CN112625134A - 一种灭蝇胺单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种灭蝇胺单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种灭蝇胺单克隆抗体及其应用，该抗体包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区的CDR1序列如SEQ ID NO：1所示、CDR2序列如SEQ ID NO：2所示、CDR3序列如SEQ ID NO：3所示；重链可变区的CDR1序列如SEQ ID NO：4所示、CDR2序列如SEQ ID NO：5所示、CDR3序列如SEQ ID NO：6所示。该抗体对灭蝇胺具有较好的检测灵敏度和添加回收率，可实现对农产品中灭蝇胺残留量的检测，为灭蝇胺残留量的免疫检测提供了原料。并且首次测得该抗体的可变区基因序列，为后续抗体试剂应用于检测试剂盒时采用规模化表达生产提供了序列基础。

Description

一种灭蝇胺单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于农药残留免疫分析技术领域，具体涉及一种灭蝇胺单克隆抗体及其应用。
背景技术
灭蝇胺 (Cyromazine)是一种昆虫生长调节剂类低毒杀虫剂，有非常强的选择性，主要对双翅目昆虫有活性。其作用机理是使双翅目昆虫幼虫和蛹在形态上发生畸变，成虫羽化不全或受抑制。该药具有触杀和胃毒作用，并有强内吸传导性，持效期较长，但作用速度较慢。然而，灭蝇胺的残留也会使一些不是预定目标的生物遭到毒害。
目前，对灭蝇胺残留的检测方法主要是仪器分析方法，包括气相色谱法(Gaschromatography，GC)、气相色谱-质谱串联法(GC-MS)等。这些方法结果可靠，灵敏度高，已有相关的技术标准可供参考。但由于需要昂贵的仪器、专门的操作人员，以及样品前处理复杂、成本高、时间长，因此不能更好地满足快速简便的现场检测要求。
与仪器分析方法相比，免疫检测方法因其简便、经济、快速等优点而在农药残留检测领域中受到越来越多的关注。ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)方法是常用的免疫检测方法，但是其却有操作步骤相对较多，检测时间较长，检测结果不够直观，不能在线进行检测等缺陷。因而ELISA在灭蝇胺的快速检测上的应用受到很大的限制。胶体金试纸条无需专业操作人员及任何辅助类仪器，根据反应所显现的条带几分钟即可判定结果，不仅操作简便、快速，且结果直观准确、成本低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灭蝇胺单克隆抗体及其应用，该抗体对灭蝇胺具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立灭蝇胺的免疫学检测方法。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种抗灭蝇胺的单克隆抗体，包括轻链可变区和重链可变区，其中，
所述轻链可变区的CDR1序列如SEQ ID NO：1所示；
所述轻链可变区的CDR2序列如SEQ ID NO：2所示；
所述轻链可变区的CDR3序列如SEQ ID NO：3所示；
所述重链可变区的CDR1序列如SEQ ID NO：4所示；
所述重链可变区的CDR2序列如SEQ ID NO：5所示；
所述重链可变区的CDR3序列如SEQ ID NO：6所示。
以上所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
本发明所述的单克隆抗体在制备灭蝇胺免疫检测产品中的应用。
抗灭蝇胺单克隆抗体的制备步骤为：
（1）免疫原的制备：以灭蝇胺为原料，KLH为载体蛋白，利用活泼酯法制备免疫原，包被原是采用同样的方法与BSA 偶联，反应结束后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，通过紫外吸收扫描方法鉴定；
（2）小鼠的免疫：将免疫原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠；首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周；第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；
（3）细胞融合与单克隆抗体的制备：通过聚乙二醇（PEG 2000）法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株；使用特异性的细胞株制备腹水并用Protein A进行抗体纯化，之后用超滤离心管去盐，冷冻抽干获得干粉状抗体，并于-20 ℃冻存备用。
有益效果：本发明提供了一种灭蝇胺单克隆抗体及其应用，该抗体对灭蝇胺具有较好的检测灵敏度（IC50值为0.56ng/mL），添加回收率为85-107%，可实现对农产品中灭蝇胺残留量的检测，为灭蝇胺残留量的免疫检测提供了原料，具有重要的实际应用价值。并且首次测得该抗体的可变区基因序列，为后续抗体试剂应用于检测试剂盒时采用规模化表达生产提供了序列基础。
附图说明
图1 为实施例中测得的灭蝇胺检测的抑制曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 杂交瘤细胞株的制备
