KR101432584B1 - 생리활성물질 함량이 증가된 증숙 및 발효된 더덕의 제조방법 - Google Patents

생리활성물질 함량이 증가된 증숙 및 발효된 더덕의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 더덕의 증숙 및 발효 공정을 이용한 생리활성 증진방법에 관한 것으로 더덕을 55~65℃에서 30~40시간 동안 건조하거나 증숙처리공정을 거친 시료를 55~65℃에서 20~30시간 동안 열수추출공정을 거친 후 발효하는 것을 특징으로 한다. 증숙발효, 증숙비발효, 비증숙발효, 비증숙비발효의 4가지 처리를 한 더덕추출물을 총페놀함량, 총플라보노이드함량, 항산화능 측정,항균활성 측정, α-글루코시데이즈 활성 저해 평가, 티로시나아제 활성 저해 평가, AChE 효소활성 저해 평가를 하여 증숙 및 발효공정을 한 더덕추출물에 항산화력, 항미생물 효과, 항당뇨효과, 인지기능 개선 등의 생리 활성 성분을 증진시킬 수 있음을 확인하여 궁극적으로 당뇨 및 뇌질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있는 의약품 및 식품첨가제, 음료조성물로도 적용이 가능한 특징이 있다.

Description

생리활성물질 함량이 증가된 증숙 및 발효된 더덕의 제조방법{Method for steamed and fermented Codonopsis lanceolata for boosting biological activity}
본 발명은 항산화력, 항미생물 효과, 항당뇨효과, 인지기능 개선 등의 생리 활성 성분을 증진시킬 수 있는 증숙 및 발효 공정을 거친 더덕의 제조방법에 관한 것이다.
더덕(Codonopsis lanceolata)은 쌍떡잎식물 합판화군 초롱꽃과(Campanulaceae)에 속하는 여러해살이 덩굴식물로 우리나라를 비롯한 일본, 중국에 분포하며, 사삼 또는 백삼이라고도 부른다. 재배역사는 오래지 않고 주로 야생에서 자라는 것을 채취하여 잔대대용 한약재와 식용으로 하던 것을 순화재배 하게 되었다. 우리나라에서는 예부터 더덕의 뿌리를 약용 또는 식용으로 널리 사용하여 왔고, 한방에서는 해독, 강장, 거담, 진해 등의 효능이 있고, 기관지염, 편도선염, 궤양, 폐결핵, 천식 등에 효과가 있는 것으로 알려져 예로부터 사삼이라 불리며 인삼대용으로 널리 이용되어 왔다. 또한, 더덕 뿌리는 항염증, 항궤양제 등으로 많이 사용하였을 뿐 아니라 간과 위, 폐 신장의 작용을 강화시켜 주는 약재로도 사용해 왔다.
또한, 더덕은 독특한 풍미로 인해 구이나 절임 식품을 비롯하여 생으로도 많이 이용되고 있으며, 일부 가공식품의 원료로도 사용되고 있다. 그러나, 잠재적 이용가치에 비해 아직은 그 활용이 매우 제한되어 있는 실정이다.
따라서 현재까지 알려진 더덕의 여러 약효는 물론 새로운 생리적 기능을 과학적으로 규명함으로써 더덕의 식품학적 우수성을 입증함과 함께 이를 이용한 고부가가치 식품소재 및 가공식품을 개발하는 것은 학문적, 기술적 측면 뿐 아니라 경제적 면에서 그 의의가 매우 클 것이다.
본 발명과 관련된 선행문헌 중 한국공개특허 제 2010-0045237 호에는 더덕 발효물이 더덕의 유용성분을 증진시킬 수 있다는 것이 개시되어 있고, 한국등록특허 제 0813652 호에는 증숙 및 건조단계를 반복한 증숙 더덕의 제조방법에 대해 개시되어 있으나 그 생리활성 효과가 미미하다는 아쉬움이 있다.
