抗体が開発され、便利な免疫試験（イムノアッセイ）
法により、このヘモグロビン誘導体の測定が可能になっ
た（米国特許第４，６４７，６５４号参照）。

モノクローナル抗体を用いるヘモグロビン＾ＩＣのイム
ノアッセイによる測定は非常に特異的であって、従来技
術の方法に比べてはるかに掛かる時間が短くかつ複雑で
ない。にもかかわらず、過通なヘモグロビン＾ｌｃのイ
ムノアッセイは、抗体結合のために糖化Ｎ−末端ペブチ
ド・エピトープを露すためには、ヘモグロビンの変性を
必要とすることが判明している（米国特許第４，６５８
，０２２号参照）。

Ａｌｃエピトープの露出に必要な程度のヘモグロビン変
性を与えることが示されている条件は、通常、暴露エピ
トープのイムノアッセイ検出に用いる抗体試薬の変性に
も十分である０例えば、化学変性剤を用いる場合、変性
剤の濃度をイムノアッセイ反応を有為に妨害する濃度以
下に十分に低減するために、変性ヘモグロビン混合液を
稀釈する必要があることが一般に判明している。このよ
うな稀釈工程は不便であり、また測定値に誤差をもたら
す可能性がある。

ヘモグロビン＾１ｃのようなヘモグロビン誘導体のイム
ノアッセイによる測定に用いる改良された変性剤試薬は
、欧州特許公告第３１５，８６４号に記載されている。

チオシアン酸塩と酸化剤を併用して血液試料を処理して
試料中のヘモグロビンを放出し、変性して、ヘモグロビ
ンを分光測光法で検出可能なメトヘモグロビン型に転換
する。このようにして、総ヘモグロビンをメトヘモグロ
ビンの吸光度測定によって測定し、八Ｌｃの部分をイム
ノアッセイによって測定して総ヘモグロビン含量に関連
づけることができる。

変性中のメトヘモグロビン酸化剤の存在は、ヘモグロビ
ンの変性速度を有為に増大し、それによって全試験時間
を短縮して測定の信頼度を改良することが判明した。し
かしながら、最適な変性に要するチオシアン酸塩の濃度
はイムノアッセイによる応答の低ドが［！？！されるほ
ど十分高いものである。したがって、チオシアン酸塩濃
度を、暴露＾ＩＣエピトープに結合する抗体の能力を有
為に妨、害しないレベルに低減するために、変性借は一
般に稀釈工程を必要とする。

発明の要約 変性剤塩中の対陽イオンの性買は、特に斐性剤塩がチオ
シアン酸塩である場合、イムノアッセイによりヘモグロ
ビン＾ｌｃのようなヘモグロビン誘導体を検出するため
にヘモグロビンを変性するその能力にｊ４意の影響を及
ぼすことが思いがけなく判明した。赤血球を溶解し、放
出ヘモグロビン（試験試料中に存在するその誘導体を含
む）を変性することができる陰イオンのリチウム塩型の
使用は、イムノアッセイを有為に妨害することなく溶解
及び変性の速度を４１為に増大することが判明している
。注目すべきは、本発明のリチウム変性剤塩を使用する
と、イムノアッセイを行う前に変性ヘモグロビン混合液
を稀釈する必要が無いことが判ったことである。チオシ
アン酸塩のような、リチウム塩形態の溶解／変性陰イオ
ンは、その結果生じる変性混合液中で直接に有意の妨害
を起こさずに、イムノアッセイ反応が起こり得るほど］
−分低い濃度で迅速に赤血球を溶解し、放出されたヘモ
グロビンを変性するのに有効であることが判明している
。

したがって、本発明のリチウム塩は、血液試料中の特定
のヘモグロビン誘導体を測定するための分析方法におけ
る溶解／変性試薬として有用である。このような方法に
おいては、血液試料を溶解／変性試薬で処理して赤血球
を溶解し、赤血球から放出される検出Ｒ（止環の当該ヘ
モグロビン誘導体を変性し、その結果生じる混合液をイ
ムノアッセイで試験してその中の変性型のヘモグロビン
誘導体を検出する。通常、当該ヘモグロビン誘導体の量
を試料中のヘモグロビンの総量の一関数又はパーセンテ
ージとして関連させるのが望ましい、このような場合に
は、血液試料をさらにフェリシアン酸塩のような酸化剤
で処理して、放出ヘモグロビン（それらの全ての誘導形
態を含む）をそのメトヘモグロビン型に転換する。その
結果混合液中に生じるメトヘモグロビンを、次に、分光
測光法で測定して、試料中線ヘモグロビン含量の測定値
をｆり、当該ヘモグロビン誘導体の形態で存在するパー
セントを分光測光的に得られたメトヘモグロビン及びヘ
モグロビン誘導体のイムノアッセイの結果から算定しく
する。

