KR20210156435A

KR20210156435A - 식물 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 식품 조성물

Info

Publication number: KR20210156435A
Application number: KR1020200074018A
Authority: KR
Inventors: 김소영; 민진우; 강희철
Original assignee: (주)지에프씨생명과학
Priority date: 2020-06-18
Filing date: 2020-06-18
Publication date: 2021-12-27
Also published as: KR102555332B1

Abstract

본 발명은 매실(Prunus mume), 유자(Citrus junos), 헛개나무열매(Hovenia dulcis), 오가피(Acanthopanax sessiliflorum Seeman) 및 흑삼(panax ginseng)의 식물 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 간기능 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 식물 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 조성물은 외부 스트레스로 인한 간 독성으로부터 우수한 간세포 보호 활성을 나타내므로 간 기능 개선제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

식물 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 식품 조성물{Food Compositions for improving liver function Comprising Complex Extracts of Plants}

본 발명은 매실, 유자, 헛개나무열매, 오가피 및 흑삼의 식물 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

간은 영양소(탄수화물, 지질, 단백질) 대사 기능, 생체이물 제거, 면역반응 등을 통한 면역기능, 담즙분비, 혈액응고 기능 등 여러 가지 기능을 하는 중요한 장기이다. 그러나, 현대인들은 식생활의 변화와 더불어 과도한 스트레스, 음주, 흡연 및 환경 오염 등으로 인해 간 기능의 손상 및 간질환의 발병 가능성이 급격히 증가하고 있다. 이러한 간질환에는 병이 생기는 원인에 따라 바이러스성 간질환, 알코올성 간질환, 약물 독성 간질환, 지방간, 자가 면역성 간질환, 대사성 간질환 및 기타 간질환 등으로 구분된다. 이러한 간질환은 간세포 파괴에 의한 해독능력 저하와 담즙분비 억제에 의한 독성물질 배설장애, 비타민 B2, B3 및 C의 흡수억제 및 축적저하에 의한 전신 권태감, 소양감, 식욕부진 및 피로 등의 증상이 나타난다. 그러나, 간은 완충능력이 큰 기관이기 때문에 초기에 질환을 자각하지 못하는 경우가 다수이며, 질환이 상당히 진행되어서야 발견되기 때문에 우리나라뿐만 아니라 세계적으로도 사망원인의 수위를 차지하고 있다. 그렇기 때문에 평소에 간의 기능을 잘 유지하는 것이 중요하다.

이와 같이 간 기능의 상실은 무자각성이며 인체의 방어 작용과 해독 작용을 상실시켜 인체에 많은 문제를 야기하므로, 부작용이 없고 안전하며 간 보호 효과가 있는 간 기능 개선용 조성물의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 알라닌 아미노전이효소(Alanine aminotransferase; ALT)와 아스파르트산 아미노전이효소(Aspartate aminotransferase; AST)는 전신의 세포에 분포하는데 ALT가 주로 간세포의 세포질에 존재하는 데 반해, AST는 심장 간, 횡문근, 신장, 적혈구의 세포질과 미토콘드리아에 분포한다. ALT와 AST는 혈청보다 조직에 높은 농도로 존재하며, 간 손상 시 그 손상 된 정도에 비례하여 혈청 내로 흘러나온다. 따라서 간조직이 독성물질이나 바이러스의 감염, 알코올, 비만 등의 여러 가지 요인 등에 의하여 손상을 받게 되면 혈액 내로 방출되어 순환하기 때문에 혈액의 ALT 및 AST 활성이 증가하게 된다. 그렇기 때문에 간세포가 파괴되면 혈중 농도가 증가하게 되므로 간세포의 손상 정도를 추정할 수 있어 간세포 손상 지표로 널리 측정되고 있다. 또한, ALT와 AST는 간질환 환자에서 그 효소 활성이 정상인과 비교하여 매우 높게 나타나는 경향이 있기 때문에 간질환 진단에 있어서 매우 중요한 인자로 볼 수 있다. 또한, AST와 ALT는 반감기가 각각 17시간과 47시간이며, 급성 간세포 손상의 초기에는 간세포 내 농도가 높은 AST가 ALT보다 더 많이 증가하지만, 24-48시간 뒤부터는 반감기가 더 긴 ALT가 더 증가한다.

인체에 들어온 각종 독성물질은 간 대사 효소에 의해 대사/배설되는 과정에서 산소 라디칼을 생성하여 간세포의 지질화를 초래하고 지질과산화물이 생체막에 구조적인 변화를 일으키며 내부의 효소계가 파괴되어 혈액 및 조직 내 과산화지질 함유량이 증가한다. 또한 운동 시 활동근육에서 많은 산소가 운반되어 사용되는 과정에서 근육막의 다불포화 지방산이 손상되어 지질과산화물의 최종산물인 MDA(malondialdehyde)가 생성될 수 있다. 간세포의 MDA 농도가 높아지면 간기능이 저하되어 MDA는 대표적인 간기능 저하의 검사 지표로 측정된다.

