KR100316296B1 - 제비콩추출물 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제비콩추출물 및 그 제조방법에 관한 것으로 제비콩추출물로부터 다이드진(daidzin), 제니스틴(genistin), 다이드제인(daidzein), 제니스테인 (genistein), 6'-o-아세틸-제니스틴(6'-o-acetyl-genistin), 6'-o-아세틸-다이드진 (6'-o-acetyl-daidzin)과 같은 이소플라보노이드 성분을 분리, 확인하였으며 본 발명 제비콩추출물은 임상에서 글루타메이트 피루베이트 트랜스아미나아제(GPT), 글루타메이트 옥살로아세테이트 트랜스아미나아제(GOT), 락테이트 디하이드로게나아제(LDH)의 활성을 낮추고 코린에스터라아제의 활성을 증가시켜 생리활성을 증가시키는 뛰어난 효과가 있다.

Description

제비콩추출물 및 그 제조방법{Extracts of Dolichoslablab L. and process for preparation thereof}
본 발명은 제비콩추출물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 생리활성 기능을 촉진하는 유용성분이 함유된 제비콩추출물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
제비콩(Dolichoslablab L.)은 일명 까치콩 또는 편두라하며 잎이 삼출복엽(三出複葉)이고 호생(互生)하며 탁엽(托葉)은 작고 삼각상란형(三角狀卵形)이며 소엽편(小葉片)은 넓은 난형(卵形)으로 잎이 뾰족하고 줄기부근에 있는 잎은 넓은 쐐기형 혹은 토막형상이며 가장자리가 밋밋하고 양면에 털이 성글게 나 있다. 꽃은 나비모양이고 백색이며 종자 역시 2 ~ 5개로 백색을 띈다. 주로 열대 및 아열대 지역에서 널리 재배되고 있고 한국에서는 남부지방에서 재배되고 있다.
제비콩은 옛부터 민간요법으로 건위화습(健胃化濕), 화중소서(和中消暑)에 효능이 있다고 전해지고 있으나 아직 그 효능성분에 관한 연구는 보고된 바 없었다. 본 발명자들은 상기와 같은 제비콩을 분자적 수준에서 연구하기 위해 제비콩으로부터 기능성 물질을 추출, 분리하여 구조분석하고 임상실험을 통해 생리활성도를 조사하므로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 생리활성 기능을 촉진하는 제비콩추출물을 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 제비콩추출물의 제조방법을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 제비콩으로부터 얻은 메탄올추출물을 HPLC로 분석하여 주요 이소플라보노이드 성분을 확인하고 이를 분리한 후1H NMR,13C NMR 등을 실시하여 그 구조를 분석한 다음 상기 제비콩 메탄올추출물을 함유하는 식이와 중금속을 흰쥐에 투여하고 혈청내 효소활성도와 중금속 독성 억제효과를 측정하여 본 발명 제비콩 추출물의 생리기능 활성도를 조사하고 또 상기 제비콩 메탄올추출물과 지방식이를 흰쥐에 투여하고 이 흰쥐의 혈청내 항산화성 효소활성도를 조사하여 본 발명 제비콩 메탄올추출물의 생체내 유용성을 조사하므로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.
도 1은 제비콩 종실 메탄올추출물의 HPLC 분석결과를 나타낸다
도 2는 제비콩 잎 메탄올추출물의 HPLC 분석결과를 나타낸다.
도 3은 제비콩 잎 메탄올추출물로부터 에테르(Ether) 분획, 에틸아세테이트(EtoAC) 분획, n-부탄올(n-BuOH) 분획, 물(H2O) 분획을 얻는 과정을 나타낸 순서도이다.
도 4는 제비콩 잎 메탄올추출물로부터 얻은 에테르 분획의 HPLC 분석결과를 나타낸다.
도 5는 제비콩 잎 메탄올추출물로부터 얻은 에틸아세테이트(EtoAc) 분획의 HPLC 분석결과를 나타낸다.
도 6은 제비콩 잎 메탄올추출물로부터 얻은 부탄올(BuOH) 분획의 HPLC 분석결과를 나타낸다.
