CN102539577B

CN102539577B - 润滑油（脂）中苯并(a)芘的检测方法

Info

Publication number: CN102539577B
Application number: CN201210027225.7A
Authority: CN
Inventors: 连运河; 高伟; 吉桂珍; 王磊; 程淑君
Original assignee: Chenguang Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Chenguang Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2012-02-08
Filing date: 2012-02-08
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2032-02-08
Also published as: CN102539577A

Abstract

本发明公开了一种润滑油（脂）中苯并(a)芘的检测方法，其将润滑油或润滑脂萃取、离心、采用凝胶渗透色谱净化后，收集目标洗脱液浓缩至干；然后定容得到样品溶液；最后将样品溶液采用反相高效液相色谱-荧光法检测，外标法定量。本方法采用GPC净化技术处理润滑油（脂），去除了绝大部分大分子油脂类杂质，极大地降低了样品基质对BaP测定的干扰，检测方法准确性高，对润滑油（脂）的适用性强；采用GPC净化技术结合高效液相色谱-荧光法检测，整个流程自动化程度高，简便，快速，易于实现大批量样品检测；GPC净化处理过程中产生的废液可以回收处理，重复使用，降低了检测成本，减少了环境污染。

Description

润滑油(脂)中苯并(a)芘的检测方法

技术领域

本发明涉及一种食品加工过程中润滑油（脂）中有毒物的检测技术，尤其是一种润滑油（脂）中苯并(a)芘的检测方法。

背景技术

苯并(a)芘（benzo[a]pyrene，BaP）是一种最具代表性的多环芳烃化合物，被认为是世界三大强致癌物之一，是国家食品安全工作的重点监测和控制对象。一般认为，食品中的BaP主要来源于食品自身的烹调过程、加工和包装环节污染以及食品环境污染。其中，对食品熏烤、烘烤过程中BaP的产生机理，以及由煤炭、汽油、烟草等物质燃烧引起的BaP大气污染等的研究报道较多，而对加工过程中食品接触材料污染，和由于加工机械润滑油（脂）泄漏导致的食品BaP污染虽有提及却鲜有报道。

对现代生产线来说，润滑油（脂）是保持设备正常运转必不可少的物质。随着现代食品工业的发展，食品的加工日渐机械化和规模化，润滑油（脂）的使用也日益广泛，相应地，食品受到润滑油（脂）污染的机率也日趋升高。因此，国家规定在可能与食品直接接触的设备中禁止使用工业级润滑油。然而，目前采用工业级润滑油（脂）来替代食品级润滑油（脂）的现象时有发生。工业级润滑油（脂）中75%-90%为基础矿物油，这些基础油宜采用溶剂精制和活性炭吸附等工艺去除多环芳烃等非理想组分，但是由于工艺问题，这些物质并不能完全去除。一旦机械装置密封不好，润滑油（脂）发生泄漏进入食品便会导致食品的BaP污染。因此，开发润滑油（脂）中BaP的检测方法，研究工业级和食品级润滑油（脂）中BaP含量差异，提升社会对工业级润滑油（脂）使用限制必要性的认识具有重要的现实意义。

目前，针对食品中BaP的检测方法报道很多，包括高效液相色谱-质谱法，高效液相色谱-荧光检测，气相色谱–质谱法，高效液相色谱-紫外检测和高效液相色谱-串联质谱等。相对而言，润滑油（脂）中BaP的检测方法鲜有报道。因为润滑油（脂）基质复杂，不仅含有基础油还含有稠化剂和添加剂，所以直接使用上述食品中BaP的检测方法，基质干扰很大，无法实现有效检测。因此，针对润滑油(脂)特性，专门开发适用于润滑油(脂)中BaP检测的方法非常关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种适用性强的润滑油（脂）中苯并(a)芘的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：其将润滑油或润滑脂萃取、离心、采用凝胶渗透色谱净化后，收集目标洗脱液浓缩至干；然后定容得到样品溶液；最后将样品溶液采用反相高效液相色谱-荧光法检测，外标法定量。

本发明方法采用下述检测步骤：

（1）润滑油或润滑脂用环己烷-乙酸乙酯混合溶剂浸泡、超声萃取；

（2）上述步骤得到的萃取液离心处理后，取上层清液采用凝胶渗透色谱净化，收集目标洗脱液浓缩至干，再用甲醇或乙腈定容，得到样品溶液；

（3）样品溶液采用反相高效液相色谱-荧光法检测，外标法定量。

本发明所述步骤（1）中环己烷-乙酸乙酯混合溶剂的体积比为50:50；步骤（1）中超声萃取时间为10～30 min，萃取次数为1～3次。

本发明所述步骤（2）中的萃取液采用高速冷冻离心机离心处理，转速为4000～10000 rpm，离心时间为5～10 min；步骤（2）中目标洗脱液采用旋转蒸发仪或者自动氮吹仪进行浓缩。

