KR101944295B1

KR101944295B1 - 헛개나무 열매 추출 발효물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101944295B1
Application number: KR1020170094100A
Authority: KR
Inventors: 이삼빈; 윤웅규; 박승춘; 이승진; 박나혜; 임종순
Original assignee: 계명대학교 산학협력단; 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2017-07-25
Filing date: 2017-07-25
Publication date: 2019-01-31

Abstract

본 발명은 헛개나무 열매 추출 발효물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에서는 헛개나무 열매 추출물을 고초균으로 1차 발효 후, 젖산균으로 2차 발효하여 혼합 발효물을 제조하였으며, 상기 발효물은 감마-폴리글루탐산(γ-PGA), 감마-아미노뷰티르산(GABA) 및 티로신을 생산하고, 많은 양의 점질물과 높은 점조도를 가지는 것을 확인하였다.
상기 발효물은 알코올에 의한 체중 감소를 개선시키고, 아스파라진산 아미노전이효소(AST) 및 알라닌 아미노전이효소(ALT) 활성을 감소시키며, 혈중 지질을 감소시킬 수 있다. 또한, 알코올 탈수소 효소, 항산화 효소 및 지방산 산화에 관여하는 단백질의 유전자 발현 증가 및 지방생성에 관여하는 단백질의 유전자 발현 억제를 통해 간 병변 및 지방증을 예방 및 억제하여 간 기능을 개선시킬 수 있는 바, 본 발명의 헛개나무 열매 추출 발효물은 기능성 소재로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

헛개나무 열매 추출 발효물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물 및 이의 제조방법{Composition for improving liver function comprising fermentation product of Hovenia dulcis fruit extract}

본 발명은 헛개나무 열매 추출 발효물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

과도한 알코올의 섭취는 간경화, 알콜성 간염, 지방증 등을 포함하는 간 손상을 야기하므로, 알코올성 간 손상은 지질 대사와 관련하여 연구되어 왔다. 흡수된 알코올은 간에서 5' 아데노신 모노포스페이트 활성화 단백질 키나아제(5’ adenosine monophosphate-activated protein kinase; AMPK), 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체-알파(peroxisome proliferator activated receptor-α; PPARα), 카르니틴 팔미토일 전환효소(carnitine palmitoyltransferase; CPT-1), 스테롤 조절인자 결합 단백질(sterol regulatory element binding protein; SREBP)-1c와 같은 다양한 효소에 의해 화학적 변형을 통해 분해된다. 특히, SREBP-1c는 지방산 및 트리글리세라이드(triglyceride) 합성에 관여하는 유전자를 활성화시켜 지질 대사를 조절하는 전사인자로서, 간에서 지방증의 발병 기전에 관여한다고 보고된 바 있다. 이들 효소는 알코올에 의해 인산화되거나 불활성화되며, 효소 활성의 변화는 간세포, 조직, 구조 및 기능에 결정적으로 영향을 미친다.

또한, 알코올은 간에서뿐만 아니라 장내 미생물의 불균형을 유발한다. 한 연구 결과에 따르면, 알코올 급여 마우스와 랫(rat)에서 프로바이오틱(probiotic) 박테리아를 제외한 장내 세균이 과증식 되었으며, 반면 락토바실러스(Lactobacillus), 페디오코쿠스(Pediococcus), 류코노스톡(Leuconostoc) 및 락토코쿠스(Lactococcus)를 포함한 프로바이오틱 박테리아의 비율이 감소하는 것을 보고한 바 있다. 과증식된 장내 세균은 섭취한 알코올로부터 대사 작용을 통해 지질 다당체(lipopolysaccharide; LPS), 아세트알데히드(acetaldehyde)와 같은 대사 산물을 방출하며, 이것은 장내 세포의 손상을 유발한다. 손상된 장벽에서 박테리아 대사 산물은 혈관을 통해 장에서 간으로 이동하며, 섭취한 알코올과 함께 간 손상을 악화시킨다. 따라서, 장내 미생물총(microbiome)의 안정화는 간 보호 효과를 향상시킬 것으로 기대된다.

전통적으로 약용식물은 약을 대신하여 간 기능을 개선시키는 용도로 사용되어 왔으며, 특히 아시아 지역의 전통 허브인 헛개(Hovenia dulcis)는 간장 보호 효과와 알코올 해독 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 특히 헛개는 페놀계 물질, 알칼로이드 및 플라보노이드를 함유하고 있어, 항염증, 항산화 및 면역개선 효과 뿐만 아니라 혈중 알코올 농도를 감소시키고, 알코올 분해대사에 관련된 효소의 활성을 증가시킨다고 보고된 바 있다.

따라서, 본 발명은 프로바이오틱 박테리아로 발효된 헛개 추출물을 이용하여 장내 미생물의 안정화를 유도하고, 종래 헛개 추출물보다 알코올로 섭취로 인한 간 손상 예방 및 간 기능 회복에 효과적인 방법을 제안하고자 한다.

대한민국 등록특허 제 10-1358944호(2014.01.28 등록)

본 발명의 목적은 헛개나무 열매 추출 발효물 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 헛개나무 열매 추출 발효물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 헛개나무 열매 추출물을 고초균 및 젖산균으로 발효시킨 발효물로서, 상기 발효물은 γ-폴리글루탐산(γ-poly glutamic acid; γ-PGA), 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA) 및 티로신 증진된 것을 특징으로 하는 헛개나무 열매 추출 발효물을 제공한다.

