KR20040052123A

KR20040052123A - 헛개나무 열매추출물을 유효성분으로 함유하는 간기능개선용 조성물

Info

Publication number: KR20040052123A
Application number: KR1020020079854A
Authority: KR
Inventors: 정중기
Original assignee: (주)광개토바이오텍
Priority date: 2002-12-13
Filing date: 2002-12-13
Publication date: 2004-06-19

Abstract

본 발명은 헛개나무 열매의 씨를 제거하여 얻은 과육을 세절하여 과육의 중량 대비 1∼10배의 물을 사입하여 1 내지 2기압, 80∼120℃로 1∼12시간 동안 열수추출하고, 상기 열수추출액을 여과하여 얻은 추출물을 65∼75 °Brix로 농축하고, 상기 농축물을 건조하고 분말화한 고체분산체를 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 조성물을 포함한다.

상기 구성에 의하면 간기능 개선에 효과적인 기능성 조성물을 제조할 수 있다. 또한 본 발명에 의해 제조된 헛개나무 열매추출물을 함유하는 조성물은 정제, 산제, 주사제 등의 각종 형태로도 제형화되어 농가의 부가가치를 제고할 수 있다.

Description

헛개나무 열매추출물을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 조성물{Functional Composition for Liver Containing Extracts of Fruits of Hovenia dulcis var.koreana}

본 발명은 헛개나무 열매추출물을 유효성분으로 함유하여 간기능 개선에 효과적인 기능성 조성물에 관한 것으로 보다 상세하게는, 헛개나무 열매의 씨를 제거하여 얻은 과육을 세절하여 과육의 중량 대비 1∼10배의 물을 사입하여 1 내지 2기압, 80∼120℃로 1∼12시간 동안 열수추출하고, 상기 열수추출액을 여과하여 얻은 추출물을 65∼75 °Brix로 농축하고, 상기 농축물을 건조하고 분말화한 고체분산체를 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 헛개나무는 갈매나무과의 낙엽교목으로서, 지구자나무라고도 칭하며, 한국(강원과 황해이남지역에 주로 분포), 일본, 중국 등에 분포되어 있다. 수피는 흑회색이며 작은가지는 갈자색으로 피목(皮目)이 있다. 겨울눈은 2개의 눈비늘로 싸여 있으며, 털이 있다. 잎은 8∼15cm이며 어긋나고 넓은 난형 또는 타원형으로 3개의 굵은 잎맥이 발달하고 가장자리에 잔 톱니가 있다. 열매는 갈색이 돌고 지름 8 mm 정도이며 닭의 발톱 모양으로, 열매의 3실에 각각 1개씩의 종자가 들어 있다.

헛개나무는 열매가 익을 무렵이면 과경(果莖)이 굵어져서 울퉁불퉁하게 된다. 은은한 향기가 있고, 단맛이 있어 먹을 수 있으며 음식 맛을 한결 돋운다. 약학서 본초강목에는 헛개나무가 술을 썩히는 작용이 있다고 하며 생즙은 술독을 풀고 구역질을 멎게 한다고 하였다.

헛개나무는 본초강목에 맛이 달고 평온하며 독성이 없으며, 오장을 부드럽게 하고 윤활하게 하며 대변, 소변을 잘 보게 하며 가슴에 번열을 없애주고 갈증을 풀어주며 술독을 풀고, 구토증을 제거하며, 충독을 없애고 다섯 종류의 치질을 치유한다고 되어있다.

현재까지 헛개나무 열매를 이용한 제품의 예로는 김치의 제조방법으로서, 2002-58589호가 공개된 바 있으나, 헛개나무 열매의 농축액으로부터 김치류에 첨가하여 함께 발효시키는 방법으로 발효과정에 수반된 활성성분의 손실이 우려되며,

국내특허 2002-22136호에 헛개나무의 껍질과 잎, 매실과 오이의 열탕 추출액 및 설탕, 허브를 첨가하여 사탕이나 음료형태로 만든 건강식품이 개시되어 있으나, 음료나 사탕에만 적용되는 제제상의 한계로 인해 폭 넓은 수요자층을 형성하는데는 한계를 가지고 있다.

본 발명은 상기한 종래 제제상의 한계를 극복하기 위해 안출된 것으로 본 발명의 목적은 간기능 개선에 효과적인 기능성을 갖춘 헛개나무 열매의 추출물을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 조성물을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 원료로 하여 제형화되는 과립제, 정제, 산제 또는 액제의 제형을 제공함에 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 헛개나무 열매의 씨를 제거하여 얻은 과육을 세절하여 과육의 중량 대비 1∼10배의 물을 사입하여 1 내지 2기압, 80∼120℃로 1∼12시간 동안 열수추출하고, 상기 열수추출액을 여과하여 얻은 추출물을 65∼75 °Brix로 농축하고, 상기 농축물을 건조하고 분말화한 고체분산체를 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 조성물을 포함한다.