リチウム塩形態の溶解／変性陰イオンの改良された特性
を発見する過程で、特定の塩であるチオシアン酸リチウ
ム及び過塩Ｍｕリチウムが変性とは関係なく赤血球の溶
解において他の陽イオン形態より優れていることも判明
した。これらのリチウム塩のこのような特性は、分析方
法を含めて、検出すべき物質を放出し、妨害を除去する
等のような赤血球の溶解を必要とする方法において有用
である。

好ましい実施例の説明 本発明は、本明細δにおいて溶解／変性陰イオンと呼ぶ
リチウム塩形態の陰イオンの使用を包含する。溶解／変
性陰イオンは、イムノアッセイにより１分に検出するた
めに、赤血球を溶解し、そこからヘモグロビンを放出し
て当該ヘモグロビン誘導体を変性するのに有効であるこ
とが知られ判明しているいかなるものからも選択するこ
とができる。最も好ましい陰イオンはチオシアン酸塩で
ある。使用可能なその他の陰イオンとしては、過塩素酸
塩、シアン化物、ヨウ１ｇ酸塩、及び過ヨウ素酸塩が挙
げられるが、それらに限定されない。

その他の官能性陰イオンは当業者によって認識されるか
、あるいは、日常の実験によって容易に決定しうろもの
である。

したがって、好ましい溶解／変性試槃はチオシアン酸リ
チウムである。一般に、当該ヘモグロビン誘導体が放出
又は変性されるｔＡＡｍ又は混合液中の約０．５モル（
Ｍ）を上回る濃度のチオシアン酸リチウムは、ほぼ室温
（すなわち約２０〜２５°Ｃ）とそれよりわずかに高い
温度（例えば約３７℃迄）の間で、かつ、酸化剤（以下
に詳述する）の存在ドで有効である。溶解及び変性の最
大効率は約１．２５モルで現れるが、しかし約３．５Ｍ
までの濃度は、稀釈なしのイムノアッセイに１γ容され
ることが判った。

しかしながら、約３．０Ｍを上回る濃度で操作するため
には、例えば試薬抗体の濃度を増大するといったような
、経済的に実用性がないが、又は、望ましくないイムノ
アッセイ試薬又は試験手法の変更を行う必要がある。さ
らに高濃度、例えば６Ｍまでの濃度を溶解のために用い
（りるが、しかしながら、その結果生じる混合液は、通
常、イムノアッセイ工程のために３．５Ｍ以下に稀釈す
る必要がある。したがって、溶解／変性媒質中のチオシ
アン酸リチウムの濃度は通常的０．５〜３．５Ｍ、好ま
しくは約３．０に未満である。さらに好ましい濃度範囲
は約１．０〜約２．ＯＭであり、目下最適且つ最も好ま
しいと考えられているのは１．２５Ｍである。

」−記濃度範囲は、温度と酸化剤の濃度によって幾分変
化する。当業者は、特定のヘモグロビン誘導体のイムノ
アッセイのための溶解／変性条件を離退化しＩ！ｌる。

溶解／変性試薬のための濃度範囲、酸化剤の効果、温度
の効果等は、いかなる特定の試験に対しても経験的に容
易に決定しくりる。目下最も好ましい条イ１は、３７°
Ｃで、１．２５Ｍチオシアン酸リチウム、酸化剤として
０．７６１Ｍフェリシアン化物である。

血液試料中の特定のヘモグロビン誘導体の濃度又は量の
測定は、酸化剤の非存在下で実行し得る。

酸化剤は、溶解／変性陰イオンとしてチオシアン酸の変
性効力を増強するのに、また、ヘモグロビンをメトヘモ
グロビンに転換し、総ヘモグロビンの測定手段を提供す
るのに役立つ。所望ならば、イムノアッセイによってヘ
モグロビン誘導体の絶対濃度及びｆｉｔ（試料中の総ヘ
モグロビンの濃度又は量を考慮しない）を測定し得るし
、あるいは誘導体型のヘモグロビンのパーセント又は割
合を算出するために、二番目の試料で別個の総ヘモグロ
ビンを測定し、その結果をこのヘモグロビン誘導体のイ
ムノアッセイと相関させ得る。

単一の血液試料中のこのヘモグロビン誘導体の相対量の
測定を行うことは特に有益である。チオシアン酸リチウ
ム溶解／変性試薬と酸化剤の併用により、血液中の事実
１全てのヘモグロビンを迅速に再現性よく変性チオシア
ン−メトヘモグロビン型に転換する手段が提供される。

この型のヘモグロビンは、イムノアッセイにおける分析
対象物として役立っている変性型の当該特定ヘモグロビ
ン誘導体とともに、総試料ヘモグロビンを測定するため
の基礎として有用である。以下番こ述べるように、イム
ノアッセイは、好ましくは、変性型の当該ヘモグロビン
誘導体に対するモノクローナル抗体の特異的親和力に基
づく。

