KR20010047621A - 대두 추출물 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대두추출물 및 그 제조방법에 관한 것으로 본 발명은 대두추출물로부터 이소플라보노이드 성분으로 다이드진(didzin), 글라이시테인-7-o-β-D-글루코스(glycitein-7-o-β-D-글루코스), 제니스틴(genistin), 다이드제인(daidzein), 제니스테인(genistein)을 분리, 확인하였으며 대두추출물이 임상에서 글루타메이트 피루베이트 트랜스아미나아제(GPT), 글루타메이트 옥살로아세테이트 트랜스아미나아제(GOT), 락테이트 디하이드로게나아제(LDH)의 활성은 낮추고 콜린에스터라아제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD) 및 글루타치온 퍼옥시다아제의 활성은 증가시켜 인체의 생리활성을 증강시키는 뛰어난 효과가 있다.

Description

대두 추출물 및 그 제조방법{Extracts of soybean and process for preparation thereof}
본 발명은 대두추출물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 생리활성 기능을 촉진하는 유용성분이 함유된 대두추출물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
대두는 옛부터 밭에서 나는 고기로 일컫어져 왔으며 오곡중의 하나로 조상대대로 주요식품이었다. 현재 콩은 그 영양학적 측면 뿐만 아니라 항암, 항동맥경화, 항산화, 혈당강화, 항균효과 등 다양한 건강기능성 생리활성이 있는 것으로 알려지고 있다. 이같은 생리활성 대두 자체 성분인 이소플라본이나 대두 펩타이드에 의한 것과 대두의 가공시 서식하는 유용 미생물의 산물이 대두의 생리활성에 기여하는 것으로 추정되고 있다.
대두의 기능성 물질로는 식이성 섬유, 올리고 당, 이소플라보노이드(isoflavonoids), 피트산(phytic acid), 트립신 저해제(trypsin inhibitor), 사포닌(saponins), 콩단백질과 그 가수분해물, 식물성 스테놀(sterol)과 페놀화합물 등이 알려져 있다. 최근에 이러한 기능성 물질중 이소플라보노이드(isoflavonoids)성분이 항암작용, 항산화작용, 성인병예방, 심장병 등에 효과가 있다고 보고되고 있으나 이들 연구의 대부분은 대두의 생리활성 성분을 사용하여in vitro및in vivo에서 대표적인 약리활성을 평가한 것으로 대두의 어떤 유효성분이 세포내에서 어떤 수용체와 작용하여 효과를 발휘할 수 있는지에 대한 분자적 연구수준은 발표된 바 없었다.
본 발명자들은 건강 기능성 식품소재로서 대두의 가치를 개발하기 위하여 대두의 철저한 유효성분 분석과 이들의 생리활성과의 관계를 규명하던중 우리나라의 대표적인 대두인 검정콩, 약콩, 수원182호, 황금콩에 함유된 이소플라보노이드(isoflavonoid)의 종류를 확인하고 구조분석한 후 상기 대두 추출물이 생리활성 기능을 촉진시키는 효과가 있음을 확인하므로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 생리활성 기능을 촉진하는 대두추출물을 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 대두추출물의 제조방법을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 대두로부터 얻은 메탄올추출물을 HPLC로 분석하여 주요 이소플라보노이드 성분을 분석하고1HNMR을 실시하여 그 구조를 분석한 후 상기 대두 메탄올추출물을 기본식이와 중금속과 함께 흰쥐에 투여하고 혈청내 효소활성도를 측정하여 생리기능 활성도를 조사하고 또 상기 대두 메탄올추출물과 지방산을 포함하는 지방식이를 흰쥐에 투여하고 이 흰쥐의 체중증가량과 항산화성 효소활성도를 조사하여 본 발명 메탄올추출물의 생체내 유용성을 조사하므로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.
도 1은 검정콩 메탄올 추출물의 HPLC 분석결과를 나타낸다.
도 2는 약콩 메탄올 추출물의 HPLC 분석결과를 나타낸다.
도 3은 수원182호 메탄올 추출물의 HPLC 분석결과를 나타낸다.
도 4는 황금콩 메탄올 추출물의 HPLC 분석결과를 나타낸다.
도 5는 대두 메탄올 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그라피 및 세파덱스 LH-20 크로마토그라피하여 5종의 화합물로 분리하는 과정을 나타낸다.
본 발명은 대두시료 검정콩, 약콩, 수원182호, 황금콩 각각을 잘게 부수고 지질성분을 제거한 후 메탄올 추출하는 단계; 검정콩, 약콩, 수원182호, 황금콩 각각의 메탄올추출물을 HPLC로 분석하여 대두 메탄올추출물내 함유된 이소플라보노이드 성분과 그 양을 조사하는 단계; 상기 단계에서 조사한 검정콩, 약콩, 수원182호, 황금콩 각각의 메탄올추출물내 함유된 이소플라보노이드 성분을 세파덱스 크로마토그라피하여 분리하는 단계; 상기 단계에서 분리한 이소플라보노이드 각각의 성분을1HNMR을 통해 구조분석하는 단계; 흰쥐에 검정콩, 약콩, 황금콩 각각의 메탄올추출물을 기본식이 및 중금속과 함께 서로 다른 양으로 투여하여 26개 실험군을 만든 후 이들 각 쥐들의 혈청내 효소활성도를 측정하여 본 발명 대두 추출물들의 생리기능 활성도를 조사하는 단계; 흰쥐에 검정콩, 수원182호, 황금콩 각각의 메탄올추출물과, 콜레스테롤 1% 식이, 포화지방산, 불포화지방산 및 고지방을 서로 다른 양으로 투여하여 32개 실험군을 만든 후 이들 각 쥐들의 시간경과에 따른 체중 증가량을 조사한 후 항산화성 효소활성도를 조사하여 검정콩, 약콩, 수원182호, 황금콩 각각의 메탄올추출물의 생체내 유용성을 조사하는 단계로 구성된다.