또한, 본 발명은 헛개나무 열매 농축액을 희석하고, 모노-소듐 γ-글루타메이트(mono-sodium γ-glutamate; MSG) 3 내지 8중량%를 첨가한 후, 멸균하여 헛개나무 열매 추출물을 제조하는 제 1단계; 상기 헛개나무 열매 추출물에 글루코즈 1 내지 5 중량%를 첨가하고, 고초균 스타터 농축액을 1 내지 10중량% 접종한 후, 배양하여 발효물을 제조하는 제 2단계; 및 상기 발효물에 글루코즈 1 내지 3 중량% 및 탈지유 1 내지 10 중량%를 첨가하고, 젖산균 스타터 농축액을 1 내지 5 중량% 접종한 후, 배양하여 혼합 발효물을 제조하는 제 3단계;를 포함하는 헛개나무 열매 추출 발효물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 헛개나무 열매 추출 발효물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 헛개나무 열매 추출물을 고초균으로 1차 발효 후, 젖산균으로 2차 발효하여 혼합 발효물을 제조하였으며, 상기 발효물은 감마-폴리글루탐산(γ-PGA), 감마-아미노뷰티르산(GABA) 및 티로신을 생산하고, 많은 양의 점질물과 높은 점조도를 가지는 것을 확인하였다.

상기 발효물은 알코올에 의한 체중 감소를 개선시키고, 아스파라진산 아미노전이효소(AST) 및 알라닌 아미노전이효소(ALT) 활성을 감소시키며, 혈중 지질을 감소시킬 수 있다. 또한, 알코올 탈수소 효소, 항산화 효소 및 지방산 산화에 관여하는 단백질의 유전자 발현 증가 및 지방생성에 관여하는 단백질의 유전자 발현 억제를 통해 간 병변 및 지방증을 예방 및 억제하여 간 기능을 개선시킬 수 있는 바, 본 발명의 헛개나무 열매 추출 발효물은 기능성 소재로서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 헛개 열매 추출 발효물의 제조 공정을 도시하여 나타낸 것이다.
도 2는 알코올 및 헛개 열매 추출 발효물을 이용한 동물실험 스케줄을 도시하여 나타낸 것이다.
도 3은 고초균 발효 중 글루코즈 농도에 따른 헛개 열매 추출 발효물의 생균수 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 고초균 및 젖산균 발효 중 탈지유 농도에 따른 헛개 열매 추출 혼합 발효물의 산도 및 pH 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 고초균 및 젖산균 발효 중 탈지유 농도에 따른 헛개 열매 추출 혼합 발효물의 생균수 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 고초균 발효 중 헛개 열매 추출 발효물의 점탄성 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 고초균 및 젖산균 발효 중 탈지유 농도에 따른 헛개 열매 추출 혼합 발효물의 티로신 함량을 나타낸 것이다.
도 8은 고초균 및 젖산균 발효 중 탈지유 농도에 따른 헛개 열매 추출 혼합 발효물의 감마-아미노뷰티르산(GABA) 함량을 나타낸 것이다.
도 9(a)는 헛개 열매 추출 발효물에 의한 간에서의 조직병리학적 변화를 나타낸 것이며, (b)는 (a)의 조직병리학적 변화를 간 병리 점수로 나타낸 것이다.
도 10은 알코올 대사에 관여하는 유전자 발현을 분석한 결과로 (a) 내지 (c)는 알코올 탈수소 효소(ADH1, ADH2, CAT), (d)는 알코올 대사 관련 단백질(CYP2E1), (e) 내지 (i)는 항산화 효소(SOD, GPx, PPAR, PGC, CRT), (j) 내지 (m)은 지방생성 관련 단백질(SERBP, FAS, SCD, ACC)의 유전자 발현을 나타낸 것이다.

본 발명의 발명자들은 고초균 및 젖산균으로 발효된 헛개 열매 추출 발효물이 알코올로 인한 체중 감소뿐만 아니라 혈중 지질 농도를 감소시키고, 알코올 탈수소에 관여하는 유전자 발현 증진 및 지방생성 억제를 통한 간 기능 개선 효과를 확인하며 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 헛개나무 열매 추출물을 고초균 및 젖산균으로 발효시킨 발효물로서, 상기 발효물은 γ-폴리글루탐산(γ-poly glutamic acid; γ-PGA), 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA) 및 티로신이 증진된 것을 특징으로 하는 헛개나무 열매 추출 발효물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 고초균은 바실러스 서브틸리스 HA(Bacillus subtilis HA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 젖산균은 락토바실러스 플랜타륨 EJ2014(Lactobacillus plantarum EJ2014)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 발효물은 알코올에 의한 체중 감소를 개선시키고, 아스파라진산 아미노전이효소(AST) 및 알라닌 아미노전이효소(ALT)의 활성을 감소시킬 수 있다.

또한, 저밀도 지단백질, 중성지방 및 유리 지방산을 감소시키고, 고밀도 지단백질을 증가시킬 수 있다.

또한, 알코올 탈수소 효소, 항산화 효소 및 지방산 산화에 관여하는 단백질의 유전자 발현을 증가시키고, 지방생성에 관여하는 단백질의 유전자 발현을 감소시켜 지방증 생성을 억제할 수 있다.

바람직하게는, 상기 알코올 탈수소효소는 알코올 탈수소효소 1(alcohol dehydrogenase 1; ADH1), 알코올 탈수소효소 2(ADH2) 및 과산화수소 분해효소(catalase; CAT)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 항산화 효소는 초과산화물 불균등화 효소(superoxide dismutase; SOD) 및 글루타치온 과산화효소(glutathione peroxidase; GPx)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 지방산 산화에 관여하는 단백질은 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체(peroxisome proliferator-activated receptor; PPAR), PPARγ 보조활성인자(PPARγ coactivator; PGC) 및 카르니틴 팔미토일 전환효소(carnitine palmitoyltransferase; CRT)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 지방생성에 관여하는 단백질은 스테롤 조절 인자 결합 단백질(sterol regulatory element-binding protein; SERBP), 지방산 합성효소(fatty acid synthase; FAS), 스테아로일-CoA 불포화효소(stearoyl-CoA desaturase; SCD) 및 아세틸-CoA 카복실화효소(acetyl-CoA carboxylase; ACC)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

또한, 본 발명은 상기 헛개나무 열매 추출 발효물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물인 경우, 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 식품첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 식품첨가물공전에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.

