KR20160125243A

KR20160125243A - 갯질경의 새로운 용도

Info

Publication number: KR20160125243A
Application number: KR1020150056167A
Authority: KR
Inventors: 정은주
Original assignee: 경남과학기술대학교 산학협력단
Priority date: 2015-04-21
Filing date: 2015-04-21
Publication date: 2016-10-31
Also published as: KR101769592B1

Abstract

본 발명은 갯질경의 새로운 용도를 제공한다. 본 발명에 의해 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환 중에서 선택된 하나 이상을 효과적으로 치료, 개선 및/또는 예방할 수 있다는 장점이 있다.

Description

갯질경의 새로운 용도{Novel use of Limonium tetragonum}

본 발명은 갯질경에 관한 것으로, 보다 상세하게는 갯질경의 새로운 용도에 관한 것이다.

갯질경(Limonium tetragonum)은 갯질경이과(Plumbaginaceae)의 초본식물로, 알츠하이머 등에 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(대한민국 등록특허 제10-0965304호).

한편, 현대인에게 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환 등의 문제는 심각하므로, 이에 효과를 나타내는 물질의 개발이 필요하다.

대한민국 등록특허 제10-0965304호, (2010.6.22), 청구범위

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 갯질경의 새로운 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 과제는 상기에 언급된 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명자는 놀랍게도 갯질경(Limonium tetragonum)이 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 및/또는 알코올성 간질환 등에 효과를 나타냄을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 갯질경의 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환 중에서 선택된 하나 이상의 치료, 개선 및/또는 예방을 위한 의약 및/또는 식품 용도를 제공한다.

상기 고지혈증, 상기 간염, 상기 간경화, 상기 지방간, 상기 간암, 상기 간손상, 상기 염증 또는 상기 알코올성 간질환 중에서 선택된 하나 이상은 식이에 의한 것으로, 일 예로, 알코올 섭취에 의한 것일 수 있다. 치료는 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환 중에서 선택된 하나 이상과 관련된 증상의 개선, 경감 등을 포괄하는 의미이고, 예방은 질병 이전 단계에서 질병으로 발전되는 것의 억제를 포괄하는 의미이다. 상기 알코올은 에탄올일 수 있다. 상기 간손상은 산화적 스트레스에 의한 것일 수 있다.

상기 알코올성 간질환은 알코올성 지방간, 알코올성 간염, 알코올성 만성 간염, 알코올성 간경화, 알코올성 간암 또는 알코올성 간손상 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명은 갯질경을 유효성분으로 포함하는 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환 중에서 선택된 하나 이상의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

상기 갯질경{Limonium tetragonum (Thunb) A.A. Bullock}은 두해살이풀로 원산지는 한국으로, 한국, 일본 등에 분포하며 바닷가에서 자란다. 이와 같은 갯질경은 자연에서 채취하거나 재배된 것일 수 있다.

상기 갯질경은 전초 또는 일부일 수 있으며, 예를 들어 지상부일 수 있다.

상기 갯질경은 생갯질경, 갯질경건조물, 또는 갯질경용매추출물 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 용매는 극성용매일 수 있다.

상기 용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합용매 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 알코올은 저급알코올일 수 있으며, 탄소수 1 내지 6개의 알코올 중 선택된 하나 이상일 수 있다. 일 구체예로 상기 알코올은 메탄올일 수 있다.

또한, 상기 갯질경 용매추출물은 상기 생갯질경, 또는 상기 갯질경건조물 중에서 선택된 하나 이상을 물, 알코올 또는 이들의 혼합용매 중에서 선택된 하나 이상으로 추출한 조추출물을 에틸아세테이트로 분획추출한 분획추출물일 수 있다.

상기 분획추출은 클로로포름, 에틸아세테이트, 및 노말-부탄올 순으로 상기 조추출물을 분획한 후, 에틸아세테이트 분획을 얻는 것일 수 있다.

또한, 상기 갯질경 용매추출물은 상기 생갯질경 또는 상기 갯질경건조물 중에서 선택된 하나 이상을 물, 알코올 또는 이들의 혼합용매 중 하나로 추출하여 조추출물을 얻는 단계; 상기 조추출물과 물을 접촉시켜 접촉물을 얻는 단계; 및 상기 접촉물을 에틸아세테이트로 분획추출하는 단계를 포함하여 수득되는 분획추출물일 수 있다.

상기 분획추출은 클로로포름, 에틸아세테이트, 및 노말-부탄올 순으로 상기 접촉물을 분획한 후, 에틸아세테이트 분획을 얻는 것일 수 있다. 분획(fraction)은 당업계에 알려진 통상의 분획법에 의해 실시할 수 있다.

상기 치료 또는 예방은 상기 갯질경에 의한, 간 조직에서 지방구 축적 억제, 간 조직에서 아스파라진산 아미노전이효소(AST)의 활성도 감소, 간 조직에서 알라닌 아미노전이효소(ALT)의 활성도 감소, 염증 완화, 혈 중 콜레스테롤 축적 억제, 혈 중 중성지방 축적 억제, 알코올대사 촉진, 알데하이드 디하이드로게나아제 활성 증가, 간조직 중 항산화효소 활성 증가, 또는 간조직 내 과산화지질 증가 억제 중에서 선택된 하나 이상에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 유효성분을 조성물 총 중량에 대하여 0.1~95중량% 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 갯질경을 유효성분으로 포함하는 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환 중에서 선택된 하나 이상의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.