使用される酸化剤は、天然ヘモグロビンの第一鉄をその
第二鉄メトヘモグロビン型に転換するに十分な１′Ｆ１
気化学ポテンシヤルを有する実質的にいかなる無機又は
有機酸化剤からも選択し得る。もちろん、その酸化ポテ
ンシャルによって選択される酸化剤の候補物質は、試験
系で試験して、総ヘモグロビン及びヘモグロビン誘導体
試験を有為に妨害しないことを確かめる。１々の酸化剤
が、ヘモグロビンをそのメトヘモグロビン型に転換する
のに有効であることは文献において公知である［Ａｄｖ
ａｎｅｅｓ　　ｉｎ　　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　　Ｃｈｓｍ
ｉｓｔｒｙ　　８：１４２−１８５（１９６５）参照］
。酸化ポテンシャルに基づいて適格な酸化剤としては、
フェリシアン化物、ヨウ素酸塩、塩素酸塩、臭素酸塩、
クロム酸塩、塩化第二水銀、セリウム及びタリウムイオ
ン、次亜塩素酸塩、過ヨウ素酸塩、ヨウ化物、ヒドロキ
シアミン、ブロモスクシンイミド、クロワスクシンイミ
ド、クロロアミン、過塩素酸塩、並びに過酸化物が挙げ
られる。変性に要する時間を減少させる変性動力学の増
強度は、もちろん、使用される酸化剤によって変わる。

チオシアン酸リチウムと併用した場合に十分に迅速な変
性を行う酸化剤の選択を可能にするために、実験による
試験を容易に行うことができる。

十分な変性とは、本明細書においては、血液試料中のヘ
モグロビンの変性が、選択されたイムノアッセイを用い
て測定し得る変性型の当該ヘモグロビン誘導体の実質的
に最大の量を与える点を意味すると、理解されるべきで
ある。したがって、十分な変性は、ヘモグロビンタンパ
ク賃の全ての三次及び二次横道の完全な崩壊を必ずしも
意味するものでなく、選択されたイムノアッセイ法によ
って検出されるヘモグロビン誘導体のエピトープの最大
の暴露を意味する。通常、イムノアッセイは、ヘモグロ
ビン誘導体を特徴とする特のエピトープに対するモノク
ローナル抗体の特異性に基づく。

酸化剤は、過剰量で、例えば試料中に通常存在するヘム
の５倍の量で添加する。２０倍までの過剰量は用いても
育苗である。特定の試験のための適量は本分舒の研究者
が決定し得る。

チオシアン酸塩／ｖ１化剤の変性剤対は、段階的に又は
、好ましくは同時に、血液試料と混合してもよい。通常
、チオシアン酸塩と酸化剤の変性剤試薬溶液を調製し、
血液試料と直接混合する。安定性のために、変性剤試薬
溶液は、しばしば、試験で使用する直前に調製する。し
かしながら、安定性が認められる場合、あるいはチオシ
アン酸塩と酸化剤の併用を可能にする安定剤又は装置の
構成を用いる場合には、変性剤試薬溶液を長期間保存及
び／又は包装し得る。変性剤成分は、乾燥形態であって
もよく、また試験試料及び／又は稀釈剤もしくはｌＪｌ
衝液による再水和時に試薬溶液を形成するように、混合
するか、他の方法で一緒にしてもよい。

本方法は、イムノアッセイによってその変性形態で検出
される血中のいかなるヘモグロビン誘導体の試験にも適
用するよう意図されている。このようなヘモグロビン誘
導体としては、アルコール濫用に関連したアセトアルデ
ヒド−ヘモグロビン付加物、尿毒症患者の血液中に存在
する尿素−ヘモグロビン付加物、アスピリン−ヘモグロ
ビン複合体、及び特に、グルコースとヘモグロビンタン
パク賃上の反応性アミン基との非酵素的反応によって形
成される一連の糖化ヘモグロビン類が挙げられるが、こ
れらに限定されない。本発明は、上述のように、ヘモグ
ロビンＡｌｅの測定に特に適用できる。

血液試料中のヘモグロビン誘導体の相対量を測定したい
場合は、処理、変性清み血液試料を総メトヘモグロビン
及び当該ヘモグロビン誘導体に関して別々に試験し、そ
の後、当該誘導化型で存在する血中ヘモグロビンの相対
量の測定値を示すためにその結果の数学的相関を試験す
る。総メトヘモグロビンは、Ｄｒａｂｋｉｎｓ法（Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｍｍ１ｓｉｏｎｆｏｒ　Ｃ１１ｎｉ
ｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｔａｎｄａｒｄ　ｏ
ｆ　ｔｈｅＵ、Ｓ、、　Ｐｒｏｐｏｓｅｄ　５ｔａｎｄ
ａｒｄ　ＰＳＨ−１５）のような任意の慣用法で測定し
てもよい、総メトヘモグロビンを測定するためのもつと
も好都合な方法は、特性波長、例えば５４０ｎｍでの溶
液中のその吸光度を測定することである。

