JPH01314966A - 生体物質の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生化学、医化学、微生物工学、分子生物学等
の分野における、ペプチド、蛋白質、ポリヌクレオチド
等の生体物質の検出法に関する。

〔従来の技術〕

従来、生体物質の検出法の−であるＤＮＡやＲＮＡ等ポ
リヌクレオチドの検出については、バイオインダストリ
ー、　２　（１１）　９２ｇ頁（１９８５）及び同書、
　２　（１２）　１０１３頁（１９８５）　（Ｂｉｏ　
Ｉｎｄｕｓｔｒｙ。

２　（１１）　９２ｇ　（１９８５）、　１ｂｉｄ、、
　２　（１２）　１０１３（１９８５）　）において論
じられている。この方法は、まずニトロセルロース膜等
の如く、測定したいポリヌクレオチドを吸着し易い物質
でできたろ紙状の担体に試料を吸着させる。次にビオチ
ンを結合させたプローブを添加し、上記ポリヌクレオチ
ドと複合物を形成させる。このビオチンにアビジン又は
ストレプトアビジンを会合させた後、さらにビオチン化
酵素を添加する。ビオチンとアビジン又はストレプトア
ビジンは非常に強く結合する性質があるため、ニトロセ
ルロース膜上に吸着したポリヌクレオチドと結合してい
るビオチン化プローブに、アビジン又はストレプトアビ
ジンを介してビオチン化酵素が結合する。そこで酵素の
基質（例えば発色剤）を加えると、試料中に存在する測
定したいポリヌクレオチドの量に対応してニトロセルロ
ース膜上に色素が生成し、検出される。

さらに、化学と生物、１４　（１１）　７３７頁（１９
７６）においてリガンドとして抗体を用い、目的物質を
検出するイムノアッセイ法が論じられている。この方法
は、ペプチド、蛋白質、ホルモン等の検出に適する。

まず、抗体を固定化した担体に試料を添加し、試料中の
測定対象物質を担体上の抗体に特異的に結合させる。結
合しない物質を洗浄して除いた後、酵素標識抗体を添加
し、担体上の抗体と結合した測定対象物質に酵素標識抗
体を結合させる。過剰の酵素標識抗体を洗浄して除いた
後、酵素の基質を用いて担体上の酵素活性を測定するこ
とで目的とする物質を検出する。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来技術は、担体表面上で酵素活性を固定するため
に生ずる担体の影響について配慮されておらず、以下に
示す問題があった。

（１）酵素の活性測定は、酵素作用により基質から生成
した物質の物理定数、例えば吸光度や蛍光強度を測定す
ることにより求められる。ところが担体は一般に不透明
な散乱体であるため、反応生成物の検出を妨害し、その
ため測定感度が低下する。

（２）上記の問題点を回避するために、酵素作用によっ
て生成した反応生成物を担体から溶質分離して測定する
方法がある。この方法は、酵素の反応時間を担体上の酵
素量とは無関係に一定にする必要がある。そのため、個
々の試料に対し、反応生成物の増加の度合いを見ながら
基質反応時間を設定することが困難である。それ故、例
えば、目的とする物質が少ない場合、基質反応時間を一
定にしておくことにより、反応生成物を測定できないと
いう問題があった。

本発明の目的は、高感度で酵素による反応生成物を測定
することのできる生体物質の検出法を提供することにあ
る。

〔課題を解決するための手段〕

上記の目的は、（１）水に不溶性の担体に、直接又は該
担体に固定したリガンドを介して被測定物質を結合させ
る工程、該被測定物質に酵素で標識したリガンドを結合
させる工程及び該酵素による酵素反応によって産生され
た物質を他の酵素反応により測定する工程を有する生体
物質の検出法において、上記酵素によって産生された物
質を担体を含む系から分離した後、上記他の酵素反応を
行うことを特徴とする生体物質の検出法、（２）水に不
溶の担体に固定化した抗体又は抗原に、被測定抗原又は
抗体を結合させる工程、該被測定抗原又は抗体に酵素で
標識した抗体又は抗原を結合させる工程、該酵素による
酵素反応によって産生された物質を担体を含む系から分
離する工程及び該産生された物質を他の酵素反応によっ
て検出する工程を有することを特徴とする生体物質の検
出法の少なくとも一項により達成される。