이때, 식품 조성물을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 조성물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.

본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

바람직하게는, 상기 제 2단계의 고초균은 바실러스 서브틸리스 HA(Bacillus subtilis HA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 제 2단계는 35 내지 48℃, 130 내지 200 rpm에서 1 내지 5일 동안 진탕 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 제 3단계의 젖산균은 락토바실러스 플랜타륨 EJ2014(Lactobacillus plantarum EJ2014)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 제 3단계는 25 내지 35℃에서 5일 내지 10일 동안 정치 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 헛개 열매 추출 발효물 제조

헛개나무 열매 농축액(Hovenia dulcis extract)은 천기누설 식품(Gapyeong, Korea)에서 구입하였다. 고초균 및 젖산균 발효 시, 감마-폴리글루탐산(gamma-poly glutamic acid; γ-PGA) 및 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA) 생성을 위하여 첨가한 부원료인 모노-소듐 γ-글루타메이트(mono-sodium γ-glutamate; MSG) 및 글루코즈(glucose)는 각각 야쿠리 퓨어 케미컬(Yakuri pure chemicals Co., LTD., Kyuto, Japan) 및 덕산약품공업(Duksan Pure Chemicals co., Ansan, Korea)에서 구입하였으며, 티로신 증진을 위해 첨가한 탈지유(skim milk)는 서울우유(seoul, Korea)에서 구입하였다.

헛개나무 열매 농축액은 두 배 희석하여 MSG 5 중량%를 첨가한 후, 고압멸균기(autoclave)를 이용하여 121℃에서 15분간 고압증기멸균시키고 방랭하였다. 그 후, 멸균된 글루코즈 3 중량%를 첨가하고, 고초균(Bacillus subtilis HA) 5 중량%를 접종하여 42℃, 160 rpm에서 3일 동안 진탕 배양하였다. 고초균 발효가 종료되면, 글루코즈 1.5 중량% 및 탈지유 5 중량%를 첨가하고, 젖산균(Lactobacillus plantarum EJ2014) 1 중량%를 접종하여 30℃에서 7일 동안 정치 배양하였다. 상기 헛개나무 추출 발효물의 제조방법은 도 1에 도시하여 나타내었다.

실시예 2 : 동물 실험

동물실험의 모든 실험 절차는 경북대학교 실험동물 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)의 승인 하에 수행되었다. C57BL/6N CrSlc 마우스(수컷, 체중 19 내지 23 g, 5주령)는 온도 25 ± 2℃, 습도 50 내지 60 % 및 12시간의 명암주기 하에서 사육하였다.

하기 표 1 및 도 2와 같이, 마우스는 군 당 8마리씩 한 개의 사육장(cage)에 배치하였으며, 알코올 급여 실험에 일반적으로 사용되는 액상 타입의 Lieber DeCarli Diet 사료를 급여하였다. 정상 대조군(normal control; NRC)에는 Lieber DeCarli Control Diet를 급여하였고, 음성 대조군(negative control; NC)에는 Lieber DeCarli Ethanol Diet(3% EtOH)를 급여하였으며, 양성 대조군(positive control; PC)에는 발효하지 않은 0.3% 헛개 추출물을 함유하는 Lieber DeCarli Ethanol Diet(3% EtOH)를 급여하였다. A 및 B군은 각각 0.1% 및 0.3% 헛개 추출 발효물을 함유하는 Lieber DeCarli Ethanol Diet(3% EtOH)를 급여하였다.

모든 군은 4주 동안 사료를 급여하였으며, 사료 섭취량은 1일 1회 확인하고, 마우스의 체중은 3일 1회 측정하여 기록하였다.

실험 종료 후, 모든 마우스는 안락사하여 심장에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 4℃에서 5,000 rpm으로 5분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였다.

또한, 안락사 후 신장, 간, 비장을 분리하여 각각의 무게를 측정하였고, 간 조직의 절반은 조직병리학적 분석을 위해 포름알데히드(formaldehyde)로 고정시켜 보존하고, 나머지 절반을 RNA 추출을 위해 -80℃ 냉동고에 보관하였다.

실시예 3 : 생화학 분석

간 손상 지표로 사용되는 아스파라진산 아미노전이효소(aspartate aminotransferase; AST) 및 알라닌 아미노전이효소(alanine aminotransferase; ALT) 활성을 측정하여 간 손상 정도를 분석하였다.

또한, 혈중 지질 분석을 위해, 저밀도 지단백질(low density lipoprotein; LDL), 고밀도 지단백질(high density lipoprotein; HDL), 중성 지방(triglyceride; TG) 및 유리 지방산(free fatty acid)은 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)을 이용하여 농도를 측정하였다. 실험에 사용된 ELISA 키트는 AST, ALT, LDL, HDL 및 유리 지방산의 경우, Sigma-Aldrich Co. LLC.(St. Louis, MO 63103, USA) 제품을 사용하였고, TG의 경우, abcam(Cambridge CB4 OF4, United Kingdom) 제품을 사용하였다.

실시예 4 : 조직병리학적 분석

마우스 간 조직은 10% 포르말린(formalin)으로 고정하고, 에탄올(50 내지 100%)을 이용하여 탈수 과정을 거친 다음, 자일렌(xylene)으로 세척하고, 파라핀에 포매(embedding)하여 블록을 제작하였다. 파라핀 블록은 4 내지 5 μm 두께로 절단하여 조직 슬라이드를 만들고, 헤마톡실린 & 에오신(hematoxylin & eosin; H&E)으로 염색한 후, 현미경(DIXI3000, Leica, Wetzlar, Germany)을 이용하여 조직병리학적 변화를 분석하였다.