본 발명에서 사용한 시험 재료중 검은콩, 수원 182호, 황금콩은 경기도 수원의 작물시험장에서 보관중인 품종을 사용하였고, 약콩은 충청남도 공주에서 1996년에 수확한 품종을 사용하였다. 시험재료는 종실을 취하였으며, 종피는 벗기지 않고 그대로 사용하였다.
본 발명 대두추출물의 생리활성 촉진효과를 조사하기 위해 사용한 실험동물은 평균 체중이 100±10g인 Sprague-Dawley종 수컷 흰쥐를 고형사료(제일제당제품, 1996년)로 일주일간 환경에 적응시킨 후 체중에 따른 난괴법으로 각 군당 7마리씩 혈청중의 효소 활성도는 26군으로, 항산화계효소활성도는 32군으로 나누어 4주간 사육하였다.
본 발명 실험동물에 투여한 식이조제는 일반사료를 기본식이로 하고 식이 무게중 3대 영양소의 비율에서 CT군은 대조군으로 65% 옥수수전분, 20% 카제인, 4.6%의 지방표준식이로 하였고, FA군은 포화지방산급원으로 돈지 15%, UFA 군은 불포화지방산 급원군으로 옥수수기름을 15% 수준으로 설정하였고 HF군은 고지방식이로 동물성과 식물성 지방식이를 각각 20%수준(열량의 40% 수준)으로 하였으며 지방식이, 포화지방, 불포화지방, 고지방식이에 각각 콜레스테롤 1%를 첨가하였다.
본 발명에서 생리활성 측정에 사용한 혈청시료는 식이를 공급한 후 흰쥐를 12시간 절식시킨후 에테르(ethyl ethe)로 가볍게 마취시켜 개복한 즉시 심장정맥에서 10mL 주사기로 3 ∼ 4mL의 혈액을 채혈한 후 15℃에서 20분간 방치한 후 3000rpm에서 15분간 원심분리하여 얻었다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 대두의 기능성물질 추출 및 구조분석
제 1 공정: 메탄올추출
대두시료 검은콩, 수원 182호, 황금콩, 약콩 각각을 2.0 kg씩 분쇄기로 잘게 부순후 추출용기에 넣고 헥산 3 L를 넣은후 3회 환류추출하여 지질성분을 제거하였다. 남은 잔사에 80% 메탄올(Methanol)수용액 3 L를 가하고 70℃에서 5시간씩 3회 환류추출한후, Whatmann No. 42 여과지로 여과하였다. 얻어진 메탄올 여액을 감압농축기에서 농축하고, 진공건조하여 검정콩, 약콩, 수원 182호, 황금콩의 메탄올 추출물을 얻었다. 표 1에 검정콩, 약콩, 수원 182호, 황금콩의 헥산추출과정 후 양과 메탄올 추출한 후 최종 양을 각각 나타내었다.
검정콩, 약콩, 수원 182호, 황금콩의 종실에서 얻은 추출물의 양
종 류 헥산추출물 메탄올추출물
검정콩 98 27
약콩 115 27
수원 182 84 23
황금콩 92 30
[주] 단위: g/Kg
제 2 공정: 대두 메탄올추출물내 함유된 이소플라보노이드 유효성분
상기 제 1 공정에서 얻은 검정콩, 약콩, 수원 182호, 황금콩의 메탄올 추출물을 Shimadzu사의 HPLC system을 이용한 역상(reversed phase) HPLC를 사용하여 그래디언트(Gradient)조건으로 분석하였다. 분석에 사용한 칼럼은 ODS계열의 YMC AM303(4.6 X 250mm)이었으며, 이동상은 아세트산(acetic acid)을 0.1%씩 함유한 아세토니트릴(acetonitrile)과 H2O이었다. 성분의 정성 및 정량은 표준품의 피크와 비교하여 분석하였다. 유속은 1.0 mL/min로 조절하였고, 주입량(injection volume)은 10 μL이었다. UV 검출기(UV Detector)를 사용하여 254 nm의 파장에서 흡광도를 관찰하였고 감도는 0.04이었다. 최적 분해능(resolution)을 얻기 위하여 그래디언트(gradient)로 유출시켜 분석하였으며, 아세토니트릴(acetonitrile) 용액(0.1% acetic acid)을 15%에서 35%까지 50분에 걸쳐 완만히 증가시켰다. 이때, 이소플라보노이드(Isoflavonoid) 표준물질은 경기도 수원시 작물시험장에 있는 것을 사용하였으며, 극히 소량만이 남아있어 시료에 함유된 7가지 이소플라보노이드(isoflavonoid)를 확인하는데만 사용하였다. 이소플라보노이드의 정량분석에는 검정콩에서 분리된 5가지 이소플라보노이드를 사용하였는바, 표준물질을 메탄올에 용해시켜 0.1∼25μg/mL 범위의 표준용액을 조제하고 HPLC 분석을 하여 피크지역(peak area)으로부터 검량선을 작성하였다. 실험결과, 도 1와 도 2에 나타낸 바와 같이 검정콩과 약콩의 크로마토그람에서 거의 모든 피크가 정성적으로 일치하여, 함유된 이소플라보노이드 성분의 종류가 동일함을 보였다. 그러나 함유된 이소플라보노이드의 양은 약콩이 검정콩보다 많았는데, 확인된 7개의 이소플라보노이드 성분중 제니스테인(genistein)을 제외한 6개의 성분이 약콩에서 5∼93% 더 많이 검출되었다. 수원182호는 검정콩, 약콩과 비교하였을때 배당체인 다이드진(daidzin)과 제니스틴(genistin)은 더 많이 함유한 반면, 아글리콘(aglycon)인 다이드제인(daidzein)과 제니스테인(genistein)은 더 적게 함유하는 특징을 나타내었다(도 3). 수원182호에서 다이드진은 각각 검정콩과 약콩의 153%, 132%씩 발견되었고, 제니스틴은 각각 133%, 129%씩 발견되었다. 또한 수원 182호에서 다이드제인은 검정콩과 약콩의 32%, 31%씩 발견되었고, 제니스테인은 각각 6%, 8%씩 발견되었다. 글라이시테인-7-O-β-D-글루코스(Glycitein-7-O-β-D-glucose)는 검정콩, 약콩, 수원 182호에 유사하게 분포되어 있었다(71.5 ∼ 93.8 mg). 황금콩의 메탄올추출물에서는 다이드제인과 제니스테인이외에 피크의 분리가 명확하지 않아 다이드제인과 제니스테인만 정량하였다(도 4). 황금콩에 함유된 다이드제인의 양은 (52.3 mg) 검정콩, 약콩, 수원 182호 등과 유사하였으나, 제니스테인의 양은 검정콩의 22%에 지나지 않았다. 검정콩, 약콩, 수원 182호, 황금콩에 함유된 이소플라보노이드(isoflavonoids)의 종류와 양은 표 2에 있다.