本発明において、酵素で標識したリガンドは直接被測定
物質に結合するとは限らない。被測定物質に別のリガン
ドを結合させ、この別のリガンドに上記酵素で標識した
リガンドを結合させる等の方法が用いられる。

本発明において、酵素反応は多段に行う。これは、例え
ば第一段の酵素反応を行い、反応生成物を同相である担
体から分離し、第二段の酵素反応を行う場合、さらに第
三段以降の酵素反応を行ってもよいことを意味する。ま
た固相を分離する以前の反応を二段以上行っても、固相
を分離してからさらに少なくとも一段の酵素反応を行え
ばよい。

説明の便宜上、二段の酵素反応を例として述べる。第二
段目酵素反応は、固相を含まない系で行うので、反応時
間を可変とすることができる。つまり１反応生成物の量
をモニタしながら量が所定量になる迄反応を継続するこ
とができる。

他の酵素、すなわち二段反応のときは第二段目の酵素の
反応系は種々の場合がある。例えばリガンドを標識して
いる第一段目の酵素による反応生成物が第二段目の酵素
の基質となる系があるにの場合第一段目の反応生成物を
含む溶液に第二段目の酵素を加え、第一段目の反応生成
物を第二段目の酵素の作用により第二段目の反応生成物
に変化させる。第二段目の反応生成物の量を吸光度や蛍
光強度として一定時間おき、あるいは連続して経時的に
所定の測定値になるまで測定する。

他にリガンドを標識している第一段目の酵素の基質が第
二段目の酵素の前駆体で、第一段目の酵素の反応生成物
が第二段目の酵素そのものである系がある。この場合、
第一段目の酵素の作用により前駆体が第二段目の酵素に
転化される。生成した第二段目の酵素溶液から固相を除
いた後、第二段目の酵素の基質を加え、反応生成物を経
時的に測定する。

第一段目の反応生成物から同相を除くには、第一段目の
酵素とその基質を一定時間反応させた後にろ過や遠心分
離等により分離するか、あるいは、基質溶液を一定の流
速で固相上に流し込み、連続的に流出してくる液を集め
る方法のいず゛れでも可能である。

〔作用〕

上記の二段反応の例で説明すると、第二段目の酵素によ
る基質の減少量や反応生成物の量は、第一段目の反応生
成物の量に依存する。第一段目の反応生成物の量は担体
である固相に結合した第一段目の酵素量に依存し、これ
は担体上の試料量に依存する。よって、固相を除いた系
で第二段目の酵素活性を測定することで目的とする物質
の量を検出することができる。第二段目の酵素の活性測
定には固相は分離されて除かれている。このため固相に
よる測定の妨害を受けることがないので、第二段目の酵
素の活性測定を吸光度や蛍光強度等の変化として経時的
に測定することができる。

〔実施例〕

以下、本発明の一実施例を説明する。

実施例１ ポリヌクレオチドの検出に関する。用いる材料を説明す
る。

試料：制限酵素ＸｈｏＩで直鎖状にしたｐＭＭ９８４Ｎ
Ａ 担体：ニトロセルロースフィルター 酵素ａ識リガンド：ビオチン・アビジン系を用いてアル
カリホスファターゼ（ＥＣ，３，１，３゜１）を結合し
たｐＭＭ９８４ＤＮＡ アルカリホスファターゼの基質：ニコチンアミド・アデ
ニンジヌクレオチドリン酸の酸化形（以下ＮＡＤＰ＋と
略す） 他の酵素：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ。

１．１．１．１）とジアホラーゼ（ＥＣ，１，６゜４．
３） 検出物質：上記他の酵素リサイクリング系を用いてテト
ラゾリウム塩を還元して生ずるホルマザン またビオチン化ｐＭＭ９８４ＤＮＡ（７）調製は、５０
μＭのｄ−ＣＴＰ、ｄ−ＧＴＰ、ｄ−ＡＴＰと２′−デ
オキシウリジントリリン酸−５−アリルアミンアミノカ
プロイル−ビオチン（Ｂｉｏ−ｄＵＴＰ）を用いて、ジ
ェフリーＪ、レアリーらの方法（プロシーデングオブナ
ショナルアカデミーオフサイエンシズユーエスエー、　
８０．４０４５（１９８３）　）に従った。

