CN104987285A - 一种分离纯化仙鹤草中间苯三酚类化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种分离纯化仙鹤草中间苯三酚类化合物的方法，其特征在于，取仙鹤草粗提物，先后经过两次高速逆流色谱法纯化处理，得到间苯三酚类化合物，两次高速逆流色谱法采用的溶剂体系均为无水体系，并且第二次分离采用闭合回路7次循环洗脱，最终分离得到纯度为95.2％的伪绵马素和纯度为93.2％的α-Kosin。本发明首次应用HSCCC无水溶剂体系以及闭合回路法分离仙鹤草中的间苯三酚类化合物，所得的单体纯度、回收率均较高；且一次性分离多个同系物，解决了采用传统分离技术带来的分离效率低、得率低、不安全环保等技术缺点。

Description

一种分离纯化仙鹤草中间苯三酚类化合物的方法

技术领域

本发明涉及天然有机化学领域，具体涉及一种分离纯化仙鹤草中间苯三酚类化合物的方法。

背景技术

仙鹤草，为蔷薇科植物龙牙草(Agrimonia polosa Ledeb)的干燥地上部分，具有收敛止血、截疟、止痢、解毒、补虚等功能，用于治疗咯血、吐血，崩漏下血，疟疾，血痢，痈肿疮毒，阴痒带下，脱力劳伤等。现代药理研究发现仙鹤草有抗肿瘤、降血糖、降血压、抗氧化等多种活性，是一种对人类有显著保健作用的天然药材。

仙鹤草全草含有多种化学成分，如仙鹤草素、鞣酸、挥发油、甾醇、有机酸、酚类、黄酮类和糖苷类等。目前，人们已尝试运用不同的技术手段对其化学成分进行了分离和鉴定，然而酚类结构的化合物(尤其是间苯三酚类化合物)，其分离纯化的方法还是以传统的柱色谱技术为主，例如在《仙鹤草地上部分仙鹤草酚B的分离与鉴定》一文中应用硅胶及Sephadex LH-20柱色谱技术对仙鹤草石油醚提取物进行分离纯化，用石油醚、氯仿洗脱，结果分离鉴定了一个丁酰基间苯三酚类化合物，即仙鹤草酚B(贺成、秦文杰、唐晓晶、陈玉武、叶祖光，《中草药》，2011年第2期255-256页)；又例如在《HPLC法测定仙鹤草中鹤草酚含量及鹤草酚结构的2DNMR分析研究》一文中通过溶剂提取及硅胶柱色谱反复分离，制备薄层，Sephadex LH-20以及多次重结晶手段，从仙鹤草根芽的95％乙醇提取物分离得到了鹤草酚、仙鹤草酚B、伪绵马素这三个间苯三酚类化合物(杜超，沈阳药科大学[D]，2008年)。上述分离技术的缺陷之处在于：①由于间苯三酚类化合物在仙鹤草中含量低、极性弱，采用传统的柱色谱技术对间苯三酚类样品分离时会产生有较强吸附，导致样品大量损失，收率降低；②分离步骤繁琐，需要多种柱色谱联用，如硅胶、凝胶柱等，洗脱剂采用大量有机溶剂，不但分离效率低，而且不够安全、环保、经济。

高速逆流色谱(High-Speed Counter Current Chromatography,HSCCC)是一种连续高效的液-液分配色谱分离技术，利用样品在互不相溶的两相中的分配能力不同，使得各组分得以分离。因其两相均为液体，能够很好地克服传统分离技术的缺点，可避免样品的不可逆吸附、失活、变性等问题，且具有一次性制备量大、产物得率较高、仪器操作简易并运行成本低等优点。HSCCC溶剂体系按极性通常分为强极性、中等极性、弱极性和无水体系，前三者均为含水体系，而无水体系是指纯有机相构成的两相溶剂体系；含水体系是目前常用的用于分离天然产物的HSCCC溶剂体系。

经检索，目前有两篇专利文献采用了HSCCC分离仙鹤草中的成分。其中一篇是公开号为CN101775028的中国发明专利，公开了一种富集纯化仙鹤草素的方法，其特点是采用高速逆流色谱含水的强极性体系和中等极性体系从仙鹤草70％丙酮浸提液中，经过两次HSCCC分离得到98％纯度的仙鹤草素。该专利与本发明的差异之处在于：①目标化合物的结构和极性差距大。该专利分到的仙鹤草素是个极性较大的化合物，本发明分到的间苯三酚二缩合体为极性非常弱的化合物；②溶剂体系的区别。该专利采用脂肪脂、脂肪醇及水为溶剂体系，适合分离中等或强极性的化合物，不适于极性很弱的化合物，本发明的化合物由于极性非常弱，在水相中保留率低，所以会导致目标物质在水相中因无保留而无法分离。