도 7은 제비콩 잎 메탄올추출물로부터 얻은 에테르분획을 DIAION HP-20 컬럼크로마토그라피하여 화합물 I을 얻는 과정을 나타낸 순서도이다.
도 8은 제비콩 잎 메탄올추출물로부터 얻은 에틸아세테이트(EtoAc) 분획을 DIAION HP-20 컬럼 크로마토그라피하여 화합물 Ⅱ를 얻는 과정을 나타낸 순서도이다.
본 발명은 제비콩의 종실은 헥산으로 먼저 지질성분을 제거한 후 메탄올(MeOH) 추출하고 제비콩 잎은 세절한 후 메탄올 추출하여 제비콩 종실과 제비콩 잎으로부터 각각의 메탄올추출물을 얻는 단계; 상기 제비콩 종실과 제비콩 잎의 메탄올추출물내 함유된 이소플라보노이드(isoflavonoid) 성분을 HPLC로 분석하는 단계; 제비콩 잎 메탄올추출물을 물과 에테르(ether) 혼합용매에 분산시킨 후 에테르층을 감압농축하여 에테르추출물을 얻고 여기에 다시 에틸아세테이트(EtoAC)를 가하여 에틸아세테이트 추출물을 얻고 다시 남은 잔사에 n-부탄올을 가하여 부탄올 추출물을 얻은 다음 각 추출물내 함유된 유효성분을 HPLC로 확인하는 단계; 상기 제비콩 잎 메탄올추출물을 다시 에테르로 감압농축하여 얻은 에테르추출물과 에틸아세테이트를 가하여 얻은 에틸아세테이트추출물 각각으로부터 이소플라보노이드 단일화합물을 컬럼 크로마토그라피(column chromatography)하여 단리하고 이 이소플라보노이드 단일화합물의 구조를1H NMR과13C NMR 등으로 분석하는 단계; 제비콩 잎 메탄올추출물 1, 3, 5와 중금속 Pb, Cd을 함유하는 식이와 제비콩 메탄올추출물 3를 함유하는 식이를 흰쥐에 투여하고 이 쥐의 혈청내 효소할성도와 중금속 독성 억제효과를 조사하는 단계; 제비콩 잎 메탄올추출물 1, 3, 5와 표준지방식이, 포화지방식이, 불포화지방식이, 고지방식이를 콜레스테롤 1와 함께 흰쥐내에 식이로 공급한 후 흰쥐의 혈청내 글루타치온 퍼옥시다아제(glutathione peroxidase)와 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)의 활성을 측정하여 항산화 효소활성도를 측정하는 단계로 구성된다.
본 발명에서 사용한 제비콩 종실은 전북익산시 농가에서 구입하였고 제비콩 잎은 동일 농가에서 재배되고 있는 식물체에서 개화기 직전에 채취하여 실험재료로 사용하였다.
본 발명 식이는 효소활성도 측정에 있어서 일반식이를 공급하였고 항산화계 효소 활성도 측정에 있어서는 지방식이를 조제하여 24시간 동안 자유롭게 투여하도록 하였다. 사료 섭취량과 두류 음용 섭취량은 매일 오후 2시에 측정하여 전날 공급량에서 남아 있는 양을 빼서 일일 섭취량으로 계산하였다. 사육실의 온도는 23 ± 2℃, 습도는 55 ~ 60조건으로 유지하였고 체중측정은 식이섭취로 인한 일시적인 체중변화를 막기 위해 측정하기 1시간 전에 식이를 제거한 후 일주일마다 같은 시각에 측정하였다.