간에서 조직의 괴사, 염증 및 지방 변성의 정도와 같은 주요 병리학적 변화는 병변의 정도에 따라 0 내지 4의 점수로 채점하였다(0: 이상 없음, 1: 미세한 변화, 2: 경증, 3: 중등도, 4: 중증). 도출된 점수는 병리학적 변화의 중요성에 따라 다음과 같은 가중치를 곱하였고(지방 변성; 0.5, 염증 세포 여과; 1, 풍선 변성; 1.5, 괴사; 2), 가중치를 곱한 점수는 합산하여 평균값 ± 표준오차로 표시하였다.

실시예 5 : 유전자 발현 분석

간에서 지질 및 알코올 대사에 관여하는 단백질의 유전자 발현 변화를 분석하기 위하여, 분리된 마우스 간 조직 50 mg을 1 ml 트리졸(trizol) 용액에 넣고 파쇄한 후, 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 RNA를 추출하였다.

추출된 RNA는 DEPC 처리된 증류수로 2배 희석하고, U-2800 분광광도계(Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan)를 이용하여 260 및 280 nm에서의 흡광도를 측정하여 RNA 농도(ug/mL)를 확인하였다. 이후 100 ng/mL의 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성은 SuperScript® III First-Strand Synthesis SuperMix (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA 92008)를 이용하여 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 수행하였다.

실시간 중합효소 연쇄반응(real-Time PCR)을 위해, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 목적한 유전자의 프라이머(10 pmol) 각 1 μL, DEPC 처리된 증류수 9.5 μL 및 SYBR Select Master Mix(Applied Biosystems, Foster City, CA 94404, USA) 12.5 μL을 PCR 튜브에 분주하고, 합성한 cDNA를 각 1 μL씩 첨가하여 CFX96 Touch ™ Real-Time PCR 검출 시스템(Bio-Rad Laboratories Inc., Irvine, CA 92618, USA)을 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.

실시예 6 : 통계분석

실험을 통해 얻어진 데이터는 SAS SOFTWARE, Version 9.4를 이용하여 통계분석을 수행하였다. ANOVA 및 Duncan's multiple range tests를 이용하여 3회 반복 분석 후 결과를 평균값 ± 표준 오차로 표현하였다. p 값이 < 0.05일 때, 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실험예 1 : 헛개 열매 추출물 및 헛개 열매 추출 발효물 분석

1-1. 헛개 열매 추출물의 성분분석

헛개 열매 진액의 성분을 분석한 결과, 헛개 열매 진액의 pH, 산도(acidity), 수분 함량(water content), 고체 함량(solid content), 환원당(reducing sugar), 폴리페놀(polyphenol) 및 플라보노이드(flavonoid)의 함량은 하기 표 3과 같다.

1-2. 헛개 열매 추출물의 무기질 함량 분석

무기질 중 Na, Ca, K, Mg, P, Fe 및 Mn 함량의 측정은 건식분해법에 따라 시험용액을 조제하고, 유도결합플라즈마 분광광도계(inductively coupled plasma-optical emission spectroscopy; ICP-OES)를 이용하여 정량하였다.

간략하게, 시료를 균질화한 후, 일정량의 시료(약 10 g)를 회화 용기에 취한 다음 탄화시키고, 550 내지 600℃의 온도에서 여러 시간 백색 내지 회백색이 될 때까지 회화하였다. 방랭 후, 염산 용액 10 ml를 첨가하여 수욕상에서 완전 증발 건고시키고, 건고물에 염산 용액 8 내지 10 ml를 첨가하여 수분 가열한 다음 50 ml 용량 플라스크에 여과하였다. 불용물은 여지와 같이 사용했던 회화 용기에 옮겨 건고한 후, 다시 회화하였다. 이 회분을 물로 적셔 염산 용액 약 2 ml를 첨가하고 물 약 5 ml로 희석한 후, 수욕상에서 가온하였다. 여과한 액을 100 ml 메스 플라스크에 채우고, 물을 가하여 100 ml로 정용하여 시험용액으로 사용하였으며, ICP-OES(Optima 7000DV, Perkin Elmer)를 이용하여 무기질 함량을 측정하였고, 이때 표준용액으로 얻은 각각의 검량선을 이용하여 정량하였다.

그 결과, 헛개 열매 추출물의 무기질 함량은 하기 표 4와 같다.

1-3. 헛개 열매 추출물의 고초균 발효 중 생균수의 변화

5% 농도의 MSG에 0, 3 및 5% 농도의 글루코즈를 각각 첨가한 후, 고초균 발효 중에서 발생하는 생균수의 변화를 분석하였다.

그 결과, 도 3을 참조하여 보면, 1차 고초균 발효 중 3 및 5% 농도의 글루코즈 조건에서 발효 1일 차에 1 x 10⁹ CFU/ml 이상으로 높은 생균수를 보였고, 발효 3일 차에는 약간 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 반면, 0% 글루코즈 조건에서는 낮은 생균수를 보였다.

고초균 발효 중 0, 3 및 5% 농도의 글루코즈 조건에서 모두 0일 차에 3.5 x 10⁷ CFU/ml의 생균수를 보였었고, 0% 글루코즈 조건에서는 2일 차에 3.95 x 10⁸ CFU/ml, 3일 차에 2.25 x 10⁸ CFU/ml로 글루코즈가 첨가된 조건에 비해 가장 낮은 생균수를 보였으며, 5% 글루코즈 조건에서는 발효 2일 차에 2.82 x 10⁹ CFU/ml로 가장 높은 생균수를 보였으나 3일 차에 1.75 x 10⁸ CFU/ml로 약간 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 3% 글루코즈 조건에서는 발효 1일 차에 1.40 x 10⁹ CFU/ml로 생균수가 증가한 후, 3일 차까지 1.33 x 10⁹ CFU/ml로 유지하는 경향을 보였다.

