KR20060025752A

KR20060025752A - 피놀레닌산 고함유 지방산 추출물 및 잣기름으로부터의선택적 추출방법

Info

Publication number: KR20060025752A
Application number: KR1020040074552A
Authority: KR
Inventors: 이철; 이광원; 김인환; 이진원
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2004-09-17
Filing date: 2004-09-17
Publication date: 2006-03-22

Abstract

본 발명은 피놀레닌산 고함유 지방산 추출물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 잣기름으로부터 요소 부가법(Urea complexation method)를 이용하여 고농도의 피놀레닌산의 선택적으로 추출하는 방법 및 그 추출물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 잣기름으로부터 피놀레닌산 고함유 지방산을 효과적으로 추출함으로써 이렇게 추출된 피놀레닌산 고함유 지방산 추출물을 고지혈증 치료 및 예방용 의약품 또는 기능성 식품의 소재로 이용할 수 있다.

Description

피놀레닌산 고함유 지방산 추출물 및 잣기름으로부터의 선택적 추출방법{Fatty acids extract comprising high content of pinolenic acid and method of selective extraction of pinolenic acid from pine-seed oil}

도 1은 5,9,12-C18:3 / C18:0 비율 잣 추출물의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 2는 에탄올로 추출된 대조군 및 요소/지방산 비율별 결정화된 잣 추출물의 지방산 조성비를 나타낸 그래프이다.

도 3은 메탄올로 추출된 대조군 및 요소/지방산 비율별 결정화된 잣 추출물의 지방산 조성비를 나타낸 그래프이다.

도 4는 HepG2 세포에서 세포-연합된(cell-associated), 결합된(bound) 및 내포된(internalized) DiI-LDL의 투여량-응답(Dose-response)를 측정한 그래프이다.

잣(pine seed)은 잣나무(Pinus koraiensis)의 열매로서, 잣에는 지방 64.2%, 단백질 18.6%, 수분 5.5%, 당질 4.3%, 회분 1.5%, 기타 섬유질, 칼슘, 인, 철분, 비타민(A1, B1, B2)이 들어 있는데, 잣 100 g에 대하여 670 칼로리 정도의 열량을 각고 있는 고칼로리 식품이다. 또한, 잣에는 비타민 B가 풍부하고 호도나 땅콩에 비해 철분이 많이 함유되어 있어 빈혈 치료와 예방에도 효과가 있으며, 잣이 지니고 있는 성분중 가장 중요한 것은 자양강장제의 역할을 하는 우수한 지방 성분으로서 잣에 함유된 지방은 올레닌산과 리놀산, 리놀레인산 등 불포화지방산으로 이루어져 있는데 이들 불포화 지방산은 동물성 지방과는 달리 혈액 속의 콜레스테롤 함량을 감소시키므로 동맥경화증은 물론 고혈압 등 각종 성인병을 예방하는 효과에도 영향을 미친다. 그리고 잣을 이용하여 죽을 만들어 섭취하게 되면 폐와 내장의 기능을 튼튼하게 해주기 때문에 기관지염 등 각종 노인성 질환을 예방하는데 좋으며, 노화현상에 대해서 좋은 약용식품으로 작용하기도 한다.

피놀레닌산(pinolenic acid, 5-cis,9-cis,12-cis-octadecatrienoic acid)은 잣나무에서 많이 발견되는 다불포화 지방산(polyunsaturated fatty acid)과 같은 활성 기능을 갖는 독특한 성분이다. 피놀레닌산은 그 특별한 화학적 구조로 인해 PGE로 전환될 수 없기 때문에 다른 다불포화 지방산보다 인체에 더욱 안전하다. 피놀레닌산은 혈중 콜레스테롤을 감소시키고, 혈소판의 응집을 저해하며, 혈압을 저하시킨다고 보고되고 있다. 그러나, 피놀레닌산에 대한 구체적인 연구에 대한 보고는 알려진 바가 많지 않다. 가스크로마토그래피를 이용하여 잣오일에 대한 지방산을 분석해 본 결과 미지의 지방산이 발견되어 조사해 본 결과 5-olefin계 지방산이고 일반 식물성 기름이나 동물성 기름 등에는 없는 아주 특이한 지방산으로 한 국산 잣 지방질의 주용 지방산으로 지방질 대사에 중요한 역할을 할 것이라고 보고된 바 있다. 이와 같은 5-olefin계 지방산으로 보고된 잣지질의 특이 지방산이 리놀레산이나 리놀렌산에 비하여 흰쥐의 혈중 콜레스테롤을 저하시키는 실험에 있어서 효과적이라는 연구 보고가 있는 정도이나, 잣에서 헥산 추출물로 잣오일을 제조한 후, 동물실험을 한 경우가 기존에 해왔던 연구이다. 따라서 본 발명에서는 5-olefin계 지방산으로 말할 수 있는 피놀레닌산을 고농도로 농축하기 위하여 요소 부가법을 이용하여 고함유 농축물을 제조한 것이다.