본 발명 제비콩추출물의 생리활성 촉진효과를 조사하기 위해 사용한 실험동물은 평균 체중이 100 ± 10g인 Sprague-Dawley종 수컷 흰쥐를 고형사료(제일제당제품, 1996년)로 일주일간 환경에 적응시킨 후 체중에 따른 난괴법으로 각 군당 7마리씩 분류하여 4주간 사육하였다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 제비콩 기능성 물질 추출 및 구조분석
제 1 공정: 메탄올 추출
제비콩의 종실과 잎을 분리한 후 제비콩 종실은 건조시킨 다음 100g을 추출용기에 넣고 헥산(Hexane) 100mL을 넣은 후 3회 환류추출하여 지질성분을 제거하였고 남은 잔사에 80메탄올(methanol)용액 200mL를 가하고 3회 환류추출하였다. 얻어진 메탄올(methanol)층을 여과, 감압농축 및 진공건조하여 제비콩 종실의 메탄올추출물 5.5g을 얻었다. 또 제비콩 잎은 건조기(4℃)에서 건조시키고 이중 2kg을 취하여 세절하였다. 이를 추출용기에 넣고 80메탄올을 사용하여 3회 추출한 후 모아진 메탄올을 여과, 감압농축 및 진공건조하여 메탄올추출물을 얻었다. 여과시 Whatman NO.540 여과지를 사용하였으나 섬유성물질이 남아 있어서 이를 제거하기 위하여 Millipore C18Sep-Pak cartridge를 사용하여 여과하였고 1kg당 110g의 점조한 추출물을 얻었다.
제 2 공정: 제비콩 메탄올추출물내 함유된 성분분석
상기 제 1 공정에서 얻은 제비콩 종실 및 잎 메탄올추출물의 유효성분을 확인하기 위하여 Shimadzu사의 HPLC system의 역상 HPLC(Reversed phase HPLC)를 사용하여 그래디언트(Gradient) 조건으로 분석하였다. 분석에 사용한 컬럼은 ODS계열의 YMC AM303(4.6×250mm)이었으며 이동상은 0.1아세트산(acetic acid)를 함유한 아세톤니트릴(acetonnitrile)과 H2O이었다. 유속은 1.0mL/min으로 조절하였고 주입부피(injection volume)는 10㎕이었다. 최적 분석(resolution)을 얻기 위하여 그래디언트(gradient)조건으로 유출시켜 분석하였으며 아세토니트릴(acetonitrile) 용액(0.1acetic acid)을 15에서 35까지 50분에 걸쳐 완만히 증가시켰고 표준물질은 메탄올(methanol)에 용해시켜 0.1 ~ 2.5㎍/mL범위로 표준용액을 조절하고 HPLC 분석을 하여 피크 범위(peak area)로부터 검량선을 작성하여 성분의 정성 및 정량은 표준물질의 피크와 비교하여 분석하였다. 실험결과, 도 1(제비콩 종실)과 도 2(제비콩 잎)에 나타낸 바와 같이 제비콩 종실과 잎에는 이소플라보노이드 성분으로 다이드진(daidzin), 제니스틴(genistin), 다이드제인(daidzein), 제니스테인 (genistein), 6'-o-아세틸-제니스틴(6'-o-acetyl-genistin), 6'-o-아세틸-다이드진 (6'-o-acetyl-daidzin)이 함유되어 있음이 확인되었고 특히 제니스틴(Genistin)함량이 다른 성분에 비해 많이 함유되어 있었고 종실에서 보다 잎에서 이소플라보노이드 함량이 높았다. 이를 표 1에 정리하였다.