測定法は、つぎの通りに行った。ＸｈｏＩで処理したｐ
　ＭＭ９８４Ｄ　ＮＡ　（０，１〜１０’Ｏμｇ）と１
．５μｇ／μＱのニシン精子ＤＮＡを含む試料溶液をア
ルカリ変性させた後ニトロセルロースフィルター上の所
定の部分に添加し、８０℃で４時間乾燥する。

次にワールらの方法（プロシーデングオブナショナルア
カデミーオブサイエンシズユーエスｘ　＋、　７６、３
６８３　（１９７９）　）　Ｉｃ従いビオチン化ｐ　Ｍ
　Ｍ　９８４　Ｄ　Ｎ　Ａを反応させる。まず最初に試
料の結合したフィルターを３５〜５０％ホルムアミドと
２５０〜５００μｇ／ｍＱのニシン精子ＤＮＡの分解物
を含む溶液で４２℃４時間処理し、次いで上記溶液に２
００ｎｇ／ｒｒｌのビオチン化ｐＭＭ　９８４ＤＮＡを
含めた溶液に４．５時間浸漬して反応させた。さらにこ
のフィルターを５０ｍｇ／ｍｆｉの牛血清アルブミンと
０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む溶液に１時間浸し、
次いで２μｇ／ｍＱのストレプトアビジンの溶液に１０
分間浸して洗浄し、１ｍＭＭｇ（、Ｏ２と０．１ｍＭＺ
ｎＣＯ２を含むｌμｇ／ｍＱのビオチン化アルカリホス
ファターゼの溶液に１０分間浸す。未反応のビオチン化
アルカリホスファターゼを除くため、フィルターをよく
洗浄する。このようにしてビオチン・アビジン系を用い
てアルカリホスファターゼを結合したｐＭＭ９８４ＤＮ
Ａが、担体に結合した被測定物質であるｐＭＭ９８４Ｄ
ＮＡと反応した構造の試料が得られた。

フィルター上の試料を添加した部分を切り出し、ＮＡＤ
Ｐ＋と１ｍＭＭｇＣＯ２，０，１ｍＭＺｎＣＱ、を含む
ｐＨ１０の溶液に浸し、１０分間反応させ、ＮＡＤＰ＋
をβ−ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド酸化形
（以下ＮＡＤ＋と略す）に変える。反応生成物を含む溶
液からフィルターを除去し、アルコールデヒドロゲナー
ゼ及びジアホラーゼとこれらの基質であるエタノールと
テトラゾリウム塩のｐＨ８，８の緩衝液を加え、生成す
るホルマザン色素の吸光度を経時的に測定した。その結
果を第１図曲線２に示す。

比較としてビオチン化アルカリホスファターゼを反応さ
せたニトロセルロースフィルターに、５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリルリン酸とニトロブルーテトラゾ
リウムを加えて発色反応をニトロセルロースフィルター
上で行わせ、吸光度を反射式のクロマトスキャナを用い
て測定した結果を第１図曲ＲＩＡ１に示した。比較例の
すべての反応をニトロセルロースフィルターで行わせた
場合は、曲線１の如＜ＤＮＡの量が少なくなると、測定
の誤差が大きく測定できなくなったが、本発明（曲線２
）によればさらに少ない量のＤＮＡを検出することが可
能であった。また、本発明を用いれば、生成するホルマ
ザン色素がニトロセルロースフィルター上に沈着するこ
とがないため、高濃度のＤＮＡ量までランバート・ベー
ル（Ｌａｍｂｅｒｔ　−Ｂ　ｅｅｒ）の法則が成立し、
よってより多くのＤＮＡ量まで測定できる効果がある。