대두 메탄올추출물에 함유된 이소플라보노이드와 그의 함량
이소플라보노이드 검정콩 약콩 수원 182호 황금콩
다이드진(Daidzin) 291.47 336.07 444.8 -
글라시테인-7-O-β-D-글루코스(Glycitein-7-O-β-D-Glucose) 90.39 93.8 -
제니스틴(Genistin) 501 516 665.3 -
다이드제인(Daidzein) 62.53 65.4 20.3 52.3
제니스테인(Genistein) 243.4 187 14.7 54.3
[주] 단위 mg/100g
제 3 공정: 대두 메탄올추출물내 이소플라보노이드 분리
본 공정에서는 제 1 공정에서 얻은 검정콩, 약콩, 수원182호, 황금콩의 메탄올 추출물에서 이소플라보노이드를 분리하였다. 검정콩, 약콩, 수원 182호, 황금콩의 메탄올 추출물 각각을 10 g씩 물과 부탄올(butanol)의 혼합용매(1:1, v/v)에 분산시킨 후 부탄올(butanol)층을 감압농축시켜 부탄올 추출물을 얻었다. 이 추출물 진공하에서 3일간 건조시켜 건조시킨 고체 4.8 g을 얻었다. 이를 TLC로 분석한 결과 다수의 화합물이 함유되어 있음을 알 수 있었다. 이 고형물 300 mg을 Sephadex LH-20 컬럼에 로딩(loading)한 후 메탄올을 용리제(eluant)로 사용하여 크로마토그라피(chromatography)하였으며 TLC상에서 2∼3개의 스팟(spot)을 보인 4개의 분획으로 나누었다. 4개의 분획의 양이 너무 적어 고형물 1 g 을 세파덱스 LH-20 크로마토그라피(Sephadex LH-20 chromatography)로 다시 분리하여 4개의 분획으로 분리하였다. 각 분획을 세미프렙(semiprep) HPLC로 반복하여 분리하고 동결건조(Lyophilization)하여 순수한 화합물 1∼3 (12.7 mg, 8.4 mg, 6.8 mg)을 얻었다. 세미프렙 컬럼(Semiprep column)으로는 Vydac column (30 x 250 mm)을 사용하였고, 유속은 1.0 mL/min으로 하여 아세토니트릴(acetonitrile) 용매(0.1% acetic acid함유)를 10 → 25%로 유출시켜 분리하였다. 고형물을 실리카겔 컬럼 크로마토그라피(Silica Gel Column chromatography)로 분리하기 위하여 여러 유기용매에 용해시켜 보았는데, 메틸렌 크로라이드(methylene chloride). 클로로포름(chloroform), 에테르(ether), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 헥산(hexane) 등에서 낮은 용해도를 보였고 톨루엔(Toluene)에서 비교적 높은 용해도를 나타내었다. 고형물 3 g을 톨루엔(toluene)과 소량의 아세톤(acetone)에 용해한 후 Whatmann filter paper No. 52로 여과한 후 여액을 실리카겔 컬럼(silica gel column)에 로딩(loading)하고 톨루엔-아세톤(toluene-acetone) 이동상으로 유출시켰다. 실리카 컬럼 크로마토그라피를 반복실시하고 에탄올에서 재결정하여 화합물 4와 5를 각각 25 mg, 12 mg씩 얻었다(도 5)
제 4 공정: 이소플라보노이드의 구조분석
상기 제 3 공정에서 검정콩, 약콩, 수원 182호, 황금콩의 메탄올 추출물에서 분리한 이소플라보노이드 성분 5종을 EI-MS 방법과 FAB-MS,1HNMR, 13CNMR, UV 스펙트럼으로 분석하였다. 실험결과, 질량분석에서 화합물 4와 5는 Electron-impact mass spectroscopy (EI-MS)방법에 의해 M+ peak가 발견되었으나, 화합물 1∼3은 해당하는 피크가 발견되지 않았다. 이는 EI-MS조건하에서 배당체 화합물이 분해되기 때문이다. 화합물 1∼3은 FAB-MS로 분석한 결과 각각의 분자량에 해당하는 피크가 발견되었다. 화합물 4 m/z 254, 화합물 5 m/z 270, 화합물 1 433 (M+1), 화합물 2 447 (M+1), 화합물 3 417 (M+1). UV spectroscopy는 화합물 4에서만 실시되었으며, 249.5 nm에서 최대 흡광도를 나타내었다.1H NMR,13C NMR spectroscopy의 결과는 하기와 같다.