ヘモグロビン誘導体の測定は、通常は、イムノアッセイ
によって実行する。上記米国特許第４．６４７，６５４
号及び第４，６５８，０２２号に記載されているように
、変性タンパク買中のヘモグロビン誘導体、例えばヘモ
グロビン＾ｌｃを特性づけるエピトープと特異的に結合
するモノクローナル抗体を開発し得る。特定のイムノア
ッセイの手法及び形式、並びに標識化法及び発生信号の
検出は、本発明にとっては制限的ではない、原則として
、酵素標識（ＥＬＩＳ＾）の使用等に基づく方法のよう
な非ラジオアイソトープ法が好ましい。

分離工程なしに行うことができて、分析対象物濃度に関
連した測定可能な吸光度変化を示し得る故に特に有用な
方法は、粒子凝集阻害イムノアッセイである。このよう
な試験は、抗体粒子試薬と凝集剤試薬との特異的相互作
用に基づく、抗体粒子試薬は、水懸濁性粒子（例えばポ
リスチレン又はその他のラテヅクス）と結合する抗体も
しくはその断片を包含する。凝集剤は、抗体試薬に対す
る多数のエピトープ結合部位を包含する０分析対象物が
存在しない場合は、抗体粒子と凝集剤は互いに結合して
、濁り（濁度）測定によって容易に定置される光の散乱
複合体を形成する。漸増量の分析対象物の存在下では、
溶液の濁りは、抗体粒子が分析対象物と結合するように
なるが凝集剤とは結合できないので減少する。凝集剤は
、当該ヘモグロビン誘導体を特性づけるエピトープを決
定する多くの有機部分、例えば、ペプチド残基と結合し
たポリマー主鎖を包含するのが好都合である。

例えば、ヘモグロビンＡｌｅ測定に関しては、そのエピ
トープは、ヘモグロビンＡｌｃ中の糖化Ｎ末端残基の配
列に対応する２〜３個のアミノ酸単位の糖化ペプチド残
基を包含し得る。

各々の総メトヘモグロビン及び誘導体ヘモグロビンの試
験は、処理清み血液試料の同じか異なった部分について
実行し得る。後者の場合、処理試料の第一の容量は、通
常１１１５液中に適度に稀釈後に、メトヘモグロビンに
関して直接試験し、第二の容置は上述のように変性化ヘ
モグロビン誘導体に関して試験する。処理試料を適度に
稀釈し、チオシアンメトヘモグロビンに関して試験し、
次にイムノアッセイ系の試薬を加えるか又はこのような
試薬に溶液を加えることによるといったように、同一処
理試料容量に関して連続して両試験を行うこともできる
。

本発明はまた、血液試料中の所定のヘモグロビン誘導体
を測定するための試験系を提供する。試験系は、本発明
の溶解／変性試薬、並びに試料に対する溶解／変性試薬
の作用により赤血球から放出される変性型のヘモグロビ
ン誘導体の量に関して、溶解され、変性された血液試料
をイムノアッセイするための試薬を包含する。試験が所
定の誘導型で存在するヘモグロビンの相対量の測定を行
うよう意図されている場合、試験系は、好ましくは上述
のようにさらに酸化剤を含む。

試験系は、種々の試薬成分を入れる個々の容器を包含す
る試験キットから、必要な試験試薬の全てを含有する一
体化試験具まで、種々の形態であってもよく、これは、
単一装置内で全ての試験工程を実行するために操作可能
である［後者の一例は、本出願人に譲渡され、同時係属
中の米国特許出願番号第１７９，８４３号（１９８８年
４月１１日提出。

表１ｆｉ　ｒＲｅａｃｔｉｏｎ　Ｖｅｓｓｅｌ　ｆｏｒ
　ＰｅｒｆｏｒｍｉｎｇＳｅｑｕｅｎｔｉａｌ　Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ　Ａｓ５ａｙｓ〕）に記載されている］
。

前述のように、ヘモグロビン誘導体試験における溶解／
豐性試薬としての本リチウム塩の改良特性の発見中に、
ある種のリチウム塩が放出ヘモグロビンの変性に関係な
く赤血球溶解特性を改良することも判明した。対応する
ナトリウム塩、カリウム塩、又はアンモニウム塩と比較
した場合、リチウム塩は赤血球を溶解する能力の予想外
の増大を示した。以下の実施例で示されるように、二つ
の特定のリチウム塩、即ちチオシアン酸リチウム及び過
塩素酸リチウムは、その他のその陽イオン形態に比して
改良された溶解特性を示した。このようなリチウム塩は
、赤血球から放出される成分を変性することがさらに所
望されるか否かにかかわらず、赤血球を溶解することが
望ましい場合に有益である。