별도의 언급이 없는 한 상기 식품 조성물은 본 발명의 약학조성물에서 언급된 사항이 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다. 상기 '개선'은 '치료'에 포함되며, 상태 또는 증세가 호전되는 것을 의미한다.

상기 식품조성물은 음료를 포함하는 식품에 다양하게 포함될 수 있고, 음료, 껌, 차, 건강기능식품 등의 형태일 수 있으며, 상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제 등의 제형으로 제제화할 수 있다. 상기 건강기능식품이라 함은 대한민국 건강기능식품에 관한 법률 제12669호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조(가공을 포함한다. 이하 같다)한 식품을 말하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 말한다. 상기 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 식품 첨가물은 케톤류, 글리신, 구연산나트륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다. 또한, 상기 식품조성물은 식품첨가제 등을 포함하는 의미이다.

본 발명은 또한 갯질경을 투여를 필요로 하는 인간을 포함한 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환 중에서 선택된 하나 이상의 치료 또는 예방법을 제공하며, 갯질경의 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환 중에서 선택된 하나 이상의 치료 또는 예방용 제제 제조를 위한 용도를 제공한다. 상기 투여되는 갯질경은 유효량의 갯질경일 수 있다.

별도의 언급이 없는 한, 본 발명의 약학 조성물, 식품 조성물, 방법, 또는 용도에서 언급된 사항은 모순되지 않는 한 서로 동일성 범위에서 적용된다.

상기 갯질경 또는 상기 조성물은 인간을 포함한 포유류에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 유효성분을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 제제화하여 투여할 수 있다. 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 및/또는 젤라틴 등을 첨가하여 제조한다. 또한, 마그네슘, 탈크 등 윤활제도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및/또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 주사가능한 액제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 비강세척제 및 좌제가 포함된다. 주사가능한 액제, 현탁제, 유제는 물, 비수성용제나 현탁용제와 유효성분을 혼합하여 제조할 수 있으며, 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등일 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및/또는 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사로 투여가능하다.

본 발명의 조성물에 포함되거나, 용도 또는 방법 중 사용되는 갯질경은 성인 기준으로 1일 1 ~ 1000 mg/kg, 바람직하게는 10~500mg/kg의 용량으로 사용가능하다. 투여는 하루에 한번 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 범주는 상기 투여량 및 투여횟수에 의해 제한되지 않는다.

상기 갯질경은 약학적으로 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등의 첨가제를 첨가하여 제제화할 수 있으며, 제제화에 관한 내용은 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA 등의 문헌을 참조할 수 있다.

따라서, 본 발명의 조성물은, 약제학적으로 허용되는 첨가제 또는 식품학적으로 허용되는 첨가제를 더 포함하고, 상기 유효성분 및 상기 약제학적으로 허용되는 첨가제 또는 상기 식품학적으로 허용되는 첨가제로 이루어질 수 있다.

본 발명에 의해 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환 중에서 선택된 하나 이상을 효과적으로 치료, 개선 및/또는 예방할 수 있다.

도 1은 실시예 1의 병리조직학적 조직검사 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 실시예 2의 혈중알코올농도 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 2의 ADH 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 2의 ALDH 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것일 뿐, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

명세서 전체에 걸쳐 "및/또는"은 언급된 구성요소의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소, 및/또는 단계는 하나 이상의 다른 구성요소, 및/또는 단계의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

본 명세서에서, '생갯질경'은 채취 후 별도의 건조과정을 거치지 않은 갯질경의 전초 또는 일부를 의미하고, '갯질경건조물'은 생갯질경을 건조한 것을 의미한다.

이하, 실시예에서는 고농도 알코올을 함유한 고지방식이 투여를 통해 간질환 및 고지혈증을 유도시킨 동물모델을 이용하여, 갯질경이 지방간, 간염, 간경화, 간암, 간손상, 염증 및/또는 알코올성 지방간 등의 알코올성 간질환 등에 효과를 나타냄을 확인하였다.

실시예에서 사용한 시약 등은 시중에서 구할 수 있는 최상급을 사용하였으며, 시그마사 등에서 구입한 것을 사용하였다.

<실시예 1> 갯질경의 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환 등의 개선, 치료, 및/또는 예방 효과 확인 I

1-1. 갯질경 준비

야생의 생갯질경 전초를 2013.7. 대한민국 신안군 해변에서 채취하여, 경남과학기술대학교 생약학 실험실에 채집표본(voucher specimen)(GNP-70)으로 기탁하였다. 기탁한 표본과 동일한 갯질경의 지상부를 동결건조기로 건조하여 갯질경건조물(2kg)을 얻은 후 파쇄하고, 건조 시료 부피와 동량 이상의 메탄올을 가하여 섭씨 25도의 저온상태에서 3시간 초음파 추출하여 1차 추출액으로 하고, 상기 방법과 동일한 방법으로 2회 추가 추출하여 2차추출액과 3차추출액을 얻었다. 1차, 2차, 3차 추출액을 모두 혼합하여 여과한 후 감압 농축하여 농축물(569.9g)을 얻었다. 농축물을 증류수에 현탁한 후 동량의 클로로포름을 가하고 30~60분 분획깔때기에서 방치한 후 층이 완전히 나뉘면 클로로포름층만을 1차 분획물로 얻는다. 동일한 방법으로 2회 추가 분획하여 2차 분획물과 3차분획물을 얻었고, 1차, 2차, 및 3차 분획물을 모두 혼합하여 클로로포름 분획으로 하였다. 클로로포름 분획을 실시하고 남은 증류수 현탁액에 상기 클로로포름 분획방법과 동일한 방법으로 에틸아세테이트 분획과 노말-부탄올 분획을 순차적으로 얻었다. 그 중 에틸아세테이트 분획을 농축한 후 동결건조하여 분말상태의 갯질경 용매추출물을 준비하였다.