글루타치온(Glutathione; GSH)이란 자연계에 널리 분포하는 결정성 폴리펩타이드로 동물, 효소 등 거의 모든 생체 내의 산화환원반응에서 중요한 역할을 하는 생체분자이다. 특히 간, 효모, 근육 등에 많이 함유하며 인체의 간에서 항산화 활동의 중심 효소가 되어 산화-환원 항상성을 유지하는 중요한 완충작용을 하고 있다. 즉, 간에서 산화 스트레스가 유발될 경우 환원형 글루타치온이 산화작용을 막기 위해서 전자를 제공함으로써 산화 스트레스를 제거해준다. 글루타치온은 산화 스트레스에 의한 라디칼을 제거하는 역할을 하며, 지질 과산화의 환원에도 관여한다.

식물 추출물을 이용하는 간 기능 개선 관련 기술로는, 국내의 경우 대한민국 등록특허공보 제10-1944295호「헛개나무 열매 추출 발효물을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물 및 이의 제조방법」, 대한민국 등록특허공보 제10-1549630호「오가피-버섯 발효물을 이용한 간기능 개선용 조성물」, 대한민국 등록특허공보 제10-1408101호「헛개나무 추출물을 첨가한 표고버섯 균사체 흑미 배양액을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 식품」, 대한민국 공개특허공보 제10-2004-0052123호「헛개나무 열매추출물을 유효성분으로 함유하는 간기능개선용 조성물」등이 개시되어 있다.

그러나, 아직까지 매실(Prunus mume), 유자(Citrus junos), 헛개나무열매(Hovenia dulcis), 오가피(Acanthopanax sessiliflorum Seeman) 및 흑삼(panax ginseng)의 식물 복합 추출물을 이용하여 간 기능 개선 효과를 부여할 수 있는 식품 조성물에 대한 연구는 존재하지 않은 실정이다.

이에, 본 발명자들은 매실(Prunus mume), 유자(Citrus junos), 헛개나무열매(Hovenia dulcis Thunb.), 오가피(Acanthopanax sessiliflorum Seeman) 및 흑삼(Panax ginseng C. A. Meyer)의 식물 복합 추출물이 외부 스트레스에 의한 간 독성으로부터 우수한 간세포 보호 활성을 나타내어, 간 기능 개선 효과가 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허공보 제10-1944295호 대한민국 등록특허공보 제10-1549630호 대한민국 등록특허공보 제10-1408101호 대한민국 공개특허공보 제10-2004-0052123호

본 발명의 목적은 천연물 유래의 간 기능 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 식품을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 매실(Prunus mume), 유자(Citrus junos), 헛개나무열매(Hovenia dulcis Thunb.), 오가피(Acanthopanax sessiliflorum Seeman) 및 흑삼(Panax ginseng C. A. Meyer)의 식물 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 간기능 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 식물 복합 추출물은 물, 주정 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매로 추출되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 식물 복합 추출물은 매실추출물, 유자추출물, 헛개나무열매추출물, 오가피추출물 및 흑삼추출물이 1~20:1~10:1~10:1~10:1~10의 중량비로 혼합되어 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 식물 복합 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량% 포함되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 식물 복합 추출물은 간 독성 유발 물질로부터 간세포 보호 활성, ALT 감소 활성, AST 감소 활성, MDA 생성 저해 활성 및 GSH 증가 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 간기능 개선용 식품을 제공한다.

본 발명으로부터 제공되는 추출물은 독성 유발 물질로부터 간세포 보호 활성, ALT 감소 활성, AST 감소 활성, MDA 감소 활성 및 GSH 증가 활성이 우수하기 때문에, 간 기능 개선용 식품 조성물로 활용 가능하다.

도 1은 실시예 1의 간암세포주(HepG2 cell) 세포독성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 2는 실시예 1의 간 독성 유발 물질로부터 간세포 보호 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 1의 간세포 손상 방지 효능 시험 결과(ALT)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 1의 간 세포 손상 방지 효능 시험 결과(AST)를 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 1의 간 세포 내 지질과산화 함량(MDA)을 나타낸 그래프이다.
도 6는 실시예 1의 간 세포 내 비효소적 항산화 활성(GSH)을 나타낸 그래프이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 매실(Prunus mume), 유자(Citrus junos), 헛개나무열매(Hovenia dulcis Thunb.), 오가피(Acanthopanax sessiliflorum Seeman) 및 흑삼(Panax ginseng C. A. Meyer)의 식물 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 간기능 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 추출물은 본 발명이 속한 분야에 공지된 다양한 추출방법을 통해 얻어질 수 있고, 구체적으로는 물, 주정 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매로 추출되는 것일 수 있다. 그 중에서도 주정으로 추출되는 것이 유효 성분을 안정적으로 추출할 수 있는 측면에서 더욱 바람직하다.