赤血球溶解剤として、チオシアン酸リチウム及び過塩素
酸リチウムの両塩は、それ自体、それらのナトリウム、
カリウム及びアンモニウム対応物よりも、低濃度でより
迅速且つ完全な溶解を提供することを示した。一方、そ
の他の塩、特に塩化物、水酸化物、及び酢酸塩は、その
陽イオンに関係なく、赤血球を有効に溶解する能力をほ
とんど又は全く示さなかった。特定の陰イオンのナトリ
ウム、カリウム、又はアンモニウム塩が赤血球溶解特性
を示す場合、リチウム形態のこのような塩は溶解増大を
示すと予期される。したがって、このようなリチウム塩
は本発明の精神内で意図されており、本明細書の目的の
ためにはチオシアン酸リチウム及び過塩素酸リチウムと
等価であると考えられる。

以下の実施例により本発明をさらに説明するが。

本発明はこれらに限定されない。

実施例 Ａ、チオシアン酸塩による鼻血＃１（ＲＢＣ）の溶解異
なる陽イオンを含有する１、５Ｍのチオシアン酸塩溶液
を、ｐＨ９で０，２５％フェリシアン化カリウムを含む
２００■Ｎグリシン中で１１１１１し、３７°Ｃで平衡
化させた。新鮮全血試料５μｌを２．５ｍｌのチオシア
ン酸塩溶液中にピペットで移し、５４０ｎ−での吸光度
を３７°Ｃで測定して、約１０分間にわたって３０秒間
隔で記録した。フェリシアン化物酸化剤の存在下での溶
解速度を、吸光度が最小に達する（完全溶解）に要する
時間として測定した。その結果を表１に示す。

上記実験を、種々の濃度のチオシアン酸塩溶液を用いて
繰り返した。チオシアン酸塩溶液を０．２５％フェリシ
アン化カリウムを含む２００５ＭグリシンｐＨ９に溶解
して調製し、３７℃で平衡化させた。溶解速度を測定す
るために、５μｍの新鮮全血を２．５■ｌのチオシアン
酸塩溶液中にピペットで移した。

５４０ｎｍでの吸光度を３７℃で測定し、１０分間にわ
たって３０秒間隔で記録した。溶解速度は、吸光度が最
小に達する（完全溶解）に要する時間として測定した。

その結果を図１〜４に示し、表２に要約する。

一表」− 」」臼２−　　　　　完危望脇Ｊ社丞助朋グアニジン Ｊヂウム アンモニウム ナトリウム カリウム ＜１１）′ｔ” 〜１分 〜３分 〜５分 〜８分 ８グアニジンはＨｂＡｌｃイムノアッセイには適しない
。

−人一λ− Ｂ、チオシアン酸塩を用いた場合のヘモグロビンカリウ
ム ナトリウム アンモニウム リチウム ＞１０ ＞１０ ＞１０ ＞１０ １゜ ＞１０ ＞１０ ＞１０ ＞１０ ＞１０ 〉１０ ＜０゜ ＞１０ ＞１０ ＜０゜ （１）溶解／変性状’＠：　ｐ）１９．０で０．２５％
フェリシアン化カリウムを含む２０（ｌｓＭグリシン中
に溶解した０、５．１．０、又は１．５Ｍチオシアン酸
リチウム、あるいは１．５Ｍチオシアン酸アンモニウム
。

（２）抗体−ラテックス試薬：抗体コーティングを０．
５％のラテックス濃度で実施し［直径０．０８５μ閣の
ポリスチレンラテックス、　　Ｓｅｒａｇｅｎ。

Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　Ｉｌｌ、　ＵＳＡ］、抗
体〔米国特許第４．６４７，６５４号に記載されている
とおりに調製したモノクローナル抗体、タンパクＩＩＡ
アフィニティークロマトグラフ（−（ＢｉｏＲａｄ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｒｉｃｂｍｏｎｄ、　ＣＡ、　ＵＳ＾）により腹水液か
ら精製Ｊは、通常、コーティング反応時にはｌ■ｇ／膳
ｌの最終濃度で用いる。

２倍稀釈濃度の抗体溶液を、必要量の抗体をＮａＣ１を
加えた１０ｍＭグリシン中に稀釈することによって！Ｉ
ＩＩ！Ｌ、所望の最終導電率（０，５〜１．８調ｗｈｏ
　）を得る。２％ラテックスを、等容置のｉＤＨのグリ
シン緩衝液と混合することにより、２倍稀釈濃度（又は
１％）に稀釈する０反応は、ラテックス懸濁液を抗体溶
液を入れた容器に注入することにより開始した。その抗
体溶液は、ラテックスを加える場合には磁気撹拌棒で混
合する。溶液は、すべて室温である。磁気攪拌板からの
加熱が起きないよう容器を絶縁するよう注意して、−晩
（少なくとも１５時間）混合を継続する。これは、絶縁
のために約１インチの空間をあけて攪拌板上に容器を吊
すことによってイ１い得る。１５時間混合徨、その結果
生じた懸濁液を５ｏｒｖａｌｌ　５Ｓ−３４０−ター（
ＤｕＰａｎｔ、　Ｗｉｌｓｉｎｇｔｏｎ、　ＤＥ、　Ｕ
ＳＡ）用のポリプロピレン遠心管中に等分する（ＵＣ験
管当り約１０ｍＬ　）。その懸濁液を１５．００Ｏｒｐ
ｍ　（２７００ｘｇ　）で６０分遠心分離する。