기존의 잣기름 추출은 종피를 제거한 잣을 마쇄한 후, 헥산을 가하여 실온에서 2시간 정도 진탕하면서 추출하는 방법은 반복하여 여과시켜 농축하여 이를 시료로 사용하는 방법을 가장 많이 이용하고 있다. 이와 같은 방법으로 추출한 잣기름을 이용하여 여기서 다시 지방산 추출만을 한 다음 잣기름에 포함되어 있는 지방산 종류 및 함량을 측정할 경우, 고농도의 피놀레닌산을 얻을 수가 없었다 (Wolff et al., Fatty acid composition of some pine seed oils. JAOCS, vol. 72, no. 9, pp. 1043-1046 (1995); Wolff et al., Frederique Pedrono, Elodie Pasquier, and Anne M. Marpeau. General characteristics of pinus spp. Seed fatty acid compositions, and lmportance od 5-olefinic acids in the taxonomy and phylogeny of the genus. Lipids, vol. 35, no. 1, pp. 1-22 (2000)) 따라서 각종 기능성 식품 및 의약품에 필요한 피놀레닌산 고함유 농축물을 얻기에는 문제가 있었다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 잣오일을 요소 부가법(Urea complexation method)를 이용하여 결정화(crystallization)하는 경우, 잣기름으로부터 고농도의 피놀레닌산의 선택적으로 추출할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 특이 지방산인 피놀레닌산을 고농도로 함유하는 지방산 추출물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 잣기름으로부터 고농도의 피놀레닌산을 선택적으로 추출하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 지방산 추출물을 함유하는 고지혈증 치료제 또는 기능성식품을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 잣오일(Pine-seed oil)에서 분리된 지방산(fatty acids)을 요소 부가법(Urea complexation method)를 이용하여 결정화(Crystallization)하여 제조되는 것을 특징으로 하는 피놀레닌산 고함유 지방산 추출물을 제공한다.

본 발명의 지방산 추출물에 있어서, 상기 잣오일은 종래 알려진 헥산 추출법에 따라 잣의 종자로부터 추출하고, 상기 지방산은 잣오일로부터 종래 알려진 추출방법에 따라 에탄올로 환유가열후 헥산 추출을 이용하여 분리할 수 있으나(Wolff et al., Fatty acid composition of some pine seed oils. JAOCS, vol. 72, no. 9, pp. 1043-1046 (1995)), 바람직하게는 잣오일에 92-97% ethanol 용액 1-1.5 N NaOH 를 가하여 20-40분간 환유 가열(refluxing heating)한 후, 분액 깔대기에 옮겨서 1.5-2.5 N HCl을 가하여 진탕(shaking)시킨 다음 n-hexane를 가하여 방치하여 분리시킨 후, H₂O를 가하여 중성화시켜 이를 황산나트륨(sodium sulfate)을 이용하여 여과한 다음 35-45℃수조에서 감압 농축함으로써 분리되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 지방산 추출물에 있어서, 상기 요소 부가법(Urea complexation method)은 종래 알려진 방법을 이용할 수 있으나(Hayes et al., Urea Complexation for the rapid, ecologically responsible fraction of fatty acids from sdeed oil. JAOCS, vol 75, pp. 1403-1409 (1998)), 바람직하게는 상기 분리된 지방산에 요소(urea)를 1:1 내지 1:3의 비율(w/w)로 혼합한 다음 에탄올(EtOH) 또는 메탄올(MeOH)를 일정량 가한 후, 15-30분간 환류 가열(refluxing heating)을 하고 이것을 냉각한 다음 4℃ 냉장고에서 12-36시간 방치한 뒤, 결정화된 상태를 진탕(shaking)하여 여과한 여액을 35-45℃ 수조에서 감압 농축한 다음, 5-7N hot HCl를 일정량 가하여 결정된 것을 용해시켜 이를 분액 깔대기에 다시 옮겨 일정량의 n-hexane를 가한 뒤, 진탕하여 분리시킨 후, H₂O를 가하여 이를 중성화 시켜 이를 황산나트륨(sodium sulfate)을 이용하여 여과한 다음 35-45℃ 수조에서 감압 농축하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 잣오일(Pine-seed oil)에서 분리된 지방산(fatty acids)을 요소 부가법(Urea complexation method)를 이용하여 결정화(Crystallization)하는 것을 포함하는 잣기름 내 피놀레닌산의 선택 적 추출방법을 제공한다.