구체적으로, 추출용매의 함량은 매실, 유자, 헛개나무열매, 오가피, 흑삼의 식물 복합물 고형분 중량의 1 내지 100배, 더욱 바람직하게는 5 내지 50배, 가장 바람직하게는 10 내지 20배인 것일 수 있다.

또한, 상기 추출물은 추출물의 유효 성분이 파괴되지 않거나 파괴가 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출 방법은 특별히 제한되지 않고 추출물의 종류와 추출하는 방법에 따라 예를들어, 중탕추출, 환류냉각추출, 초음파추출 및 냉침추출 및 퍼콜레이션(percolation) 추출방법을 이용할 수 있다.

상기 추출하는 단계에서 추출 횟수는 구체적으로 1 내지 5회 반복될 수 있다. 이러한 경우, 유효성분의 추출 효율이 더욱 향상될 수 있다.

일 예로, 상기 추출하는 단계는 환류 냉각기가 달린 추출기에 추출 물질 및 추출 용매를 투입한 후, 50 내지 100℃에서 4 내지 20시간 동안 가열 환류 냉각 추출하는 것일 수 있다. 이때 상기 가열 환류 냉각 추출 방법은 가열하면서 환류시킨 후, 냉각하여 추출하는 방법인데, 구체적으로 가열로 인해 기화현상이 발생하여 용매 손실이 발생할 수 있기 때문에 냉각과정을 함께 실시함으로써, 용매 손실을 최소화하는 추출 방법을 의미한다. 다른 방법으로 상기 추출하는 단계는 추출 물질에 추출 용매를 투입한 후, 5 내지 37℃에서 1 내지 15일간 침적시켜 냉침하여 추출할 수 있다.

또 다른 방법으로 상기 추출하는 단계는 추출 물질에 추출 용매를 투입한 후, 1 내지 200시간 동안 퍼콜레이션(Percolation)할 수 있다.

또 다른 방법으로 상기 추출하는 단계는 추출 물질에 추출 용매를 투입한 후, 50 내지 100℃에서 0.5 내지 72시간 동안 중탕하여 추출할 수 있다.

또 다른 방법으로 상기 추출하는 단계는 식물 복합물의 건조 고형물 기준으로 상기 추출 물질 중량의 10 내지 50배의 주정을 가하고, 20 내지 80℃에서 1 내지 72시간 동안 추출하고, 여과 및 농축하여 농축물 상태의 추출액을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 추출 물질은 상술한 추출 용매에 의해 추출된 추출 물질뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거쳐 추출된 추출 물질도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다.

여과는 추출액으로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로 면, 나일론, 종이 등을 이용하여 입자를 걸러내거나 한외여과법, 냉동여과법, 원심분리법 등을 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

여액을 농축한 다음 건조하는 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 경우에 따라 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 추출물은 추출액, 상기 추출액을 건조시킨 분말, 상기 추출액을 농축 여과한 농축물 등 다양한 형태로 가공되어 이용될 수 있다. 또한, 상기 추출물은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면 주정을 침출 용매로 포함하는 틴크, 농축물, 엑기스, 유동엑기스 등의 형태로 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 식물 복합 추출물은 매실추출물, 유자추출물, 헛개나무열매추출물, 오가피추출물 및 흑삼추출물이 1~20:1~10:1~10:1~10:1~10 중량비로 혼합되어 이루어진 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 10~20:1~10:1~7:1~5:1~3의 중량비로 혼합되어 이루어진 것일 수 있다. 상기 범위로 포함할 경우, 상기 매실추출물, 유자추출물, 헛개나무열매추출물, 오가피추출물 및 흑삼추출물에 포함된 활성 성분 사이의 상승 작용이 발생하여, 외부 스트레스에 의한 간 독성으로부터 간 보호 효과가 우수하며 식품 조성물의 안전성 또한 우수하다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기와 같은 방법으로부터 수득된 매실추출물, 유자추출물, 헛개나무열매추출물, 오가피추출물 및 흑삼추출물의 식물 복합 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 50중량% 포함될 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 30 중량% 포함될 수 있다. 상기 범위로 포함시킬 경우, 활성 성분의 함량이 높아 간기능 개선 효과가 증대되면서도, 식품 조성물의 안전성을 유지할 수 있기 때문에 바람직하다.