1-2. 대조물질 등 준비

대조물질: Silymarin (LEGALON CAP. 140, 부광약품)

질환 등 유도물질: 에틸알코올

부형제: 0.5% carboxymethylcellulose(CMC)

1-3. 조제

1-3-1. 시험물질, 대조물질 및 부형제의 조제

일정량의 시험물질 및 대조물질을 칭량하여 0.5%의 부형제에 넣어 stirrer로 10분이상 교반하여 조제한다. 대조물질의 경우 캡슐을 제거하고 내용물만 칭량하여 사용한다.

부형제는 일정량을 칭량하여 멸균증류수와 함께 stirrer로 10분이상 교반하여 0.5% 부형제를 조제한다.

1-3-2. 조제빈도 및 보관

시험물질은 매주 1회 조제하며 조제시험물질은 냉장보관한다.

1-4. 실험동물 준비

종: 마우스(특정병원체부재 (SPF))

계통/아계통: C57BL/6J Jms Slc

입수동물수: 48마리(수컷 48마리)

투여동물수: 48마리(수컷 48마리)

주령범위: 약 7주령에 입수하며, 투여개시 시 약 8주령 동물을 사용한다.

공급원: 중앙 실험동물

순화: 모든 동물은 실험실 환경에 적응하기 위해 5일간의 순화기간을 둔다.

군 분리: 질병이나 상처 등의 임상증상을 보이지 않고, 적절한 체중을 나타내는 동물을 선택하여 시험에 사용한다. 가장 최근에 측정된 체중을 근거로 Path/Tox System을 이용하여 대조군과 투여군에 무작위로 배치한다.

사육: 순화기간 및 투여기간에 6마리 이하로 폴리카보네이트 사육상자에 수용하여 사육한다.

동물실 환경: 온도(섭씨 23±3도), 습도(30 - 70%), 조명12 hour light/12 hour dark cycle (08:00 점등 ~ 20:00 소등), 조도(150 - 300 Lux), 환기횟수(10 - 20 times/hour)

사료와 물: 순화기간에는 감마선이 조사된 실험동물용 고형사료 (Lab Diet(R)#5002 Lab Diet(R) #5053 PMI Nutrition International, USA)를 자유 급여한다. 순화기간 이후에는 알코올이 포함된 특수사료와 이에 대한 control 사료 (Lieber-DeCarli ethanol diet #710260, Lieber-DeCarli control diet #710027, Dyets, USA)를 실험 설계에 따라 매일 조제하여 급여한다. 물은 미세여과기와 자외선 유수살균장치를 통과한 상수도수를 자유급여 한다.

1-5. 실험군

하기 표와 같이 실험군을 구성하였다.

군	마릿수	유도물질	시험물질
정상대조군	12	Lieber-DeCarli Control diet	0.5% CMC 10mg/kg
양성대조군	12	Lieber-DeCarli Ethanol diet	Silymarin 100mg/kg
에탄올투여군	12	Lieber-DeCarli Ethanol diet	0.5% CMC 10mg/kg
갯질경투여군	12	Lieber-DeCarli Ethanol diet	실시예 1-1. 추출물 100mg/kg

1-6. 투여

1-6-1. 알코올 사료 적응기간

군 분리를 실시한 후 급여 사료 내 알코올 농도를 7일 간 점진적으로 증가시켜 최고 알코올 농도의 사료에 동물을 순응시킨다. 군 분리를 실시한 후 다음의 표에 따라 유도물질인 ethyl alcohol을 섞은 Lieber-DeCarli ethanol diet를 feeding tube에 담아 매일 새로 급여하여 알코올성 지방간을 유도한다. 정상대조군의 사료 조제는 Lieber-DeCarli control diet 221.78g, 찬물 1L의 비율을 맞춰 blender로 잘 섞는다.

일	사료 (g)	알코올 (mL)	찬물 (total volume; mL)	농도 (%)
1일차	106	8	800	1
2일차	106	16	800	2
3일차	106	24	800	3
4일차	106	28	800	3.5
5일차	106	28	800	3.5
6일차	106	32	800	4
7일차	106	36	800	4.5
8일차 이후	106	40	800	5

1-6-2. Binge drinking에 의한 알코올성 간손상의 유도

Bertola et al., (2013)의 NIAAA model 을 참조하여 Leiber-DeCarli 사료를 급여하는 중 single binge ethanol feeding을 실시한다(Mouse model of chronic and binge ethanol feeding (the NIAAA model). Nat Protoc. Mar 2013; 8(3): 627-637 참조). 부검 7일 전 40% EtOH 10ml/kg를 양성대조군, 에탄올투여군, 갯질경투여군 각각에 경구로 투여한다.