본 발명의 추출방법에 있어서, 상기 요소 부가법(Urea complexation method)은 종래 알려진 방법을 이용할 수 있으나(Hayes et al., Urea Complexation for the rapid, ecologically responsible fraction of fatty acids from sdeed oil. JAOCS, vol 75, pp. 1403-1409 (1998)), 바람직하게는 상기 분리된 지방산에 요소(urea)를 1:1 내지 1:3의 비율(w/w)로 혼합한 다음 에탄올(EtOH) 또는 메탄올(MeOH)를 일정량 가한 후, 15-30분간 환류 가열(refluxing heating)을 하고 이것을 냉각한 다음 4℃ 냉장고에서 12-36시간 방치한 뒤, 결정화된 상태를 진탕(shaking)하여 여과한 여액을 35-45℃ 수조에서 감압 농축한 다음, 5-7N hot HCl를 일정량 가하여 결정된 것을 용해시켜 이를 분액 깔대기에 다시 옮겨 일정량의 n-hexane를 가한 뒤, 진탕하여 분리시킨 후, H₂O를 가하여 이를 중성화 시켜 이를 황산나트륨(sodium sulfate)을 이용하여 여과한 다음 35-45℃ 수조에서 감압 농축하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 피놀레닌산 고함유 지방산 추출물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 치료제를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 피놀레닌산 고함유 지방산 추출물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 개선 기능성 식품을 제공한다.

본 발명의 고지혈증 치료제 또는 기능성 식품에 있어서, 간세포의 LDL-Receptor에 작용하여 LDL(Low-density lipoproteins)의 흡수(uptake)를 촉진함으로써 고지혈증 개선 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서는 HepG2 cell을 이용하여 LDL 흡수 효과를 확인하였다.

본 발명에 있어서, 피놀레닌산 고함유 지방산 추출물에는, 잣기름으로부터 요소 부가법으로 추출 및 정제되는 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액 및 정제물, 그 희석액 또는 농축액, 또는 그 건조물 중 어느 하나도 포함하는 것으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 잣기름으로부터 지방산을 추출하는 사용될 수 있는 추출용매로는, 예컨대, 메탄올, 에탄올, 프로필알콜, 이소프로필알콜 등의 탄소수1~5의 저급알콜;아세톤, 메틸에틸케톤 등의 저급지방족케톤; 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린 등의 탄소수 2~5의 다가알콜, 헥산 등을 들 수 있고, 이들 유기용매와 물과의 혼합용액 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 원료인 피놀레닌산 고함유 지방산 추출물은 당업계에 알려진 통상의 방법에 의해 과립, 정제, 캡슐 또는 드링크제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 또한, 보존이나 취급을 용이하게 하기 위하여 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 통상 제제화에 사용되는 캐리어, 그 밖의 임의의 조제를 부가하여도 좋다. 또한, 식품 또는 약물에 통상적으로 첨가되는 보조적인 원료 또는 첨가물로는 특히 제한되지 않으나, 예컨대, 포도당, 과당, 자당, 말토오스, 솔비톨, 스테비오사이드, 롭소사이드, 콘시럽, 유당, 구연산, 주석산, 사과산, 호박산, 유산, L-아스코르빈산, d1-α-토코페롤, 엘리솔빈산 나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 글리세린지방산 에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 자당지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, 아라비아껌, 칼라기난, 카제인, 젤라틴, 펙틴, 한천, 비타민 B류, 니코틴산 아미드, 팬트텐산 칼슘, 아미노산류, 칼슘염류, 색소, 향료, 보존제 등을 들 수 있다.