만일, 상기 추출물이 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 중량% 미만일 경우에는 간기능 개선 효과를 충분히 얻을 수 없기 때문에 조성물로서의 기능이 떨어지고, 50 중량%를 초과하는 경우에는 그 이상을 함유하지 않아도 충분한 효능을 나타낼 수 있기 때문에 비경제적이기 때문에 바람직하지 않다.

전술된 바와 같이, 식물 복합 추출물은 간 독성으로부터 간세포 보호 활성이 우수하기 때문에, 간 기능 개선용 식품 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 식물 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 식품조성물은 식품, 식품첨가제, 음료, 음료첨가제, 발효유, 건강기능식품 등으로 사용될 수 있다. 식품, 식품첨가제, 음료, 음료첨가제, 또는 건강기능식품으로 사용되는 경우, 각종 식품류, 발효유, 육류, 음료수, 초콜렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료, 비타민 복합제, 주류 및 그 밖의 건강기능식품일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 복합 추출물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 상기 매실, 유자, 헛개나무열매, 오가피 및 흑삼뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 상기 첨가 성분은 예컨대 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미네 및 향미제를 포함한다. 상기 탄수화물로는 단당류(예를 들어 포도당, 과당 등), 이당류(예를 들어 말토스, 수크로스, 올리고당 등) 및 다당류(예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등)과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당알코올이다. 향미제로서 천연 향미제(타우마린, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오사이드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분인 매실, 유자, 헛개나무열매, 오가피 및 흑삼 이외에 펙틴, 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 식품조성물은 식품, 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 천연소재의 가공 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 상기 식물 복합 추출물을 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 식품으로는 음료(알코올성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예를 들어 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예를 들어 햄, 소시지, 콘비프 등), 빵류 및 면류(예를 들어 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예를 들어 요거트, 발효유, 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예를 들어 된장, 간장, 소스 등) 등 본 발명의 식물 복합 추출물을 첨가하여 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 식물 복합 추출물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 간 기능 개선용 식품 조성물의 사용량은 연령, 건강 상태 정도 등의 개인차나 제형, 형태에 따라 적절하게 조절될 수 있으며,간 기능 개선을 위한 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

상기와 같은 방법으로부터 수득된 조성물은 간 독성 유발 물질로부터 간세포 보호 활성, ALT 감소 활성, AST 감소 활성, MDA 생성 저해 활성 및 GSH 증가 활성을 나타내어 우수한 간 기능 개선용 식품을 제공할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1 내지 4> 식물 복합 추출물 제조

매실(매실, 홈플러스) 1kg, 유자(유자, 고흥농장) 1kg, 헛개나무열매(헛개나무열매, 홈플러스) 1kg, 오가피(오가피, 제천한방약초) 1kg 및 흑삼(흑삼, 길기춘인삼) 1kg에 각각 50% 주정 20kg을 가하고, 상온에서 3일 동안 교반 추출하였다. 추출한 후 여과 공정을 3회 반복하고, 얻어진 여액을 각각 혼합한 후, 60brix로 회전진공농축장치에서 농축하여 매실추출물, 유자추출물, 헛개나무열매추출물, 오가피추출물 및 흑삼추출물을 각각 수득하였다. 그 다음에, 총 중량에 대하여 제조된 매실추출물, 유자추출물, 헛개나무열매추출물, 오가피추출물 및 흑삼추출물을 아래 표 1과 같은 함량(g)으로 각각의 추출물을 혼합하여 식물 복합 추출물을 제조하였다.

	실시예
	1	2	3	4
매실추출물	20	15	5	10
유자추출물	10	5	7	10
헛개나무열매추출물	7	10	5	10
오가피추출물	5	7	10	10
흑삼추출물	3	10	5	10
정제수	55	53	68	50

<비교예 1 내지 7> 식물 추출물 제조

상기 실시예와 동일한 방법으로 각각의 추출물을 제조하여, 아래 표 2와 같은 함량(g)으로 각각의 추출물을 혼합하여 식물 추출물을 제조하였다.

	비교예
	1	2	3	4	5	6	7
매실추출물	20	-	-	-	-	20	10
유자추출물	-	20	-	-	-	20	12
헛개나무열매추출물	-	-	20	-	-	20	15
오가피추출물	-	-	-	20	-	20	17
흑삼추출물	-	-	-	-	20	20	20
정제수	80	80	80	80	80	0	26

<실험예 1> 세포독성 시험 : MTT assay

실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 7의 식물 복합 추출물을 이용하여 세포에 대한 독성을 갖는지 확인하기 위해 인간 유래 간암 세포주인 HepG2 세포를 이용하여 세포독성 실험을 진행하였다.