1-6-3. 투여방법

최고 알코올 농도의 사료를 급여함과 동시에 시험물질의 투여를 시작한다.

시험물질은 8주간 투여하며 투여 방법은 가장 최근의 체중을 기준으로 정상대조군과 에탄올투여군에 0.5% CMC 10ml/kg를, 양성대조군에는 silymarin 100mg/kg, 갯질경투여군에는 실시예 1-1. 추출물 100mg/kg를 매일 1회 경구 투여한다. 투여는 매일 오전 중 같은 시간에 실시하며 시험물질은 동물실에서 투여 전과 투여 중 지속적으로 교반한다.

1-7. 채혈 및 혈액생화학 검사

1-7-1. 혈액 채취 및 검사방법

계획 도살되는 시험 동물을 대상으로 부검 전에 혈액을 채취한다. 부검 전날overnight으로 절식시킨 동물을 CO₂ 마취 하에 개복 후 후대정맥에서 2ml가량 채혈하여 전혈을 채혈튜브에 넣는다. 채취한 혈액을 부드럽게 섞은 후 약 60분간 실온에 방치하였다가 원심분리(3000 rpm, 10분)하여 혈청을 분리한다. 분리된 혈청은 미리 표시된 polypropylene 튜브에 옮긴 후, 혈액생화학적 항목{Asparatate aminotransferase(AST), Alanine aminotransferase (ALT), Alkaline phosphatase (ALP), Blood urea nitrogen (BUN), Creatinine (CREA), Glucose (GLU), Total cholesterol (TCHO), Albumin/globulin ratio (A/G), Total protein (TP), Albumin (ALB), Creatine kinase (CK), Triglyceride (TG), Total bilirubin (TBIL), Phospholipid (PL), Gamma Glutamyl transferase (GGT), Calcium (Ca), Inorganic phosphorus (IP), Chloride (Cl), Sodium (Na), Potassium (K)}에 관하여 측정한다. 상기의 항목에 대해서는 혈액생화학자동분석장치 (HITACHI Automatic analyzer 7180 Hitachi Co., Japan)를 이용하여, 제조사의 지시에 따라 측정하였다.

얻어진 자료에 대한 통계분석은 다중비교검정법을 실시한다. 검사항목에 대해 Levene 등분산 검정을 실시하여 모두 유의성이 인정되지 않을 경우 모수적 방법인 일원배치분산분석(ANOVA)으로 유의수준 0.05로 검정한다. 검정 결과 유의성이 인정된 항목에 대해서는 Tukey post hoc test로 각 시험군 사이에 차이가 있는지 사후검정 한다. Levene 검정에서 유의성이 인정된 경우는 비모수 방법인 Kruskal-Wallis로 유의수준 0.05로 검정한다. 검정 결과 유의성이 인정된 항목에 대해서는 순위변수(rank)를 부여한 후 Tukey post hoc test를 실시한다. 이러한 분석은 SPSS 17.0 프로그램을 이용하여 실시한다.

혈중 글루코오스, 혈중 총 단백질, 혈중 알부민, 혈 중 AST, 혈 중 ALT, 혈 중 ALP, 혈중 콜레스테롤, 혈중 트리글리세라이드의 변화는 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환 등과 관련되어 있음이 알려져 있으므로, 그를 이용하여 갯질경추출물이 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환 등에 효과적임을 확인하고자 하였다.

그 결과를 표 3에 나타내었다. 표 3은 혈액검사결과를 나타낸 표이다.

	GLU (g/dL)	TP (g/dL)	ALB (g/dL)	AST (U/L)	ALT (U/L)	ALP (U/L)	Chol (mg/dL)	TG (mg/dL)
정상대조군	230.67	5.43	1.98	53.50	31.33	335.44	170.67	55.33
에탄올 투여군	184.29^#	5.64	2.07	189.50^#	149.57^#	314.14	142.43^#	61.71
갯질경 투여군	159.25^*	5.61	2.06	141.25^*	101.13^*	310.50	122.14^*	49.38^*