（1）完全抗原的制备
利用活泼酯法制备免疫抗原。分别称取0.1 mmol 半抗原与0.1 mmol NHS，用600μL DMF溶解于反应装置中；称取0.1 mmol DCC，用400 μL DMF溶解；将DCC/DMF溶液缓慢滴加到上述反应装置中。在磁力搅拌下室温密封反应7小时。反应终液置4 ℃冰箱冷却2小时以上，经8000 rpm离心5分钟，取上清活泼酯液缓慢的加入到5 mL 15 mg/mL的KLH蛋白中，反应在磁力搅拌下室温搅拌4小时。待反应完成后，将反应液置于透析袋内，于0.02 mol/LpH7.4的PBS缓冲液中4℃搅拌透析，每四小时换一次透析液，共透析60小时。透析结束后将透析袋中的液体取出，经4 ℃ 12000 rpm离心5分钟，取上清分装保存于-20 ℃冰箱中。
利用活泼酯法制备包被抗原，方法与免疫抗原相同，用BSA代替KLH。
（2）动物免疫
选择的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫，将以上制得的1mg/mL的完全抗原与等量福氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只100μL。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；选择抑制最好的小鼠，在五免后21天冲刺免疫，准备融合。
（3）细胞融合
在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（分子量为2000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，
将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1-4*107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、将脾细胞和SP2/0细胞按照计数比1：10 的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
（4）细胞筛选与细胞株建立
在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。
筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步以灭蝇胺作为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得抗灭蝇胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
实施例2 抗灭蝇胺单克隆抗体的制备
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
实施例3 抗灭蝇胺单克隆抗体灵敏度的鉴定
（1）包被：将包被原用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液从8ng/mL开始3倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
（2）洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
（3）封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h，洗涤后烘干备用；
（4）加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应
30min。
（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
（6）终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。图1为测得的抑制曲线图，其R2＝0.995，Y=0.077+1.33/（1+（X/0.555）2.862），IC50为：0.56ng/mL，对灭蝇胺的灵敏度较好，可用于灭蝇胺分析检测。
实施例4 添加回收实验
以阴性水作为实验样本，向阴性样本中添加不同含量的灭蝇胺标准品，按照实施例2的步骤进行标准曲线的测定和检测样本的测定，结果如表1所示，从表1中得出，灭蝇胺的回收率在85％-107％，符合样本的添加回收要求。
表1 添加回收结果（n=5）
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE001
实施例5 灭蝇胺单克隆抗体的氨基酸序列测序及分析
将筛选到的最佳的杂交瘤细胞株交于抗体序列测序服务公司测得抗体的氨基酸序列，所得单克隆抗体的具体序列如下：
抗体轻链可变区氨基酸序列为：
PAYLSVKQVLMAQYTNNNATASKLWFFPWYATLSATITEDLSKAAPQFPGGSYQLKFNTAYQLPQCLFGDKADVLQTVSLVYSAQWIERTNTLKEVNRAT（SEQ ID NO：7）；
轻链可变区的CDR1序列为：PWYATL（SEQ ID NO：1）；
轻链可变区的CDR2序列为：FPGGSYQ（SEQ ID NO：2）；
轻链可变区的CDR3序列为：VYSAQWIER（SEQ ID NO：3）；
抗体重链可变区氨基酸序列为：