이에 본 발명자들은 더덕의 다양한 생리활성을 극대화 할 수 있는 방법을 연구하였으며, 그 결과 본 발명에 따른 증숙 및 발효 공정을 거친 더덕 추출물이 증숙 또는 발효 공정을 거치지 않은 더덕 추출물보다 항산화력, 항미생물 효과, 항당뇨효과, 인지기능 개선 등의 효과가 탁월하게 증가됨을 확인하였다.
따라서 본 발명의 목적은 더덕을 가공하여 더덕이 가지고 있는 다양한 생리활성을 극대화할 수 있는 증숙 및 발효 공정을 거친 더덕 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,
(a) 더덕을 85~95℃에서 100~140분 동안 열처리하여 증숙하는 단계;
(b) 증숙 처리한 더덕을 55~65℃에서 30~40시간 동안 건조하는 단계; 및
(c) 건조한 더덕을 분쇄하고 발효 균주를 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는 생리활성물질의 함량이 증가된 더덕의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a)단계에서 증숙 처리한 더덕은 건조 단계 이전에 55~65℃에서 20~30시간 동안 열수 추출하여 더덕 추출물을 수득하는 단계일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b)단계에서 더덕을 증숙하고 건조하는 단계는 4~6회 반복 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (c)단계에서 발효시키는 단계는 더덕 분쇄물 중량에 대해 7~10배(w/w)의 증류수를 가하고 발효 균주를 접종하여 35~37℃에서 7~10일간 혐기적 조건으로 배양하는 방법일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (c)단계에서 발효균주는 105 CFU/g~107 CFU/g으로 접종하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (c)단계에서 발효균주는 Lactobacillus rhamnosus 일 수 있다.
또한, 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (c)단계에서 생리활성물질은 폴리페놀 또는 플라보노이드일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서 상기의 제조방법으로 제조된 더덕은 항산화 효과, 항균 효과, 혈당강하 효과 및 인지기능개선 효과 등을 가질 수 있다.
더덕에 증숙 및 발효 공정을 처리하여 더덕의 유효성분 함량을 증진하고 항산화, 항균, 항당뇨 등의 다양한 생리활성 작용을 향상시킨다는 점에 특징이 있으며, 궁극적으로 이러한 점을 이용하여 기능성 의약품, 식품첨가제, 음료조성물, 사료첨가제의 제조에 이용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 증숙발효(S-LF), 증숙비발효(S-NF), 비증숙발효(NS-LF), 비증숙비발효(NS-NF)의 4가지 처리를 한 더덕추출물의 DPPH 소거능을 비교한 그래프이다.
도 2는 증숙발효(S-LF), 증숙비발효(S-NF), 비증숙발효(NS-LF), 비증숙비발효(NS-NF)의 4가지 처리를 한 더덕추출물의 AChE 의 저해활성을 비교한 그래프이다.
본 발명은 항산화력, 항미생물 효과, 항당뇨효과, 인지기능 개선 등의 생리 활성 성분을 탁월하게 증진시킬 수 있는 증숙 및 발효 공정을 통한 더덕 추출물의 제조방법을 제공함에 그 특징이 있다.
더덕의 대표적 약효 성분인 사포닌은 항암, 면역증강, 혈압강하 등 매우 다양한 효능을 가지는 것으로 알려져 있으나, 그 외 더덕에 관한 연구는 인삼 및 홍삼류에 비해 아직 활발히 진행된 상태가 아니며 기존의 연구가 주로 재배 및 육종에 관한 것이었다.
이에 본 발명자들은 더덕 내 생리활성물질의 함량을 증가시킬 수 있는 특유의 온도 및 시간 조건의 증숙 및 발효 공정을 거친 더덕 및 더덕 추출물의 제조방법을 규명하였다. 본 발명에 따른 제조방법을 통해 제조된 더덕 및 이의 추출물은 기존의 더덕 및 이의 추출물과 비교해 탁월한 생리활성 효과를 나타낸다는 효과가 있다.