另一篇是公开号为CN102329206的中国发明专利，公开了一种鹤草酚的制备方法，方法是：1)取仙鹤草药材粉碎，加5-10倍量60-90％乙醇溶液回流提取2-3次，提取液加活性炭脱色，过滤浓缩，浓缩液用氯仿萃取，萃取液回收试剂，得粗提物；2)将上述粗提物采用高速逆流色谱含水体系分离，紫外检测器监测，根据图谱收集目标成分，流分减压回收试剂，干燥即得高纯度鹤草酚。该专利与本发明的差异之处在于：①目标化合物的极性差距较大。鹤草酚为单苯环结构，且含不饱和六元环酮，因此极性也较仙鹤草中其他的间苯三酚类化合物大；②鹤草酚可以采用常规的含水体系进行分离，但仙鹤草中石油醚提取出来的极性较鹤草酚弱的间苯三酚类化合物无法用含水体系分离获得。

我们知道，仙鹤草中的间苯三酚类化合物多为间苯三酚二缩合体以及间苯三酚三缩合体，而且同系物和同分异构体较多，该类化合物极性很弱(鹤草酚除外)，采用HSCCC常规溶剂体系不能达到分离的目的，是天然产物分离中的一大技术难题。因此，综上所述，采用何种方法，能够同时高效地分离得到低极性的间苯三酚类化合物尤其是本发明所涉及的间苯三酚二缩合体化合物，是本领域技术人员急需解决的技术难题。

发明内容

本发明目的在于提供了一种分离纯化仙鹤草中极性极弱的间苯三酚类化合物的方法，实现快速、高效、环保地分离，以解决现有技术存在的上述缺陷。

为实现上述发明目的，本发明以仙鹤草提取物作为分离对象，采用薄层色谱筛选溶剂体系，并用高速逆流色谱无水溶剂体系法分离纯化，得到两个间苯三酚化合物，经鉴定为伪绵马素(pseudo-aspidin)、α-Kosin。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种分离纯化仙鹤草中间苯三酚类化合物的方法，取仙鹤草粗提物，先后经过两次高速逆流色谱法纯化处理，得到间苯三酚类化合物，其中：

(1)第一次高速逆流色谱法分离纯化

采用由溶剂A、溶剂B、溶剂C组成的溶剂体系，各组分的体积比为A:B:C＝(10～12):(0.5～1):(0～0.5)，混合均匀，静置分层，分液得到上下两相溶液；以上相为固定相，下相为流动相，先将固定相填满逆流色谱分离柱，再泵入流动相，取仙鹤草粗提物用两相溶液溶解后进样，按梯度时间间隔分管收集洗脱液，分段合并，回收溶剂，得间苯三酚类化合物的混合物；

(2)第二次高速逆流色谱法分离纯化

采用由溶剂D、溶剂B、溶剂E组成的溶剂体系，各组分的体积比为D:B:E＝10:7:3，混合均匀，静置分层，分液得到上下两相溶液；以上相为固定相，下相为流动相，先将固定相填满逆流色谱分离柱，再泵入流动相，并将流动相的出液口与进液口连通以形成闭合回路；取步骤(1)分离得到的混合物用两相溶液溶解后进样，循环洗脱，直至分离得到间苯三酚类化合物的单体；

溶剂A为正己烷、环己烷、正庚烷、石油醚、乙腈中的一种或几种；溶剂B为二氯甲烷、三氯甲烷中的一种或几种；溶剂C为甲醇、乙醇中的一种或几种；溶剂D为正己烷；溶剂E为乙腈。

优选的，步骤(2)中高速逆流色谱采用闭合回路循环的次数为7次。

优选的，步骤(1)中的仙鹤草粗提物，由如下方法制得：将仙鹤草粉末用石油醚回流提取，过滤，合并滤液，回收溶剂，残渣经溶剂萃取后，浓缩，即得。

更优选的，仙鹤草粗提物的制备方法中，提取溶剂选用石油醚60～90℃；萃取溶剂选用氯仿、5％氢氧化钠中的一种或几种。

优选的，两次高速逆流色谱法的分离条件为：柱温10～20℃，转速700～1000rpm，优选800～900rpm，流动相的流速为2～5mL/min，检测波长为285nm。

