CN102432866B

CN102432866B - 一种雷公藤甲素前药的制备方法

Info

Publication number: CN102432866B
Application number: CN 201110279102
Authority: CN
Inventors: 任天斌; 刘昌进; 李建波
Original assignee: Tongji University
Current assignee: Tongji University
Priority date: 2011-09-20
Filing date: 2011-09-20
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2031-09-20
Also published as: CN102432866A

Abstract

本发明属于高分子材料和生物医学工程领域，具体涉及一种雷公藤甲素前药的制备方法。具体步骤是：在聚乙二醇的两端通过二硫键连接上雷公藤甲素，在一般的体液环境中是稳定存在，雷公藤甲素由于疏水性构成疏水内核，外壳为亲水性的聚乙二醇，一旦到达病变位置，由于还原环境的刺激，二硫键开始断裂，从而快速释放出内核中的雷公藤甲素，从而提高了药物的治疗效果，减轻毒副作用。

Description

一种雷公藤甲素前药的制备方法

技术领域

本发明属于高分子材料和生物医学工程领域，具体涉及一种雷公藤甲素前药的制备方

法。

背景技术

雷公藤甲素是雷公藤的主要有效成分，具有抗炎、免疫抑制、抗生育、抗肿瘤和白血病治疗等多种药理租用，在临床上用于治疗器官移植的排斥反应、自身免疫性疾病、肾病综合症等方面疗效显著，同时还可用于风湿性关节炎、类风湿性关节炎、跌打损伤、肾小球肾炎、红斑狼疮、肾病综合症等疑难病症的治疗。然而直接口服雷公藤甲素不仅药物代谢快，半衰期短，而且副作用大，不具有选择性，不良反应多，主要有胃肠道反应、月经紊乱和骨髓抑制等。为了提高疗效、减轻毒副反应，开发一种有选择性杀死细胞的雷公藤甲素药物具有重要意义。

巯基-二硫键交换反应快速、可逆，在保持活体细胞的诸多生物功能方面（如蛋白结构、酶活性、氧化-还原平衡等）发挥着非常重要的作用。谷胱甘肽是一种由三个氨基酸组成的含巯基的小分子肽，有还原型（GSH）和氧化型（GSSG）两种形式，它们是动物细胞内最主要的氧化-还原对，在生理条件下绝大多数以还原型谷胱甘肽的形式存在，谷胱甘肽还原酶催化两型间的互相转变。在线粒体、细胞质、细胞核、分泌途径和细胞外空间中，GSH/GSSG之间保持着一种独特的非平衡态。还原型谷胱甘肽（GSH）在人体各部位的浓度差别很大，例如在体液（如血液）和细胞外只有2~20uM，细胞内部却可以达到为0.5mM以上，而肿瘤细胞内部的浓度更是正常细胞的至少4倍以上。肿瘤细胞内高浓度GSH的存在，为其创造了一种独特的内部还原性环境，这就为二硫键连接的聚合物提供了相应的信号，因此针对细胞内药物传递的还原敏感性聚合物胶束的研究逐渐变得引人注意。例如， Zhong等人制备了以生物大分子葡聚糖（Dextran）作为亲水链的两嵌段共聚物（Dextran-S-S-PCL），（Biomacromolecules, 2010, 11(4): 848-854）； Li等人则制备了以聚亮氨酸为疏水链段的两嵌段共聚物（PEG-S-S-Pleu）（Polymer, 2011, 52(16): 3580-3586）。

本发明制备的一种雷公藤甲素前药，在聚乙二醇的两端通过二硫键连接上雷公藤甲素，在一般的体液环境中是稳定存在，雷公藤甲素由于疏水性构成疏水内核，外壳为亲水性的聚乙二醇，一旦到达病变位置，由于还原环境的刺激，二硫键开始断裂，从而快速释放出内核中的雷公藤甲素，从而提高了药物的治疗效果，减轻毒副作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种雷公藤甲素前药的制备方法。