1-4. 헛개 열매 추출물의 고초균 발효 중 pH 및 산도 변화

점질물과 GABA 생성을 최적화하기 위해, 1차 고초균 발효에서 글루코즈 농도를 달리하여 발효물의 pH, 산도, 생균수 등을 분석하였다. 5% 농도의 MSG에 0, 3 및 5% 농도의 글루코즈를 각각 첨가하고, 고초균을 5% 접종한 다음 3일 동안 진탕 배양하였다.

그 결과, 하기 표 5를 참조하여 보면, 1차 고초균 발효를 진행한 결과 모두 발효가 진행되는 동안 발효물의 pH가 증가하는 경향을 보였으며, 0일 차에 0% 글루코즈 조건에서 pH 값은 5.74였고, 3 및 5% 글루코즈 조건(B 및 C)에서 pH 값은 5.72로 근소한 차이를 보였으며, 3일 차에 0, 3 및 5% 글루코즈 조건에서 각각 pH 값은 8.51, 7.3 및 6.57로 글루코즈를 첨가하지 않은 조건에서 pH 값이 가장 높은 것을 확인하였다.

산도는 pH와는 반대로 감소하는 경향을 보였으며, 0일 차에 0% 글루코즈 조건에서 산도는 0.21%였으며, 3 및 5% 글루코즈 조건에서 산도는 각각 0.23%였으며, 3일 차에 0, 3 및 5% 글루코즈 조건에서 산도는 각각 0%, 0.09% 및 0.08%로 글루코즈를 첨가하지 않은 조건에서 산도가 가장 낮은 것을 확인하였다.

1-5. 헛개 열매 추출물의 고초균 발효 중 점질물 및 점조도 변화

5% 농도의 MSG에 0, 3 및 5% 농도의 글루코즈를 각각 첨가하여 고초균으로 발효시킨 발효물의 점질물 및 점조도 변화를 분석하였다.

그 결과, 상기 표 5를 참조하여 보면, 고초균 발효가 진행되는 동안 0% 글루코즈 조건에서 점질물 및 점조도가 생성되지 않았으며, 3 및 5% 글루코즈 조건에서 발효 2일 차에 가장 많은 양의 점질물을 생성하였고, 3일 차에 조금 감소하는 경향을 보였다. 3 및 5% 조건에서 발효 2일 차에 점질물이 각각 3.27% 및 2.55%를 나타냈으며, 점조도는 각각 3.9 Pa·sn 및 0.69 Pa·sn로 3% 글루코즈 조건에서 많은 양의 점질물과 높은 점조도 값을 나타내는 것을 확인함으로써, 1차 고초균 발효에서 5% MSG, 3% 글루코즈를 첨가하는 배지 조성을 가장 최적의 조건으로 판단하였다.

1-6. 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 γ-PGA 함량 분석

고초균 발효를 위하여 5% MSG 및 3% 글루코즈를 첨가한 조건에서 점질물의 γ-PGA 함량을 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)를 통해 분석하였다. 시험용액의 조제를 위하여 시료를 1 g 정밀히 칭량하여 6 N 염산 10 ml를 가한 후, 110℃에서 22시간 동안 가수분해하였다. 가수분해된 용액은 50 ml 부피의 플라스크에 옮겨 증류수로 정용하고, 이후 용액 1 ml을 취하여 10 ml 부피의 플라스크에 옮긴 다음 증류수로 정용하여 필터 후 시험용액으로 사용하였다. Water AccQ Tag Method를 이용하여 시험용액 유도체화 한 시험용액 10 μl와 Brate Buffer(I) 70 μl를 혼합하고, AccQ-Fluor Reagent 20 μl를 첨가하여 10초간 혼합한 후, 1분간 방치하였다. 55℃ 온도의 오븐에서 10분간 가열한 후 방랭하여 최종 시험용액으로 사용하였다. γ-PGA 분석을 위한 HPLC 조건은 하기 표 6에 나타내었다.

그 결과, 하기 표 7을 참조하여 보면, 594.24 mg/g의 γ-PGA 가 생성되는 것을 확인할 수 있었다.

1-7. 헛개 열매 추출물의 고초균 및 젖산균에 의한 혼합발효 중 pH 및 산도 변화

1차 고초균 발효 후, 2차 젖산균에 의한 젖산 발효를 위하여 추가적으로 글루코즈 및 탈지유 첨가에 따른 발효 특성을 분석하였다.

그 결과, 도 4를 참조하여 보면, 2차 젖산발효 과정 중 1.5% 글루코즈 및 0% 탈지유 조건에서 초기 pH는 7.13에서 발효 7일 차에 4.96으로 계속해서 감소하는 경향을 보였다. 1.5% 글루코즈에 1, 3 및 5% 탈지유 조건에서 초기 pH는 각각 6.53, 6.92 및 6.77에서 발효 1일 차에 각각 4.68, 4.87 및 4.58로 감소하였고, 1% 탈지유 조건에서는 발효 7일 차까지 pH가 4.94로 계속 증가하였으며, 3 및 5% 탈지유 조건에서는 발효 3일 차에 pH가 각각 4.98 및 4.96으로 근소하게 증가한 후, 발효 7일 차에 최종적으로 pH 4.68 및 4.52로 다시 감소하였다.

또한, 2차 젖산 발효물의 산도를 분석한 결과, 0% 탈지유 조건에서 초기 산도는 0.09%에서 발효 7일 차에 0.535%로 계속 증가하였고, 1, 3 및 5% 탈지유 조건에서 초기 산도는 각각 0.16%, 0.16% 및 0.18%로 비슷한 값을 보였으며, 발효 1일 차에 각각 0.90%, 0.69% 및 0.95%로 증가하였다. 1% 탈지유 조건에서 발효 5일 차까지 0.85%로 비슷하게 유지하는 경향을 보이다가 발효 7일 차에 0.58%로 감소하였다. 3% 탈지유 조건에서 발효 3일 차까지 근소하게 감소한 후, 7일 차에 0.89%로 증가하였으며, 5% 탈지유 조건에서는 발효 3일 차에 0.66%로 급격히 감소한 후, 발효 7일 차에 1.08%로 증가하였다.