상기 조성물은 과립제, 정제, 산제 또는 주사제로 제형화될 수 있으며, 이들 제형은 간기능 개선제의 용도로 제공될 수 있다.

이하 상기 본 발명의 구성을 그 작용과 함께 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명에 사용가능한 헛개나무 열매는 특별히 한정되는 것은 아니며, 현재 강원도 산야에 자생하는 것 내지는 국립수목원 등에서 자생하는 나무로부터 얻어지는 갈색의 지름 약 8 mm 정도의 열매로서 바람직하게는 종자는 제거한 상태의 것이 좋다.

과육의 적당한 크기는 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 0.1∼10mm 정도로 세절한 것이 좋다.

과육을 이용한 추출과정은 세절한 과육의 중량 대비 1∼10배의 물을 사입하여 1 내지 2기압, 80∼120℃의 열수로 1∼12시간 추출하는 것으로 충분하다.

상기 과정에 따라 얻어진 열수추출액은 공지의 여과장치를 이용해 여과시키고, 이때 얻어진 추출물을 65∼75 °Brix로 진공농축시킨다. 진공농축을 거친 추출물은 이후 통상적인 분무건조기를 이용하여 50~70℃ 조건 하에 분무건조시켜 고체분산체를 얻는다.

고체분산체를 이용해 과립제 및 기타 제제로 제형화하는 경우 배합가능한 부형제의 예로는 미세결정성 셀룰로오스, 셀룰로오스 분말, 셀룰로오스 아세테이트, 칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 콘 스타치, 락토스, 만니톨, 폴리비닐피롤리돈, 탈크, 덱스트린, 글루코스, 프럭토스, 말토스, 수크로스, 카올린, 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 옥사이드, 폴리메타크릴레이트의 군에서 선택되는 적어도 1종 이상의 성분 등이 있다.

또한 고체분산체와 배합가능한 결합제의 예로는 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 등을 포함하는 셀룰로오스 유도체, 알긴산, 소듐 알지네이트, 아카시아, 구아검, 폴리메타크릴레이트의 군에서 선택되는 적어도 1종 이상의 성분 등이 있다.

고체분산체를 유효성분으로 함유하는 기능성 조성물의 제조시 바람직하게는 0.5∼30 중량% 이내의 범위에서 배합된다. 만일 0.5중량% 미만으로 첨가되는 경우에는 헛개나무 열매 추출물내에 함유된 활성성분의 활성을 충분히 기대하기 곤란하며, 30중량%를 초과하게 되는 경우 첨가에 따른 추가적인 활성을 기대하는 것이 곤란하고, 오히려 관능에 악영향을 초래할 수 있다.

본 발명에 의한 상기 기능성 조성물은 각종 제제로 제형화되는 경우 통상의 첨가제가 첨가되어도 무방하다. 이러한 첨가제의 예로는 각종 영양제, 비타민류, 당류, 향미제, 활택제(콜로이달 실리콘디옥사이드 또는 스테아린산마그네슘 등), 착색제, 충진제, pH 조절제, 안정화제, 방부제 등이 추가로 첨가될 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.

<실시예 1> 고체분산체의 제조

종자를 제거한 갈색의 지름 8 mm 정도의 헛개나무 열매를 2mm 정도로 세절하였다. 세절한 과육의 중량 대비 10배의 물을 사입하고 1.5기압, 90℃의 열수로 4시간 동안 열수추출을 수행하였다.

열수추출액을 공지의 여과장치를 이용해 여과시키고, 이때 얻어진 추출물을 65 °Brix로 진공농축시켰다. 진공농축을 거친 추출물은 이후 통상적인 분무건조기를 이용하여 55℃ 조건 하에 분무건조시켜 고체분산체를 얻었다.

<실시예 2> 과립제의 제조

상기 실시예 1의 고체분산체 100g에 미세결정셀룰로오스 500g, 스테아린산 마그네슘 2g을 혼합하고 결합제로 5% PVP 수용액 1000ml로 과립을 제조하고 송풍건조하였다.

<실시예 3> 정제의 제조

<실시예 4> 산제의 제조

고체분산체 100g에 젖당 50g을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<실시예 5> 주사제의 제조

고체분산체 100mg에 주사용 증류수 잔량 및 pH 조절제로서 인산염 완충액을첨가하여 주사제를 제조하였다.