본 발명의 지방산 추출물은 과립, 정제 또는 캡슐형태의 기능성 식품의 경우에는 통상 0.1~100질량%, 바람직하기로는 5~100질량%의 범위에서 첨가하면 된다.

또한, 본 발명의 피놀레닌산 고함유 지방산 추출물은, 성인 하루당 섭취량이 1~3000mg이 되도록 투여하는 것이 적당하다. 또한, 투여량은 연령, 증상 등에 따라 적당히 증감하는 것이 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

본 실험에 사용한 분석용 화학시약, 용매 및 potassium hydroxide과 fatty acid 표준물질은 Sigma사로부터 구입하였다.

실시예 1: 잣오일(Pine-seed oil) 제조

본 실험에 사용된 잣(Pine koraiensis seed)은 농협 중앙에서 판매하는 것을 구입하여 사용하였다. 잣으로부터 기름을 추출하기 위한 방법으로는 우선, pine-seed(0.2 kg)에 5배량의 n-hexane(1 L, 1:5, w/v)을 가하여 Waring blender에서 2분간 균질화 시킨 후, 실온 암소에서 교반하면서 12시간씩 3회 반복 추출하였으며, 추출된 시료를 여과한 여액을 합하여 40℃수조에서 감압 농축하여 질소를 이용하여 남아있는 n-hexane 을 제거한 뒤, 냉동 보관하면서 시료로 사용하였다.

실시예 2: 잣오일(Pine-seed oil)에서 지방산(fatty acids) 제조

Pine-seed oil에서 fatty acids를 분리하기 위하여 추출한 시료를 일정량 (5 g) 이용하여 95% ethanol solution 1.25 N NaOH(500 ml)를 가하여 30분간refluxing heating한 후, 분액 깔대기에 옮겨서 2 N HCl을 가하여 shaking시킨 다음 n-hexane를 가하여 방치하여 분리시킨 후, H2O를 가하여 중성화시켜 이를 sodium sulfate를 이용하여 여과한 다음 40oC수조에서 감압 농축하고 남아있는 용매를 질소로 제거하여 순수 fatty acids를 분리한다.

실시예 3: 결정화(Crystallization)

요소 부가법(Urea complexation method)를 이용하여 pinolenic acid 고함유 지방산(high pinolenic acid-containing fatty acid extract(HPAFAE)를 제조하는데 첫 번째 방법으로, pine-seed oil에서 추출한fatty acid에 urea를 fatty acids에 대한 비율로(fatty acid:urea 1:1, 1;2, 1:3, w/w) 혼합한 다음 각각의 두 가지 종류의 용매(EtOH, MeOH)를 일정량 가한 후, 20분간 refluxing heating을 하고 이것을 냉각한 다음 4℃ 냉장고에서 24시간 방치한 뒤, 결정화된 상태를 shaking하여 여과한 여액을 40℃ 수조에서 감압 농축한 것에 6N hot HCl를 일정량 가하여 결정된 것을 용해시켜 이를 분액 깔대기에 다시 옮겨 일정량의 n-hexane를 가한 뒤, shaking하여 분리시킨 다음, H₂O를 가하여 이를 중성화 시켜 또 다시 sodium sulfate를 이용하여 여과한 다음 40℃ 수조에서 감압 농축하여 잔존하는 H₂O를 aceton을 소량 가하여 제거한 후, 질소로 남아있는 용매를 제거하여 순수 fatty acids를 분리한다.

실시예 4: 가스크로마토그래피(GC) 분석

Gas-Chromatograph를 이용하여 urea complexation method에서 얻은 fatty acids 중 pine-seed oil에 포함되어 있는 fatty acids의 종류와 pinoleic acid의 고함유 지방산을 분석하기 위해 우선 urea complexation method를 이용하여 얻어진 fatty acids를 methylation 시키는 과정을 거친다. 일정량의 시료에 0.5N NaOH(methyl alcohol solution)를 가하여 10분간 boiling한 후, 냉각하여 3 ml 정도의 BF₃(boron trifluoride)를 가해서 다시 10분간 boiling한 다음, 냉각 후 saturated NaCl solution을 5 ml 가한다. 여기에 다시 2 ml 정도의 n-hexane을 가하여 분리되면 상층액만을 취하여 sodium sulfate를 이용하여 H₂O를 제거한 뒤 gas-chromatograph (Varian3800: Varian Inc., Walnut Creek, CA)을 이용하여 fatty acids를 분석한다.