本发明所述润滑油或润滑脂称样量为0.5～1.5 g；所述环己烷-乙酸乙酯混合溶剂的用量为10～25 mL；所述的甲醇或乙腈体积5.0 mL；所述反相高效液相色谱-荧光法检测时样品溶液的进样量为5～20 μL。

本发明所述的凝胶渗透色谱净化的流动相为环己烷-乙酸乙酯，体积比为50:50，流速为4.7 mL/min，收集时间为16.0～21.0 min。

本发明所述反相高效液相色谱条件为等度洗脱，色谱柱为反相C18柱，流动相为甲醇-水体系或乙腈-水体系。

本发明所述C18色谱柱的规格为150 mm×4.6 mm，粒径5 μm；选用Kromasil 100-5 C18柱、SB-C18柱、XB-C18柱、Eclipse Plus C18柱或者AE.Lichrom C18-5μm-100柱；所述的流动相为体积比为（80～90）:（20～10）的甲醇-水体系，或体积比为（80～90）:（20～10）的乙腈-水体系。

本发明所述的荧光法检测条件为：激发波长为366 nm，发射波长为410 nm。

本发明所述步骤（2）中经凝胶渗透色谱净化处理后，环己烷-乙酸乙酯混合溶剂废液经旋转蒸发提纯处理后，重复使用。

本发明所述的凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography, GPC）是一种根据溶质分子大小进行分离的色谱技术，能够去除样品中大量的油脂及色素，具有快速、高效、节省溶剂、易自动化等优点，已广泛应用于油脂类食品中塑化剂、农残等危害成分的痕量分析。但是到目前为止，还未有采用GPC技术处理润滑油（脂）样品然后进行BaP测定的报道。本发明采用GPC净化技术，对润滑油（脂）样品进行处理，结合高效液相色谱-荧光法检测技术，从而建立了一种适用性很强的润滑油（脂）中BaP的测定方法。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

（1）采用GPC技术处理润滑油（脂），去除了绝大部分大分子油脂类杂质，极大地降低了样品基质对BaP测定的干扰，检测方法准确性高，对润滑油（脂）的适用性强；

（2）采用GPC技术结合高效液相色谱-荧光法检测，整个流程自动化程度高、简便、快速、易于实现大批量样品检测；

（3）GPC净化处理过程中产生的废液可以回收处理，重复使用，降低了检测成本，减少了环境污染。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明GPC净化处理润滑油（脂）分离效果图；

图2是本发明反相高效液相色谱-荧光检测苯并(a)芘色谱图。

具体实施方式

一、检测条件：Series III液相色谱仪配荧光检测器（美国LabAlliance公司），PREPLINC凝胶渗透色谱仪（美国J2公司）配BIO-Beads S-X3填料的净化柱（300 mm x 25 mm），所用试剂均为色谱纯，色谱柱的规格为150 mm×4.6 mm，粒径5 μm；选用Kromasil 100-5 C18柱、SB-C18柱、XB-C18柱、Eclipse Plus C18柱或者AE.Lichrom C18-5μm-100柱。流动相为甲醇-水体系或乙腈-水体系，荧光检测器的激发波长为366 nm，发射波长为410 nm。进样量为5～20 μL，流速为1.2 mL·min^-1。计算机系统记录色谱图，以峰面积作为信号响应值，对苯并（a）芘进行定性定量分析。

二、检测方法：本润滑油（脂）中苯并(a)芘的检测方法采用下述实施例中的方法检测。

实施例1：本润滑油（脂）中苯并(a)芘的检测方法的具体步骤如下所述。

（1）标准曲线：准确称取10mg（精确至0.1mg）BaP标准品于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成0.1mg·mL^-1的标准储备液。其工作曲线，由标准储备液逐级稀释成质量浓度分别为5.0、10.0、50.0、100.0、150.0、200.0 μg·L^-1的系列标准溶液，按上述试验条件进样做标准曲线进行分析。

（2）样品提取：准确称取1.0g（精确至0.0001g）润滑脂样品于25mL容量瓶中，加入10mL环己烷-乙酸乙酯（1:1，v/v）混合溶液，超声15min，冷却至室温，加入环己烷-乙酸乙酯（1:1，v/v）混合溶液定容。萃取液转移至离心管中，5℃下以10000 rpm的转速离心5 min，取上层清液用0.45 μm滤膜过滤，滤液转移至GPC上样瓶中。