본 발명에 따른 더덕추출물의 제조방법은, (a)더덕을 열처리하여 증숙하는 단계; (b)증숙 처리한 더덕을 건조하는 단계; 및 (c)건조한 더덕을 분쇄하고 발효 균주를 이용하여 발효시키는 단계를 포함한다.
상기 본 발명에 따른 더덕추출물의 제조방법을 단계별로 보다 세부적으로 설명하면 다음과 같다.
제1단계: 더덕을 열처리하여 증숙하는 단계
본 발명에서 더덕은 야생에서 채취한 산더덕과 인공에서 재배한 밭더덕을 모두 사용할 수 있고, 시장에서 용이하게 구입하여 사용할 수 있다.
상기 준비한 더덕은 우선 깨끗이 세척하고 손질한다. 이때, 세척하는 횟수는 더덕의 양 및 상태에 따라 1~3회 정도 선택하여 수행할 수 있다. 세척이 끝나면, 더덕은 85~95℃ 온도에서 100~140분 동안 열처리하여 증숙한다. 본 증숙은 4~6회 반복되어야 하므로, 상기 증숙 온도 및 시간 조건이 본 발명의 목적에 가장 적합하다. 본 증숙은 증숙기를 이용하여 실시할 수 있으며, 더덕에서 증발된 수분이 더덕에 다시 닿지 않도록 더덕의 양을 조절하여 적용될 수 있다.
상기 증숙된 더덕을 55~65℃에서 20~30시간 동안 열수 추출하여 얻어진 수득물은 선택적으로 이후 공정에 사용할 수 있다.
제2단계: 증숙 처리한 더덕을 건조하는 단계
상기 제1단계의 증숙단계를 통해 증숙된 더덕은 건조하는 단계를 거치는데,더덕의 건조는 양건건조, 음건건조, 열풍건조 또는 자연 건조의 방법을 통해 시행될 수 있으나, 열풍건조가 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 더덕의 건조는 55~ 65℃의 온도 조건에서 30~40시간 동안 열풍건조를 통해 이뤄진다.
또한, 상기 제1단계의 증숙과 본 제2단계의 건조 처리 공정은 4~6회 반복 수행하는 것이 가장 바람직하다. 4~6회 정도 더덕이 연속적으로 증숙 및 건조되어야 생리활성 물질의 함량이 가장 극대화 되기 때문이다.
제3단계: 건조한 더덕을 분쇄하고 발효 균주를 이용하여 발효시키는 단계
상기 1~2 단계를 거친 증숙 및 건조된 더덕은 분쇄하는 단계를 거친다. 분쇄크기에 제한이 있는 것은 아니나 추출효율을 증대시키기 위하여 본 발명의 실시예에서는 20 ~ 100mesh 로 분쇄하였다.
분쇄한 더덕은 이후 발효시키게 되는데, 발효 단계에서는 더덕 분쇄물 중량에 대해 7~10배(w/w)의 증류수를 가하고, 발효 균주를 접종한 후 35~37℃ 온도에서 7~10일간 혐기적 조건으로 배양한다.
이러한 단계를 통해 본 발명의 더덕 및 상기 배양액인 더덕 발효 추출물이 완성될 수 있다. 또한 상기 추출물은 이후, 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다.
구체적으로 상기 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압 농축기, 일예로 회전 증발기를 이용하여 감압 농축할 수 있으며, 상기 건조는 일예로 동결건조법으로 수행할 수 있다. 또한, 상기 수득한 더덕 추출물은 사용 시까지 급속 냉동 냉장고(deep freezer)에 보관할 수 있고, 농축 및 동결건조를 통하여 수분을 완전히 제거시킬 수 있으며, 상기 수분을 완전히 제거시킨 패과 식물 추출물은 분말형태로 사용하거나 상기 분말을 증류수 또는 통상의 용매에 녹여 사용할 수 있다.