に澄をデカントする。ペレットを、所望の塗布用タンパ
クＭ［一般に、Ｍｉｌｅｓ　Ｉｎｃ、、　Ｅｌｋｈａｒ
ｔ、　ＩＮ。

ＵＳＡから購入した１％グロテアーゼ無金含有ウシ血清
アルブミンｓｓＡ−ｐｆ）　］を含有するｌＯ■にグリ
シン緩衝液で２回洗浄する。ペレットを洗浄するために
は、試験管中の元の容量に等しい容置の洗浄液を加える
。ペレットを、激しく攪拌し、短期間ａ波破砕（−度に
１０〜１５秒）することにより、ｉｎ！渇する。Ｒ初の
再懸濁徨、＾ｂ−ラテックスを、再遠心分１ａｌｌ？＋
に１時間、室温で放置する。最初の再懸濁及び遠心分子
ａ慎、ペレットが完全に拡散するとすぐ、再懸濁液を遠
心分離する。２回洗浄擾、ペレットを最初の反応液に等
容置て再懸濁する。懸濁液を０．８μフイルターで濾過
して、５°Ｃで保存した。

濃度は、原上澄、−回［］及び二回目洗１｝によるｌ二
澄、妓びに１００倍稀釈の最終試料の５４６ｎｍでの吸
光度を測定することにより確定した。これらの吸光度の
合計は１００％であるか、もしくは０．５％ラテックス
に等しいと仮定する。最終試料の１００倍稀釈液の吸光
度を１００％を算出するために用いた吸光度の合計で割
る。最終試料の１００倍稀釈液の吸光度に１００を掛け
ると最終試料の吸光度が１１られる。

！　ｕｆｊ４　： 試料　　　　　　　　Ａ３４６ Ｆ澄　　　　　　　　　　　　　０．０４４−回目洗浄
液　　　　０．０３４ 二回目洗浄液　　　　０．０２１ 経絣（１００倍稀釈）　　　０．０５１ｘｌＯＯ＝５．
１１００％（又は０．５％ラテックス）＝５．１Ｏ÷０
．０４４◆０．０３４　　＋０．０２１　　＝　　５゜
１９９最終試料のラテックス濃度＝ （５，１１５，１９９）　Ｋ　Ｏ，５％＝　０．４９％
濃縮された＾ｂ−ラテックスを０．０５％ＢＳＡ−ｐｆ
を含イ１する２００１Ｍグリシン４！ｉ　ｆｊｓ液（ｐ
Ｈ９）で２，５％に稀釈する。マンニトールを、４％の
濃度でｌＪｔ　１７液中に含有してもよい、稀釈後、＾
ｂ−ラテックス溶液を短時間（５〜ｌθ秒）超ａ波破砕
する。

（３）ｉ％ｆｊｌ剤試薬：ポリ（アスパラギンＩ’ｌ１
）を、Ａｌｐ＠ｒｔ、　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｙ　２６６：２３（１９８３）の手順にしたがって
調領した。

アミノエタノール（８０ミリモル）及び４．９−ジオキ
サ−１，１２−ドデカンジアミン（２０ミリモル）をア
ルゴン雰囲気下で、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に
溶解した。その溶液を、ポリ（アスパラギン酸）（１０
ミリモル）及びＤＭＦの溶液で処理した。その反応液を
室温で１時間、次に７０°Ｃで２時間撹拌した。

次いで、その混合液を冷却し、液のほとんどを減圧下で
蒸発して除去した。油秋夕１査をエーテルで、次いで熱
テトラヒドロフランで繰り返し洗浄した。

生成物を固化させ、濾過して回収した。粗製生成物を水
に溶解し、ｐＨを中性に調節した。つぎにその溶液を８
ｉｏＲａｄ　ｐ６−ＤＧ脱塩ゲルカラム（ＢｉｏＲａｄ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃ
Ａ、　ｔｌｓＡ）で精製した。

アミン官能化ポリマーを含有する留分をプールし、凍結
乾燥した。ポリマー上のアミノ基の数を、Ｈａｂｅｅｂ
の丁１１Ｂｓ試験［Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　！４
：３２８−３３６（１９６６）］で測定し、ポリマー１
嘗ｇ当り２２であることが判明した。

