CN105136918B - 一种食品中3-硝基丙酸高效液相色谱分析检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品安全技术领域，涉及食品中3‑硝基丙酸的检测方法。称取均匀样品，以pH8的Na₂HPO₄‑NaH₂PO₄缓冲溶液均质提取，高速冷冻离心后，移取缓冲溶液，磷酸调节pH至2，乙酸乙酯萃取，GPC净化，洗脱液氮吹至干，流动相溶解定容，经0.45μm有机滤膜过滤，待测。待测物经C18液相色谱柱分离，二极管阵列检测器检测，外标法定量。本发明所述检测方法前处理步骤简单新颖，除杂效果好，方法的灵敏度、回收率高，测定结果的精密度好，可以有效的检测各类食品中3‑硝基丙酸的含量。

Description

一种食品中3-硝基丙酸高效液相色谱分析检测方法

一、技术领域

本发明属于食品安全技术领域，具体涉及食品中3-硝基丙酸的检测方法。

二、技术背景

3-硝基丙酸为白色结晶化合物，易溶于水、甲醇、乙酸乙酯、乙腈等极性溶剂。研究表明，3-硝基丙酸是曲霉属和青霉属少数菌种的代谢产物，我国从变质甘蔗中分离所得的甘蔗节菱孢、蔗生节菱孢霉菌等菌种也能产生3-硝基丙酸。3-硝基丙酸是一种神经毒素，人误食容易发生中毒，儿童中毒尤为严重，该中毒症的主要表现为中枢神经系统受损。急性期的症状有呕吐、眩晕、阵发性抽搐、眼球偏侧凝视、昏迷，甚至死亡，后遗症主要为锥体外系的损害，主要症状有屈曲、扭转、痉挛，肢体强直，静止时张力减低等。人中毒剂量约为12.5mg/kg。。

甘蔗作为一种富含糖分的农作物，深受大众喜爱，其深加工制品(比如蔗糖)也广泛存在人们日常生活中。在我国，甘蔗的主产区是广西、福建、广东、海南等南方地区，北方地区则需从南方调运。在运输、存储过程中，新鲜甘蔗容易发霉变质。相关研究表明，变质发红的甘蔗中含有3-硝基丙酸，以变质甘蔗作为原料生产的食品也可能受到3-硝基丙酸的污染，尤其蔗糖，在食品中用途尤为广泛，对食品安全造成较大的威胁。用米曲霉发酵产生的酶制剂可能含有强毒物质3-硝基丙酸，联合围粮农组织和世界卫生组织关于食品添加剂的联合专家委员会(Joint FAO/WHO Expert Committeeon Food Additives)在1987即明确规定用米曲霉发酵生产的淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖化酶、脂肪酶等时均要检测3-NPA。原料中含有这些物质的食品也可能受到3-硝基丙酸的污染。

目前，对于3-硝基丙酸的检测研究则多集中于甘蔗和霉菌中的含量，比如固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法检测甘蔗中3-硝基丙酸的方法研究(李兵等中国食品卫生杂志2012年第24卷第2期)，采用乙腈提取，氨基柱净化，液质联用进行检测分析。3-硝基丙酸的液相色谱分析(江涛等 卫生研究1999年05期)，该方法利用反相高效液相色谱法定量分析米曲霉菌种培养基中3-硝基丙酸的含量，样品用乙酸乙酯提取。固相萃取/超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法检测酶制剂中3-硝基丙酸(张璐 分析测试学报 第32卷第6期)，该法采取乙腈提取，PSA固相萃取柱净化，液质联用进行检测分析。

这些方法多针对特定基质，提取和净化方式不能满足检测各类食品的需求。比如文献中采用乙腈提取、具有弱阴离于交换功能的氨基柱、PSA柱净化，这种方法对于盐分含量高的样品就不适合，由于各种离子的干扰，造成回收率很低。直接采用乙酸乙酯等非极性溶剂提取，对于一些固体、半固体样品渗透能力差，提取效果不好，并且容易被油脂等非极性成分干扰。

本法通过优化提取方式，最后采用pH 8.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲溶液均质提取，调节pH值至2.0后，乙酸乙酯萃取磷酸盐缓冲溶液中的3-硝基丙酸。提取效率高，采用缓冲盐提取不易被样品基质干扰，并且通过液液萃取有效的去除了多数水溶性杂质。