# 정상대조군 대비 p<0.01

* 에탄올투여군 대비 p<0.01

혈 중 AST 및 ALT는 간이 알콜, 약물 등이 원인이 되어 손상을 입을 경우 간으로부터 혈액 중으로 분비되기 때문에 간 기능 장애를 나타내는 일반적인 지표로서 사용되고 있는 효소이며, 혈 중 AST 및 ALT의 활성을 저하시킬 수 있는 물질은 지방간 개선 등 간 기능을 개선할 수 있다고 알려져 있다. 또한, ALP는 여러 가지 인산에스터를 분리시키고 골격내에서 석회화를 촉진시켜 장내에서는 인 흡수 등에 관여하는 효소로 골질환, 간이나 담도질환, 임신 및 악성종양 등에서 활성치가 상승한다(Korean J. Lab. Ani. Sci. 11, 141-145, 1995; Korean J. Lab. Ani. Sci. 9, 71-82, 1993). 본 실시예에서, 혈청 중 AST와 ALT의 수치는 에탄올투여군이 각각 189.50과 149.57 U/L로 정상대조군보다 유의성 있게 높은 활성을 나타냈다(#p<0.01). 에탄올투여군과 비교했을 때 갯질경투여군에서는 AST와 ALT의 수치가 각각 141.25와 101.13 U/L으로 유의적으로 감소하였다(*p<0.01). ALP 수치는 정상대조군에 비해 에탄올투여군에서 약간 감소한 경향을 나타내었으나 유의적인 차이는 없었다. 알부민은 간에서 만들어지는 단백질의 1/4을 차지할 정도로 간에서 생산되는 주요 단백질이다. 따라서 간세포의 수가 충분치 않으면 알부민이 충분히 생성되지 못하여 혈청내의 알부민이 낮아지며 심각한 수준의 간질환 또는 신증후군, 영양실조 등을 의심할 수 있다. 정상대조군과 에탄올투여군에서 혈 중 총단백질(TP)과 알부민(ALB) 수치는 유의적인 변화가 관찰되지 않았다. 혈 중 콜레스테롤 수치는 정상대조군과 비교했을 때 에탄올 투여군에서 약간 감소하는 경향을 나타내었으나, 이는 고지방식이만을 투여한 정상대조군의 체중증가치를 고려했을 때 비슷한 수준으로 판단된다. 갯질경투여군에서는 에탄올투여군과 비교했을 때 콜레스테롤 수치가 유의적으로 감소하였다(*p<0.01). 갯질경 투여군에서 중성지방 수치는 에탄올 투여군 뿐만 아니라 정상대조군보다 낮은 수치를 나타내어, 갯질경 추출물이 혈 중 콜레스테롤 및 중성지방 감소에 효과적임을 알 수 있다.

위의 결과로부터 유도물질인 에탄올과 고지방식이에 의해, AST와 ALT의 활성도 증가, 콜레스테롤과 중성지방 축적 증가 등이 관찰되어 알콜성 고지혈증, 지방간 등 간질환이 효과적으로 유도되었음을 알 수 있다.

갯질경 추출물 투여군의 경우, 에탄올 투여군과 동일하게 에탄올을 섭취하였음에도, 에탄올 투여군에 비해 AST 및 ALT의 활성도가 크게 감소하였고, 혈 중 콜레스테롤과 중성지방의 수치 또한 크게 감소하는 것으로 관찰되었다. 이와 같은 결과로부터, 갯질경이 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환, 예를 들어, 알코올로 유도되는 알코올성 간염, 알코올성 만성간염, 알코올성 간경화, 알코올성 지방간, 알코올성 간암, 알코올성 간손상 등에 효과적임을 알 수 있다.

이와 같은 결과로부터, 갯질경에 의해, 고지혈증, 간염, 간경화, 간암, 간손상, 염증, 지방간 또는 알코올성 간질환 등의 개선, 치료, 및/또는 예방, 보다 바람직하게는 알코올로 인한 고지혈증, 간염, 간경화, 간암, 간손상, 염증, 지방간 또는 알코올성 간질환 등의 개선, 치료, 및/또는 예방이 가능함을 알 수 있다.

1-8. 부검 및 병리조직학적 검사

1-8-1. 부검 및 장기중량 측정, 조직의 고정

시험 동물은 CO₂ 흡입을 이용하여 채혈 후 안락사 시키며, 후대정맥과 복대동맥을 절단하여 방혈치사 시킨다. 부검 전 육안소견을 확인하고 완전하게 방혈 된 것을 확인하고 복강과 흉강의 비정상 유무를 관찰한 후 간 전엽을 적출한다. 적출한 간은 증류수(D.W)에 씻어 남은 혈액을 제거하고 무게를 측정한 후, 고정 대상 위치를 trimming하여 슬라이드 제작에 필요한 부분을 즉시 10% 중성 완충 포르말린에 고정한다. 고정하지 않은 간의 나머지 부분은 50ml conical tube에 넣어 deep freezer (-72°C)에 보관한다.

1-8-2. 병리조직학적 검사

조직학적 검사를 통하여, 에탄올과 고지방식이 투여에 의한 간 조직 염증세포의 증식, 간세포 사멸, 간 조직 구조물의 파괴, 지방구 축적 등 병리학적 소견을 관찰하고, 이러한 간독성 지표에 대한 갯질경추출물의 개선 효과를 확인하고자 하였다.

10% 중성 완충포르말린에 고정한 간 조직은 조직표본을 만들고, Hematoxylin & eosin 염색 후 병리조직학적 검사를 실시한다.

그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 실시예 1의 병리조직학적 조직검사 결과를 나타낸 사진이다.

도 1에 도시된 바와 같이, 정상대조군에 비해 에탄올 투여군에서 지방구(lipid droplet) 축적이 확연히 증가하고 염증세포의 증가가 일부 관찰된 것으로 부터, 유도물질(에탄올)에 의해 에탄올 투여군에 지방간이 진행되었거나 진행될 수 있는 상태로 유도되었음을 시각적으로 확인할 수 있다. 또한, 간염, 간경화, 간암, 간손상, 염증, 고지혈증, 알코올성 간질환 등으로 진행되었거나, 진행될 수 있는 상태로 유도되었음을 알 수 있다. 갯질경투여군의 경우, 지방구가 에탄올투여군에 비해 적게 나타나고 염증세포의 감소 및 간세포 파괴가 감소하였음을 알 수 있다. 즉, 조직학적 관찰에서 대조군과 비교했을 때 갯질경투여군의 간조직에서 지방구 축적이 감소하고 염증이 완화된 것으로부터 간보호 효과를 확인할 수 있으며, 이로부터 갯질경이 고지혈증, 간염, 간경화, 간암, 간손상, 염증, 지방간 또는 알코올성 간질환 등에 효과적임을 알 수 있다.