优选的，溶剂A为体积比为1:1的正己烷与乙腈的混合液或体积比为1:1的石油醚与乙腈的混合液，溶剂B为二氯甲烷，溶剂C为甲醇。

更优选的，第一次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为6:6:0.5:0.5的正己烷、乙腈、二氯甲烷、甲醇组成，第二次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为10:7:3的正己烷、二氯甲烷、乙腈组成。

更优选的，第一次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为5:5:0.5的正己烷、乙腈、二氯甲烷组成，第二次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为10:7:3的正己烷、二氯甲烷、乙腈组成。

更优选的，第一次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为6:6:0.5:0.5的石油醚、乙腈、二氯甲烷、甲醇组成，第二次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为10:7:3的正己烷、二氯甲烷、乙腈组成。

更优选的，第一次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为5:5:1的石油醚、乙腈、二氯甲烷组成，第二次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为10:7:3的正己烷、二氯甲烷、乙腈组成。

需要说明的是，采用本发明提供的方法分离得到的间苯三酚类化合物，主要是指间苯三酚二缩合体以及间苯三酚三缩合体，包括但不限于其同分异构体、同系物等结构相近、极性弱的化合物，例如属于同分异构体的伪绵马素和α-Kosin，属于同系物的仙鹤草酚A、B、C、D和E……等等化合物的分离纯化，均可以借鉴本发明的思路。由于上述化合物的结构相近，极性较弱，通常共混于仙鹤草的粗提物中，传统的HSCCC开路体系无法将其分离，亦因此，发明人创造性的应用无水溶剂体系结合闭合回路循环，才得以顺利分离出各个目标化合物。与现有技术相比，本发明的优点主要体现在：

(1)本发明采用HSCCC无水溶剂体系，经过两步分离，一次性得到了结构非常接近的弱极性化合物间苯三酚类化合物伪绵马素和α-Kosin，两者为同分异构体，仅苯环侧链的结构有微小差异，国内尚属首次应用。

(2)如前所述，普通高速逆流分离过程采用烷烃、脂肪脂、脂肪醇、水等为体系，因分离需要一般都含水，但本发明由于目标化合物极性很弱，在水相完全不溶解，因此本发明另辟蹊径采用HSCCC无水溶剂体系，在取得理想分离效果的同时，避免了水带来的易乳化、难分层、分离效率低的隐患。

(3)普通高速逆流过程为一次开路分离，但因目标化合物为一系列同分异构体或同系物，一般分离过程难以达到，本发明中先采用一次溶剂体系粗分，再采用二次溶剂体系、并通过7次闭合回路法，循环分离，从而使得目标化合物分离度逐渐增大，最终得以分离，且在一次过程中同时分得多个结构相近的单体。

(4)采用无水体系分离的产品后续处理更为便捷，回收溶剂更方便，溶剂可回收反复利用。

(5)本发明的方法克服了传统柱色谱分离技术带来的固相吸附、样品损失、得率低、不安全环保等缺点。

附图说明

图1为实施例1制得的仙鹤草粗提物的高效液相色谱图。

图2为实施例1第一次分离的高速逆流色谱图。

图3为实施例1第二次分离的高速逆流色谱图。

图4为实施例1分离得到的化合物伪绵马素的高效液相色谱图。

图5为实施例1分离得到的化合物α-Kosin的高效液相色谱图。

图6为伪绵马素和α-Kosin两个化合物的结构式。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。

实施例1

1、仙鹤草粗提物的制备：取150g仙鹤草粉碎成粗粉，加入1500ml的石油醚(60～90℃)，加热回流提取2次，每次1h；过滤，合并滤液，回收溶剂，残渣加50ml氯仿溶解，用50ml 5％氢氧化钠振摇萃取，弃去氯仿液，氢氧化钠液用稀盐酸调节pH值至1～2，用氯仿振摇萃取2次，合并氯仿液，加水洗涤，弃去水液，浓缩氯仿液，得到仙鹤草粗提物310mg。高效液相色谱图如图1所示。