<실험예 1> 항암 및 세포독성실험

본 실험에 이용된 세포주는 암세포로 인간 간암세포인 Hep3B, 인간 폐암세포인 A549, 인간 유방암세포인 MCF7을 사용하였고 시료 자체의 세포 독성을 알아보기 위한 정상세포로는 인간 정상 간세포인 WRL68을 사용하였다. 실험에 사용된 세포들 중 Hep3B, MCF7, WRL68은 DMEM배지를 A549는 RPMI 1640배지에서 10% 가열비활성화 FBS로 적응시켜 배양하였다.

아래의 표 1에 인간유방암세포(%/mg/ml), 표 2에 인간 간암세포(%/mg/ml) 및 표 3에 인간 폐암세포(%/mg/ml)에 대한 각각의 항암활성 결과를 나타내었다.

<표 1> 인간유방암세포(%/mg/ml)

구분	MCF7(인간유방암세포)
구분	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
90℃, 1시간 열수추출물	15.70	30.23	65.87	72.23	81.76
효과기준	50%이상
검정방법	SRB

<표 2> 인간 간암세포(%/mg/ml)

구분	Hep3B(인간간암세포)
구분	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
90℃, 1시간 열수추출물	13.24	28.57	40.18	52.23	67.88
효과기준	50%이상
검정방법	SRB

<표 3> 인간 폐암세포(%/mg/ml)

구분	A549(인간폐암세포)
구분	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
90℃, 1시간 열수추출물	23	38	57	68	70
효과기준	50%이상
검정방법	SRB

헛개나무 열매추출물의 인간 유방암세포(MCF7), 인간 간암세포(Hep3B) 및 인간 폐암세포(A549)에 대한 생육억제 활성을 측정한 결과, 생육 억제 효과가 큰 것으로 확인되어 항암효과가 있는 것으로 나타났다.

세포독성은 SRB방법으로 세포 단백질을 염색하여 세포의 증식이나 독성을 측정하는 방법으로 실험 대상 세포인 WRL68, Hep3B, MCF7(10% FBS, DMEM 배지)과 A549(10% FBS, RPMI 1640 배지)의 농도를 4∼5×10⁴cell/㎖으로 96 well plate의 각 well에 100㎕씩 첨가하여 24시간 동안 배양(37℃, 5% CO₂)한 후, 각각의 시료를 최종농도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0㎎/㎖로 100㎕씩 첨가하여 48시간 배양하였다. 배양이 완료된 후에 상등액을 제거하고 차가운 10%(w/v) TCA 100㎕를 가하여 4℃에서 1시간동안 방치한 후 증류수로 4∼5회 세척하여 TCA를 제거하고 실온에서 플레이트를 건조한 후, 각 well에 1%(v/v) 초산에 녹인 0.4%(w/v) SRB용액을 100㎕씩 첨가하고 상온에서 30분 동안 염색시켰다. 결합되지 않은 SRB 염색액은 1% 초산으로 4∼5회 정도 세척, 건조시킨 후에 10mM 트리스버퍼 100㎕를 첨가하여 염색액을 녹여낸 후 540nm에서 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 흡광도를 측정하여 그 결과를 하기의 표 4에 나타냈다.

<표 4> 정상세포독성(%/mg/㎖)

구분	WRL68(정상간세포)
구분	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
90℃, 1시간 열수추출물	2.51	3.76	6.27	10.08	12.34
안전성 및 효과기준	50%이상
검정방법	SRB

사람 정상 간세포인 WRL-68에 대한 세포독성을 측정한 결과, 헛개나무 추출물의 세포독성은 낮은 것으로 확인되었다.

<실험예 2> 항돌연변이실험

Rec-검정법에 의해 균주를 프랑카 자니(Franca Zani, Italy)로부터 분양받은 바실러스 서브틸리스 PB 1652 rec+와 PB 1791 rec-이며 동결건조된 이 균주를 클린벤치에서 메스를 이용하여 영양아가(nutrient agar)를 고화시킨 페트리디쉬에 접종시킨 후 24∼48시간 배양을 하였다. 배양이 완료되면 멸균된 TSB 액체 배지에 1백금이 취하여 37℃에서 24시간 배양하여 실험에 사용하였다. 배양이 완료된 0.1㎖ spore 액이 첨가된 soft broth agar 10㎖를 페트리디시에 분주하여 고화시킨 후 페이퍼디스크를 올려놓고 열수추출물은 20㎕, 대조구인 MNNG는 10㎕ 접종하고 37℃에서 12∼24시간 배양한 후 돌연변이원성 및 항돌연변이원성을 측정하였다.