アミノ官能化ポリ（アスパラギン酸）（１０，７腸ｇ）
及びＳＭＣＣ（３０１ｇ）をＤＭＦに溶解した。その反
応液を、室温で２時間撹拌した。氷水をその混合液に加
え、活性化ポリマーをＢｉｏＲａｄ　Ｐ６−ＤＧゲルカ
ラムを用いて混合液から分離した。つぎに、活性化ポリ
マーを、欧州特許公告第１８５，８７０号に記載のｊｉ
法にしたがって調製された時化ペプチド（２０ｍｇ　）
　：ｉｌ と室温で３分間反応させた。反応後、Ｐ６−ＤＧゲルカ
ラムを用いて生成物を再び精製し、凍結乾燥した。

活性化ポリマー上のマレイミド基の数を、ＰＤＳ試験［
Ｇｒａｓｓｅｔｔｉ　ａｎｄ　Ｈｕｒｒａｙ、　Ａｒｃ
ｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１１９：４４−４９（１９６７）］
によって劃定し、ポリマーＩＢ当り０．４６マイクロモ
ルであることが判明した。ポリマー上のＧｌｃ−ペプチ
ドの眉を、チロシンに関して、２？５ｎｍでのモル吸光
度係数を用いたＵＶ／Ｖｔｓ吸収測定により確定し、ポ
リマー１履ｇ当り０．４６マイクロモルであることが判
明した。

凝集剤試薬の処理用液を、１゜ｏＢ／水Ｌ１の保存溶液
から調製する。５０μｇ／ｍＬ溶液は、０．１％　Ｏ３
＾−ｐ【を含有する２０ｍＭクエン酸塩緩衝液でストッ
クを稀釈することによりＩＩＩ製する。

匙堡 全血（１０μｍ）を５ｍｌの溶解／変性試薬と混合し、
その後、３７°Ｃで放置した。種々の時間間隔で、０．
５ｍｌの処理済み血液試料をｌＯμｌの抗体−ラテック
ス試薬（２，５％）及び１０μｌの凝集剤試薬（５０μ
ｇ／ｍ１）と混合し、５４０ｎ＋ｓでの吸光度を測定す
ることにより、免疫反応を監視した。完全変性は、最小
吸光度達成に要する時間として測定された。　その結果
を表３に示す。

−ムー旦− 陽イオ’／　　　　　Ｊ！−度一　　完余亥性に寒旦亙
叫皿アンモニウム　　　　１．５Ｍ　　　　　　〜４分
リチウム　　　　　　０．５Ｍ　　　　　〜２．５分リ
チウム　　　　　　ｌ・、ＯＭ　　　　　　−１分リチ
ウム　　　　　１．５Ｍ　　　　　　〜１分Ｃ，チオシ
アン酸塩の種々の陽イオン塩による、佐朶 以ドを除いては、上記Ｉ３におけると同様の試薬を用い
た： （ａ）次の一連の溶解／変性試薬を用いた：ｐＨ９，０
で０．２５％フェリシアン化カリウムを含有する２０ｈ
Ｍグリシンニ溶解した０、１．０．５．１．０．１．２
５、又は２．５Ｍチオシアン酸塩溶液（リチウム、アン
モニウム、カリウム、又はナトリウム）、そして（ｂ）
凝集剤試薬のための処理Ｈ１液を、１．ｏｔｉｇ／水１
ｍｌス］・ツク溶）αがら、０．１％　ＢＳ＾−Ｐ【を
含イ１する２０膳Ｈクエン酸塩（ｐＨ４）を用いて１０
μｇ／ｍｌ溶液に稀釈することにより調製した。

還堡 赤血球を完全に溶解し、血液をより正確に送出するため
に、血液１部と蒸留水４部を混合することにより、全血
を予ｕ８ａ釈した。稀釈ｖＣ料Ｃ５μ１）を５００μｌ
の溶解／変性試薬と混合し、つぎに３７“Ｃでインキュ
ベートした。適当な間隔で、０．５ｍｌの処理済み血液
試料を１０μｌの抗体−ラテ・ソクス試１！（２，５％
）及び１０μｌの凝集剤試薬（１０μｇｌ腸１）と混合
し、５４０ｎ鵬での吸光度を測定することにより、免疫
反応を監視した。完全変性は、最小吸光度に達するに要
する時間として測定した。その結果を図５及び表４に示
す。

表４ Ｄ３種々の陰イオンのすトリウム塩及びリチウムカリウ
ム ナトリウム アンモニウム ＞１０ ＞１０ ＞１０ −１Ｏ 不十分な反応度 〉１０ 〉１０ ＞１０ −１Ｏ 不十分な反応度 〉ＩＯ ＞１０ −１０ −３ 不十分な反応度 ノチウム ＞１０ −９ −４ 〉　１ 不十分な反応度 グリシン２００ｍ１ｌグリシン（ｐＨ９）中の１．５１
４のナトリウム及びリチウム塩形態の過塩素酸塩、チオ
シアン酸塩、塩化物、水酸化物、及び酢酸塩の溶解用液
を調製し、３７°Ｃで平衡化させた。新鮮全血試料の５
μｍを２．５ｍｌの溶解用液中にピペットで移し、５４
０ｒｖでの吸光度を３７°Ｃで測定し、３０秒間隔で１
０分間記録した。溶解速度は、吸光度が最小となるのに
要する時間として測定した。その結果を図６に示し、ａ
５に要約するニ ー人−旦一 １ＳＣＮ ａＳＣＮ ＬｉＣε０４ ＮａＣＩ２０４ 酢酸リチウム １分 ４分 ２分 ６分 遅く且つ不十分 試験用ｌｊＩ衝液基液系いては、２．８Ｍまでの塩化物
又は水酸化物に関しては、溶解現象はｌ［１１察されな
かった。酢酸塩の場合は、多少の溶解が検出されたが、
しかしながら、その溶解は不完全であった。