1-8. 헛개 열매 추출물의 고초균 및 젖산균에 의한 혼합발효 중 생균수의 변화

1차 고초균 발효의 최적 조건인 5% MSG 및 3% 글루코즈 조건에 2차 젖산 발효를 위한 영양성분으로 1.5% 글루코즈와 0, 1, 3 및 5% 탈지유를 각각 첨가하여 젖산 발효 중에서 발생하는 생균수의 변화를 분석하였다.

그 결과, 도 5를 참조하여 보면, 2차 젖산 발효 중 1차 발효에 관여했던 고초균의 수가 감소하는 경향을 보였으며, 특히 탈지유가 첨가된 조건에서 급격하게 고초균의 생균수가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 반면 젖산균의 생균수는 0, 1, 3 및 5% 탈지유 조건에서 모두 0일 차에 1.E+0.7 CFU/ml로 동일하였으며, 1, 3 및 5% 탈지유 조건에서 1일 차부터 7일 차까지 모두 10⁹ 이상 유지하고 있으나 0% 탈지유 조건에서는 7일 차에 7.42 x 10⁸ CFU/ml로 가장 낮은 생균수를 보였다.

1-9. 헛개 열매 추출액의 고초균 발효 중 점탄성 변화

증류수로 2배 희석한 헛개 열매 농축액에 5% MSG 및 3% 글루코즈를 첨가하여 3일 동안 고초균 발효를 진행한 후, 발효물의 점탄성 측정하였다.

그 결과, 도 6을 참조하여 보면, 발효물의 점탄성은 발효 기간에 따라 차이를 보였는데 탄성(G’)보다 점성(G“)이 높은 것으로 나타났다. 발효 초기에는 점탄성이 매우 낮았고, 발효가 진행되면서 발효 2일 차에 점탄성이 가장 높았으며, 점성은 발효 3일 차에 0.89 Hz로 발효 2일 차와 비슷한 값을 나타내었다. 이러한 결과로 점질물에 포함되어 있는 고분자 r-PGA의 함량 및 분자량 차이가 발효물의 점탄성에 영향을 미치는 것으로 사료되었다.

1-10. 헛개 열매 추출물의 고초균 및 젖산균에 의한 혼합발효 중 티로신 함량 변화

1차 고초균 발효의 최적 조건인 5% MSG 및 3% 글루코즈 조건에 2차 젖산 발효를 위한 영양성분으로 1.5% 글루코즈와 0, 1, 3 및 5% 탈지유를 각각 첨가하여 젖산 발효시킨 발효물의 티로신(tyrosine) 함량 변화를 분석하였다.

그 결과, 도 7을 참조하여 보면, 고초균 발효가 진행되는 동안 티로신 함량은 0일 차에 38.55 mg%에서 3일 차에 51.43 mg%로 증가하는 경향을 보였다. 2차 젖산 발효 중 0 및 1% 탈지유 조건(a, b)에서는 발효가 종료되는 7일 차까지 티로신을 더 이상 생성하지 못하였으나, 3 및 5% 탈지유 조건(c, d)에서는 7일 차까지 티로신을 생성하였으며, 5% 탈지유 조건에서는 86.62 mg%로 가장 높은 티로신 함량을 보였다.

1-11. 헛개 열매 추출물의 젖산 발효 중 탈지유 농도에 따른 GABA 생성

박막 크로마토그래피(thin layer chromatograph; TLC)를 통한 MSG 및 GABA의 정성 분석을 위해, 젖산 발효 7일 동안 발효물을 취하여 증류수로 두 배 희석한 후, 실리카 겔 TLC 플레이트 위에 점적하였다. 헛개 열매 추출물의 고초균 및 젖산균에 의한 혼합 발효물의 TLC 결과는 도 8에 나타내었다.

GABA 생성에 관여하는 젖산균에 의한 2차 발효가 진행되면서 발효 3일 차에 1, 3 및 5% 탈지유 조건(b, c, d)에서 GABA가 생성되는 것을 확인할 수 있었고, 1% 탈지유 조건(b)에서 GABA 전환이 지연되면서 MSG가 1% 가량 잔존하였으나 발효 5일 차부터 기질인 MSG가 모두 소진된 것을 확인할 수 있었다. 3 및 5% 탈지유 조건(c, d)에서는 발효 3일 차부터 MSG가 모두 소진되어 GABA로 전환된 것을 확인할 수 있었다. 따라서 2차 젖산균 발효에 의해서 발효물에 잔존하는 MSG를 효과적으로 GABA로 전환시키기 위해서는 1차 고초균 발효 후에 추가적인 영양성분으로 1.5% 글루코즈 및 3% 탈지유가 첨가되는 것이 최적 배양조건으로 사료되었다. 특히 2차 젖산균 발효를 통한 펩타이드 생성을 위해서는 5% 수준의 탈지유를 첨가하는 것이 유리할 것으로 판단되었다.

1-12. HPLC의한 GABA 함량 분석

고초균 및 젖산균에 의한 혼합발효에서 5% 탈지유를 넣은 조건으로 HPLC를 통해 GABA 함량을 측정하기 위하여 유리 아미노산(free amino acid) 분석을 수행하였다.

시료를 6N의 염산으로 10배 희석시킨 후, 30 μl씩 분주하여 분석에 사용하였으며, 취한 시료는 각각 완전히 건조시킨 후, PLTC로 유도체화한 시험용액(MeOH: H₂O: TEA: PITC= 7: 1: 1: 1의 중량비) 20 μl와 상온에서 30분간 반응시키고, 시료를 완전히 건조시켜 200 μl의 용매(140 mM NaHAc, 0.15% TEA, 0.03% EDTA, 6% CH₃CN, pH 6.1)로 용해시켰다. 용해시킨 시료는 원심분리하고 상층액을 취해 HPLC의 autosampler에 안치하였다. GABA 함량 분석을 위한 HPLC 조건은 하기 표 9에 나타내었으며, GABA 분석을 위한 용출 프로파일은 하기 표 10에 나타내었다.