2、第一次高速逆流色谱分离：将正己烷、乙腈、二氯甲烷、甲醇按体积比6:6:0.5:0.5组成溶剂体系，混合均匀，静置分层，分液得到上下两相溶液；以上相为固定相，下相为流动相，先将固定相填满逆流色谱分离柱，柱温为20℃，开启速度控制器，调整转速为900rpm，以10mL/min的流速将流动相泵入柱内；待两相溶剂体系达到流动力学平衡后(即当流动相从色谱柱出口流出时)，设置流动相流速为5mL/min，取步骤1所得的仙鹤草粗提物310mg，用上下相溶液各5ml的混合液溶解后，由进样阀进样，根据高效液相色谱检测流出液(检测波长为285nm)，同时用自动部分收集器按5min梯度时间间隔分管收集75～100min时间段的洗脱液，即得间苯三酚类化合物的混合物。第一次分离的高速逆流色谱如图2所示。

3、第二次高速逆流色谱分离：将正己烷、二氯甲烷、乙腈按体积比10:7:3组成溶剂体系，混合均匀，静置分层，分液得到上下两相溶液；以上相为固定相，下相为流动相，先将固定相填满逆流色谱分离柱，柱温为10℃，开启速度控制器，调整转速为900rpm，以10mL/min的流速将流动相泵入柱内；待两相溶剂体系达到流动力学平衡后(即当流动相从色谱柱出口流出时)，设置流动相流速为3mL/min，取步骤2所得的混合物47mg，用上下相溶液各5ml的混合液溶解后，由进样阀进样，检测波长为285nm，在目标峰出现约10分钟时将流动相的出液口与进液口连通以形成闭合回路，经过7次循环，直至目标化合物分离，即得化合物Ⅰ伪绵马素和化合物Ⅱα-Kosin。第二次分离的高速逆流色谱如图3所示。

4、目标化合物的结构鉴定与纯度检测：对步骤3分离得到的化合物Ⅰ和Ⅱ进行ESI-MS、¹H-NMR和¹³C-NMR分析，经结构解析并与文献数据比对，可确定得到的化合物Ⅰ为伪绵马素，化合物Ⅱ为α-Kosin，两者互为同分异构体，结构式如图6所示，结构表征数据具体如下：

伪绵马素分子式：C₂₅H₃₂O₈；ESI-MS(m/z)：459.0[M-H]-；

1H-NMR(500MHz，CDCl3)δppm：1.00(6H，t，J＝7.5Hz)，1.75(4H，m)，2.12(6H，s)，3.09(4H，t，J＝7.5Hz)，3.72(6H，s)，3.86(2H，s)，9.57(2H，s，OH)，15.57(2H，s，OH)；

13C-NMR(125MHz，CDCl3)δppm：9.15，13.96，16.29，18.22，44.28，61.54，107.86，109.19，112.12，159.62，160.25，161.79，206.88。

α-Kosin分子式：C₂₅H₃₂O₈；ESI-MS(m/z):459.0[M-H]-；

1H-NMR(500MHz，CDCl3)δppm：1.21(6H，d，J＝5Hz)，2.12(6H，s)，3.72(6H，s)，3.86(2H，m)，3.87(2H，s)，9.59(2H，s，OH)，15.48(2H，s，OH)；

13C-NMR(125MHz，CDCl3)δppm：9.22，16.49，19.81，38.35，62.11，106.68，109.30，112.22，159.94，160.05，161.77，211.63。

进一步的，使用高效液相色谱仪对化合物Ⅰ和Ⅱ进行纯度检测，色谱条件为：依利特Hypersil ODS2色谱柱(250mm×4.6mm，5μm，大连依利特公司)，乙腈-0.1％甲酸水(90:10，V/V)，流速为1.0mL·min-1；检测波长为285nm，柱温25℃，进样量5μL，测得化合物Ⅰ伪绵马素的纯度为95.2％，化合物Ⅱα-Kosin的纯度为93.2％。化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的高效液相色谱图如图4和图5所示。

需要说明的是，本发明中第二次高速逆流色谱分离时，除采用前述方式在进样后形成闭合回路外，还可在进样前先将流动相的出液口与进液口连通以形成闭合回路，其先后顺序的设置并不影响化合物的分离。

实施例2

1、仙鹤草粗提物的制备：步骤同实施例1。

2、第一次高速逆流色谱分离：按体积比为5:5:0.5的正己烷、乙腈、二氯甲烷组成溶剂体系，设置柱温为10℃，转速为700rpm，流动相的流速为2mL/min，按8min梯度时间间隔分管收集140～170min洗脱液，高速逆流色谱分离的其余步骤同实施例1。