본 발효 단계에 사용하는 미생물은 미국 식약청에서 안전성 및 안정성을 인정하는 GRAS 미생물을 포함하여 식품에 사용하여 인체에 무해하고 유익한 기능성을 나타내는 활성 유용미생물을 사용할 수 있으며 당업자가 통상적으로 인식할 수 있는 모든 종류의 발효 미생물을 대상으로 할 수 있으나, 가장 바람직하게는 Dr. Azlin Mustapha (University of Missouri, MO, USA)에 의해 제공된 발효균주인 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus)를 사용한다. 더불어 상기 균주는 105 CFU/g~107 CFU/g의 범위로 접종하는 것이 가장 바람직하다.
한편, 본 발명자들은 본 발명에 따라 제조된 증숙 및 발효 처리된 더덕추출물이 실제로 항산화력이 있는지 여부를 조사하였는데, 즉, 증숙발효, 증숙비발효, 비증숙발효, 비증숙비발효의 4가지 처리를 한 더덕추출물의 총페놀함량, 총플라보노이드 함량을 조사한 결과, 본 발명에 따른 증숙 및 발효 공정을 거친 더덕 추출물이 총 페놀함량, 총 플라보노이드 함량이 탁월하게 높음을 알 수 있었다(표 1 참조).
상기 함량이 증가한 생리활성물질은 폴리페놀 또는 플라보노이드일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, DPPH 소거율을 이용하여 본 발명에 따른 더덕의 추출물의 항산화 효과를 측정하였는데, 그 결과 증숙 또는 발효공정을 거치지 않은 것과 비교해 본 발명에 따른 더덕의 추출물이 DPPH 소거율이 뛰어나 유의적으로 항산화 효과가 증가됨을 알 수 있었다(도 1 참조).
또한, 본 발명자들은 본 발명의 실시예에 따라 활성 배양균주의 최소저해농도를 측정하는 방법으로 항균효과를 측정하였는데, 그 결과 본 발명에 따른 증숙 및 발효 공정을 거친 더덕의 추출물이 그램 양성균 및 그램 음성균의 활성을 탁월하게 억제함을 나타내었다(표 2 참조).
또한, 본 발명의 일실시예에 따르면 본 발명에 따른 더덕의 추출물이 α-글루코시데이즈 활성 및 티로시나아제 활성을 효과적으로 저해함을 알 수 있었다(표 3 참조) 더불어, 아세틸콜린에스터라아제(AChE) 효소활성을 저해 평가 결과, 본 발명에 따른 더덕의 추출물이 뛰어난 AChE 효소 억제 활성을 보임을 확인할 수 있었다(도 2 참조).
따라서 본 발명의 상기의 결과를 통해, 본 발명에 따른 증숙 및 발효 공정을 통한 더덕 및 이의 추출물은 생리활성물질의 함량을 크게 증가시킬 뿐만 아니라 여러 생리활성 효과 또한 탁월하게 향상시킴을 알 수 있다.
그리하여, 본 발명에 따른 더덕 및 이의 추출물은 효과적인 약제학적 조성물, 구체적으로 항산화 조성물, 항균 조성물, 항당뇨 조성물 또는 아세틸콜린에스터라아제 억제용 조성물과 같은 인지기능개선 효과를 지닌 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 조성물과 같이 활용될 수 있으며, 더 나아가 상기 용도를 위한 식품용 조성물로 이용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 추출물을 유효성분으로서 그 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 더덕 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 ~ 30 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약제학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 해당 질환의 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있고, 천연물로서 인체의 별다른 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.
한편, 상기 본 발명에 따른 추출물을 유효성분으로 하는 조성물은 상기 개시되어 있는 항산화, 항균, 항당뇨 또는 아세틸콜린에스터라아제 억제를 통한 인지기능개선 효과를 지닌 퇴행성 질환 예방 또는 증상 개선용 식품용 조성물로 사용할 수 있다. 그리하여 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.