KQFISYDLQGDVIGTPSNVKNTTLSGKSGTSARYVNSPWLMYCLSTETIQNGLYGSIYGYFLYFGNYWYQARTDWSSGNLWGSKTCLGNQAIQSTLRVPNPSYEVRDNVDTFKTTKSQYSATRSP（SEQ ID NO：8）；
重链可变区的CDR1序列为：SGTSAR（SEQ ID NO：4）；
重链可变区的CDR2序列为：IQNGLYGS（SEQ ID NO：5）；
重链可变区的CDR3序列为：GSKTCLGNQ（SEQ ID NO：6）。
序列表
<110> 苏州快捷康生物技术有限公司
<120> 一种灭蝇胺单克隆抗体及其应用
<141> 2020-11-27
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 1
Pro Trp Tyr Ala Thr Leu
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 2
Phe Pro Gly Gly Ser Tyr Gln
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 3
Val Tyr Ser Ala Gln Trp Ile Glu Arg
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 4
Ser Gly Thr Ser Ala Arg
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 5
Ile Gln Asn Gly Leu Tyr Gly Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 6
Gly Ser Lys Thr Cys Leu Gly Asn Gln
1 5
<210> 7
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 7
Pro Ala Tyr Leu Ser Val Lys Gln Val Leu Met Ala Gln Tyr Thr Asn
1 5 10 15
Asn Asn Ala Thr Ala Ser Lys Leu Trp Phe Phe Pro Trp Tyr Ala Thr
20 25 30
Leu Ser Ala Thr Ile Thr Glu Asp Leu Ser Lys Ala Ala Pro Gln Phe
35 40 45
Pro Gly Gly Ser Tyr Gln Leu Lys Phe Asn Thr Ala Tyr Gln Leu Pro
50 55 60
Gln Cys Leu Phe Gly Asp Lys Ala Asp Val Leu Gln Thr Val Ser Leu
65 70 75 80
Val Tyr Ser Ala Gln Trp Ile Glu Arg Thr Asn Thr Leu Lys Glu Val
85 90 95
Asn Arg Ala Thr
100
<210> 8
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 8
Lys Gln Phe Ile Ser Tyr Asp Leu Gln Gly Asp Val Ile Gly Thr Pro
1 5 10 15
Ser Asn Val Lys Asn Thr Thr Leu Ser Gly Lys Ser Gly Thr Ser Ala
20 25 30
Arg Tyr Val Asn Ser Pro Trp Leu Met Tyr Cys Leu Ser Thr Glu Thr
35 40 45
Ile Gln Asn Gly Leu Tyr Gly Ser Ile Tyr Gly Tyr Phe Leu Tyr Phe
50 55 60
Gly Asn Tyr Trp Tyr Gln Ala Arg Thr Asp Trp Ser Ser Gly Asn Leu
65 70 75 80
Trp Gly Ser Lys Thr Cys Leu Gly Asn Gln Ala Ile Gln Ser Thr Leu
85 90 95
Arg Val Pro Asn Pro Ser Tyr Glu Val Arg Asp Asn Val Asp Thr Phe
100 105 110
Lys Thr Thr Lys Ser Gln Tyr Ser Ala Thr Arg Ser Pro
115 120 125

Claims (3)

1.一种抗灭蝇胺的单克隆抗体，包括轻链可变区和重链可变区，其特征在于：
所述轻链可变区的CDR1序列如SEQ ID NO：1所示；
所述轻链可变区的CDR2序列如SEQ ID NO：2所示；
所述轻链可变区的CDR3序列如SEQ ID NO：3所示；
所述重链可变区的CDR1序列如SEQ ID NO：4所示；
所述重链可变区的CDR2序列如SEQ ID NO：5所示；
所述重链可变区的CDR3序列如SEQ ID NO：6所示。
2. 根据权利要求1所述的一种抗灭蝇胺的单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
3.权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备灭蝇胺免疫检测产品中的应用。
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