인간 유래 간암 세포주인 HepG2 세포에 독성을 미치는지 확인하기 위해 MEM 배지를 이용하여 24-well plate에 1X10⁵ cell/well의 농도로 세포를 분주한 후, 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 cell에 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 7의 식물 복합 추출물을 농도별로 배지와 혼합하여 각 well에 처리 후, 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양한 다음, 배양액을 제거하고 각 well에 0.5mg/mL의 MTT용액을 처리하여 배양기에서 4시간 반응시켰다. 4시간 후, 상등액을 제거하고 각 well에 1mL의 DMSO를 첨가하여 생성된 포마잔(formazan) 결정을 용해시켜 ELISA reader기로 560nm에서 흡광도를 측정하였으며, 아래의 수학식 1과 같이 세포 생존율을 계산하였다.

[수학식 1]

세포 생존율(%)=[(시료 처리군의 흡광도/무처리군의 흡광도) X 100]

	세포 생존율(%)
실시예 1	110.23±2.55
실시예 2	103.11±1.59
실시예 3	99.07±2.37
실시예 4	113.26±0.80
비교예 1	102.31±0.61
비교예 2	104.55±1.21
비교예 3	106.18±1.39
비교예 4	101.83±0.79
비교예 5	100.34±0.95
비교예 6	92.08±1.25
비교예 7	95.62±1.51

그 결과, 상기 표 3 및 도 1에 나타난 바와 같이 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 7의 2.5% 처리 농도에서 세포 독성이 나타나지 않아 식품에 안전한 소재로 사용이 가능함을 확인하였다.

<실험예 2> t-BHP에 의한 산화 손상에 대한 간세포 보호 활성 : MTT assay

실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 7의 식물 복합 추출물을 이용하여 t-BHP에 의한 산화적 손상에 대한 간세포 보호 효과를 갖는지 확인하기 위해 인간 유래 간암 세포주인 HepG2 세포를 이용하여 간 보호 활성 실험을 진행하였다.

산화적 손상이 유발된 HepG2 세포에 보호 효과를 나타내는지 확인하기 위해 MEM 배지를 이용하여 24-well plate에 1X10⁵ cell/well의 농도로 세포를 분주한 후, 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 cell에 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 7의 식물 복합 추출물을 농도별로 배지와 혼합하여 각 well에 처리 후, 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양한 다음, t-BHP로 4시간 동안 산화 스트레스를 유도한 뒤, 배양액을 제거하고 각 well에 0.5mg/mL의 MTT용액을 처리하여 배양기에서 4시간 반응시켰다. 4시간 후, 상등액을 제거하고 각 well에 1mL의 DMSO를 첨가하여 생성된 포마잔(formazan) 결정을 용해시켜 ELISA reader기로 560nm에서 흡광도를 측정하였으며, 아래의 수학식 2와 같이 간세포 보호 활성을 계산하였다. 이때, 양성 대조군으로 간 보호 작용이 있는 것으로 알려진 실리마린(silymarin)을 사용하여 진행하였다.

[수학식 2]

간세포 보호 활성(%)={[(시료 처리군의 흡광도/t-BHP 처리 및 시료 무처리군의 흡광도)] X 100}

	간세포 보호 활성(%)
음성 대조군	45.15±0.12
실시예 1	105.19±2.74
실시예 2	89.97±2.35
실시예 3	70.06±1.14
실시예 4	75.58±2.13
비교예 1	66.08±0.75
비교예 2	62.45±1.21
비교예 3	61.76±0.26
비교예 4	55.15±0.27
비교예 5	48.69±0.32
비교예 6	57.62±0.38
비교예 7	65.55±0.89
양성 대조군(silymarin)	93.83±0.72

그 결과, 상기 표 4에 나타난 바와 같이 독성물질인 t-BHP 처리에 의해 감소한 간세포 생존율에 대해 비교예 1 내지 7의 2.5% 처리 농도에서 나타난 간세포 보호 활성 증가 대비 실시예 1 내지 4의 2.5% 처리 농도에서 나타나는 간세포 보호 활성 증가가 현저하게 높았으며, 그 중에서도 실시예 1의 간세포 보호 활성 증가가 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 2에 나타난 바와 같이 실시예 1의 식물 복합 추출물을 농도별로 처리하였을 때, 산화적 스트레스에 의해 손상된 HepG2 cell에서 간세포 보호 활성이 농도 의존적인 증가가 관찰되어, 간기능 개선에 효과가 있음을 확인하였다.