화합물 1.
1HNMR (DMSO-d6) δ3.15-3.85 (6H, m, H2"-H6"), 5.06 (1H, d, J = 7.3 Hz, H1"),
6.47 (1H, d, J = 2.5 Hz, H6), 6.72 (1H, d, J = 2.5 Hz, H8),
6.83 (2H, d, J = 8.8 Hz, H3', H5'), 7.40 (2H, d, J = 8.8
Hz, H2', H6'), 8.41 (1H, s, H2), 9.66 (1H, bs, C4'-OH),
12.92 (OH, bs, C5-OH).
13C NMR (DMSO-d6) δ60.6 (C6"), 69.6 (C4"), 73.1 (C2"), 76.4 (C3"), 77.2
(C5"), 94.6 (C8), 99.6 (C6), 99.9 (C1"), 106.1 (C10), 115.1
(C3', C5'), 121.0 (C1'), 122.6 (C3), 130.2 (C2', C6'),
154.6 (C2), 157.2 (C9), 157.5 (C4"), 161.7 (C5), 163.0
(C7), 180.5 (C4).
화합물 2.
1H NMR (DMSO-d6) δ3.87 (1H, s, OCH3), 5.15 (1H, d, J = 7.0 Hz, H1"), 6.81
(1H, d, J = 8.4 Hz, H3', H5'), 7.39 (2H, d, J = 8.4 Hz,
H2', H6'), 7.31 (1H, s, H8), 7.47 (1H, s, H5), 8.36 (1H, s,
H2).
화합물 3.
1H NMR (DMSO-d6) δ3.15-3.85 (6H, m, H2"-H6"), 5.17 (1H, d, J = 7.3 Hz, H1"),
6.82 (2H, d, J = 8.8 Hz, H3', H5'), 7.14 (1H, dd, J = 8.8,
2.4 Hz, H6), 7.23 (1H, d, J = 2.4 Hz, H8), 7.41 (2H, d, J =
8.8 Hz, H2', H6'), 8.05 (1H, d, J = 8.8 Hz, H5), 8.38 (1H,
s, H2), 9.57 (1H, bs, C4'-OH).
13C NMR (DMSO-d6) δ60.7 (C6"), 69.7 (C4"), 73.2 (C2"), 76.5 (C3"), 77.2
(C5"), 100.0 (C1"), 103.4 (C8), 115.0 (C3', C5'), 115.6
(C6), 118.5 (C10), 122.3 (C1'), 123.7 (C3), 127.0 (C5),
130.1 (C2', C6'), 153.3 (C2), 157.0 (C9), 157.3 (C4"),
161.4 (C7), 174.8 (C4).
화합물 4.
1H NMR (DMSO-d6) δ6.81 (2H, d, J = 9.3 Hz, H3' and H5'), 6.87 (1H, s, H8),
6.94 (1H, d, J = 10.5 Hz, H6), 7.38 (2H, d, J = 8.4 Hz, H2'
and H6'), 7.97 (1H, d, J = 8.7 Hz, H5), 8.27 (1H, s, H2),
9.59 (1H, s, 4'-OH), and 10.86 (1H, s, 7-OH).
13C NMR (DMSO-d6) δ102.01 (C8), 114.92 (C3'), 114.94 (C5'), 115.26 (C6),
116.34 (C4a), 122.54 (C3), 123.40 (C1'), 127.16 (C5),
130.00 (C2', C6'), 152.66 (C2), 157.19 (C8a), 157.45 (C4'),
162.96 (C7), 174.62 (C4).
화합물 5.
1H NMR (DMSO-d6) δ6.22 (1H, d, J = 2.4 Hz, H6), 6.38 (1H, d, J = 1.5 Hz, H8),
6.82 (2H, d, J = 8.4 Hz, H3' and H5'), 7.37 (2H, d, J = 8.4
Hz, H2' and H6'), 8.30 (1H, s, H2), 9.57 (1H, s, C4'-OH),
10. 86 (1H, s, C7'-OH), 12.93 (1H, s, C5'-OH).
13C NMR (DMSO-d6) δ102.02 (C8), 114.89 (C3'), 114.90 (C5'), 115.28 (C6),
116.37 (C4a), 122.50 (C3), 123.43 (C1'), 130.04 (C2', C6'),
152.68 (C2), 157.15 (C8a), 157.43 (C4'), 161.73 (C5),
162.96 (C7), 174.62 (C4).
따라서 상기 분석된 데이터와 문헌의 데이터를 비교한 결과 화합물 1은 구조식(I)에 나타낸 바와 같은 제니스틴(genistin), 화합물 2는 구조식(Ⅱ)로 나타낸 바와 같은 글라이시테인-7-O-β-D-글루코스(glycitein-7-O-β-D-glucose), 화합물 3은 구조식(Ⅲ)로 나타낸 바와 같은 다이드진(daidzin), 화합물은 4는 구조식(Ⅳ)로 나타낸 바와 같은 다이드제인(daidzein), 화합물 5는 구조식(Ⅴ)로 나타낸 바와 같은 제니스테인(genistein)으로 판정하였다.