제비콩의 종실과 잎에 함유된 이소플라보노이드 함량
이소플라보노이드 제비콩 종실 제비콩 잎
다이드진(daidzin) 43 10
제니스틴(genistin) 67 256
다이드제인(daidzein) 5 13
제니스테인(genistein) 14 85
6'-o-아세틸-제니스틴(6'-o-acetyl-genistin) 0 14
6'-o-아세틸-다이드진(6'-o-acetyl-daidzin) 0 8
합 계 119 387
제 3 공정: 제비콩 잎 메탄올추출물내 함유된 유효성분 분리
제 1 공정에서 얻은 제비콩 잎 메탄올추출물 30g을 물과 에테르(Ether)의 혼합용매에 분산시킨 후 에테르층을 분리하였고 이를 6회 반복하여 에테르층을 갑압농축시켜 에테르 분획의 추출물를 얻었다. 남은 잔사에 에틸아세테이트(EtoAC)를 가하여 6회 반복추출하여 에틸아세테이트(EtoAC) 추출물을 얻었으며 이 후 남은 잔사에 n-부탄올(n-BuOH)을 가하여 4회 반복 추출해서 부탄올 추출물을 얻었다. 수층을 감압농축하여 수추출물을 얻었고 각각의 분획별 추출물 즉, 에틸아세테이트 추출물(EtoAC Ex.), 에테르 추출물(Ether Ex), 부탄올 추출물(BuOH Ex.) 그리고 수추출물을 TLC로 분석하였고 유효성분을 확인하기 위하여 Dionex Dual pump DX-500의 역상 HPLC(Reversed phase HPLC)를 사용하여 그래디언트(gradient) 조건으로 분석하였다. 분석에 사용한 칼럼은 prodigy 5μ ODS(3) 100Å(4.6×150mm)이였으며 유속은 1.5mL/min으로 하였다. 이동상 A는 H2O로서 0.2아세트산(acetic acid)을 사용하여 액성을 산성으로 한 후 NaOH로 pH 3.8로 보정하여 사용하였고 이동상 B는 메탄올을 사용하였다. 성분 피크는 262nm에서 UV 검출기로 검출하여 성분의 정량 및 정성은 표준물질의 피크와 비교하여 분석하였다. 이어서 상기 제비콩 잎 에테르(Ether)추출물과 에틸아세테이트(EtoAC)추출물내 함유된 유효성분을 분리하기 위하여 Diaion HP-20 컬럼 크로마토그라피(column chromatography), 실리카겔 컬럼 크로마토그라피(silica gel column chromatograpy)와 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그라피(sephadex LH-20 column chromatography)를 사용하였다. 실험결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 에테르 추출물은 1.35g을 얻었고, 에틸아세테이트는 750mg를 얻었으며 n-부탄올 추출물은 9.74g, 수추출물은 7.22g을 얻었다. 각각의 분획 추출물을 TLC로 분석 결과는 에틸아세테이트와 에테르 추출물에서 다수의 화합물이 존재한 반면 부탄올과 수층에는 이동상(mobile phase)을 사용하여도 전개가 힘든 극성이 높은 화합물이 존재함을 알 수 있었다.
HPLC 분석결과는 도 4(에테르추출물), 도 5(에틸아세테이트추출물), 도 6(부탄올추출물)에 나타낸 바와 같이 에테르(Ether) 추출물에서는 그람당 6'-o-아세틸-제니스틴(6'-o-acetyl-genistin)이 1.2mg, 다이드제인(daidzein)이 9.2mg, 제니스테인(genistein)이 4.5mg 함유되어 있었으며 에틸아세테이트(EtoAC) 추출물에는 제니스틴(genistin)이 147mg, 6'-아세틸-다이드진(6'-o-acetyl-daidzin)이 7.6mg, 6'-o-아세틸-제니스틴(6'-o-acetyl-genistin)이 2.5mg, 다이드진(daidzein)이 2.3mg, 제니스틴(genistein)이 1.8mg 각각 함유되어 있었다. 이상의 결과로 보아 에틸아세테이트(EtoAC)분획에서 유효성분이 많이 이행되었으며 부탄올(BuOH)과 수(H2O) 추출물에는 주로 극성이 높은 물질들이 이행되었으며 이소플라보노이드(isoflavonoid)는 거의 존재하지 않았다.
에테르추출물은 도 7에 나타낸 바와 같이 DIAION HP-20 컬럼 크로마토그라피(column chromatography)하여 물(H2O), 20메탄올(MeOH), 60메탄올(MeOH) 및 100메탄올(MeOH) 분획을 얻었으며 60메탄올(MeOH) 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그라피(silica gel column chromtography 하여 화합물 I(compound Ⅰ)을 단리하였다. 또 에틸아세테이트는 도 8에 나타낸 바와 같이 DIAON HP-20으로 에테르 추출물과 동일한 방법으로 컬럼 크로마토그라피(column chromatography)하여 각각의 분획을 얻었으며 20메탄올 분획물을 반복적으로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그라피(sephadex LH-20 column chromatography)(전개용매:20,30,50MeOH)하여 화합물 Ⅱ(compound Ⅱ) 23.7mg을 단리하였다.