実施例２ ヒトα−フェトプロティンの検出について説明する。ま
ず材料について述べる。

担体：抗ヒトα−フェトプロティン抗体を固定化したセ
ファローズ 酵素標識リガンド：ウロキナーゼを結合した抗ヒトα−
フェトプロティン抗体 他の酵素：プラスミン（前駆体であるプラスミノーゲン
を用いる） 他の酵素の基質：　Ｂｏｃ−ＧＱｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−
４−メチルクマリンアミド まず抗ヒトα−フェトプロティン抗体を固定化したセフ
ァローズを調整する。セファローズＣＬ−４Ｂ（ファル
マシア　ファインケミカルス製）５ｍＭ（膨潤状態）を
水洗し、０．０５Ｍ　Ｎａ　Ｉ　Ｏ４水溶液４ｍＱを加
え、２５℃で２時間ゆるやかに攪拌しアルデヒド基を導
入した。このセファローズを水１００ｍ＋２及び０．１
５ＭＮａＣｌ１，５０ｍＭリン酸ナトリウムからなるｐ
Ｈ８，０の緩衝液１００ｍ！２で洗浄後、１ｍｇ／ｍｎ
の濃度の抗ヒトα−フェトプロティン抗体（ＩｇＧフラ
クション、ウサギ由来）の０．１５ＭＮａＣＱ、５０ｍ
Ｍリン酸ナトリウムからなるｐＨ８，０の緩衝溶液２ｍ
１２を加え、２５℃で３時間ゆるやかに攪拌する。

このセファローズにさらに０．４５Ｍジメチルアミンボ
ランの０゜１５ＭＮａＣＱ、５０ｍＭリン酸ナトリウム
からなるｐＨ８，０の緩衝溶液０．４２ｒｒｌを加え、
２５℃で１時間ゆるやかに攪拌し、さらに４℃で１６時
間放置し、０．１５ＭＮａＣｊ！、５０ｍＭリン酸ナト
リウムからなるｐＨ８，０の緩衝液で洗浄後、１０ｍＭ
ＮａＢＨ４を含む同一の緩衝溶液を１０ｍＱ加え４℃で
１時間反応させ、過剰のアルデヒド基を不活性化した。

このようにして調製した抗ヒトα−フェトプロティン固
定化セファローズＣＬ−４Ｂは５０ｍｇ／ｍΩの牛血清
アルブミンを含む０．１５ＭＮａＣＱ、と５０ｍＭリン
酸ナトリウムからなるｐＨ７，４の緩衝液中に保存した
。

ウロキナーゼで標識した抗ヒトα−フェトプロティン抗
体の調製法は、ザジャーナルオブバイオロジカルケミス
トリー、　２６２　（２２）　１０８１９（１９８７）
　（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｃｈｅｍｉ−ｓｔｒｙ、　２６２　（２２）　１
０８１９　（１９８７）　）記載の方法に従い調製した
。すなわち、２−イミノチオランでチオール基を導入し
た抗ヒトα−フェトプロティン抗体（ウサギ由来）とウ
ロキナーゼ（Ｍｒ３３０００゜６０Ｋｉｎ／　ｍｇ　ｐ
ｒｏｔｅｉｎ　（株）、ミドリ十字製）をＮ−スクシン
イミジル−３−（２ピリジルジチオ）プロピオン酸を用
いて結合させた。未反応の抗体は、ベンツアミジン固定
化セファローズＣＬ−４Ｂアフイニテイカラムを使用し
て除いた。次に試料を限外ろ過により２ｒｒｌまで濃縮
した。あらかじめ、０．１５ＭＮａＣＱと０．０５Ｍリ
ン酸ナトリウムからなるｐＨ７，４の緩衝液で平衡化し
たセファクリルＳ−３００カラム（１，５φｘ　９０ａ
ｎ　）に添加し４　、５　ｍ　Ｑ　／　ｈの流速でゲル
ろ過することで未反応のウロキナーゼを除いた。以上の
方法によりウロキナーゼ標識抗ヒトα−フェトプロティ
ン抗体を得た。

次にヒトα−フェトプロティンの測定法を示す。

上記手法で調製した抗ヒトα−フェトプロティン固定化
セファローズＣＬ−４Ｂ７５μＱ（膨潤時の容量）をア
フィニティークロマトグラフィー用カラムに充填した。

各種濃度のヒトα−フェトプロティンの５ｍｇ／ｍΩ（
牛血清アルブミン、　０．１５ＭＮａＣＱ、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウムからなるＰＨ７，４の緩衝溶液１００μ
Ｑをカラムに添加し、１ｏ分間攪拌し、５ｍｇ／ｍｕ牛
血清アルブミンを含む０．１５ＭＮａＣＱ、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）２ｍＭで洗浄した
。次に、ウロキナーゼ標識抗ヒトα−フェトプロティン
抗体１００μＱをカラムに添加し５分間攪拌し、　０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０．０．５ＭＮａＣＱ、５０ｍＭ　
　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱからなるｐＨ８，０の緩衝液５ｍｆ
ｌ、続いて０．１５ＭＮａＣＱ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・
ＨＣＱからなるｐＨ８，０の緩衝液５ｍＡでこれを洗浄
した。さらにプラスミノーゲンの０．１５ＭＮａＣＱ。