Pine-seed oil에 존재하는 fatty acid가 urea complexation법에 의해서 urea crystalization이 되는 과정에 있어서 18:0과 5,9,12-18:3의 fatty acid의 비율로 불포화되는 과정을 알아본 결과, urea 함량이 증가할수록 crystalization되어 회수되는 불포화 지방산의 함량은 증가된다는 결과를 알 수 있었다 (도 1).

Fatty acid Profile에 있어서 pine-seed oil에 urea complexation법을 처리한 결과 pine-seed oil에 존재하는 모든 fatty acid 종류에 대하여 yield of total oil(%)는 초기 fatty acid와 비교해 보았을 때, 첫 번째로 urea complexation법을 처리한 결과 urea와 fatty acid의 비율(urea:fatty acid=1:1, 2:1, 3:1)과 EtOH(ethlyl alcohol)용매를 이용한 경우, urea의 함량이 증가할수록 yield of total oil(%)는 감소하는 경향을 나타내었으나, yield of total 5,9,12-18:3(pinolenic acid)에 대한 함량은 초기 pine-seed oil에서의 함량 14.05%에서 45.05%로 약 3.2배 증가하는 경향을 나타내었다 (도 2).

두 번째로 urea complexation법을 처리한 결과 urea와 fatty acid의 비율(urea:fatty acid=1:1, 2:1, 3:1)과 MeOH(methyl alcohol)용매를 이용한 경우, urea 함량이 증가할수록 EtOH(ethlyl alcohol)용매를 이용한 경우와 마찬가지로 모든 종류의 fatty acid에 대하여 yield of total oil(%)는 감소하는 경향을 나타내었으나, yield of total 5,9,12-18:3(pinolenic acid)에 대한 함량은 초기 pine-seed oil에서의 함량 14.05%에서 33.57%로 약 2.4배 증가하였다 (도 3).

따라서, 용매(ethlyl alcohol, methyl alcohol)별 pine-seed oil에서의 yield of total 5,9,12-18:3(pinolenic acid)의 함량을 비교해 보면, EtOH(ethlyl alcohol)를 사용한 경우, 3.2배 증가하였고, MeOH(methyl alcohol)를 이용한 경우에는 2.4배 정도 증가경향을 나타내었으므로 5,9,12-18:3(pinolenic acid)의 yield를 증가시키기 위해서는 MeOH을 이용한 추출보다는 EtOH를 이용하여 추출하는 것이 pine-seed oil에서의 yield of total 5,9,12-18:3(pinolenic acid)함령을 증가시키는데 효율적이라고 사료된다 (표 1).

[표 1]

Urea crystallization of FA prepared from pine seed oil

a For urea crytallization procedure see material and methods. LPAFAE, low pinolenic acid-containing FA extract; EtOH, ethanol; MeOH, methanol.

b UFR-EtOH, UFR in EtOH as a solvent; UFR-MeOH, UFR in MeOH as a solvent;

UFR, Urea to FA ratio.

c Weight % based on the original FA.

d Recovery of pinolenic acid based on the initial contents in FA. n.d= not detected.

실시예 5: HepG2 cell에서의 LDL uptake 효과 시험

1) Low-density lipoproteins (LDL) 제조

LDL제조는 혈액을 신선한 상태로 채취하고 합쳐진 plasma 시료 (250 ml)로부터 분리하였다. 분리된 LDL은 iodixanol (OptiPrepTM, Axis-Shield PoC AS, Norway)을 이용하여 n-LDL을 제조하였다. 즉, plasma와 50%의 iodixanol을 3:1의 비율로 혼합하여 최종 iodixanol의 농도가 12.5% (w/v)가 되도록 하였으며, cusion 용액인 20% (w/v) iodixanol 용액은 buffer saline과 함께 제조하여 tube에 0.5 ml씩 가한 후, plasma와 iodixanol 혼합액을 원심 분리 (33,000 ｘg, 4℃, 3hr)하여 n-LDL을 추출할 수 있었다.