제 4 공정: 제비콩 잎 메탄올추출물내 함유된 유효성분 분석
상기 제 3 공정에서 얻은 화합물 I(compound Ⅰ)과 화합물 Ⅱ(compound Ⅱ)를1HNMR,13CNMR, 질량분석하여 구조를 분석하였다. 실험결과, 질량분석에서 화합물 Ⅰ(compound I)은 EI-MS(Electron-impact mass spectroscopy) 방법에 의해 M+ 피크(M+ peak)가 발견되었으나, 화합물 Ⅱ(compound Ⅱ)는 해당하는 피크가 발견되지 않았다. 이는 EI-MS 조건하에서 배당체 화합물이 분해되기 때문이다. 화합물 Ⅱ를 FAB-MS로 분석한 결과는 분자량에 해당하는 피크가 발견되었다. 화합물 Ⅰ은 m/z 254, 화합물 Ⅱ는 433 (M+1)이였다. 그리고1H NMR,13C NMR spectroscopy의 결과는 하기와 같다.
화합물 Ⅰ
1H NMR (DMSO-d6) δ6.81 (2H, d, J = 9.3 Hz, H3' and H5'), 6.87 (1H, s, H8),
6.94 (1H, d, J = 10.5 Hz, H6), 7.38 (2H, d, J = 8.4 Hz, H2'
and H6'), 7.97 (1H, d, J = 8.7 Hz, H5), 8.27 (1H, s, H2),
9.59 (1H, s, 4'-OH), and 10.86 (1H, s, 7-OH).
13C NMR (DMSO-d6) δ102.01 (C8), 114.92 (C3'), 114.94 (C5'), 115.26
(C6),116.34 (C4a), 122.54 (C3), 123.40 (C1'), 127.16 (C5),
130.00 (C2', C6'), 152.66 (C2), 157.19 (C8a), 157.45 (C4'),
162.96 (C7), 174.62 (C4)
화합물 Ⅱ
1H NMR (DMSO-d6) δ3.15-3.85 (6H, m, H2'-H6'), 5.06 (1H, d, J = 7.3 Hz, H1'),
6.47 (1H, d, J = 2.5 Hz, H6), 6.72 (1H, d, J = 2.5 Hz, H8),
6.83 (2H, d, J = 8.8 Hz, H3', H5'), 7.40 (2H, d, J = 8.8
Hz, H2', H6'), 8.41 (1H, s, H2), 9.66 (1H, bs, C4'-OH),
12.92 (OH, bs, C5-OH).
13C NMR (DMSO-d6) δ60.6 (C6'), 69.6 (C4'), 73.1 (C2'), 76.4 (C3'), 77.2
(C5'), 94.6 (C8), 99.6 (C6), 99.9 (C1'), 106.1 (C10), 115.1
(C3', C5'), 121.0 (C1'), 122.6 (C3), 130.2 (C2', C6'),
154.6 (C2), 157.2 (C9), 157.5 (C4'), 161.7 (C5), 163.0
(C7), 180.5 (C4).
이상 분석된 데이터와 문헌의 데이터를 비교한 결과 화합물 I(compound I)은 하기 구조식 (Ⅰ)으로 나타낸 바와 같은 다이드제인(daidzein), 화합물 Ⅱ(compound Ⅱ)는 하기 구조식(Ⅱ)로 나타낸 바와 같은 제니스틴(genistin)으로판정하였다.
실시예 2: 제비콩 잎 메탄올추출물의 생리활성 조사
본 실시예에서 생리활성 측정에 사용한 혈청시료는 식이를 공급한 후 흰쥐를 12시간 절식시킨 후 에틸에테르로 가볍게 마취시켜 개복한 즉시 심장정맥에서 10mL 주사기로 3 ~ 4mL의 혈액을 채혈한 후 응고를 방지하고자 헤파린 처리를 하여 항산화성 측정에 사용하였다. 혈청은 15℃에서 20분간 방치한 후 3000rpm에서 15분간 원심분리한 후 시료로 사용하였다.
이하, 공정별로 설명한다.