실시예 2: 대두 추출물의 생리활성 조사
본 실시예에서 생리활성 측정에 사용한 혈청시료는 식이를 공급한 후 흰쥐를 12시간 절식시킨후 에테르(ethyl ethe)로 가볍게 마취시켜 개복한 즉시 심장정맥에서 10mL 주사기로 3 ~ 4mL의 혈액을 채혈한 후 15℃에서 20분간 방치한 후 3000rpm에서 15분간 원심분리하여 얻었다.
이하, 공정별로 설명한다.
제 1 공정: 효소활성 실험동물군의 분류
생리기능활성도를 측정하기 위하여 실험동물군을 26개군으로 구분하였는데 대조구를 증류수 + 기본식이군으로 검정콩1호, 약콩, 황금콩 추출물의 양을 쥐 체중 ㎏당 40㎎, 400㎎, 4000㎎의 수준을 두었고, 중금속 투여군 비교에서는 남의 수준을 100, 200ppm 카드뮴 처리에서는 50, 100ppm의 두수준을 두어 증류수와 기본식이를 대조구로 하였고, 중금속 투여군에 증류수 대신 400㎎/㎏의 콩추출물을 투여하면서 실험을 수행하였다. 이를 표 3에 나타내었다.
실험동물군의 분류
실험군 처 리 내 용
1군 증류수 + 기본식이 + 기본식이
2군 40mg/kg + 검정콩추출물 + 기본식이
3군 400mg/kg + 검정콩추출물 + 기본식이
4군 4000mg/kg + 검정콩추출물 + 기본식이
5군 40mg/kg + 약콩 추출물 + 기본식이
6군 400mg/kg + 약콩 추출물 + 기본식이
7군 4000mg/kg + 약콩 추출물 + 기본식이
8군 40mg/kg + 황금콩추출물 + 기본식이
9군 400mg/kg + 황금콩추출물 + 기본식이
10군 4000mg/kg + 황금콩추출물 + 기본식이
11군 Pb 100ppm + 증류수 + 기본식이
12군 Pb 200ppm + 증류수 + 기본식이
13군 Cd 50ppm + 증류수 + 기본식이
14군 Cd 100ppm + 증류수 + 기본식이
15군 400mg/kg + 검정콩추출물 + Pb 100ppm +기본식이
16군 400mg/kg + 검정콩추출물 + Pb 200ppm +기본식이
17군 400mg/kg + 검정콩추출물 + Cd 50ppm +기본식이
18군 400mg/kg + 검정콩추출물 + Cd 100ppm +기본식이
19군 400mg/kg + 약콩 추출물 + Pb 100ppm +기본식이
20군 400mg/kg + 약콩 추출물 + Pb 200ppm +기본식이
21군 400mg/kg + 약콩 추출물 + Cd 50ppm +기본식이
22군 400mg/kg + 약콩 추출물 + Cd 100ppm +기본식이
23군 400mg/kg + 황금콩추출물 + Pb 100ppm +기본식이
24군 400mg/kg + 황금콩추출물 + Pb 200ppm +기본식이
25군 400mg/kg + 황금콩추출물 + Cd 50ppm +기본식이
26군 400mg/kg + 황금콩추출물 + Cd 100ppm +기본식이
제 2 공정: 혈청의 효소 활성도 측정
아스파라테이트 아미노 트랜스퍼라제(Asparatate amino transferase) (E.C. 2.6.1.1.: ASTase, Glutamate oxaloacetate transaminase:GOT) 및 알라닌 트랜스퍼라아제(alanine amino transferase) (E.C 2.6.1.2.: ALTase, Glutamate pyruvate transaminase:GPT)의 활성도 측정은 Reitman-Franke법에 기초한 혈청 트랜스아민나아제(transaminase 측정용) kit시약 (한국, 亞山製藥)을 사용하였고, 활성 단위는 혈청 mL당 Karmen unit로 하였다. 코린에스터라아제(Cholinesterase) (E.C.3.1.3.8: Acylcholine acylhydrolase; ChEase) 활성도 측정은 코린에스터라아제 측정용 kit 시약(일본, Mizuho Medy RM-141K)을 이용하였고 코린에스터라아제 활성도는 아래 공식에 의하여 IU/L로 하였다.
락테이트 디하이드로전나아제(Lactate dehydrogenase)(E.C.1.1.1.27: L-Lactate: NAD+oxidoreduc tase: LDHase) 활성 측정은 락테이트 디하이드로전나아제(lactate dehydrogenase) 측정용 kit 시약(일본, Mizuho, Medy, SR-1110)을 이용하여 효소 활성도는 아래공식에 의하여 Wro. Unit (Wro. U=0.4821 IU/ℓ)11)로 하였다.
실험결과, 표 4에 나타낸 바와 같이 기본식이 대조군에 비해 콩추출물의 처리가 GPT활성이 낮았으며 추출물의 농도가 높을수록 간조직의 손상이 경감되어 효과가 뚜렷하였다. 납과 카드뮴을 투여하고 증류수와 기본식이를 처리한 군에서의 GPT를 보면 납처리가 83.96 ~ 88.02, 카드뮴 처리가 71.60 ~ 77.23인데 비하여 콩추출물 투여 처리는 전체적으로 볼 때 46.06 ~ 64.24정도로 크게 낮아졌는데 이는 콩 추출물의 중금속을 흡착하여 간조직의 손상을 경감시킴 것임을 알 수 있었다.
GOT는 일반적으로 심근경색, 용혈성질환 등 주로 심장병의 진단자료로 이용되는데 기본식이 대조구에 비해 콩추출물 투여처리가 활성도가 낮은 경향이고 중금속 투여처리에서도 콩추출 투여처리가 활성이 낮아 효과가 뚜렷하였다.