本发明的目的是在聚乙二醇的两端通过二硫键连接上雷公藤甲素，使其具有良好的环境响应性，提高药物的治疗效果，减轻毒副作用。

本发明提供的一种雷公藤甲素前药的制备方法，具体步骤如下：

将聚乙二醇（分子量1000~10000）加入反应釜，并分散溶解在溶剂二甲亚砜（DMSO）

中，加入重量百分数40%的苛性碱A水溶液，常温搅拌反应0.5~3小时后，加入聚乙二醇端羟基总摩尔数的5~10倍量的氯乙酸，反应温度为50~80℃，反应时间为24~48小时，调节PH至中性，抽滤，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到两端含有端羧基的聚乙二醇；将所得到的两端含有端羧基的聚乙二醇溶于溶剂无水二氯甲烷中，加入聚乙二醇端羟基总摩尔数1~5倍量的N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC），并按照N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）摩尔数加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应12~24小时后，将该溶液缓慢滴加至聚乙二醇端羟基总摩尔数的5~10倍量的胱胺的二氯甲烷溶液中，室温反应，反应时间为12~24小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到含端氨基的聚乙二醇；将该含端氨基的聚乙二醇的氨基总数的1.5~3倍量的羧基化的雷公藤甲素加入另一反应釜，并分散溶解在溶解二甲亚砜（DMSO）中，加入聚乙二醇的氨基总数的1~5倍量的N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC），并按照N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）摩尔数加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应12~24小时后，将含端氨基的聚乙二醇的二甲亚砜溶液缓慢滴加至上述溶液中，室温反应，反应时间为12~24小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，用在去离子水中透析，冻干，即得到所需产物。

本发明中，所述苛性碱A为氢氧化钠或氢氧化钾中的一种或两种。

本发明中，所述的羧基化的雷公藤甲素的制备方法如下：

取雷公藤甲素，丁二酸酐，4-二甲氨基吡啶（DMAP），三乙胺，按摩尔比1：1.5~2.5：1~1.5：1溶于溶剂C中，反应温度为50~65℃，反应时间为12~36小时，经浓缩后，用冰冻的二氯化碳沉淀2~3次除去过量的丁二酸酐，再浓缩滤液，用大量乙醚沉淀2~3次，过滤并真空干燥，得到羧基化的雷公藤甲素。

本发明中，所述的溶剂C为氯仿、二甲亚砜、乙酸乙酯中的一种或多种。

本发明中，所述的产物是在聚乙二醇两端由二硫键连接有雷公藤甲素，该产物可在还原环境中分解并脱落释放出雷公藤甲素，该产物的的分子量为1500~10000。

本发明的优点在于：由二硫键连接的雷公藤甲素前药具有还原敏感性，当给该药物提供一个还原环境，硫硫键会断裂，疏水内核中的雷公藤甲素会释放出来，药物被选择性的释放进入肿瘤细胞内部，从而有效地提高药物利用率，提高治疗效果，减轻毒副作用。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。

实施例1

将聚乙二醇（分子量为1000）2g加入反应釜，并分散溶解在溶剂二甲亚砜（DMSO）中，加入重量百分数40%的NaOH水溶液，常温搅拌反应0.5小时后，加入聚乙二醇端羟基总2g氯乙酸，反应温度为50℃，反应时间为24小时，调节PH至中性，抽滤，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到两端含有端羧基的聚乙二醇；将所得到的两端含有端羧基的聚乙二醇溶于溶剂无水二氯甲烷中，加入1.65g N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC），0.92g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应12小时后，将该溶液缓慢滴加至胱胺（3g）的二氯甲烷溶液中，室温反应，反应时间为12小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到含端氨基的聚乙二醇；将2g雷公藤甲素加入另一反应釜，并分散溶解在溶解二甲亚砜（DMSO）中，加入1.65g N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC），0.92g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应12小时后，将含端氨基的聚乙二醇的二甲亚砜溶液缓慢滴加至上述溶液中，室温反应，反应时间为12小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，用在去离子水中透析，冻干，即得到所需产物。

其中羧基化的雷公藤甲素的制备方法如下：

取2.16g雷公藤甲素，0.9g丁二酸酐，0.7g 4-二甲氨基吡啶（DMAP），2ml三乙胺，溶于氯仿中，反应温度为50℃，反应时间为12小时，经浓缩后，用冰冻的四氯化碳沉淀2~3次除去过量的丁二酸酐，再浓缩滤液，用大量乙醚沉淀2~3次，过滤并真空干燥，得到羧基化的雷公藤甲素。