돌연변이원성은 무균 상태인 클린벤취 하에서 여러 돌연변이원성 물질 중 강한 돌연변이원 물질인 MNNG(2㎍/㎕)를 돌연변이원성 대조구로 하여 20㎍/paper disc의 양으로 멸균 처리된 paper disc에 첨가하였고 열수추출물을 4∼100㎍/paper disc가 되도록 첨가하고 rec(+)균과 rec(-)균에 의해 형성된 억제영역(㎝)의 차이로 돌연 변이원성을 측정하였다. 항돌연변이원성은 돌연변이원성을 확인한 후에 MNNG(10㎍/p.disc)와 열수추출물(50, 100㎍/p.disc)을 1 : 1 (10㎕:10㎕)로 혼합하여 돌연변이원성 측정과 같은 방법으로 배양한 후 각기 형성된 억제영역을 비교하여 각 추출물이 돌연변이원 물질인 MNNG의 돌연변이원성을 어느 정도 억제하는가를 rec(+)균과 rec(-)균의 차이영역(㎝)과 차이율(sample+MNNG / MNNG)로 나타내었다. 대조구는 MNNG만 처리한 것으로 하였다. 그 결과를 하기의 표 5에 나타냈다.

<표 5> 항돌연변이

구 분	amounttest(㎍/disc)	Inhibition halodiameter(cm)	differnce zone(cm)	differnce ratio(sample/MNNG)
구 분	amounttest(㎍/disc)	rec⁺	differnce zone(cm)	differnce ratio(sample/MNNG)	rec^-
90℃, 1시간 열수추출물	50	1.2	2.2	1.0	0.58
90℃, 1시간 열수추출물	100	1.1	1.6	0.6	0.53
MNNG	10	1.25	2.72	1.67	1
안정성 및 효과기준	0.55이하
검정방법	Rec-검정

헛개나무 열매추출물(50, 100㎍/paper disc)과 MNNG(10㎍/paper disc)를 1 : 1로 혼합하여 추출물 농도에 따른 돌연변이원 억제 효과의 실험결과 대조구인 MNNG(20㎍/paper disc)에 비해 MNNG와 열수추출물이 1 : 1로 혼합된 것이 비교적 높은 항돌연변이원성을 보였고, rec(+)와 rec(-)의 돌연변이가 일어난 영역 지름의 차이로 대조구(MNNG)와 비교하여 항돌연변이원성을 알아낼 수가 있었다.

<실험예 3> 혈당강하실험

생체 내에서 혈당 상승의 결정적인 역할을 하는 α-글루코시다제를 이용하여실험을 수행하였다. 먼저 효소를 10mM PIPES buffer에 용해시켜 효소액을 제조하고 20mM 말토스와 열수추출물을 각각 10㎕, 40㎕, 10㎕를 혼합하여 최종 부피를 60㎕로 열수추출물을 농도별로 혼합한 후 37℃에서 20분간 배양하였다. 반응액 60㎕에 1㎖ DNS 시약을 첨가하고 100℃ 물에서 열탕 처리(10min)하여 반응을 정지시킨 후에 540nm에서 흡광도를 측정하여 효소 반응으로 생성된 환원당을 정량하여 열수추출물을 처리하지 않은 대조구와 비교하여 효소활성 저해율을 계산하여 그 결과를 하기 표 6에 나타냈다.

<표 6> 혈당강하(%/mg/ml)

구 분	혈당강하효과
구 분	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
90℃, 1시간 열수추출물	24	28	35	58	73
효과 기준	50%이상
검정방법	α-글루코시다제

상기 실험결과 헛개나무 추출물의 경우 높은 혈당강하능을 보여 당뇨 조절을 위한 기능성 식품으로의 활용이 가능할 것으로 판단된다.

<실험예 4> 고혈압저해

ACE는 고혈압을 유도하는 효소이므로 이 효소의 억제 활성을 측정하기 위해 ACE 시약을 사용했다. 실험 전에 모든 반응물을 37℃로 유지시켜 놓은 후 37℃ 증류수 10㎖에 ACE 시약 1바이알을 용해시키고 1㎖씩 취하여 튜브에 넣었다. 각 튜브에 농도별 추출물과 ACE 캘리브레이터를 100㎕씩 첨가한 후 37℃에서 5분간 반응시켜 340nm에서 흡광도를 측정하여 이것을 초기 A 값으로 정하고 다시 5분이 지난 후 측정한 흡광도를 최종 A라 정하였다. 대조구로는 추출물 대신 증류수 100㎕를 첨가한 것으로 하였다. Control의 ACE(U/L) 값은 아무 것도 첨가하지 않았을 때의 흡광도 변화를 측정한 것으로 하였으며 ACE의 활성 계산은 다음 공식에 준하여 산출하여 그 결과를 다음의 표 7에 나타냈다.