제 1 공정: 효소활성 실험동물군의 뷴류
평균체중이 100±10g인 Sprague-Dawley종 수컷 흰쥐를 고형사료(제일제당제품 1996년)로 일주일간 환경에 적응시킨 후 체중에 따른 난괴법으로 각 군당 7마리씩 표시하여 표 2에 나타낸 바와 같이 12개군으로 나누었다. 기본식이는 조단백질 22.4, 조지질 3.5, 조셀룰루오스 5.0, 회분 0.7, 칼슘 0.5, 인 0.5, 비타민 3.5, 미네랄 1.0을 함유하며 원료는 옥수수, 밀, 밀가루, 생선가루, 육류수지, 대두유, 대두가루로 하였으며 대조군은 증류수와 상기 기본식이를, 본 발명 실험군은 제비콩 잎 메탄올추출물 1, 3, 5수준과 기본식이를 공급한 군과 제비콩 잎 메탄올추출물에 중금속으로 Pb 100ppm, 200ppm 및 Cd 50ppm, 100ppm 각각과 기본식이를 공급하였으며 중금속 투여 비교군은 Pb 100ppm, 200ppm 및 Cd 50ppm, 100ppm 각각과 기본식이를 공급하였다.
제비콩 잎 메탄올추출물의 효소활성 측정을 위한 실험군
군 식 이 조 성
1군 증류수 + 기본식이
2군 제비콩잎 추출물 1 + 기본식이
3군 제비콩잎 추출물 3 + 기본식이
4군 제비콩잎 추출물 5 + 기본식이
5군 Pb 100ppm + 기본식이
6군 Pb 200ppm + 기본식이
7군 Cd 50ppm + 기본식이
8군 Cd 50ppm + 기본식이
9군 제비콩잎 추출물 3 + Pb 100ppm + 기본식이
10군 제비콩잎 추출물 3 + Pb 200ppm + 기본식이
11군 제비콩잎 추출물 3 + Cd 50ppm + 기본식이
12군 제비콩잎 추출물 3 + Cd 100ppm + 기본식이
제 2 공정: 혈청의 효소활성도 측정
아스파라테이트 아미노 트랜스퍼라아제(Asparatate amino transferase)(E.C. 2.6.1.1.: ASTase, Glutamate oxaloacetate transaminase:GOT) 및 알라닌 아미노 트랜스퍼라아제(alanine amino transferase)(E.C 2.6.1.2.: ALTase, Glutamate pyruvate transaminase: GPT)의 활성도측정은 Reitman-Franke법에 기초한 혈청 transaminase 측정용 키트(kit)시약 (한국, 亞山製藥)을 사용하였고, 활성단위는 혈청 mL당 Karmen unit로 하였다. 코린에스터라아제(Cholinesterase)(E.C.3.1.3.8: Acylcholine acylhydrolase; ChEase) 활성도측정은 코린에스터라아제 (Cholinesterase) 측정용 키트(kit) 시약(일본, Mizuho Medy RM-141K)을 이용하였고 코린에스터라아제(cholinesterase) 활성도는 하기 공식에 의하여 IU/L로 하였다.
락테이트 디하이드로게나아제(Lactate dehydrogenase)(E.C.1.1.1.27: L-Lactate: NAD+oxidoreduc tase: LDHase) 활성 측정은 락테이트 디하이드로게나아제(lactate dehydrogenase) 측정용 키트 (kit)시약(일본, Mizuho, Medy, SR-1110)을 이용하여 효소 활성도를 하기 공식에 의하여 Wro. Unit (Wro.U=0.4821 IU/L)로 하였다.
실험결과, 표 3에 나타낸 바와 같이 제비콩 잎 메탄올추출물 농도별 효소활성에 차이가 없었으며 3농도처리에서 코린에스테라제의 활성이 다소 높았다. 납과 카드뮴을 단독 투여한 처리와 이들 중금속 투여처리와 제비콩 잎 메탄올추출물 3를 혼용하여 쥐에 투여하여 효소의 활성도를 비교한 결과는 표 4, 5에 나타낸 바와 같이 제비콩 잎 메탄올추출물 혼용투여처리에서 GPT, GOT, LDHase효소 활성이 낮은 경향이고 chEase의 활성이 중금속 단독투여군에 비해 다소 높은 경향을 보였다. 이 결과는 간, 신장, 심장 등에 중금속과 같은 유해물질에 의해 이상이 생겼을 때 정상적인 상태에서보다 제비콩 잎 메탄올추출물의 투여가 효소활성을 낮춤을 알 수 있었다.