实施例2

将聚乙二醇（分子量为2000）2g加入反应釜，并分散溶解在溶剂二甲亚砜（DMSO）中，加入重量百分数40%的KOH水溶液，常温搅拌反应1小时后，加入聚乙二醇端羟基总1.5g氯乙酸，反应温度为55℃，反应时间为24小时，调节PH至中性，抽滤，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到两端含有端羧基的聚乙二醇；将所得到的两端含有端羧基的聚乙二醇溶于溶剂无水二氯甲烷中，加入0.8g N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC），0.47g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应18小时后，将该溶液缓慢滴加至胱胺（1.5g）的二氯甲烷溶液中，室温反应，反应时间为18小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到含端氨基的聚乙二醇；将1g雷公藤甲素加入另一反应釜，并分散溶解在溶解二甲亚砜（DMSO）中，加入0.8g N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC），0.47g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应12小时后，将含端氨基的聚乙二醇的二甲亚砜溶液缓慢滴加至上述溶液中，室温反应，反应时间为18小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，用在去离子水中透析，冻干，即得到所需产物。

其中羧基化的雷公藤甲素的制备方法如下：

取1.2g雷公藤甲素，0.5g丁二酸酐，0.4g 4-二甲氨基吡啶（DMAP），2ml三乙胺，溶于氯仿中，反应温度为55℃，反应时间为24小时，经浓缩后，用冰冻的四氯化碳沉淀2~3次除去过量的丁二酸酐，再浓缩滤液，用大量乙醚沉淀2~3次，过滤并真空干燥，得到羧基化的雷公藤甲素。

实施例3

将聚乙二醇（分子量为4000）4g加入反应釜，并分散溶解在溶剂二甲亚砜（DMSO）中，加入重量百分数40%的KOH水溶液，常温搅拌反应2小时后，加入聚乙二醇端羟基总2.5g氯乙酸，反应温度为60℃，反应时间为24小时，调节PH至中性，抽滤，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到两端含有端羧基的聚乙二醇；将所得到的两端含有端羧基的聚乙二醇溶于溶剂无水二氯甲烷中，加入2g N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC），1.18g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应24小时后，将该溶液缓慢滴加至胱胺（2g）的二氯甲烷溶液中，室温反应，反应时间为36小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到含端氨基的聚乙二醇；将1.5g雷公藤甲素加入另一反应釜，并分散溶解在溶解二甲亚砜（DMSO）中，加入2g N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC），1.18g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应24小时后，将含端氨基的聚乙二醇的二甲亚砜溶液缓慢滴加至上述溶液中，室温反应，反应时间为18小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，用在去离子水中透析，冻干，即得到所需产物。

其中羧基化的雷公藤甲素的制备方法如下：

取2g雷公藤甲素，1g丁二酸酐，0.6g 4-二甲氨基吡啶（DMAP），2ml三乙胺，溶于氯仿中，反应温度为60℃，反应时间为24小时，经浓缩后，用冰冻的四氯化碳沉淀2~3次除去过量的丁二酸酐，再浓缩滤液，用大量乙醚沉淀2~3次，过滤并真空干燥，得到羧基化的雷公藤甲素。

实施例4

将聚乙二醇（分子量为5000）10g加入反应釜，并分散溶解在溶剂二甲亚砜（DMSO）中，加入重量百分数40%的NaOH水溶液，常温搅拌反应3小时后，加入聚乙二醇端羟基总3g氯乙酸，反应温度为65℃，反应时间为48小时，调节PH至中性，抽滤，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到两端含有端羧基的聚乙二醇；将所得到的两端含有端羧基的聚乙二醇溶于溶剂无水二氯甲烷中，加入3g N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC），1.8g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应24小时后，将该溶液缓慢滴加至胱胺（3g）的二氯甲烷溶液中，室温反应，反应时间为12小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到含端氨基的聚乙二醇；将2g雷公藤甲素加入另一反应釜，并分散溶解在溶解二甲亚砜（DMSO）中，加入3g N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC），1.8g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应12小时后，将含端氨基的聚乙二醇的二甲亚砜溶液缓慢滴加至上述溶液中，室温反应，反应时间为12小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，用在去离子水中透析，冻干，即得到所需产物。

其中羧基化的雷公藤甲素的制备方法如下：

取3g雷公藤甲素，4g丁二酸酐，2g 4-二甲氨基吡啶（DMAP），5ml三乙胺，溶于氯仿中，反应温度为60℃，反应时间为48小时，经浓缩后，用冰冻的四氯化碳沉淀2~3次除去过量的丁二酸酐，再浓缩滤液，用大量乙醚沉淀2~3次，过滤并真空干燥，得到羧基化的雷公藤甲素。