本発明を、特に上記で説明し、例証した。本発明のその
他の変更及び修正は、本発明の精神及び範すｎを逸脱し
ない限りにおいて、成し得ることは明かである。

【図面の簡単な説明】

図１〜４は、種々のチオシアン酸塩を用いた場合の赤血
球（ＲＢＣ）の溶解に関する時間経過を示すグラフであ
る。データは、ＲＢＣの溶解に関してはリチウム塩が最
も有効であることを示す。 図５は、リチウム及びすトリウム塩形態のチオシアン酸
塩及び過塩素酸塩を用いた場合のＲＢＣの溶解に関する
時間経過を示すグラフである。リチウム塩は、各々の場
合、ナトリウム塩より優れている。 図６は、種々のチオシアン酸塩を用いた場合のヘモグロ
ビンの変性に関する時間経過を示すグラフである。デー
タは、ヘモグロビン変性に関してはリチウム塩が筋も有
効であることを示す。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）血液試料中の特定のヘモグロビン誘導体を測定す
   るための分析方法において、（ａ）血液試料を溶解／変
   性試薬で処理して赤血球を溶解し、赤血球から放出され
   た検出可能量のその上記誘導体を変性し、（ｂ）その結
   果生じた混合液を、その中に存在する変性型の上記ヘモ
   グロビン誘導体の量に関してイムノアッセイにより試験
   する方法であって、上記溶血／変性試薬として赤血球を
   溶解し上記ヘモグロビン誘導体を変性することができる
   リチウム塩形態の陰イオンを用い、それによって溶血及
   び上記ヘモグロビン誘導体の変性を、イムノアッセイ工
   程を有意に妨害しないリチウム塩濃度で迅速に成し遂げ
   ることを特徴とする方法。
2. （２）上記溶解／変性試薬としてチオシアン酸リチウム
   を用い、好ましくは約０．５〜約３．５モルの濃度にな
   る量で加える請求項１記載の方法。
3. （３）ほぼ室温から約３７℃の間で実行する請求項２記
   載の方法。
4. （４）チオシアン酸リチウムを約１．２５モルの濃度に
   なる量で加える請求項１〜３のいずれか一に記載の方法
   。
5. （５）試料中に上記誘導体の形態で存在するヘモグロビ
   ンの相対量の測定のための請求項１〜４のいずれか一に
   記載の方法において、血液試料をさらに酸化剤、好まし
   くはフェリシアン化塩で処理して溶解／変性試薬によっ
   て放出される事実上全ての形態のヘモグロビンをそのメ
   トヘモグロビン形態に転換し、その結果生じた混合液を
   その中に存在する総メトヘモグロビンの量に関して試験
   し、ヘモグロビン誘導体の測定量を総メトヘモグロビン
   の測定量と関連づける方法。
6. （６）測定すべき特定のヘモグロビン誘導体がヘモグロ
   ビンＡｌｃである請求項５記載の方法。
7. （７）血液試料中の特定のヘモグロビン誘導体を測定す
   るための試験系において、１）赤血球を溶解し、赤血球
   から放出される検出可能量の上記ヘモグロビン誘導体を
   変性する試薬、及び２）そこに含まれる変性型の上記ヘ
   モグロビン誘導体の量に関して溶解、変性した血液試料
   をイムノアッセイするための試薬を包含する系であって
   、上記溶解／変性試薬が赤血球を溶解し上記ヘモグロビ
   ン誘導体を変性することができるリチウム塩形態の陰イ
   オンであることを特徴とする系。
8. （８）上記溶解／変性試薬がチオシアン酸リチウムであ
   る請求項１０記載の試験系。
9. （９）試料中に上記誘導体の形態で存在するヘモグロビ
   ンの相対量の測定のための請求項７又は８記載の試験系
   において、上記試験系が、溶解／変性試薬により放出さ
   れる事実上全ての形態のヘモグロビンをそのメトヘモグ
   ロビン形態に転換するためにさらに酸化剤、好ましくは
   フェリシアン酸塩を包含する系。
10. （１０）測定する特定のヘモグロビン誘導体がヘモグロ
    ビンＡｌｃである請求項９記載の試験系。