이와 같이 갯질경은 간조직에서 지방구 축적 억제 작용 및 항염증 작용에 의해, 그와 관련된 고지혈증, 간염, 간경화, 간암, 간손상, 염증, 지방간 또는 알코올성 간질환 등의 개선, 치료, 및/또는 예방, 보다 바람직하게는 알코올로 인한 고지혈증, 간염, 간경화, 간암, 간손상, 염증, 지방간 또는 알코올성 간질환 등의 개선, 치료, 및/또는 예방이 가능함을 알 수 있다.

1-7.~1-8.의 결과로부터 갯질경은 알코올로 유도된 간염 및 지방간조직에서 지방구 축적 억제와 염증 반응 완화 등이 가능함을 알 수 있다.

이로부터, 갯질경은 고지혈증, 간염, 간경화, 간암, 간손상, 염증, 지방간 또는 알코올성 간질환 등의 개선, 치료, 및/또는 예방, 보다 바람직하게는 알코올로 인한 고지혈증, 간염, 간경화, 간암, 간손상, 염증, 지방간 또는 알코올성 간질환 등에 효과적임을 알 수 있다.

따라서, 갯질경은 고지혈증, 간염, 간경화, 간암, 간손상, 염증, 지방간 또는 알코올성 간질환 등의 개선, 치료, 및/또는 예방, 보다 바람직하게는 알코올로 인한 고지혈증, 간염, 간경화, 간암, 간손상, 염증, 지방간 또는 알코올성 간질환 등의 개선, 치료, 및/또는 예방이 가능함을 알 수 있다.

<실시예 2> 갯질경의 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환 등의 개선, 치료, 및/또는 예방 효과 확인 II

2-1. 갯질경 준비

실시예 1-1.과 동일한 방법으로, 갯질경 용매추출물을 준비하였다.

2-2. 실험동물 준비

실험동물은 7주령의 웅성 흰쥐(Spargue-Dawley rat)를 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 적응기간 중 동물 사육실의 환경은 온도 섭씨 23±1도, 습도 50±5%, 12시간의 명암주기를 유지하도록 조절하였으며, 사료는 실험동물용 사료를 음수는 정제수를 자유로이 섭취하도록 하였다.

2-3. 실험동물 처리

1주일간 적응시킨 흰쥐를 8마리씩 3군으로 나누어 정상대조군, 에탄올투여군, 갯질경투여군으로 구분하였다. 정상대조군은 0.5%-CMC(카복시메틸셀룰로오즈) 용액을 투여하였고, 갯질경투여군에는 2-1.에서 준비된 갯질경 추출물 200mg/kg을 0.5%-CMC에 녹여 경구 투여하였다. 1시간 후, 갯질경투여군과 에탄올투여군에 40%에탄올 10mg/kg을 1회 경구투여하였다. 에탄올투여 1, 2, 4시간 후에 정상대조군, 에탄올투여군, 갯질경투여군의 꼬리정맥으로부터 1mL의 혈액을 채취하였고, 마지막 채혈 후 즉시 간을 적출하였다.

2-4. 혈중 알코올 농도 측정

2-3.에서 채취한 혈액을 분리시험관(seperation tube)에 넣어 실온에 30분 방치 후, 3000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액만 취하여 섭씨 영하 70도에서 보관하였다. 보관된 상층액에 대하여, 에탄올측정 키트(Bio-vision, Cat# K620-100)를 이용하여, 제조사의 지시에 따라 알코올 농도를 측정하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2는 실시예 2의 혈중알코올농도 측정 결과를 나타낸 그래프로, x축은 경과시간(시간)을 나타내고, y축은 알코올농도(nM)을 나타낸다. 도 2의 수치는 평균±표준편차를 나타내고, *은 에탄올투여군 대비 p<0.001을 나타낸다.

도 2에서 보는 바와 같이, 에탄올 투여 후 상승한 혈중 알코올 농도는 알코올 투여 4시간 후 감소하는 경향을 나타내었다. 에탄올투여군에 비해 갯질경투여군의 혈중 알코올 농도가 빠른 속도로 감소하였음을 알 수 있다.

이와 같은, 갯질경에 의한 알코올대사 촉진 작용에 의해, 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환 등, 특히, 알코올로 인한 질환 및/또는 증세의 치료, 개선 및/또는 예방이 가능할 것으로 보인다.

2-5. 간조직 중 ALDH 측정

혈중 알코올 분해 촉진이 실제 생체 내에서 어떤 기작에 의해 일어나는지 알아보기 위해, 체내 알코올 대사에 관여하는 ADH 및 ALDH 활성 증진 정도를 측정하였다.