<실험예 3> t-BHP에 의한 산화 손상에 대한 간세포 보호 활성 : ALT, AST activity assay

간세포 손상 시 배양액으로 유리되어 나오는 ALT(Alanine aminotransferase) 및 AST(Aspartate aminotransferase)의 활성을 측정함으로써 간세포 손상에 대한 보호 활성을 확인하고자 하였다.

실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 7의 식물 복합 추출물을 이용하여 t-BHP에 의한 산화적 손상 대한 간세포 보호 효과를 갖는지 확인하기 위해 인간 유래 간암 세포주인 HepG2 세포를 이용하여 ALT 및 AST 활성을 측정하였다.

산화적 손상이 유발된 HepG2 세포에 보호 효과를 나타내는지 확인하기 위해 MEM 배지를 이용하여 24-well plate에 1X10⁵ cell/well의 농도로 세포를 분주한 후, 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 cell에 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 7의 식물 복합 추출물을 농도별로 배지와 혼합하여 각 well에 처리 후, 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양한 다음, t-BHP로 4시간 동안 산화 스트레스를 유도한 후, 배양액을 회수하여 ALT activity assay kit(sigma), AST activity assay kit(sigma)를 사용하여, kit 내 manual에 따라 활성을 측정하였다. ALT 및 AST 활성은 표준용액의 정량곡선을 기준으로 계산하였고, 아래의 수학식 3 및 4와 같이 반응시간에 따른 pyruvate 및 glutamate를 생성하는 효소의 활성을 계산하여 mU/mL로 표기하였다. 1mU의 ALT는 37℃에서 1분 동안 1nmole의 pyruvate를 생성하는 효소의 활성이며, 1mU의 AST는 37℃ 및 pH 8에서 1분 동안 1nmole의 glutamate를 생성하는 효소의 활성을 의미한다. 이때, 양성 대조군으로 간 보호 작용이 있는 것으로 알려진 실리마린(silymarin)을 사용하여 진행하였다.

[수학식 3]

ALT activity(mU/mL) = {(pyruvate 정량곡선에서 얻은 시료 처리군의 pyruvate 생성량(nmole)) / [(총 반응 시간(min)) X 시료 부피(mL)]}

[수학식 4]

AST activity(mU/mL) = {(glutamate 정량곡선에서 얻은 시료 처리군의 glutamate 생성량(nmole)) / [(총 반응 시간(min)) X 시료 부피(mL)]}

	ALT(mU/mL)	AST(mU/mL)
음성 대조군	15.42±0.38	24.44±0.53
실시예 1	7.16±0.79	8.43±0.12
실시예 2	9.88±0.25	11.39±1.25
실시예 3	11.46±0.65	16.16±0.29
실시예 4	10.02±0.57	13.62±0.56
비교예 1	12.64±0.21	17.28±0.75
비교예 2	12.16±0.41	18.67±0.77
비교예 3	13.43±0.82	20.21±0.79
비교예 4	14.11±0.53	22.54±0.97
비교예 5	14.14±0.35	21.22±1.01
비교예 6	13.96±0.49	19.88±0.65
비교예 7	12.51±0.32	17.92±0.61
양성 대조군(silymarin)	8.68±0.44	9.87±0.13

그 결과, 상기 표 5에 나타난 바와 같이 독성물질인 t-BHP 처리에 의해 상승한 간세포의 ALT 및 AST는 비교예 1 내지 7의 2.5% 처리 농도에서 나타난 간세포 손상 지표 감소 활성 대비 실시예 1 내지 4의 2.5% 처리 농도에서 나타나는 간세포 손상 지표 감소 활성이 현저하게 우수한 것을 확인할 수 있었으며, 그 중에서도 실시예 1의 간세포 손상 지표 감소 활성이 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 3-4에 나타난 바와 같이 실시예 1의 식물 복합 추출물을 농도별로 처리하였을 때, 산화적 스트레스에 의해 손상된 HepG2 cell에서 간세포 손상 지표의 농도 의존적인 감소가 관찰되어, 간세포 보호 활성이 우수한 것을 확인하였다.

<실험예 4> t-BHP에 의한 산화 손상에 대한 지질과산화물 생성 억제 활성 : MDA(malondialdehyde) assay

t-BHP는 간세포 내에서 상당량의 자유라디칼(free radical)을 생성하게 되고, 이렇게 생성된 자유라디칼은 단백질과 핵산 및 세포막을 구성하는 불포화 지방산과 직접적 및 간접적으로 지질과산화반응을 일으켜 MDA(malondialdehyde) 형성을 초래함으로써 DNA에 손상을 주어 세포독성을 유도하는 등 세포손상과 세포사멸을 유도한다.