본 발명에서 상기 식품이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
본 발명에 따른 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물 공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본원발명에서 상기 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본원발명의 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
그러므로 본 발명은 본 발명에 따른 더덕 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품을 제공할 수 있으며, 상기 식품의 형태는 이에 제한되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
재료 준비
생더덕(Codonopsis lanceolate)은 강원도 횡성지역에서 2010년 9월에 채취한 하위품을 구입하였으며, 구입한 더덕은 세척한 후 60℃에서 5일간 건조하거나 증숙처리공정을 거친 시료를 60℃에서 24시간 동안 열수추출공정을 거친 후 건조 및 증숙 더덕추출물을 발효공정에 사용하였다.
Folin-Ciocalteu reagent,DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), 갈릭산(gallic acid), 루틴(rutin), PIPES(1,4-piperazine-diethanesulfonic acid), DNS(3,5-dinitrosalicylic acid), α-글루코시데이즈, 티로시나아제, 말토즈, L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine),AChE(acetylcholinesterase), DTNB(5,5’-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)), ATC(acetylthocholine iodine)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
< 실시예 2>
증숙처리 및 발효 공정
생더덕을 증숙처리하기 위하여 90℃에서 2시간 동안 열처리하였다. 그리고 60℃에서 36시간 동안 건조하는 처리공정을 거쳤는데, 상기의 증숙 및 건조 공정을 5회 반복 수행하였다. 상기 증숙 및 건조된 더덕은 100 mesh 이하로 분쇄하여 발효에 이용하였다. 100g의 더덕 시료에 8배(w/w)의 증류수를 가하고 Dr. Azlin Mustapha(University of Missouri, MO, USA)에 의해 제공된 발효균주인 Lactobacillus rhamnosus를 약 10 CFU/g 접종한 후, 37℃에서 7일간 혐기적 조건에서 배양하였다.
상기 과정을 통해 얻어진 더덕 발효 추출물은 감압여과 및 농축한 후 동결 건조하여 분말을 얻어 이화학적 특성 및 생리활성 평가를 위한 실험에 사용하였다. 비증숙과 비발효된 더덕추출물(NS-NF, non-steamed and non-fermented extract)을 대조군으로 하여 처리군인 비증숙과 발효된 더덕추출물(NS-LF, non-steamed and L. rhamnosus fermented extract), 증숙과 비발효된 더덕추출물(S-NF, steamed and non-fermented extract),증숙과 발효된 더덕추출물(S-LF, steamed and L. rhamnosus fermented extract)을 비교 평가하였다.
< 실시예 3>
총 페놀 및 총 플라보노이드 함량 측정
더덕추출물의 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 방법을 이용하여 측정하였다. 0.1 g의 더덕추출물을 1 mL인 10% Folin-Ciocalteu reagent와 혼합하고 25℃에서 5분간 방치한 후 혼합물을 10% 소디엄 카보네이트(sodium carbonate) 용액과 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 표준검량선은 갈산(gallic acid; GA)을 0~512 mg/mL의 농도로 희석하여 더덕 시료 방법과 동일하게 반응시켜 760 nm에서 흡광도를 측정하였고 총 페놀 함량은 갈산의 당량가(mgGAE/mL)로 표시하였다.
또한, 더덕추출물의 총 플라보노이드 함량은 스펙트로메트릭 방법(Spectrometric method)으로 측정하였다. 0.1g의 추출물을 0.8mL의 90% 디에틸렌 글리콘과 0.02 mL인 4 M NaOH를 반응시킨 후 40℃에서 10분간 방치하였다. 표준 검량선은 루틴을 0~256 mg/mL의 농도로 희석하여 더덕 시료 방법과 동일하게 반응시켜 420nm에서 흡광도를 측정하였고 총 플라보노이드 함량은 루틴의 당량가(mgGAE/mL)로 표시하였다.