５０ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＦＩからなるｐＨ８，５の
緩衝溶液を１００μΩカラムに添加し、１０分間攪拌反
応させ、つぎに０．１５ＭＮａＣＱ、５０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＱからなるＰＨ７，４の緩衝液１ｍＱを加え、
直ちにろ過した。

ろ液０．５ｍＱに基質溶液（Ｂｏｃ−ＧＱｕ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−４−メチルクマリンアミドの０．１５ＭＮａＣ
Ｑ。

５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱのｐＨ７，８の緩衝液）　
０．５ｍＱを加え、直ちにλｅｘ＝３６５ｎｍ、λｅｍ
＝４６０ｎｍにおける蛍光強度を経時的に測定した。基
質反応を最長１時間として、蛍光強度が一定値以上にな
るまで行わせ、単位時間当りの蛍光強度の増加率として
測定した結果を第２図の１３に示す。

比較例として、プラスミノーゲンと基質を同時に加え、
同相を除去しないで１０分間反応を行った後、１／１０
容量のジイソプロピルフルオロホスフェイトを加え反応
を停止させ、固相を含んだまま蛍光測定した場合の測定
曲線を第２図１１に示す。

また、同様に同相を除去しないで反応を行った後、反応
を停止させ、同相を除いて蛍光測定した場合の測定曲線
を第２図１２に示す。蛍光測定時に同相　２を除かない
と同相による光の散乱が大きくヒトα−フェトプロティ
ンはほとんど測定できなかった。

固相を除かずに第二段目の反応を１ｏ分間行い、蛍光測
定時に固相を除くと１０−”ｍｏＱ／　Ｑがら１０−”
ｍｏｊ２／Ｑの範囲で測定可能であった。本発明すなわ
ち、固相を除いた状態で第二段目の反応を行い、さらに
反応の進行状態をモニターしながら反応時間を設定した
場合はヒトα−フェトプロティンの測定濃度範囲が広が
る効果があった。

〔発明の効果〕

本発明によれば、高感度で低濃度の試料を、測定するこ
とが可能である。また他の酵素による反応時間を１反応
の進行の度合いを検討しながら設定することもできるの
で、高濃度の試料を短時間で測定でき、反応によって生
成する物質が濃度消光が生じる濃度や、ランバート・ベ
ールの法則に従わなくなる濃度に達する以前に測定する
ことが可能なため、高濃度の試料まで測定できる効果が
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明を説明するためのＤＮＡの測定結果を
示す図、第２図は本発明を説明するためのヒトα−フェ
トプロティンの測定結果を示す図である。 １、１１．１２・・・比較例の測定曲線２．１３・・・
本発明の測定曲線 代理人弁理士　　中　村　純之助 ０．１　　　　１　　　　１０　　　１００ｒ）ＮＡ量
（μｌ） 第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水に不溶性の担体に、直接又は該担体に固定したリ
   ガンドを介して被測定物質を結合させる工程、該被測定
   物質に酵素で標識したリガンドを結合させる工程及び該
   酵素による酵素反応によって産生された物質を他の酵素
   反応により測定する工程を有する生体物質の検出法にお
   いて、上記酵素によって産生された物質を担体を含む系
   から分離した後、上記他の酵素反応を行うことを特徴と
   する生体物質の検出法。 ２、上記酵素によって産生された物質が他の酵素であり
   、該他の酵素により上記他の酵素反応を行う請求項１記
   載の生体物質の検出法。 ３、上記酵素によって産生された物質が酵素以外の物質
   であり、他の酵素を用いて他の酵素反応を行う請求項１
   記載の生体物質の検出法。 ４、水に不溶の担体に固定化した抗体又は抗原に、被測
   定抗原又は抗体を結合させる工程、該被測定抗原又は抗
   体に酵素で標識した抗体又は抗原を結合させる工程、該
   酵素による酵素反応によって産生された物質を担体を含
   む系から分離する工程及び該産生された物質を他の酵素
   反応によって検出する工程を有することを特徴とする生
   体物質の検出法。