제비콩 잎 메탄올추출물의 농도별 효소활성 비교
처 리 GOT(unit:kingamstrong) GPT(unit:kingamstrong) LDHase(unit:wrou) chEase(unit:IU/I)
증류수 214 63 1,783 326
제비콩잎추출물135 225222186 605851 2,1621,9891,842 316349318
[주] GOT: 글루타메이트 옥살로아세테이트 트랜스아미나아제GPT: 글루타메이트 피루베이트 트랜스아미나아제LDHase: 락테이트 디하이드로게나아제chEase:코린에스터라아제
제비콩 잎 메탄올추출물의 납독성 억제효과
처 리 GOT GPT LDHase chEase
Pb 100ppm 255 79 2,222 271
Pb 200ppm 244 75 2,754 251
제비콩잎 추출물 3+ Pb 100ppm제비콩잎 추출물 3+ Pb 200ppm 188163 6348 1,4001,556 284282
제비콩 잎 메탄올추출물의 카드늄 독성 억제효과
처 리 GOT GPT LDHase chEase
Cd 100ppm 233 78 2,779 242
Cd 200ppm 237 79 2,986 241
제비콩잎 추출물 3+ Cd 50ppm제비콩잎 추출물 3+ Cd 100ppm 169195 6861 1,7751,776 243246
제 3 공정: 항산화계 효소활성도 실험동물군 분류
항산화계 효소의 활성도를 검정하기 위하여 제비콩 잎 메탄올추출물 1, 3, 5와 표준지방식이, 포화지방식이, 불포화지방식이 및 고지방식이를 콜레스테롤 1식이와 함께 흰쥐에게 공급하였으며 효소활성계 실험동물군과 마찬가지로 체중에 따른 난괴법으로 각 군당 7마리씩 분류하였으며 표 6에 나타낸 바와 같다.
항산화계 효소활성도 실험동물군
군 식 이 조 성
1군 제비콩잎추출물 1 + 표준지방식이 + 콜레스테롤 1
2군 제비콩잎추출물 3 + 표준지방식이 + 콜레스테롤 1
3군 제비콩잎추출물 5 + 표준지방식이 + 콜레스테롤 1
4군 제비콩잎추출물 1 + 포화지방식이 + 콜레스테롤 1
5군 제비콩잎추출물 3 + 포화지방식이 + 콜레스테롤 1
6군 제비콩잎추출물 5 + 포화지방식이 + 콜레스테롤 1
7군 제비콩잎추출물 1 + 불포화지방식이 + 콜레스테롤 1
8군 제비콩잎추출물 3 + 불포화지방식이 + 콜레스테롤 1
9군 제비콩잎추출물 5 + 불포화지방식이 + 콜레스테롤 1
10군 제비콩잎추출물 1 + 고지방식이 + 콜레스테롤 1
11군 제비콩잎추출물 3 + 고지방식이 + 콜레스테롤 1
12군 제비콩잎추출물 5 + 고지방식이 + 콜레스테롤 1
제 4 공정: 제비콩 잎 메탄올추출물의 항산화성 효소활성도
슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase) 활성은 크산틴 옥시다아제(xanthine oxidase)에 의해 크산틴(xanthine)에서 생성된 슈퍼옥사이드 (superoxide)가 페릭 사이크롬(ferric cytochrome)을 페로우스 사이토크롬 C(ferrous cytochrome C)로 환원시키는데 이때 SOD가 존재하면 이 반응이 방해를 받게된다는 원리를 이용하여 크산틴(xanthine)과 사이토크롬 C가 들어있는 버퍼(buffer)에 효소원과 크산틴 옥시다아제(xanthine oxidase)용액을 넣어 사이토크롬 C의 환원을 방해하는 정도로써 측정하였고 사이토크롬 C의 환원을 50방해하는 SOD량을 1unit으로하여 활성정도를 나타내었다. 적혈구의 SOD측정을 위해 적혈구 현탁액을 용혈시킨 후 McCord등의 방법에 의해 헤모글로빈을 제거시켜 원심분리한 후 얻어진 상층액을 효소원으로하여 자동분석기로 측정, 분석하여 나온 결과치를10×Hb value으로 나누어준다.