증숙과 발효가 더덕추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과 비증숙비발효된 더덕추출물(NS-NF)과 비증숙발효된(NS-LF) 더덕추출물의 폴리페놀 함량은 10mg/g 이하인 반면 증숙비발효(S-NF)된 더덕추출물과 증숙발효된 더덕추출물(S-LF)에서 26mg/g 이상의 높은 폴리페놀 함량을 보였다. 또한 비증숙비발효된 더덕추출물(NS-NF)과 비증숙발효된(NS-LF) 더덕추출물의 플라보노이드 함량은 2mg/g 이하인 반면 증숙과비발효(S-NF)된 더덕추출물과 증숙발효된 더덕추출물(S-LF)에서 7mg/g 이상의 높은 플라보노이드 함량을 보임을 확인하였다. 특히, 본 발명에 따른 더덕 추출물은 다른 더덕 추출물과 비교해 월등히 높은 총 페놀 함량 및 플라보노이드 함량을 나타내었다(표 1 참조).
본 발명에 따른 더덕의 추출물의 총 페놀 및 플라보노이드 함량
처리 총 페놀(mg GAE/g) 플라보노이드(mg RE/g)
비증숙비발효
(NS-NF)		 8.90±1.01b 1.84±0.21b
비증숙발효
(NS-LF)		 9.54±0.35b 1.80±0.35b
증숙비발효
(S-NF)		 26.15±1.42a 8.07±1.42a
증숙발효
(S-LF)		 26.78±1.55a 7.80±1.55a
< 실시예 4>
DPPH 를 이용한 항산화 효과 측정
DPPH는 화학적으로 안정한 자유 라디칼을 지니고 있는 화합물로 항산화 활성을 가진 물질을 만나면 환원되어 항산화 능력을 확인하는데 널리 사용되는 물질이다. 이에, 본 실시예에서는 DPPH를 이용하여 비증숙비발효 처리, 비증숙발효 처리, 증숙비발효 처리, 증숙발효 처리된 더덕 추출물의 자유 라디칼 소거효과(DPPH에 대한 수소 공여능)를 평가하여 항산화 효과를 평가하였다.
0.1g의 더덕추출물을 0.5ml인 0.2mM DPPH 라디칼과 혼합하고 25℃에서 30분간 방치한 후 흡광도를 517nm에서 측정하였다. 또한 항산화력은 다음 식에 의해 계산되었다.
DPPH 소거율(%) = [1(AE/AC)]× 100
(A= control의 흡광도, AE=추출물의 흡광도)
더덕추출물의 DPPH 소거능 비교 그래프를 확인한 결과, 비증숙비발효된 더덕추출물(NS-NF)이 가장 낮은 항산화 효과를 보임을 알 수 있었으며, 본 발명에 따른 증숙발효(S-LF) 추출물이 가장 뛰어난 항산화력이 있음을 알 수 있었다(도 1 참조).
< 실시예 5>
항균효과 측정
더덕추출물의 항미생물 활성은 Clinical Laboratory Standards Institute(CLSI)방법에 따라 평가하였다. 인디케이터 균주로 Listeria monocytogenes KACC 12671, Staphylococcus aureus KACC 10196, Shigella boydii KACC 10792, Salmonella typhimurium KCCM 40253을 농업유전자원정보센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC; Suwon, Korea)와 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM; Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 인디케이터를 TSB에 접종하고 37℃에서 24시간 배양하여 약 10CFU/mL의 활성 배양 균주를 얻었다.
또한 더덕 추출물의 항미생물 효과는 최소저해농도(MIC, minimum inhibitory concentration)로 평가하였다.
그 결과, 비증숙비발효 처리된 더덕 추출물(NS-NF)의 경우 S. aureus , L. monocytogenes, S. Typhimurium , S. boydii에서 MIC 값이 모두 60mg/mL이상으로 낮은 항미생물 효과를 보였으나, 본 발명에 따른 증숙발효(S-LF)처리된 군은 S. aureus, L. monocytogenes , S. Typhimurium , S. boydii에 대해 MIC 값이 10mg/mL 이하로, 압도적으로 높은 항미생물 효과를 보였다(표 2 참조).