지질과산화는 lipid peroxidation (MDA) kit (sigma)를 이용하여 측정하였다. HepG2 cell을 6-well plate에 1X10⁶ cell/well의 농도로 세포를 분주한 후, 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 cell에 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 7의 식물 복합 추출물을 농도별로 배지와 혼합하여 각 well에 처리 후, 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양한 다음, t-BHP로 4시간 동안 산화 스트레스를 유도하였다. 산화 스트레스가 유도된 HepG2 cell을 DPBS로 1회 세척한 뒤 MDA lysis buffer 300uL와 butylated hydroxytoluene(BHT) 3uL를 넣고 세포를 모아준 후 sonication 방법으로 lysis하였다. lysis된 세포를 13,000g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 단백질 정량 후 실험에 사용하였다. 상층액 200uL와 TBA reagent 600uL를 넣은 후 95℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액을 ice에서 10분 동안 식힌 뒤 96-well plate에 200uL씩 옮긴 후 532nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 단백질 농도는 Bio-Rad Protein Assay kit(Bio-Rad)를 이용하여 595nm 파장에서 측정하였다. MDA 농도는 표준용액의 정량곡선을 기준으로 계산하였고, 아래의 수학식 5와 같이 MDA 생성량을 계산하여 nmole/mg protein으로 표기하였다. 이때, 양성 대조군으로 간 보호 작용이 있는 것으로 알려진 실리마린(silymarin)을 사용하여 진행하였다.

[수학식 5]

세포 내 지질과산화(MDA) 생성량(nmole/mg protein)=[(MDA 정량곡선에서 얻은 시료 처리군의 MDA 양/시료 부피(mL)) X 시료 처리군의 단백질 양(mg/mL)]

	MDA(nmol/mg protein)
음성 대조군	68.15±1.18
실시예 1	7.83±0.00
실시예 2	15.53±1.25
실시예 3	27.35±3.71
실시예 4	20.89±2.84
비교예 1	32.65±3.52
비교예 2	30.29±4.24
비교예 3	43.48±5.12
비교예 4	57.11±3.29
비교예 5	55.19±2.36
비교예 6	48.22±3.38
비교예 7	35.61±2.70
양성 대조군(silymarin)	11.98±0.19

그 결과, 상기 표 6에 나타난 바와 같이 비교예 1 내지 7의 2.5% 처리 농도에서 나타난 세포 내 MDA 생성량 대비 실시예 1 내지 4의 2.5% 처리 농도에서 나타나는 MDA 생성량 감소가 현저하게 우수한 것을 확인할 수 있었으며, 그 중에서도 실시예 1의 MDA 생성량 감소가 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 5에 나타난 바와 같이 실시예 1의 식물 복합 추출물을 농도별로 처리하였을 때, 산화적 스트레스에 의해 손상된 HepG2 cell에서 지질과산화 생성물인 MDA의 농도 의존적인 감소가 관찰되어, 간세포 보호 활성이 우수한 것을 확인하였다.

<실험예 5> t-BHP에 의한 산화 손상에 대한 비효소적 항산화 활성 : 세포 내 glutathione(GSH) 함량 측정

불포화 지방산이 풍부한 세포막은 생성된 free radical에 의해서 지질과산화의 표적이 되어 세포소기관들이 정상적인 구조 및 기능을 잃게 되며, 국소적인 손상은 물론 알데하이드와 같은 지질과산화 분해 산물이 생성부위에서 멀리 떨어진 부위로 이동하여 세포 손상을 일으키게 된다. 이러한 지질과산화를 일으키는 대표적인 물질인 tert-butyl hydroperoxide(t-BHP)는 배양 간세포에 저농도로 처리할 경우 간세포에서 cytochrome P-450 효소에 의해 세포 구성물들을 산화시킬 수 있는 alkoxy free radical이나 peroxyl free radical로 분해되며, 이러한 산물들이 DNA의 손상을 가져와 결국 세포를 죽이는 결과를 초래하여 간세포의 산화적 손상을 일으키는 실험 모델로 흔히 사용되고 있다. 이러한 free radical에 의한 생체의 산화적 손상은 catalase, superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(PGPX), glutathione-S-transferase(GST)와 같은 항산화효소와 vitamin A, vitamin C, vitamin E 및 glutathione(GSH)과 같은 비효소적 항산화물질에 의해 어느 정도 방어되어진다.