HPLC 분석 결과, 하기 표 8을 참고 하여 보면, GABA가 16.08 mg/ml의 농도로 생성된 것을 확인할 수 있었다.

B¹⁾: 60% CH₃CN, 0.015% EDTA

실험예 2 : 체중, 장기 무게 및 식이량 변화 분석

마우스에 알코올 및 헛개 열매 추출 발효물 급여가 생체에 미치는 영향을 분석하고자 마우스의 체중, 장기 무게 및 식이량 변화를 측정하였다.

그 결과, 하기 표 11을 참조하여 보면, 정상 대조군은 4주에 걸쳐 체중이 21.1 ± 0.8 g에서 29.2 ± 2.0 g(증체량 8.1 g)으로 다른 군과 비교하여 높은 증체량을 보였으며, 음성 대조군은 20.3 ± 1.9 g에서 25.9 ± 0.7 g(증체량 5.6 g)으로 다른 군보다 적은 체중 증가를 보였다.

헛개 열매 추출 발효물을 급여한 군에서 실험 종료 시점의 체중 및 증체량은 음성 대조군 보다 높았고(A군: 26.3 ± 0.6 g, B군 : 26.5 ± 1.0 g), 반면에 체중에 대한 간 중량은 음성 대조군에서 3.3%로 가장 높게 확인되었다.

실험예 3 : 혈액 생화학 분석

마우스 각 군의 혈액을 채취하여 혈장을 분리한 후, 생화학 분석을 수행한 결과, 하기 표 12를 참조하여 보면, 알코올 급여에 의해 ALT 및 AST 효소 활성이 증가하는 것을 확인하였고, 상기 증가된 ALT 및 AST 효소 활성이 헛개 열매 추출 발효물을 급여한 A군 및 B군에서 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 혈중 LDL, TG 및 유리 지방산 농도는 음성 대조군과 비교하여 A군 및 B군에서 유의하게 감소하였다.

반면, 혈관 질병 개선에 도움이 된다고 알려진 HDL 콜레스테롤 농도는 음성 대조군에 비해 헛개 열매 추출 발효물을 급여한 A군 및 B군에서 증가한 것이 확인되었다.

실험예 4 : 조직병리학적 분석

알코올 유발 간 손상에 있어서, 헛개 열매 추출 발효물의 간 손상 예방 효과를 평가하기 위하여 간 조직에서 조직병리학적 변화를 분석하였다. 마우스 각 군에서 간을 분리하여 병리학적 간 병변의 정도 및 증상의 중증도에 따라 점수를 채점하였다.

그 결과, 도 9를 참조하여 보면, 음성 대조군의 분석 결과는 2.2 ± 0.76으로, 염증 세포 침윤이 발견되었지만 간 세포의 풍선 변성(ballooning degeneration) 및 괴사는 발견되지 않았다.

대조적으로, 헛개 열매 추출물을 급여한 양성 대조군과 헛개 열매 추출 발효물을 급여한 A군 및 B군에서 간 조직을 관찰한 결과, 알코올에 의한 간 병변을 대부분 감소시켰고, 특히 간 지방증과 염증 세포의 여과(filtration of inflammatory)를 감소시켰으며, 각 군의 점수는 각각 1.83 ± 0.44, 1.17 ± 0.33 및 1.17 ± 0.67로 확인되었다. 특히, A군 및 B군은 음성 대조군과 비교하여 볼 때 알코올에 의해 유발되는 간 병변을 약 53% 정도 유의하게 감소시키는 것을 확인하였다.

헛개 열매 추출 발효물을 급여한 A군 및 B군 사이의 점수는 유사하였고, 0.3% 헛개 열매 추출 발효물을 급여한 B군에서 대부분의 마우스는 가벼운 간 지방 변화(0.5점)를 보였으나 음성 대조군과 달리 약간의 지방 변화와 부분적인 염증 세포(2.5점)를 보이는 개체는 확인되지 않았다. 헛개 열매 추출물을 급여한 양성 대조군에서는 약간의 간 지방 변화와 염증 세포 침윤(0.5 내지 1.5점)이 확인되었다. 상기 결과는 헛개 열매 추출 발효물의 급여가 알코올에 의한 마우스의 간 지방증을 예방할 수 있음을 시사한다.

실험예 5 : 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 간 대사 관련 유전자의 정량적 분석

헛개 열매 추출 발효물이 간에서 알코올 탈수소 효소(alcohol dehydrogenation enzyme) 활성, 항산화 효소(antioxidant enzyme) 활성, 지방산 산화(fatty acid oxidation) 및 지방생성(lipogenesis)과 관련된 단백질의 유전자 발현에 미치는 영향을 확인하고자 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-Time PCR)을 이용하여 정량 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 10(a) 내지 도 10(c)를 참조하여 보면, 알코올 탈수소에 관여하는 효소인 알코올 탈수소효소 1(alcohol dehydrogenase 1; ADH1), 알코올 탈수소효소 2(ADH2) 및 과산화수소 분해효소(catalase; CAT)의 유전자 발현이 음성 대조군과 비교하여 헛개 열매 추출 발효물을 급여한 군에서 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 도 10(d) 및 도 10(j) 내지 도 10(m)을 참조하여 보면, 알코올 대사와 지방생성 관여하는 사이토크롬 P450 2E1(cytochrome P450 2E1; CYP2E1), 스테롤 조절 인자 결합 단백질(sterol regulatory element-binding protein; SERBP), 지방산 합성효소(fatty acid synthase; FAS), 스테아로일-CoA 불포화효소(stearoyl-CoA desaturase; SCD) (0.3% 헛개 열매 추출 발효물) 및 아세틸-CoA 카복실화효소(acetyl-CoA carboxylase; ACC)의 유전자 발현이 헛개 열매 추출 발효물을 급여한 군에서 유의하게 억제되는 것을 확인하였다[NRC(Nomal control), NC(negative control), A(0.1% 헛개 열매 추출 발효물), B(0.3% 헛개 열매 추출 발효물), PC(positive control)].