본 발명에 따른 더덕의 추출물의 항균 효과 분석
처리 MIC(mg/mL)
S. aureus L. monocytogenes S. Typhimurium S. boydii
비증숙비발효
(NS-NF)		 88.35±3.67a,x 62.96±10.91a,y 75.70±7.36a, xy 82.10±5.16a, xy
비증숙발효
(NS-LF)		 16.67±0.91c,x 7.28±0.77b,y 9.21±0.98bc ,y 8.22±0.49c,y
증숙비발효
(S-NF)		 34.62±1.75b,x 15.31±4.67b,y 18.31±1.87b,y 21.72±4.02b,y
증숙발효
(S-LF)		 8.85±0.39d,x 6.64±1.03b,x 7.13±1.10c,x 7.76±0.70c,x
< 실시예 6>
α- 글루코시데이즈 활성 억제능 시험
더덕추출물의 잠재적 항당뇨 효과가 있는지 여부를 확인하기 위하여 당뇨병환자의 식후 급격한 혈당 상승을 억제하는 α-글루코시데이즈를 측정하였다.
더덕추출물을 4~32 mg/mL로 희석하여 각 20을 0.1M 1,4-piperazine-diethanesulfonic acid(PIPES, pH 7.0)에 녹인 20mM 말토즈와 50 U/mL α-글루코시데이즈 (40 )를 37℃에서 20분간 반응시켰고 혼합액에 DNS 시약 1 mL를 첨가하고 100℃에서 10 분간 반응 후 실온에 방치한 후 효소반응으로 생성된 환원당의 정량반응을 측정하기 위해 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
α-글루코시데이즈 활성 저해는 다음 식에 의해 계산하였다.
α-글루코시데이즈 활성억제능(%) = [1-(AE-AB)/(AC-AB)]× 100
(AE: 반응액의 흡광도, AB: blank의 흡광도, AC: control의 흡광도)
그 결과, α-글루코시데이즈 효소활성은 비증숙비발효(NS-NF)처리된 더덕추출물이 9.9mg/mL인 것과 비교할 때 비증숙증숙(NS-LF)처리군, 증숙비발효(S-NF)처리군, 증숙발효(S-LF)처리군은 유의적으로 낮은 값을 보였다(표 3 참조). 특히 증숙과 발효처리를 병행한 본 발명에 따른 더덕추출물이 가장 뛰어난 효과를 보이는 것으로로 나타났다.
따라서, 본 발명에 따른 증숙과 발효처리를 병행한 더덕추출물은 당뇨병과 관련 있는 것으로 알려진 α-글루코시데이즈의 활성을 저해하여, 당뇨병 예방 및 치료에도 사용할 수 있다는 점을 확인하였다.
본 발명에 따른 더덕의 추출물의 글루코시데이즈 및 티로시나아제 억제 활성 분석
처리 Glucosidase activity Tyrosinase activity
비증숙비발효
(NS-NF)		 9.94±0.91a 16.33±0.26a
비증숙발효
(NS-LF)		 4.50±0.34b 5.79±0.66c
증숙비발효
(S-NF)		 4.71±0.28b 7.99±0.68b
증숙발효
(S-LF)		 3.09±0.38b 4.78±0.65c
< 실시예 7>
티로시나아제( Tyrosinase )활성 저해 평가
티로시나아제 활성 억제력은 dopachrome 방법을 이용하여 측정하였다.
발효 더덕추출물을 2~128mg/mL로 희석하여 각 20을 1.5mM L-DOPA (25 ), 50 mM 포스페이트 버퍼 (25 , pH 6.8), 500 U/mL 티로시나아제 (30 )와 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시켰으며 반응물은 490nm에서 각각의 흡광도를 측정하였고 티로시나아제 억제율은 다음 식에 의해 계산하였다.