ACE (U/L) = (초기 A - 최종 A)_실험군/(초기 A - 최종 A)_대조군×active of ACE reagent (50U/L)

<표 7> 고혈압 (%/mg/ml)

구 분	고혈압억제능
구 분	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
90℃, 1시간 열수추출물	23	30	51	62	73
효과 기준	50%이상
검정방법	ACE

상기 실험결과, 헛개나무 열수추출물은 약 80%에 가까운 높은 고혈압억제능을 나타내었다.

<실험예 5> 간기능개선

간의 해독작용 정도를 측정하기 위하여 간의 중요 해독기전 중의 하나인 GST의 활성을 측정하였다. 조제된 반응시약에 대조구로 추출물이 제외된 반응액을 대조구로 하였으며, 열수추출물을 농도별로 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 다음 기질로서 1-클로로-2,4디니트로벤젠을 첨가한 후 다시 37℃에서 2분간 반응시켰다.

반응후 20% TCA를 가하여 반응을 종결시키고 원심분리한 후 상등액을 340nm에서 흡광도를 측정한 뒤 다음과 같이 GST의 비활성과 활성율을 계산하여 하기의 표 8에 나타냈다.

총활성(units) = (A₃₄₀/ 9.6) × 희석배수 × (3ml / 0.1) ×조추출물(㎖)

비활성( units/㎖ protein ) = 총활성 /총단백

활성율 (%) = 비활성_실험구/비활성_대조군×100

<표 8> 간기능개선(%/mg/ml)

구 분	간기능개선효과
구 분	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
90℃, 1시간 열수추출물	180	201	241	285	309
효과 기준	100%이상
검정방법	GST

상기 실험결과 본 발명의 실험군이 대조군의 GST 활성인 7613.32보다 약 3배 가량 증가하였다.

본 발명에 의하면 간독성 해소에 효과적인 기능성 조성물을 제조할 수 있다. 또한 본 발명에 의해 제조된 헛개나무 열매추출물을 함유하는 조성물은 정제, 산제, 주사제 등의 각종 형태로도 제형화되어 농가의 부가가치를 제고함에 크게 기여할 수 있다.

Claims

헛개나무 열매의 씨를 제거하여 얻은 과육을 세절하여 과육의 중량 대비 1∼10배의 물을 사입하여 1 내지 2기압, 80∼120℃로 1∼12시간 동안 열수추출하고, 상기 열수추출액을 여과하여 얻은 추출물을 65∼75 °Brix로 농축하고, 상기 농축물을 건조하고 분말화한 고체분산체를 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 조성물
제 1항에 있어서,

상기 고체분산체에 부형제 또는/및 결합제가 배합된 간기능 개선용 조성물
제 2항에 있어서,

부형제는 미세결정성 셀룰로오스, 셀룰로오스 분말, 셀룰로오스 아세테이트, 칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 콘 스타치, 락토스, 만니톨, 폴리비닐피롤리돈, 탈크, 덱스트린, 글루코스, 프럭토스, 말토스, 수크로스, 카올린, 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 옥사이드, 폴리메타크릴레이트의 군에서 선택되는 적어도 1종 이상의 성분이 배합됨을 특징으로 하는 간기능 개선용 조성물
제 2항에 있어서,

결합제는 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 등을 포함하는 셀룰로오스 유도체, 알긴산, 소듐 알지네이트, 아카시아, 구아검, 폴리메타크릴레이트의 군에서 선택되는 적어도 1종 이상의 성분임을 특징으로 하는 간기능 개선용 조성물
제 2항 또는 제 3항에 있어서,

원료의 배합시 활택제로 콜로이달 실리콘디옥사이드 또는 스테아린산마그네슘이 더 첨가됨을 특징으로 하는 간기능 개선용 조성물
제 1항에 있어서,

고체분산체는 0.5∼30 중량% 첨가됨을 특징으로 하는 간기능 개선용 조성물
제 1항에 있어서,

상기 조성물은 과립제, 정제, 산제 또는 주사제로 제형화됨을 특징으로 하는 간기능 개선용 조성물