（3） GPC净化处理：GPC检测波长为254 nm，流动相为环己烷-乙酸乙酯（1:1，v/v），流速为4.7 mL·min^-1。步骤（2）中得到的滤液5.0 mL进GPC净化处理；GPC净化处理润滑脂分离效果见图1；收集16～21 min流出液（目标洗脱液），使用旋转蒸发仪于40℃浓缩至干，加5.0 mL甲醇超声溶解，溶液用0.45 μm滤膜过滤后进样测定。

（4）液相检测：选取 Kromasil 100-5 C18色谱柱，甲醇-水（85:15，v/v）作为流动相，荧光检测器的激发波长366 nm，发射波长410 nm，进样量20 μL，流速1.2 mL·min^-1；反相高效液相色谱-荧光检测苯并(a)芘色谱图见图2。

（5）采用外标法定量，对润滑脂样品做3个平行样，试验编号为A、B、C，分析结果见表1，并对一个样品重复测定五次，分析结果见表2。由表1得，平行样的相对标准偏差为2.54%；由表2得重复性的相对标准偏差为1.61%。

（6）将步骤（1）中的标准样品加入到已知苯并(a)芘含量的润滑脂中，按照上述步骤进行实验，对该样品连续做10次平行测定，取平均值，计算加标回收率，实验结果见表3。加标回收率为81.22%～94.42%，相对标准偏差为1.36%。

表2：润滑脂样品中苯并（a）芘检测结果的重复性

次数	1	2	3	4	5	平均值	RSD%
								苯并（a）芘含量/ppb	880.9	877.5	894.6	910.5	904.8	893.7	1.61

实施例2：本润滑油（脂）中苯并(a)芘的检测方法的具体步骤如下所述。

（1）标准曲线：准确称取10 mg（精确至0.1 mg）BaP标准品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成0.1 mg·mL^-1的标准储备液。其工作曲线，由标准储备液逐级稀释成质量浓度分别为5.0、10.0、50.0、100.0、150.0、200.0 μg·L^-1的系列标准溶液，按上述试验条件进样做标准曲线进行分析。

（2）样品提取：准确称取1.5 g（精确至0.0001 g）润滑油样品于20 mL容量瓶中，加入10 mL环己烷-乙酸乙酯（1:1，v/v）混合溶液，超声10 min，冷却至室温，加入环己烷-乙酸乙酯（1:1，v/v）混合溶液定容。萃取液转移至离心管中，5℃下以7000 rpm的转速离心10 min，取上层清液用0.45 μm滤膜过滤，滤液转移至GPC上样瓶中。

（3） GPC净化处理：GPC检测波长为254 nm，流动相为环己烷-乙酸乙酯（1:1，v/v），流速为4.7 mL·min^-1。步骤（2）得到的滤液5.0 mL进GPC净化处理，收集16～21 min流出液（目标洗脱液），采用氮吹仪浓缩至干，加5.0 mL甲醇超声溶解，溶液用0.45 μm滤膜过滤后进样测定。

（4）液相检测：选取 SB-C18色谱柱，甲醇-水（80:20，v/v）作为流动相，荧光检测器的激发波长366 nm，发射波长410 nm，进样量10 μL，流速1.2 mL·min^-1。

（5）采用外标法定量，对润滑油样品做3个平行样，试验编号为A、B、C，对其中一个样品重复测定五次，得平行样的相对标准偏差为3.42%，重复性的相对标准偏差为2.75%。

（6）将步骤（1）中的标准样品加入到已知苯并(a)芘含量的润滑油中，按照上述步骤进行实验，对该样品连续做10次平行测定，取平均值，计算加标回收率。由结果得加标回收率为82.01%～95.67%。

实施例3：本润滑油（脂）中苯并(a)芘的检测方法的具体步骤如下所述。

（1）标准曲线：准确称取10 mg（精确至0.1 mg）BaP标准品于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配成0.1 mg·mL^-1的标准储备液。其工作曲线，由标准储备液逐级稀释成质量浓度分别为5.0、10.0、50.0、100.0、150.0、200.0 μg·L^-1的系列标准溶液，按上述试验条件进样做标准曲线进行分析。

（2）样品提取：准确称取0.5 g（精确至0.0001 g）润滑脂样品于10 mL容量瓶中，加入5 mL环己烷-乙酸乙酯（1:1，v/v）混合溶液，超声3次，每次30 min，冷却至室温，环己烷-乙酸乙酯（1:1，v/v）混合溶液定容。萃取液转移至离心管中，5℃下以4000 rpm的转速离心8 min，取上层清液用0.45 μm滤膜过滤，滤液转移至GPC上样瓶中。

（3） GPC净化处理：GPC检测波长为254 nm，流动相为环己烷-乙酸乙酯（1:1，v/v），流速为4.7 mL·min^-1。步骤（2）得到的滤液5.0 mL进GPC净化处理，收集16～21 min流出液（目标洗脱液），采用自动氮吹仪浓缩至干，加5.0 mL乙腈超声溶解，溶液用0.45 μm滤膜过滤后进样测定。