Tyrosinase inhibition ratio(%)=[1-(AC-AD)/(AA-AB)]×100
그 결과 다른 더덕 추출물 처리군과 비교하여, 본 발명에 따른 증숙 및 발효처리된 더덕 추출물군은 4.8mg/mL으로 가장 효율적으로 티로시나아제 활성을 저해하는 것으로 나타났다(표 3 참조).
따라서, 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 더덕 추출물을 식품, 의약품 및 화장품 제조에 티로시나아제 억제소재, 즉 미백 화장품 조성물로서 사용 가능함을 확인할 수 있었다.
< 실시예 8>
AChE 활성 저해 평가
치매 등 만성 퇴행성 뇌질환은 아세틸콜린을 만들어내는 신경세포의 퇴화와 함께 AChE(acetylcolinesterase)의 증가로 더욱 심화됨이 알려져 있다. 이에 증숙 및 발효처리된 더덕추출물이 만성퇴행성뇌질환의 치료에도 이용될 수 있는지를 알아보기 위하여 AChE 효소활성 저해도를 측정해보았다.
AChE 효소활성 저해는 colorimetric 방법에 의해 측정하였으며 AChE 와 ATC는 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 8.0)에 녹여 각각 0.04U/mL과 75mM을 제조하였다.
6mg의 DTNB를 15mg NaHCO₃을 함유한 0.1M 포스페이트버퍼(pH 7.0) 10mL에 녹여 buffered Ellman reagent를 제조하였다. 25 의 더덕추출물과 25 의 AChE 을 혼합하여 25℃에서 10분간 동안 항온 후 Ellman reagent (125 )를 첨가하여 25℃에서 5분 동안 예비 반응시켰다. 혼합액에 25의 ATC를 가하여 25℃에서 20분 동안 반응에 따라 412nm에서 흡광도를 측정하였다. Reagent blank에 의해 비효소적 가수분해 반응을 보정하였고 AChE 효소활성 저해(%)를 계산하였다.
그 결과, 본 발명에 따른 더덕 추출물 군이 AChE 효소활성 저해도인 IC 값이 31 mg/mL로 가장 높은 AChE 저해활성을 보임을 알 수 있었다(도 2 참조). 따라서 본 발명자들은 증숙 및 발효 더덕이 인지기능성 개선에 도움을 줄 수 있음을 확인하였다.
통계분석
실험결과의 통계처리는 3회 반복 실험한 자료를 Statistical Analysis System (SAS Institute,Inc., Cary, NC, USA)에 의해 분석하였다. 처리군의 통계적 처리는 분산분석(ANOVA)을 수행하여 Duncan 다중비교로 유의성을 검증하였다 (p<0.05).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

  1. 더덕을 85~95℃에서 100~140분 동안 열처리하여 증숙하는 단계;
    55~65℃에서 20~30시간 동안 열수 추출하여 더덕 추출물을 수득하는 단계;
    증숙 및 열수추출한 더덕을 55~65℃에서 30~40시간 동안 건조하는 단계; 및
    건조한 더덕의 분쇄물 중량에 대해 7 ~ 10배(w/w)의 증류수를 가하고 발효 균주를 접종하여 35~37℃에서 7~10일간 혐기적 조건으로 발효시키는 단계를 포함하는, 생리활성물질인 폴리페놀 또는 플라보노이드의 함량이 증가된 더덕의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    더덕을 증숙하고 건조하는 단계는 4~6회 반복 수행하는 것을 특징으로 하는 생리활성물질인 폴리페놀 또는 플라보노이드의 함량이 증가된 더덕의 제조방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 발효 균주는 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus)를 105 CFU/g~107 CFU/g의 양으로 접종하는 것을 특징으로 하는 생리활성물질인 폴리페놀 또는 플라보노이드의 함량이 증가된 더덕의 제조방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항의 방법으로 제조되고 항산화 효과, 항균 효과, 혈당강하 효과 및 인지기능개선 효과를 갖는 생리활성물질인 폴리페놀 또는 플라보노이드의 함량이 증가된 더덕.
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