2) LDL-labeling 제조

LDL-labeling은 제조된 n-LDL을 48시간 동안 dialysis 시킨 후, Lowery protein assay법을 이용하여 LDL의단백질을 정량하고 그 결과에 따라 fluorescent probe인 DiI (Molecular probe, Eugene, OR) stock solution을 30 mg의 DiI(3.3-dioctadecylindocarbocyanine)를 1 ml의 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 만들고 LDL과 혼합하였다 (DiI: LDL protein = 300㎍ : 1 mg). 혼합용액은 Dil-LDL을 만들기 위해 37℃에서 빛을 차단한 상태로 18시간 방치하고, 원심 분리하여 (33,000 ｘg, 4℃, 3hr) 다시분리한다. 그 다음 PBS (Phosphate-buffer saline)로 4℃에서 18시간 투석한 후 여과하여 단백질 농도를 측정하였다.이와 같이 제조된 Dil-LDL은 암소 (4℃) 에서 저장하고 이를 7일 내로 사용하였다.

3) HepG2 cell에 의한 six-well 배양

HepG2 cell의 배양은 CO2 incubator에서 배양중인T-25 tube의 HepG2 cell (American Type Culture Collection, USA)이 70~80%정도 자랐을 때 subculture를 하는데 먼저 MEM (+)을 제거하고 pasteur pipette를 사용하여 HBSS (Hank's balanced salt solution, 1)를 2회 가하여 흔들어서 2회 닦아낸 후 0.7 ml trypsin을 넣어주고 골고루 흔든 후 CO2 incubator에서 8분 동안 보관하고, 새로운 T-25를 준비하여 HepG2의 passage 숫자, 날짜를 기록 후 MEM (+) 2 ml씩 미리 넣어서 혼합한 다음, 8분 동안 배양한 것에pasteur pippet을 사용하여 MEM (+)을 신속히 2 ml씩 3회 정도 넣고 하얗게 풀릴 때까지 세척하였다. 15 ml tube에 옮겨 원심분리 (600 rpm, 3 min)한 후, 상등액을 제거하였다. 그리고 MEM (+)을 정확히1 ml가하고 침전물 부분의 cell과 혼합한 후 2 ml의 MEM (+) 더 가하여 다시 혼합한 뒤 그대로 1 ml씩 준비한 T-25에 넣고 cell이 잘 퍼지도록 흔들어준 다음 CO2 incubator에서 subculture를 하였다. Six-well은 위의 HepG2 cell을 원심분리 후 상등액을 제거하고 MEM (+)을 정확히1 ml가하고 침전물 부분의cell과 섞어준 후 MEM (+)을 사용하여 약 10~20배 희석시켜 2.5ㅧ10⁵ cell/well로 세포수를 조절하여 six-well plate에 각각 분주하였다. 분주한 세포가 약70~80% 자랐을 때 MEM (-)에 7.5% albumin을 혼합하여 medium으로 가하고 24시간 후에 처리하였다.

4) Pinolenic acid 농축물 처리에 따른HepG2 cell에서의 DiI-LDL uptake

Pine seed oil에 함유된 pinolenic acid 농축물 처리에 따른 HepG2 cell에서 의 DiI-LDL uptake의 대한 효과를 살펴보기 위해서는 우선 LDL에 DiI 형광물질을 binding시킨 시료의 단백질 함량을 측정하여 그 함량에 따라서 농도를 조절하여 70% 이상 cell이 자란 six-well plate에 pinolenic acid extract (PAE)(실시예2)과 pinolenic acid concentrate (PAC)(실시예3) 및 Fatty acid-free한 BSA를 각각 pinolenic acid의 두 가지 종류 fatty acid (20 μmole)와 5 μmole의 BSA를 1:4로 혼합하여 처리한 후, 4, 37℃에서 2시간 동안 incubation한 다음, 다시 단백질 함량이 구해진 DiI-LDL을 농도별로 처리하여 다시 2시간 동안 배양하였다. 배양한 후, plate의 medium 부분을 제거하고, 200㎕씩 2회 1PBS를 가하여 washing을 한 다음 2 ml의 isopropanol을 가하여 15분 동안 shaking을 하여 plate의 cell을 collect하고 이를 원심분리 (3,000 rpm, 15 min, 4℃) 하였다. 그 다음 상등액 부분을 취하여 형광광도계를 이용하여 Excitation (522 nm)와 Emission (564 nm)에서fluorescence를 측정하고, 침전물 부분에 대해서는 2 N NaOH를 50 ㎕를 가하여 mixing하고 거기에 200㎕의 증류수를 가하여 다시 mixing 한 다음, 그 중 50 ㎕를 취하여 Lowry assay법으로 단백질 함량을 측정하였다.