然后进一步优化了净化方式，通过比较各种净化方式，发现各种固相萃取柱(比如中性氧化铝等)净化效果和回收率都不太理想。考虑采用GPC，3-硝基丙酸分子量119，不在多数GPC净化柱的适宜分子量范围内，通过比较筛选，最后发现Bio-Rad Bio-Beads S-X3，200-400目填料尽管适宜分子量范围400-14000，但对于3-硝基丙酸的净化效果良好。

本法简单快速，提取效率高，杂质去除效果好，对各类食品检测都没有干扰，提供了一个较好的食品中3-硝基丙酸的检测方法。

三、发明内容

本发明所要解决的技术问题是适用于各类食品中3-硝基丙酸的检测方法，能够有效的提取各类食品中的3-硝基丙酸，并很好的去除各类食品中的干扰物。

本发明的技术方案是通过以下步骤实现的：

(1)提取：称取样品5.0g(精确到0.0001g)于50ml离心管中，加入40ml pH 8.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲溶液，均质提取10min，高速冷冻离心后，移取缓冲盐溶液，40ml pH8.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲溶重复提取一次，合并提取液，用磷酸调节pH至2.0，分别用30ml、30ml乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯层，待GPC净化：

(2)净化：

凝胶渗透色谱条件：

净化柱：Bio-Rad Bio-Beads S-X3，200-400目；

检测波长：254nm；

流动相：乙酸乙酯+正己烷，体积比1∶1；

进样量：5ml；

开始收集时间：10min；

结束收集时间：25min；

50℃氮吹至于，准确移取0.5ml流动相溶解残渣，混匀后，过0.45μm滤膜，待测。

(3)高效液相色谱-二极管阵列检测器检测。

色谱柱：Agilent HC-C₁₈，4.6×250mm，5μm；

流动相：乙腈+0.02mol/L KH₂PO₄溶液＝10％+90％；

柱温：40℃；

流速：1.0ml/min；

检测波长：210nm；

进样体积：20μL。

本发明所述检测方法前处理步骤简单新颖，除杂效果好，方法的灵敏度、回收率高，测定结果的精密度好，检出限为10μg/kg。

附图说明

图1为3-硝基丙酸标准物质液相色谱谱图

具体实施方法

本发明将通过以下实施例作进一步说明。实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可用于本发明中，文中所述的较佳实施方法仅作示范之用。

实施例1

1、仪器与试剂

高效液相色谱仪：日本岛津LC-20AT，配二极管阵列检测器；

标准物质：3-硝基丙酸，纯度98.0％；

乙腈：色谱纯；

乙酸乙酯、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸均为分析纯；

本方法中所用水均为一级水。

2、仪器分析条件

凝胶渗透色谱条件：

净化柱：Bio-Rad Bio-Beads S-X3，200-400目；

检测波长：254nm；

流动相：乙酸乙酯+正己烷，体积比1∶1；

进样量：5ml；

开始收集时间：10min；

结束收集时间：25min；

液相色谱条件：

色谱柱：Agilent HC-C₁₈，4.6×250mm，5μm；

流动相：乙腈+0.02mol/L KH₂PO₄溶液＝10％+90％；

柱温：40℃；

流速：1.0ml/min；

检测波长：210nm；

进样体积：20μL。

3、线性方程及标准品色谱图

标准储备液配制：称取10.5mg 3一硝基丙酸标准物质，用乙腈溶解并定容至100ml，标准储备液浓度为102.9mg/L。

用上述标准溶液配制标准工作液：浓度为0.01mg/L，0.05mg/L，0.2mg/L，0.5mg/L，1mg/L，2mg/L。在上述色谱条件下进行测定，外标法定量。以峰面积y为纵坐标，浓度x为横坐标进行线性回归，结果如表1

表1 3-硝基丙酸保留时间，回归方程及线性相关系数

4、样品前处理方法

提取：称取果汁样品5.0g(精确到0.0001g)于50ml离心管中，加入40ml pH 8.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲溶液，均质提取10min，高速冷冻离心后，移取缓冲盐溶液，40ml pH8.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲溶重复提取一次，合并提取液，用磷酸调节pH至2.0，分别用30ml、30ml乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯层，上GPC净化。洗脱液50℃氮吹至于，准确移取0.5ml流动相溶解残渣，混匀后，过0.45μm滤膜，待测。

5、重复性实验

称取6份样品，按4所述前处理方法处理样品，按2所述液相色谱条件检测，保留时间定性，外标法定量。实验结果3-硝基丙酸未检出，见表2。

表2 6份样品检测结果

6、方法加标回收率试验

本方法的加标回收率实验结果如表3所示。

表3 重复性和加标回收率实验结果

加标量0.125μg，样品中加标回收率在91.6-96.8％，RSD％为2.7％.