LDH 효소는 유산 탈수소요소로 활성이 증가하면, 악성종양, 밸혈병, 폐암, 뇌종양등이 나타나는 진단자료로 이용되는데 기본식이군에 비해 대체로 콩추출물을 투여한 처리군이 LDH의 활성이 크게 낮아져 효과가 뚜렷하였다.
콜린에스터라아제(Cholinesterase) 활성 비교처리에서 보면 기본식이 대조구에 비해 콩추출물 투여시 효소활성이 증가하였고 중금속 투여 기본식이군에 비해 콩추출물 투여군이 효소활성이 크게 증가하여 중금속 독성에 의한 대뇌 신경조직의 손상을 예방할 수 있음을 알 수 있었다.
대두 추출물이 혈청의 효소활성도에 미치는 영향
구 분 GPT(unit:king-amstrone) GOT(unit:king-amstrong) LDHase(unit:Wrong:Wro. U) ChEaseunit:IU/L
1군 98.07±41.021)a2)*3) 130.80±4.44ab* 496.33±51.89bcde* 70.67±6.17ab
2군 81.28±27.27abc 125.60±24.89bc 642.83±121.13a 80.80±7.92ab
3군 73.56±21.84bcd 126.68±72.93bc 590.80±268.53b 81.40±81.40ab
4군 65.93±10.33abcd 111.93±39.32bc 551.17±197.92bcd 77.67±12.04ab
5군 74.88±14.22abcd 134.88±98.741ab 635.40±117.79bc 77.40±12.05ab
6군 63.27±8.23bc 137.47±66.73a 429.33±190.35bcde 78.67±6.53ab
7군 67.50±14.80abcd 107.04±18.30bc 444.80±174.35bcde 75.60±11.82ab
8군 56.74±15.42bcd 108.82±33.91bc 306.40±25.74de 73.80±8.23ab
9군 56.94±5.01bcd 121.46±31.30bc 420.40±357.30bcde 81.80±14.72ab
10군 60.10±8.86bcd 88.62±13.61c 417.80±36.67bcde 70.00±14.75ab
11군 83.96±31.69ab 133.07±34.13ab 595.33±52.43de 60.33±4.67ab
12군 88.02±7.46ab 139.62±31.16a 516.50±97.01de 64.00±9.24ab
13군 71.60±27.39abcd 130.17±19.98bc 526.33±139.05cde 66.20±9.55ab
14군 77.23±12.35abcd 131.90±40.99ab 516.17±124.09cde 66.50±12.24ab
15군 59.24±15.59bcd 101.80±32.19bc 364.40±221.87bcde 72.40±10.11ab
16군 57.98±20.51bcd 101.72±23.84c 422.80±178.14bcde 80.40±11.72ab
17군 58.16±7.13bc 105.96±19.23bc 376.60±140.78bcde 80.80±10.60ab
18군 63.32±13.74bcd 109.14±13.98bc 402.60±193.02bcde 84.20±11.52ab
19군 51.46±5.78bcd 91.34±11.75c 409.80±21.77bcde 71.75±14.32ab
20군 46.06±4.49d 103.92±12.84bc 464.80±130.30bcde 80.75±7.14ab
21군 64.24±13.72bcd 89.22±11.91c 335.50±118.38bcde 87.60±11.95a
22군 65.50±22.23abcd 99.30±18.73bc 374.20±105.99bcde 75.80±15.16ab
23군 57.64±7.13bcd 97.18±8.46bc 277.20±162.67de 74.50±10.15b
24군 54.00±17.49bcd 97.66±31.87bc 399.60±242.59bcde 78.80±2.49ab
25군 56.02±8.32bcd 103.10±22.47bc 452.80±179.57bcde 79.00±9.30ab
26군 51.00±6.54bcd 94.46±3.27c 216.40±46.21e 71.67±10.97ab
[주] 1) 평균 ± SD2) 칸내 같은 위첨자의 의미는 Duncan's multiple range test에 의해 유의성없는 차이를 나타낸다.3) *는 대조군 값과 유의성 있는 차이를 나타낸다(P<0.01).GPT: 글루타메이트 피루베이트 트랜스아미나아제GOT: 글루타메이트 옥살로아세테이트 트랜스아미나아제LDH: 락테이트 디하이드로전나아제ChE: 콜린에스터라아제
제 3 공정: 항산화계 효소활성도 실험동물군 분류
항산화계 효소의 활성도를 검정하기 위하여 증류수와 표준 지방식이를 대조군으로 하여 표 5와 같이 처리군을 분류하였다.