Pinolenic acid extract (PAE)과 Pinolenic acid concentrate (PAC) 및 Fatty acid-free한 bovine serum albumin (BSA)를 HepG2 cell을 이용한 six-well에 DiI-LDL을 60 ㎍/ml의 농도로 처리하여 4, 37℃에서 incubation 하여 최종적으로 구한 specific activity에 대한 결과를 살펴보면 도 4과 같다. 도 4는 HepG2 세포에서 세포-연합된(cell-associated), 결합된(bound) 및 내포된(internalized) DiI-LDL의 투여량-응답(Dose-response)를 측정한 그래프이다. 세포를 배양물이 70-80% confluent될 때까지 37℃에서 10% BSA를 함유하는 MEM에서 배양하고, 배지를 추가 24h동안 7.5% FA-free BSA를 함유하는 MEM로 치환하고, 그 후 세포를 4 또는 37℃에서 2h동안 MEM에서 30, 60 및 90 g/mL의 DiI-LDL로 배양하였다. 값은 mean SD (n=3)이고 LDL(ng)/cell protein(mg)로 표현하였다. 우선, 4℃에서 none상태, LPAFAE 및 HPAFAE 처리경우 각각 DiI-LDL 최대 농도처리 (60 ㎍/ml) 에 대해서 65.1, 74.8 및 66.3ng/mg cell protein의 결과를 나타내어 LPAFAE이 surface binding에 영향을 미침을 알 수 있었으나, 37℃에 대한 결과에서는 DiI-LDL 최대 농도처리 (60 ㎍/ml)에 대하여 92.2, 100 및 113.3 ng/mg cell protein의 결과를 나타내면서 HPAFAE에 대한 영향이 가장 컸음을 나타내고 있다(표 2).

[표 2]

Cell-Associated, Bound and Internalized DiI-LDL in HepG2 Cells Treated with HPAFAE and LPAFAEa

aValues presented as mean SD (n=3). Letters sharing different superscript letters in the same row are significantly different (p<0.05). DiI-LDL; 3,3'- dioctadecylindocarbocyanine -LDL; LPAFAE, low pinolenic acid-containing FA extract; HPAFAE, high pinolenic acid-containing FA extrac

다시 말해서 이와 같은 결과는 즉, pinolenic acid의 농축물을 처리한 경우 cell에 대하여 surface binding보다는 internalization되는데 더 큰 영향을 미침을 알 수 있으며, 모든 fatty acid를 처리했을 경우 처리하지 않은 경우에 비하여 DiI-LDL이 cell내로 더 많이 internalization 되어 cell에 uptake되는 효과가 있음을 알 수 있었다. 또한, 실험에 사용한 fatty acid 중에서 pine seed oil에 함유된 pinolenic acid 추출물보다는 농축물에 대한 cell에서의 DiI-LDL uptake가 더 많이 증가됨을 알 수 있었다.

실시예 6: 지방산 추출물의 제제화 (정제)

하기의 배합의 정제를 통상의 타정기에 의해 제조하였다.

실시예 3의 지방산추출물의 분말 20질량부

덱스트린 72질량부

분당(粉糖) 80질량부

글리세린지방산에스테르 8질량부

원료의 혼합과 타정은 용이하고, 정미가 양호한 정제가 얻어졌다.

실시예 7: 지방산 추출물의 제제화 (갭슐제)

통상의 방법에 의해, 이하의 조성을 갖는 캡슐제를 제조하였다. 또한, 캡슐에는 1호 하드젤라틴캡슐을 사용하였다.

<1캡슐(1정 200mg)중의 조성>

실시예 3의 지방산추출물의 분말 5mg

콘스타치 60.0mg

유당 100.0mg

유산칼슘 10.0mg

하이드록시프로필셀룰로오스(HPC-L) 10.0mg

실시예 8: 지방산 추출물의 제제화 (과립)

통상의 방법에 의해, 하기의 배합의 인스턴트티 과립을 유동층조립기에 의해 제조하였다.