7、检出限

3-硝基丙酸检出限为10μg/kg。

实施例2

1、仪器与试剂

高效液相色谱仪：日本岛津LC-20AT，配二极管阵列检测器；

标准物质：3-硝基丙酸，纯度98.0％；

乙腈：色谱纯；

乙酸乙酯、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸、正己烷均为分析纯；

本方法中所用水均为一级水。

2、仪器分析条件

凝胶渗透色谱条件：

净化柱：Bio-Rad Bio-Beads S-X3，200-400目；

检测波长：254nm；

流动相：乙酸乙酯+正己烷，体积比1∶1；

进样量：5ml；

开始收集时间：10min；

结束收集时间：25min；

液相色谱条件：

色谱柱：Agilent HC-C₁₈，4.6×250mm，5μm；

流动相：乙腈+0.02mol/L KH₂PO₄溶液＝10％+90％；

柱温：40℃；

流速：1.0ml/min；

检测波长：210nm；

进样体积：20μL。

3、线性方程及标准品色谱图

标准储备液配制：称取10.3mg 3-硝基丙酸标准物质，用乙腈溶解并定容至100ml，标准储备液浓度为100.9mg/L。

用上述标准溶液配制标准工作液：浓度为0.01mg/L，0.05mg/L，0.2mg/L，0.5mg/L，1mg/L，2mg/L。在上述色谱条件下进行测定，外标法定量。以峰面积y为纵坐标，浓度x为横坐标进行线性回归，结果如表4

表4 3-硝基丙酸保留时间，回归方程及线性相关系数

4、样品前处理方法

提取：称取辣椒酱样品5g于50ml离心管中，加入40ml pH 8.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲溶液，均质提取10min，高速冷冻离心后，移取缓冲盐溶液，40ml pH 8.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲溶重复提取一次，合并提取液，用磷酸调节pH至2.0，分别用30ml、30ml乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯层，上GPC净化。洗脱液50℃氮吹至干，准确移取0.5ml流动相溶解残渣，混匀后，过0.45μm滤膜，待测。

5、重复性实验

称取6份辣椒酱样品，按4所述前处理方法处理样品，按2所述液相色谱条件检测，保留时间定性，外标法定量。辣椒酱样品中3-硝基丙酸未检出，实验结果如表5所示。

表5 辣椒酱样品实验结果

6、方法加标回收率试验

本方法的加标回收率实验结果如表6所示。

表6 回收率实验结果

加标量0.125μg，样品中加标回收率在88.0-94.8％，RSD％为3.7％.

7、检出限

辣椒酱样品中3-硝基丙酸检出限为10μg/kg。

Claims (1)

1.一种食品中3-硝基丙酸高效液相色谱分析检测方法，其特征在于方法包括以下步骤：

(1)提取：称取样品5g于50ml离心管中，加入40ml pH 8.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲溶液，均质提取10min，高速冷冻离心后，移取缓冲盐溶液，40ml pH 8.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲溶液重复提取一次，合并提取液，用磷酸调节pH至2.0，分别用30ml、30ml乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯层，待GPC净化；

(2)净化：

凝胶渗透色谱条件：

净化柱：Bio-Rad Bio-Beads S-X3，200-400目；

检测波长：254nm；

流动相：乙酸乙酯+正己烷，体积比1∶1；

进样量：5ml；

开始收集时间：10min；

结束收集时间：25min；

50℃氮吹至干，准确移取0.5ml流动相溶解残渣，混匀后，过0.45μm滤膜，待测；

(3)高效液相色谱-二极管阵列检测器检测

色谱柱：Agilent HC-C₁₈，4.6×250mm，5μm；

流动相：乙腈+0.02mol/L KH₂PO₄溶液＝10％+90％；

柱温：40℃；

流速：1.0ml/min；

检测波长：210nm；

进样体积：20μL。