실험동물군의 분류
실험군 처 리 내 용
1군 증류수 + 표준지방식이 + 콜레스테롤1%식이
2군 증류수 + 표준지방 + 콜레스테롤1%식이
3군 증류수 + 포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
4군 증류수 + 불포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
5군 증류수 + 고지방 + 콜레스테롤1%식이
6군 검정콩1호추출물40mg/kg + 포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
7군 검정콩1호추출물400mg/kg+ 포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
8군 검정콩1호추출물4000mg/kg+ 포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
9군 검정콩1호추출물40mg/kg + 불포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
10군 검정콩1호추출물400mg/kg+ 불포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
11군 검정콩1호추출물4000mg/kg+ 불포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
12군 검정콩1호추출물40mg/kg + 고지방 + 콜레스테롤1%식이
13군 검정콩1호추출물400mg/kg+ 고지방 + 콜레스테롤1%식이
14군 검정콩1호추출물4000mg/kg+ 고지방 + 콜레스테롤1%식이
15군 수원182호추출물40mg/kg + 포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
16군 수원182호추출물400mg/kg+ 포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
17군 수원182호추출물4000mg/kg+ 포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
18군 수원182호추출물40mg/kg + 불포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
19군 수원182호추출물400mg/kg+ 불포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
20군 수원182호추출물4000mg/kg+ 불포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
21군 수원182호추출물40mg/kg + 고지방 + 콜레스테롤1%식이
22군 수원182호추출물400mg/kg+ 고지방 + 콜레스테롤1%식이
23군 수원182호추출물4000mg/kg+ 고지방 + 콜레스테롤1%식이
24군 황금콩추출물40mg/kg + 포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
25군 황금콩추출물400mg/kg + 포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
26군 황금콩추출물4000mg/kg + 포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
27군 황금콩추출물40mg/kg + 불포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
28군 황금콩추출물400mg/kg + 불포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
29군 황금콩추출물4000mg/kg + 불포화지방산 + 콜레스테롤1%식이
30군 황금콩추출물40mg/kg + 고지방 + 콜레스테롤1%식이
31군 황금콩추출물400mg/kg + 고지방 + 콜레스테롤1%식이
32군 황금콩추출물4000mg/kg + 고지방 + 콜레스테롤1%식이
제 4 공정: 지방식이와 대두추출물 투요한 흰쥐의 체중증가량
상기 제 3 공정에서 증류수와 지방의 콩류를 달리한 식이와 증류수대신 콩추출물의 농도를 달리한 식이 방법으로 1주간격으로 4주동안 흰쥐의 체중증가량을 관찰하였다. 실험결과 4주의 체중을 보면 지방식이와 물만 섭취한 경우에는 183.68 ~ 249.98g범위였고 지방식이와 검정콩1호 추출물을 섭취한 군에서는 218.14 ~ 254.58g, 수원182호는 223.42 ~ 260.48g, 황금콩 222.64 ~ 252.92g 으로 큰차이를 나타내지 않았는데 이는 단백질이 풍부한 아미노산과 지방의 영향으로 외견상으로는 양호한 상태를 보였다(표 6).
식이별 체중의 변화
구분 1주 2주 3주 4주
1군 114.04±4.81a* 167.76±6.92ab* 191.94±4.68tghi 224.00±16.43hi*
2군 91.44±4.72b 148.43±6.50c 141.70±5.52j 183.68±8.93j
3군 116.24±2.68a 172.47±4.11ab 188.92±5.97ghi 232.64±15.86defghi
4군 120.74±1.95a 177.43±3.08a 213.58±6.09ab 249.94±12.53abcde
5군 119.26±4.88a 176.01±8.76ab 199.98±9.23abcdefghi 238.52±14.28cdefghi
6군 117.08±2.30a 170.45±4.64ab 193.26±3.20efghi 218.14±8.45i
7군 117.20±4.14a 172.74±5.23ab 202.82±11.62abcdefgh 238.00±6.95cdefghi
8군 115.10±4.77a 170.99±7.67ab 202.86±12.64abcdefgh 231.38±14.47efghi
9군 113.34±4.60a 169.19±8.89ab 187.96±9.44hi 223.36±15.54hi
10군 113.98±2.89a 171.17±2.55ab 190.04±5.80ghi 238.76±5.67cdefgi
11군 117.84±5.89a 173.27±6.21ab 188.52±11.06ghi 241.80±17.75bcdefgh
12군 121.02±7.26a 177.14±9.82ab 204.54±7.45abcde 224.94±13.30bcdefgh
13군 114.76±3.15a 169.35±5.68ab 208.50±4.89abcd 254.58±9.42hi
14군 117.96±3.62a 171.80±3.94ab 204.70±3.95abcde 249.96±6.97abc
15군 116.62±3.81a 171.86±4.94ab 208.20±5.24abcde 227.00±12.01fghi
16군 120.80±3.61a 174.34±6.43ab 202.62±8.41abcdefgh 226.12±9.77ghi
17군 126.98±3.251)a2)*3) 168.14±8.48ab 193.50±5.38defghi 223.42±15.02hi
18군 115.38±6.13a 170.78±6.58ab 189.14±8.35ghi 242.96±12.64abcdefgh
19군 117.36±5.07a 170.46±6.46ab 193.50±5.37defghi 247.24±9.27abcdefg
20군 113.36±3.19d 170.48±5.58ab 190.68±6.82fghi 252.28±6.91abcde
21군 115.08±4.91a 170.98±4.79ab 203.12±6.64abcdefg 249.94±5.81abcde
22군 117.64±4.14a 173.77±6.07ab 208.80±6.68abc 260.48±8.93ab