실시예 3의 지방산추출물의 분말 20질량부

올리고당 40질량부

구연산 50질량부

설탕 50질량부

덱스트린 810질량부

원료의 혼합과 유동층조립기에 의한 과립화는 용이하며, 정미가 양호한 인스턴트티과립이 얻어졌다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 잣기름으로부터 피놀레닌산 고함유 지방산을 효과적으로 추출함으로써 이렇게 추출된 피놀레닌산 고함유 지방산 추출물을 고지혈증 치료 및 예방용 의약품 또는 기능성 식품의 소재로 이용할 수 있다.

Claims

잣오일(Pine-seed oil)에서 분리된 지방산(fatty acids)을 요소 부가법(Urea complexation method)를 이용하여 결정화(Crystallization)하여 제조되는 것을 특징으로 하는 피놀레닌산 고함유 지방산 추출물.
제 1항에 있어서, 상기 지방산은 잣오일에 92-97% ethanol 용액 1-1.5 N NaOH를 가하여 20-40분간 환유 가열(refluxing heating)한 후, 분액 깔대기에 옮겨서 1.5-2.5 N HCl을 가하여 진탕(shaking)시킨 다음 n-hexane를 가하여 방치하여 분리시킨 후, H₂O를 가하여 중성화시켜 이를 황산나트륨(sodium sulfate)을 이용하여 여과한 다음 35-45℃수조에서 감압 농축함으로써 분리되는 것을 특징으로 하는 피놀레닌산 고함유 지방산 추출물.
제 1항에 있어서, 상기 요소 부가법은 상기 분리된 지방산에 요소(urea)를 1:1 내지 1:3의 비율(w/w)로 혼합한 다음 에탄올(EtOH) 또는 메탄올(MeOH)를 일정량 가한 후, 15-30분간 환류 가열(refluxing heating)을 하고 이것을 냉각한 다음 4℃ 냉장고에서 12-36시간 방치한 뒤, 결정화된 상태를 진탕(shaking)하여 여과한 여액을 35-45℃ 수조에서 감압 농축한 다음, 5-7N hot HCl를 일정량 가하여 결정된 것을 용해시켜 이를 분액 깔대기에 다시 옮겨 일정량의 n-hexane를 가한 뒤, 진탕 하여 분리시킨 후, H₂O를 가하여 이를 중성화 시켜 이를 황산나트륨(sodium sulfate)을 이용하여 여과한 다음 35-45℃ 수조에서 감압 농축하는 것을 특징으로 하는 피놀레닌산 고함유 지방산 추출물.
잣오일(Pine-seed oil)에서 분리된 지방산(fatty acids)을 요소 부가법(Urea complexation method)를 이용하여 결정화(Crystallization)하는 것을 포함하는 잣기름 내 피놀레닌산의 선택적 추출방법.
제 4항에 있어서, 상기 요소 부가법은 상기 분리된 지방산에 요소(urea)를 1:1 내지 1:3의 비율(w/w)로 혼합한 다음 에탄올(EtOH) 또는 메탄올(MeOH)를 일정량 가한 후, 15-30분간 환류 가열(refluxing heating)을 하고 이것을 냉각한 다음 4℃ 냉장고에서 12-36시간 방치한 뒤, 결정화된 상태를 진탕(shaking)하여 여과한 여액을 35-45℃ 수조에서 감압 농축한 다음, 5-7N hot HCl를 일정량 가하여 결정된 것을 용해시켜 이를 분액 깔대기에 다시 옮겨 일정량의 n-hexane를 가한 뒤, 진탕하여 분리시킨 후, H₂O를 가하여 이를 중성화 시켜 이를 황산나트륨(sodium sulfate)을 이용하여 여과한 다음 35-45℃ 수조에서 감압 농축하는 것을 특징으로 하는 피놀레닌산 고함유 페놀레신산의 선택적 추출방법.
제 1항 내지 제 3항중 어느 한항에 따른 피놀레닌산 고함유 지방산 추출물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 치료제.
제 1항 내지 제 3항중 어느 한항에 따른 피놀레닌산 고함유 지방산 추출물을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 개선 기능성 식품.