또한, 도 10(e) 내지 도 10(i)을 참조하여 보면, 항산화 관련 효소인 초과산화물 불균등화 효소(superoxide dismutase; SOD), 지방산 산화에 관련하는 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체(peroxisome proliferator-activated receptor; PPAR), PPARγ 보조활성인자(PPARγ coactivator; PGC)의 유전자 발현은 음성 대조군과 비교하여 발현량이 증가하는 것을 확인하였다.

본 발명에서는 알코올성 간 손상에 있어서, 헛개 열매 추출 발효물의 간 기능 개선 효과를 마우스 동물실험을 이용하여 분석하였다.

실험 결과, 군 간의 체중과 간 중량에서 차이를 확인하였으며, 알코올을 급여한 음성 대조군은 다른 실험 군에 비하여 체중이 유의적으로 낮게 확인되었고, 정상 대조군과 비교하여 간 중량이 증가하는 것을 확인하였다. 반면, 헛개 열매 추출 발효물을 급여한 군의 경우, 알코올 급여로 인한 체중 감소 개선 효과를 보였고, 0.1% 헛개 열매 추출 발효물을 급여한 A군에 비해 0.3% 헛개 열매 추출 발효물을 급여한 B군에서 평균 체중이 더 높았으며, 따라서 헛개 열매 추출 발효물 급여가 알코올로 인한 체중 감소의 개선에 효과가 있음을 시사한다.

간에서 알코올 및 지질 대사 관련 효소의 유전자 발현을 분석 결과, 알코올 급여 군에서 알코올 탈수소 효소(ADH1, ADH2 및 CAT), 항산화 효소(SCD 및 GPx) 및 지방산 산화(PPAR, PGC 및 CRT)에 관여하는 유전자 발현은 억제되고, 지방생성(SREBP, FAS, SCD 및 ACC)에 관여하는 유전자 발현은 음성 대조군에서 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 헛개 열매 추출 발효물은 알코올 탈수소 효소의 유전자 발현을 촉진시키고, 간에서 지방생성에 관여하는 유전자 발현을 억제하였다. 또한, 간에서 지방생성의 억제는 혈중 지질 농도에 영향을 미치는데, 지방생성을 통해 생성된 저밀도 지단백질(LDL)은 중성지방(TG)과 결합하여 혈액에서 고밀도 지단백질(HDL)의 농도를 감소시키고 지방증을 유발한다고 알려져 있다. 따라서, 헛개 열매 추출 발효물 급여 군에서 지방생성 억제 효과가 확인됨에 따라 혈청 지질 농도 또한 연계되어 감소한 것으로 사료된다.

지방증은 지방생성 유전자의 발현 증가와 지방산 산화에 필요한 유전자의 발현 감소로 인해 발생하는데, 지방증은 알코올 섭취로 인한 간 손상 초기에 관찰되는 조직병리학적 증상으로 일반적으로 간에서 중앙 정맥 및 문맥 주위에서 관찰된다. 본 발명에서는 헛개 열매 추출 발효물을 급여한 군에서 음성 대조군과 비교하여 가벼운 간 지방 변성이 확인되었다.

요약하자면, 헛개 열매 추출 발효물은 알코올로 인한 체중 감소뿐만 아니라 혈중 지질 농도를 감소시키고, 알코올 탈수소 관련 효소의 유전자 발현 증진 및 지방생성을 억제를 통해 간에서 지방증 생성을 예방할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 프로바이오틱 박테리아를 이용하여 발효한 헛개 열매 추출 발효물은 간 기능 개선 효과를 가진 기능성 소재로서 유용하게 활용될 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

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헛개나무 열매 농축액을 희석하고, 모노-소듐 γ-글루타메이트(mono-sodium γ-glutamate; MSG) 3 내지 8중량%를 첨가한 후, 멸균하여 헛개나무 열매 추출물을 제조하는 제 1단계;
상기 헛개나무 열매 추출물에 글루코즈 1 내지 5 중량%를 첨가하고, 바실러스 서브틸리스 HA(Bacillus subtilis HA) 스타터 농축액을 1 내지 10중량% 접종한 후, 배양하여 발효물을 제조하는 제 2단계; 및
상기 발효물에 글루코즈 1 내지 3 중량% 및 탈지유 1 내지 10 중량%를 첨가하고, 락토바실러스 플랜타륨 EJ2014(Lactobacillus plantarum EJ2014) 스타터 농축액을 1 내지 5 중량% 접종한 후, 배양하여 헛개나무 열매 추출 발효물을 제조하는 제 3단계;를 포함하며,
상기 헛개나무 열매 추출 발효물은 γ-폴리글루탐산(γ-poly glutamic acid; γ-PGA), 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA) 및 티로신이 증진되며, 아스파라진산 아미노전이효소(aspartate aminotransferase; AST) 및 알라닌 아미노전이효소(alanine aminotransferase; ALT)를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 헛개나무 열매 추출 발효물의 제조방법.
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제 12항에 있어서, 상기 제 2단계는 35 내지 48℃, 130 내지 200 rpm에서 1 내지 5일 동안 진탕 배양하는 것을 특징으로 하는 헛개나무 열매 추출 발효물의 제조방법.
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제 12항에 있어서, 상기 제 3단계는 25 내지 35℃에서 5일 내지 10일 동안 정치 배양하는 것을 특징으로 하는 헛개나무 열매 추출 발효물의 제조방법.