2-3.에서 적출한 간의 일정량을 4배량의 0.25M 수크로오스 용액에 넣고 호모게나이저를 이용하여 20%(w/v)마쇄균질액을 제조하였다. 마쇄균질액을 600xg에서 10분간 원심분리 후, 다시 상층액을 1,000xg에서 20분, 다시 상층액을 15,000xg에서 1시간 동안 초원심분리하여 분획을 얻었다. 이 분획 내 존재하는 알코올디하이드로게나아제(alcohol dehydrogenase; ADH)와 알데하이드 디하이드로게나아제(aldehyde dehydrogenase; ALDH) 활성도를 각각 ADH assay kit(Biovision Cat. #787-100)와 ALDH assay kit(Biovision Cat. #731-100)를 이용하여 측정하였다. 측정법은 제조사의 지시를 따랐다.

그 결과를 도 3, 도 4에 나타내었다. 도 3은 실시예 2의 ADH 측정 결과를 나타낸 그래프이고, 도 4는 실시예 2의 ALDH 측정 결과를 나타낸 그래프이다. 도 3과 도 4의 x축은 군을 나타내고, 도 3의 y축은 ADH활성도(시간당 NADH 함량)를 나타내고, 도 4의 y축은 ALDH활성도(시간당 NADH 함량)를 나타낸다. 도 3과 도 4의 수치는 평균±표준편차를 나타내고, #은 정상대조군 대비 p<0.01을 나타내고, *은 에탄올투여군 대비 p<0.01을 나타낸다.

도 3에서 보는 바와 같이, 에탄올투여군의 ADH 활성도가 정상대조군에 비해 높게 나타났으며, 갯질경투여군의 ADH 활성도는 정상대조군에 비해 약간 상승하였으나, 에탄올투여군과 유의적인 차이는 나타내지 않았다.

ALDH 활성도의 경우는 도 4에서 보는 바와 같이, 에탄올투여군의 경우 에탄올투여에 의해 증가하는 경향을 나타내며, 갯질경투여군의 경우는 에탄올투여군에 비해 큰 폭으로 상승함을 알 수 있다.

이와 같은 결과로부터 갯질경이 체내 알코올 대사와 관련된 알데하이드 분해활성이 뛰어남을 알 수 있다.

이와 같은, 갯질경에 의한 알데하이드 분해 활성에 의해, 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환 등, 특히, 알코올로 인한 질환 및/또는 증세의 치료, 개선 및/또는 예방이 가능할 것으로 보인다.

2-6. 간조직 중 항산화효소 활성 측정

2-3.에서 적출한 간의 일정량을 4배량의 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 7.4)에 넣고 호모게나이저를 이용하여 마쇄균질액을 제조한 후, 3000xg에서 30분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. SOD(슈퍼옥시드디스뮤타제; superoxide dismutase)의 활성도는 McCord and Fridovich method(J. Biol. Chem. 1969, 244, 6056-6063)를 이용하여 측정하였으며, 조직 상층액 200 ul에 반응액 (0.2 mM hydroxylamine and hypoxanthine)을 동량 첨가한 후 200ul의 xanthine oxidase와 함께 섭씨 37도씨에서 30분간 반응시켰다. 반응을 중지시킨 후 상온에서 20분간 방치하고 UV흡광장치를 이용하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 활성단위는 사람의 적혈구 효소를 이용하여 SOD 표준치 값과 비교하여 결정하였다. GSH-px(글루타치온 퍼옥시다제; glutathione peroxidase)의 활성도는 GSH(glutathione)에서 GSSG(glutathione disulfide)로의 산화율을 cumene hydroperoxide로 측정하였다(Methods Enzymol. 1984, 105, 114-121.). 조직 상층액 200ul을 53ul의 glutathione reductase, 133ul GSH, 100ul NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)가 담긴 880ul phosphate buffer(pH 7.2)에 첨가하였다. 반응액을 섭씨 37도씨에서 3분간 반응시킨 후 흡광도의 감소 정도를 340nm에서 2분간 매 15초 간격으로 측정하였다. Catalase의 활성도 측정을 위하여 조직 상층액 200ul를 150ul의 19mM 과산화수소가 담긴 microcuvette에 첨가하였다. 과산화수소의 고갈정도를 UV흡광장치를 이용하여 240nm에서 측정하였다(J. Bil. Chem. 1952, 195, 133-140 참조).

그 결과를 표 4에 나타내었다. 표 4의 값은 평균±표준편차를 나타낸다. 표에 기재된 바와 같이, 에탄올투여군은 정상대조군에 비해 SOD, GSH-px, 카탈라아제의 효소 활성이 감소한 것으로 나타났다. 갯질경투여군의 경우는 에탄올투여군에 비해 3종의 항산화 효소의 활성이 모두 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 GSH-px와 카탈라아제의 경우 정상대조군 수준으로 회복되는 것으로 나타났다.

군	정상대조군	에탄올투여군	갯질경투여군
SOD (mmol/mg protein)	102.79±12.78	69.22±8.89^#	78.34±5.57^*
GSH-px (nU/mg protein)	326.80±25.57	259.61±31.90^#	318.99±22.28^*
카탈라아제 (U/g protein)	204.79±19.89	165.77±13.34^#	189.57±17.20^*

# 정상대조군 대비 p<0.01

* 에탄올투여군 대비 p<0.01

이와 같은 결과로부터, 갯질경에 의한 간조직 중 항산화효소 활성 증가 작용에 의해, 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환 등, 특히, 산화적스트레스로 인한 간손상, 알코올로 인한 질환 및/또는 증세의 치료, 개선 및/또는 예방이 가능할 것으로 보인다.