实施例5 为了进一步理解本产物的药效作用，进行以下动物急性毒性试验和一般药理试验，以证明本发明所述药物的安全性。

动物急性毒性试验

将按本发明所提供的方法制得的前药，经大鼠及小鼠口服该前药，发现结果如下：

1）对小鼠采用含该前药的有效活性成分雷公藤甲素40毫克/公斤（相当于临床推荐剂量的350倍）时，未出现任何的毒性反应和死亡，证明该产物对小鼠无急性毒性。

2）对大鼠采用含该前药的有效活性成分雷公藤甲素45毫克/公斤（相当于临床推荐剂量的120倍）时，未出现任何的毒性反应和死亡，证明该产物对大鼠无急性毒性。

一般药理试验

采用采用Beagle犬对该产物进行一般药理学研究。

Beagle犬口服含该前药的有效活性成分雷公藤甲素分别为低（5毫克/公斤）、中（15毫克/公斤）、高（25毫克/公斤）三个剂量的该产物和蒸馏水（对照实验），共4个组, 对心血管系统、呼吸系统进行观察。

结果：该产物对Beagle犬收缩压、舒张压、平均动脉压、心率、心律、ECG之P波电压、T波电压、QRS时间、PR间期、QT间期、ST段、呼吸频率、节律和幅度均无明显影响。

结果表明，该前药对Beagle犬心血管系统、呼吸系统无明显影响。

Claims

1.一种雷公藤甲素前药的制备方法，其特征是具体步骤如下：

(1)将分子量为1000~10000的聚乙二醇加入反应釜，并分散溶解在溶剂二甲亚砜中，加入重量百分数40%的苛性碱A水溶液，常温搅拌反应0.5~3小时后，加入聚乙二醇端羟基总摩尔数的5~10倍量的氯乙酸，反应温度为50~80℃，反应时间为24~48小时，调节pH至中性，抽滤，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到两端含有端羧基的聚乙二醇；

(2)将所得到的两端含有端羧基的聚乙二醇溶于溶剂无水二氯甲烷中，加入步骤(1)中聚乙二醇端羟基总摩尔数1~5倍量的N,N'-二环己基碳二亚胺，并按照N,N'-二环己基碳二亚胺摩尔数加入N-羟基琥珀酰亚胺，体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应12~24小时后，将该溶液缓慢滴加至步骤(1)中聚乙二醇端羟基总摩尔数的5~10倍的胱胺的二氯甲烷溶液中，室温反应，反应时间为12~24小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到含端氨基的聚乙二醇；

(3)将该含端氨基的聚乙二醇的氨基总数的1.5~3倍量的羧基化的雷公藤甲素加入另一反应釜，并分散溶解在二甲亚砜中，加入聚乙二醇的氨基总数的1~5倍量的N,N'-二环己基碳二亚胺，并按照N,N'-二环己基碳二亚胺摩尔数加入N-羟基琥珀酰亚胺，体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应12~24小时后，将含端氨基的聚乙二醇的二甲亚砜溶液缓慢滴加至上述溶液中，室温反应，反应时间为12~24小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，用在去离子水中透析，冻干，即得到所需产物。

2.根据权利要求1所述一种雷公藤甲素前药的制备方法，其特征是所述的苛性碱A为氢氧化钠或氢氧化钾中的一种或两种。

3.根据权利要求1所述的一种雷公藤甲素前药的制备方法，其特征是所述羧基化的雷公藤甲素的制备方法如下：

取雷公藤甲素、丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺，按摩尔比1：(1.5~2.5)：(1~1.5)：1比例溶于溶剂C中，反应温度为50~65℃，反应时间为12~36小时，经浓缩后，用冰冻的四氯化碳沉淀2~3次除去过量的丁二酸酐，再浓缩滤液，用乙醚沉淀2~3次，过滤并真空干燥，得到羧基化的雷公藤甲素。

4.根据权利要求3所述的一种雷公藤甲素前药的制备方法，其特征是所述溶剂C为氯仿、二甲亚砜或乙酸乙酯中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的一种雷公藤甲素前药的制备方法，其特征是所述的产物是在聚乙二醇两端由二硫键连接有雷公藤甲素，该产物可在还原环境中分解并脱落释放出雷公藤甲素，该产物的分子量为1500~10000。