（4）液相检测：选取 XB-C18色谱柱，乙腈-水（80:20，v/v）作为流动相，荧光检测器的激发波长366 nm，发射波长410 nm，进样量5 μL，流速1.2 mL·min^-1。

（5）采用外标法定量，对润滑脂样品做3个平行样，试验编号为A、B、C，对其中一个样品重复测定五次，得平行样的相对标准偏差为2.76%，重复性的相对标准偏差为2.98%。

（6）将步骤（1）中的标准样品加入到已知苯并（a）芘含量的润滑脂中，按照上述步骤进行实验，对该样品连续做10次平行测定，取平均值，计算加标回收率，得加标回收率为81.65%～98.89%，相对标准偏差为1.43%。

实施例4：本润滑油（脂）中苯并(a)芘的检测方法的具体步骤如下所述。

步骤（1）-（3）与实施例1相同。

（4）液相检测：选取 Eclipse Plus C18色谱柱，乙腈-水（90:10，v/v）作为流动相；其余与实施例1相同。

（5）与实施例1相同；得平行样的相对标准偏差为2.83%，重复性的相对标准偏差为2.89%。

（6）与实施例1相同；得加标回收率为81.37%～96.60%。

实施例5：本润滑油（脂）中苯并(a)芘的检测方法的具体步骤如下所述。

步骤（1）-（3）与实施例1相同。

（4）液相检测：选取 AE.Lichrom C18-5μm-100色谱柱，甲醇-水（90:10，v/v）作为流动相；其余与实施例1相同。

（5）与实施例1相同；得平行样的相对标准偏差为2.72%，重复性的相对标准偏差为2.99%。

（6）与实施例1相同；得加标回收率为81.51%～97.43%。

实施例6：本润滑油（脂）中苯并(a)芘的检测方法的具体步骤如下所述。

步骤（1）-（3）与实施例1相同。

（4）液相检测：选取 SB-C18色谱柱，甲醇-水（80:20，v/v）作为流动相；其余与实施例1相同。

（5）与实施例1相同；得平行样的相对标准偏差为3.26%，重复性的相对标准偏差为2.81%。

（6）与实施例1相同；得加标回收率为81.93%～95.47%。

Claims

1.一种润滑油或润滑脂中苯并(a)芘的检测方法，其将润滑油或润滑脂萃取、离心、采用凝胶渗透色谱净化后，收集目标洗脱液浓缩至干；然后定容得到样品溶液；最后将样品溶液采用反相高效液相色谱-荧光法检测，外标法定量；其特征在于，该方法采用下述检测步骤：

（2）上述步骤得到的萃取液离心处理后，取上层清液采用凝胶渗透色谱净化，收集目标洗脱液浓缩至干，再用甲醇定容，得到样品溶液；

（3）样品溶液采用反相高效液相色谱-荧光法检测，外标法定量；

所述步骤（1）中环己烷-乙酸乙酯混合溶剂的体积比为50:50；所述步骤（1）中超声萃取时间为10～30 min，萃取次数为1～3次；

所述反相高效液相色谱条件为等度洗脱，色谱柱为反相C18柱，流动相为甲醇-水体系；

所述C18色谱柱的规格为150 mm×4.6 mm，粒径5 μm；选用Kromasil 100-5 C18柱、SB-C18柱、XB-C18柱、Eclipse Plus C18柱或者AE.Lichrom C18-5μm-100柱；所述的流动相体积比为（80～90）:（20～10）的甲醇-水体系；

所述的荧光法检测条件为：激发波长为366 nm，发射波长为410 nm；

所述的凝胶渗透色谱净化的流动相为环己烷-乙酸乙酯，体积比为50:50，流速为4.7 mL/min，收集时间为16.0～21.0 min。

2.根据权利要求1所述的润滑油或润滑脂中苯并(a)芘的检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中的萃取液采用高速冷冻离心机离心处理，转速为4000～10000 rpm，离心时间为5～10 min；所述步骤（2）中目标洗脱液采用旋转蒸发仪或者自动氮吹仪进行浓缩。

3.根据权利要求1所述的润滑油或润滑脂中苯并(a)芘的检测方法，其特征在于：所述的润滑油或润滑脂称样量为0.5～1.5 g；所述的环己烷-乙酸乙酯混合溶剂的用量为10～25 mL；所述的甲醇体积为5.0 mL；所述的反相高效液相色谱-荧光法检测时样品溶液的进样量为5～20 μL。

4.根据权利要求1所述的润滑油或润滑脂中苯并(a)芘的检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中经凝胶渗透色谱净化处理后，环己烷-乙酸乙酯混合溶剂废液经旋转蒸发提纯处理后，可以重复使用。