2-7. 간조직 내 과산화지질 측정

2-3.에서 적출한 간의 일정량을 0.02M 포스페이트 버퍼(pH 7.4)에 넣고 호모게나이저를 이용하여 10%(w/v)마쇄균질액을 제조한 후, 0.02M 포스페이트 버퍼(pH 7.4)로 희석하여 5%(w/v) 균질액이 되도록 하였다. 9000xg에서 30분간 원심분리하여 얻은 미토콘드리아 다음 상등액(post mitochondrial supernatant)에서 과산화 생성물의 마론디알데하이드(malondialdehyde; MDA)를 티오바비튜릭산(thiobarbituric acid)법에 의해 측정하였다(Buege, J.A.; Aust, S.D. Methods Enzymol. 1978, 52, 302-310).

그 결과를 표 5에 나타내었다. 표 5의 값은 평균±표준편차를 나타낸다. 표에 기재된 바와 같이, 간 조직의 지질과산화물 농도는 정상군에 비해 에탄올투여군의 경우 증가하였으나, 갯질경투여군의 경우 감소되어 정상대조군과 유사한 수준이 되는 것으로 나타났다.

군	정상대조군	에탄올투여군	갯질경투여군
MDA (mmol/mg protein)	23.45±1.39	49.89±3.45^#	35.44±3.20^*

# 정상대조군 대비 p<0.01

* 에탄올투여군 대비 p<0.01

이와 같은 결과로부터, 갯질경에 의한 간조직 내 알코올에 의한 과산화지질 증가 억제 작용에 의해, 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환 등의 치료, 예방, 및/또는 개선이 가능할 것으로 보인다.

2-4.~2-7.의 결과로부터 갯질경은 알코올대사 촉진, 알데하이드 디하이드로게나아제 활성 증가, 간조직 중 항산화효소 활성 증가, 간조직 내 알코올에 의한 과산화지질 증가 억제 등이 가능함을 알 수 있다.

이로부터, 갯질경은 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환 등, 특히, 알코올로 인한 질환 및/또는 증세의 치료, 개선 및/또는 예방이 가능할 것으로 보인다.

<제조예 1> 약학 조성물의 제조

실시예 1-1과 동일한 방법으로 준비한 갯질경 추출물 100mg, 옥수수 전분 100mg, 유당 100mg, 스테아린산 마그네슘 2mg을 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<제조예 2> 식품 조성물의 제조

실시예 1-1과 동일한 방법으로 준비한 갯질경 추출물(10중량 %), 액상과당(0.5중량%), 올리고당(2중량%), 설탕(2중량%), 및 식염(0.5중량%)에 물을 추가하여 잔량을 맞춘 후 균질하게 배합하여 순간 살균을 하여 건강음료를 제조하였다.

Claims

갯질경을 유효성분으로 포함하는 고지혈증, 간염, 간경화, 지방간, 간암, 간손상, 염증 또는 알코올성 간질환 중에서 선택된 하나 이상의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 고지혈증, 상기 간염, 상기 간경화, 상기 지방간, 상기 간암, 상기 간손상, 상기 염증 또는 상기 알코올성 간질환 중에서 선택된 하나 이상은 알코올 섭취로 인한 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 간손상은 산화적 스트레스에 의한 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 갯질경은 생갯질경, 갯질경건조물 또는 갯질경용매추출물 중에서 선택된 하나 이상인 약학 조성물.
제4항에 있어서, 상기 용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합용매 중에서 선택된 하나 이상인 약학 조성물.
제5항에 있어서, 상기 알코올은 탄소수 1 내지 6개의 알코올 중 선택된 하나 이상인 약학 조성물.
제4항에 있어서, 상기 갯질경 용매추출물은 상기 생갯질경 또는 상기 갯질경건조물 중에서 선택된 하나 이상을 물, 알코올 또는 이들의 혼합용매 중에서 선택된 하나 이상으로 추출한 조추출물을 에틸아세테이트로 분획추출한 분획추출물인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 치료 또는 예방은 상기 갯질경에 의한, 간 조직에서 지방구 축적 억제, 간 조직에서 아스파라진산 아미노전이효소(AST)의 활성도 감소, 간 조직에서 알라닌 아미노전이효소(ALT)의 활성도 감소, 염증 완화, 혈 중 콜레스테롤 축적 억제, 혈 중 중성지방 축적 억제, 알코올대사 촉진, 알데하이드 디하이드로게나아제 활성 증가, 간조직 중 항산화효소 활성 증가, 또는 간조직 내 과산화지질 증가 억제 중에서 선택된 하나 이상에 의한 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 알코올성 간질환은 알코올성 간염, 알코올성 만성 간염, 알코올성 간경화, 알코올성 간암, 알코올성 간손상 또는 알코올성 지방간 중에서 선택된 하나 이상인 약학 조성물.
갯질경을 유효성분으로 포함하는 고지혈증, 간염, 간경화, 간암, 간손상, 염증, 지방간 또는 알코올성 간질환 중에서 선택된 하나 이상의 개선 또는 예방용 식품 조성물.