세포내 GSH는 항산화 활성의 지표로 glutathione assay kit(sigma)를 이용하여 다음과 같이 측정하였다. HepG2 cell을 6-well plate에 1X10⁶ cell/well의 농도로 세포를 분주한 후, 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 cell에 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 7의 식물 복합 추출물을 농도별로 배지와 혼합하여 각 well에 처리 후, 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양한 다음, t-BHP로 4시간 동안 산화 스트레스를 유도하였다. 산화 스트레스가 유도 된 HepG2 cell을 DPBS로 1회 세척한 뒤 5% 5-sulfosalicylic acid(SSA)를 300uL씩 넣어준 후 sonication 방법으로 lysis하였다. lysis된 시료를 10,000Xg에서 10분 동안 원심분리하여 얻어낸 상층액을 단백질 정량 후 실험에 사용하였다. 96-well plate에 상층액 10uL와 working mix solution 150uL를 넣어주었다. 실온에서 5분 동안 반응시킨 후 NADPH (0.16mg/mL) 50uL씩 넣어준 뒤 412nm 파장에서 5분 동안 1분 간격으로 흡광도를 측정하였다. 단백질 농도는 Bio-Rad Protein Assay kit(Bio-Rad)를 이용하여 595nm 파장에서 측정하였다. GSH 농도는 표준용액의 정량곡선을 기준으로 계산하였고, 아래의 수학식 6과 같이 세포 내 GSH 함량을 계산하여 nmole/mg protein 으로 표기하였다. 이때, 양성 대조군으로 간 보호 작용이 있는 것으로 알려진 실리마린(silymarin)을 사용하여 진행하였다.

[수학식 6]

세포 내 비효소적 항산화 활성(GSH) 함량(nmole/mg protein)={[(시료 처리군의 흡광도/glutathione 1nmole의 흡광도)/반응 시료 부피(mL)] X 시료 처리군의 단백질 양(mg/mL)}

	GSH(nmol/mg protein)
음성 대조군	20.41±8.84
실시예 1	108.52±4.05
실시예 2	83.97±6.22
실시예 3	50.52±5.25
실시예 4	69.39±4.53
비교예 1	41.22±7.24
비교예 2	38.16±5.52
비교예 3	35.93±6.44
비교예 4	31.71±5.63
비교예 5	33.98±4.29
비교예 6	36.40±3.58
비교예 7	43.23±4.31
양성 대조군(silymarin)	84.17±10.94

그 결과, 상기 표 7에 나타난 바와 같이 비교예 1 내지 7의 2.5% 처리 농도에서 나타난 세포 내 glutathione(GSH) 함량 증가 대비 실시예 1 내지 4의 2.5% 처리 농도에서 나타나는 세포 내 GSH 함량 증가가 현저하게 우수한 것을 확인할 수 있었으며, 그 중에서도 실시예 1의 세포 내 GSH 함량 증가가 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 6에 나타난 바와 같이 실시예 1의 식물 복합 추출물을 농도별로 처리하였을 때, 산화적 스트레스에 의해 손상된 HepG2 cell에서 세포 내 비효소적 항산화 활성 지표인 GSH 함량의 농도 의존적인 증가가 관찰되어, 간세포 보호 활성이 우수한 것을 확인하였다.

<제제예 1> 간기능 개선용 음료의 제조

아래의 표 8에 기재된 성분을 사용하여 통상의 방법에 의하여 간기능 개선용 음료를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 1의 식물 복합 추출물	30.00
구연산	0.30
올리고당	1.00
말토덱스트린	5.00
펙틴	1.00
혼합제제(비타민B군믹스)	0.10
정제수	잔량
계	100.0

<제제예 2> 간기능 개선용 아이스크림 제조

아래의 표 9에 기재된 성분을 사용하여 통상의 방법에 의하여 간기능 개선용 아이스크림을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 1의 식물 복합 추출물	20.00
안정제	0.30
말토덱스트린	5.00
과당	7.00
혼합제제(비타민B군믹스)	0.20
정제수	잔량
계	100.0

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

매실(Prunus mume), 유자(Citrus junos), 헛개나무열매(Hovenia dulcis Thunb.), 오가피(Acanthopanax sessiliflorum Seeman) 및 흑삼(Panax ginseng C. A. Meyer)의 식물 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 간기능 개선용 식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 식물 복합 추출물은 물, 주정 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 간기능 개선용 식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 식물 복합 추출물은 매실추출물, 유자추출물, 헛개나무열매추출물, 오가피추출물 및 흑삼추출물이 1~20:1~10:1~10:1~10:1~10의 중량비로 혼합되어 이루어진 것을 특징으로 하는 간기능 개선용 식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 식물 복합 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 간기능 개선용 식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 식물 복합 추출물은 간 독성 유발 물질로부터 간세포 보호 활성, ALT 감소 활성, AST 감소 활성, MDA 생성 저해 활성 및 GSH 증가 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 간기능 개선용 식품 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 간기능 개선용 식품.