23군 115.72±3.14a 171.61±3.64ab 208.32±6.26abcde 251.26±7.58abcd
24군 131.14±2.44a 173.59±8.64ab 208.88±10.75abc 228.38±9.92defghi
25군 122.52±5.11a 175.25±6.55ab 215.06±6.67a 232.54±9.18defghi
26군 114.44±3.73d 168.75±5.24ab 202.62±8.41abcdefgh 222.64±8.89hi
27군 120.10±7.40a 176.58±5.17ab 193.54±8.69defghi 263.34±5.28a
28군 116.74±5.11a 171.38±6.12ab 187.92±8.10i 252.78±10.29abcde
29군 111.24±4.61a 166.11±3.44ab 187.50±6.48hi 251.22±6.14abcde
30군 111.84±2.79a 166.19±2.22ab 196.08±2.68cdefghi 251.06±3.68abcde
31군 112.84±4.89a 165.70±5.82b 199.96±6.51bcdefghi 248.05±8.85abcdef
32군 116.10±5.72a 171.50±5.17ab 204.36±5.73abcde 252.92±5.76abcd
[주] 1) 평균±SD2) 칸내 같은 윗첨자의 의미는 Duncan's multiple range test에 의해유의성 없는 차이를 나타낸다.3) *는 대조군 값과 유의성 있는 차이를 나타낸다(P<0.01)
제 5 공정: 콩추출물의 항산화성 효소활성도
슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase) 활성은 크산틴 옥시다아제( xanthine oxidase)에 의해 크산틴(xanthine)에서 생성된 슈퍼옥사이드가 페릭 사이토크롬(ferric cytochrome)을 페로우스 사이토크롬 C(ferrous cytochrome C)로 환원시키는데 이때 SOD가 존재하면 이 반응이 방해를 받게된다는 원리를 이용하여 크산틴(xanthine)과 사이토크롬 C(cytochrome C)가 들어있는 버퍼(buffer)에 효소원과 크산틴 옥시다아제(xanthine oxidase)용액을 넣어 사이토크롬 C(cytochrome C)의 환원을 방해하는 정도로써 측정하였고 사이토크롬 C(cytochrome C)의 환원을 50% 방해하는 SOD량을 1unit으로하여 활성정도를 나타내었다. 적혈구의 SOD측정을 위해 적혈구 현탁액을 용혈시킨 후 McCord등의 방법에 의해 헤모글로빈을 제거시켜 원심분리한 후 얻어진 상층액을 효소원으로하여 자동분석기로 측정하여 분석하여 나온 결과치를 10×Hb value으로 나누어주었다(u/g Hb으로 환산). 글루타치온 퍼록시다아제(Glutathione peroxidase)는 H2O2와 환원형의 글루타치온(glutathione)의 반응에 관여하여 산화형의 글루타치온(glutathione)을 생성하며 이 글루타치온(glutathione)은 글루타치온 환원제(glutathione reductase)의 도움으로 NADPH에 의해 다시 글루타치온(glutathione)으로 환원되는데 이 원리를 이용하여 Floche와 Gunzler의 방법에 따라 분당 산화되는 NADPH량을 측정하여 글루타치온 퍼옥시다아제(Glutathione peroxidase)의 활성을 나타내었다. 적혈구의 글루타치온 퍼옥시다아제(Glutathione peroxidase) 활성은 적혈구를 용혈시킨 후 적당량 희석해서 drabkin 용액을 1:1 비율로 혼합하여 헤모글로빈(hemoglobin;Hb)을 cyanometHb으로 전환시킨 것을 효소원으로 측정하였다. 실험결과, 표 7에 나타낸 바와 같이 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide Dismutase:SOD)의 활성도는 처리간 크게 차이를 나타내지 아니 했지만 검정콩1호 추출물이 높은 경향이었고 글루타치온 퍼옥시다아제(Glutathione peroxidase) 활성도는 검정콩1호와 수원182호에서 높았다.
항산화성 효소활성도
구 분 SOD(superoxide Dimutase)(Hb의 μ/g) GPx(Glutathione peroxidase)(Hb의μ/g)
1군 1261 314.8
2군 922 376.8
3군 1522 344.7
4군 1452 329.9
5군 1267 352.8
6군 1418 381.1
7군 1319 331.1
8군 1398 404.0
9군 1327 369.0
10군 1295 370.9
11군 1519 394.3
12군 1653 419.9
13군 3550 350.5
14군 1367 342.2
15군 1219 346.6
16군 1408 374.1
17군 1345 376.1
18군 1195 327.8
19군 1352 424.0
20군 1395 361.4
21군 1192 289.4
22군 1250 370.6
23군 1215 373.8
24군 1095 348.3
25군 1133 323.9
26군 1043 358.6
27군 1316 370.3
28군 1035 363.0
29군 1189 333.4
30군 1280 345.4
31군 1064 340.2
32군 1048 363.9
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 대두추출물로부터 이소플라보노이드 성분으로 다이드진(didzin), 글라이시테인-7-o-β-D-글루코스 (glycitein-7-o-β-D-글루코스), 제니스틴(genistin), 다이드제인(daidzein), 제니스테인(genistein)을 분리, 확인하였으며 대두추출물이 임상에서 글루타메이트 피루베이트 트랜스아미나아제(GPT), 글루타메이트 옥살로아세테이트 트랜스아미나아제(GOT), 락테이트 디하이드로게나아제(LDH)의 활성을 낮추고 콜린에스터라아제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD) 및 글루타치온 퍼옥시다아제의 활성은 증가시켜 인체의 생리활성을 증가시키는 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약 및 식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (2)

  1. 대두을 부순 후 헥산에 넣고 환류추출하여 지질성분을 제거하고 남은 잔사에 메탄올 수용액을 첨가하여 환류추출한 후 여과한 다음 감압농축하고 진공건조하는 것을 포함하는 대두추출물 제조방법.
  2. 상기 제 1 항의 의해 제조된 대두추출물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20040009971A (ko) * 2002-07-26 2004-01-31 김희정 이소플라본으로부터 다이드제인을 분리하는 방법
KR100858280B1 (ko) * 2006-08-29 2008-09-11 (주)엔앤비 제니스틴을 이용한 모나콜린 케이를 함유하는 제니스테인을 갖는 홍국균 배양 방법과 이를 이용한 분말, 겔, 쌀 제조방법
KR20210051157A (ko) * 2019-10-30 2021-05-10 김명환 플라보노이드를 함유하는 기능성 콩 및 그 재배방법
KR20220079352A (ko) 2020-12-04 2022-06-13 안동대학교 산학협력단 대두 껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물

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