(u/g Hb으로 환산하려고) 글루타치온 퍼옥시다아제(Glutathione peroxidase)는 H2O2와 환원형의 글루타치온(glutathione)의 반응에 관여하여 산화형의 글루타치온을 생성하며 이 글루타치온은 글루타치온 리덕타아제(glutathione reductase)의 도움으로 NADPH에 의해 다시 글루타치온으로 환원되는데 이 원리를 이용하여 Floche와 Gunzler의 방법에 따라 분당 산화되는 NADPH량을 측정하여 글루타치온 퍼옥시다아제(Glutathione peroxidase)의 활성을 나타내었다. 적혈구의 글루타치온 퍼옥시다아제(Glutathione peroxidase) 활성은 적혈구를 용혈시킨 후 적당량 희석해서 drabkin 용액을 1:1 비율로 혼합하여 헤모글로빈(hemoglobin;Hb)을 cyanometHb으로 전환시킨 것을 효소원으로 측정하였다. 실험결과, 표 7에 나타낸 바와 같이 3수준에서 어느 지방식이에서나 글루타치온 퍼옥시다아제(Glutathion peroxidase)와 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)의 활성이 높았다. 특히 3추출물농도에서 표준 지방식이에 비해 포화지방, 불포화지방, 고지방식이에서 항산화성 효과가 높았고, 전체적으로 고지방식이 처리에서 항산화성 효소의 활성이 가장 높았다.
제비콩 잎추출물 농도별 잎지방식이 종류에 따른 항산화성 효소 활성
추출물 농도식이종류 1 3 5
GPx SOD GPx SOD GPx SOD
표준지방 7,839 13,517 8,236 14,708 4,185 12,555
포화지방 2,903 8,709 5,611 16,833 7,204 21,612
불포화지방 5,286 15,858 7,582 22,746 4,277 12,831
고지방 9,606 28,18 10,416 31,248 10,104 30,312
[주] GPx: 글루타치온 퍼옥시다아제SOD: 슈퍼옥사이드 디스뮤타제표준지방: 라드 + 옥수수기름=23g + 23g/kg 식이포화지방: 라드= 150g/kg 식이불포화지방: 옥수수기름=150g/kg 식이고지방: 라드 + 옥수수기름=100g + 100g/kg 식이
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 제비콩 종실과 잎으로부터 다이드진(daidzin), 제니스틴(genistin), 다이드제인(daidzein), 제니스테인(genistein), 6'-o-아세틸-제니스틴(6'-o-acetyl-genistin), 6'-o-아세틸-다이드진(6'-o-acetyl-daidzin)과 같은 이소플라보노이드 성분을 분리, 확인하였으며 본 발명 제비콩추출물은 임상에서 글루타메이트 피루베이트 트랜스아미나아제 (GPT), 글루타메이트 옥살로아세테이트 트랜스아미나아제(GOT), 락테이트 디하이드로게나아제(LDH)의 활성을 낮추고 코린에스터라아제의 활성을 증가시켜 생리활성을 증가시키는 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약 및 식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (2)

  1. 제비콩 종실과 잎을 분리하여 건조시키는 단계; 제비콩 종실은 헥산에 넣고 환류추출하여 지질성분을 제거하고 제비콩 잎은 세절하는 단계; 메탄올 용액을 지질이 제거된 제비콩 종실과 세절한 잎에 각각 첨가하고 환류추출하는 단계; 상기 제비콩 종실추출물과 제비콩 잎추출물을 여과하고 감압농축한 후 진공건조하는 단계를 포함하는 제비콩추출물 제조방법.
  2. 상기 제 1 항에 의해 제조된 제비콩추출물.
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