3、第二次高速逆流色谱分离：按体积比为10:7:3的正己烷、二氯甲烷、乙腈组成溶剂体系，设置柱温为10℃，转速为900rpm，流动相的流速为2mL/min，高速逆流色谱分离的其余步骤同实施例1。

实施例3

1、仙鹤草粗提物的制备：步骤同实施例1。

2、第一次高速逆流色谱分离：按体积比为6:6:0.5:0.5的石油醚、乙腈、二氯甲烷、甲醇组成溶剂体系，设置柱温为20℃，转速为1000rpm，流动相的流速为5mL/min，按3min梯度时间间隔分管收集65～90min洗脱液，高速逆流色谱分离的其余步骤同实施例1。

3、第二次高速逆流色谱分离：按体积比为10:7:3的正己烷、二氯甲烷、乙腈组成溶剂体系，设置柱温为20℃，转速为700rpm，流动相的流速为5mL/min，高速逆流色谱分离的其余步骤同实施例1。

实施例4

1、仙鹤草粗提物的制备：步骤同实施例1。

2、第一次高速逆流色谱分离：按体积比为5:5:1的石油醚、乙腈、二氯甲烷组成溶剂体系，设置柱温为10℃，转速为800rpm，流动相的流速为2mL/min，按8min梯度时间间隔分管收集100～120min洗脱液，高速逆流色谱分离的其余步骤同实施例1。

3、第二次高速逆流色谱分离：按体积比为10:7:3的正己烷、二氯甲烷、乙腈组成溶剂体系，设置柱温为10℃，转速为1000rpm，流动相的流速为3mL/min，高速逆流色谱分离的其余步骤同实施例1。

实施例5

1、仙鹤草粗提物的制备：步骤同实施例1。

2、第一次高速逆流色谱分离：按体积比为5.5:5.5:0.75:0.25的环己烷、乙腈、三氯甲烷组成溶剂体系，设置柱温为20℃，转速为900rpm，流动相的流速为4mL/min，按4min梯度时间间隔分管收集100-120min洗脱液，高速逆流色谱分离的其余步骤同实施例1。

3、第二次高速逆流色谱分离：按体积比为10:7:3的正己烷、三氯甲烷、乙腈组成溶剂体系，设置柱温为20℃，转速为800rpm，流动相的流速为2mL/min，高速逆流色谱分离的其余步骤同实施例1。

实施例6

1、仙鹤草粗提物的制备：步骤同实施例1。

2、第一次高速逆流色谱分离：按体积比为5:5:1:0.5的正庚烷、乙腈、三氯甲烷、乙醇组成溶剂体系，设置柱温为20℃，转速为900rpm，流动相的流速为5mL/min，按3min梯度时间间隔分管收集81-102min洗脱液，高速逆流色谱分离的其余步骤同实施例1。

3、第二次高速逆流色谱分离：按体积比为10:7:3的正己烷、三氯甲烷、乙腈组成溶剂体系，设置柱温为10℃，转速为900rpm，流动相的流速为3mL/min，高速逆流色谱分离的其余步骤同实施例1。

实施例7

1、仙鹤草粗提物的制备：步骤同实施例1。

2、第一次高速逆流色谱分离：按体积比为6:6:0.5:0.5的正己烷、乙腈、三氯甲烷、甲醇组成溶剂体系，设置柱温为20℃，转速为900rpm，流动相的流速为3mL/min，按5min梯度时间间隔分管收集45～60min洗脱液，高速逆流色谱分离的其余步骤同实施例1。

3、第二次高速逆流色谱分离：按体积比为10:7:3的正己烷、三氯甲烷、乙腈组成溶剂体系，设置柱温为10℃，转速为800rpm，流动相的流速为2mL/min，高速逆流色谱分离的其余步骤同实施例1。

Claims (10)

1.一种分离纯化仙鹤草中间苯三酚类化合物的方法，其特征在于，取仙鹤草粗提物，先后经过两次高速逆流色谱法纯化处理，得到间苯三酚类化合物，其中：

步骤(1)：第一次高速逆流色谱法分离纯化

采用由溶剂A、溶剂B、溶剂C组成的溶剂体系，各组分的体积比为A:B:C＝(10～12):(0.5～1):(0～0.5)，混合均匀，静置分层，分液得到上下两相溶液；以上相为固定相，下相为流动相，先将固定相填满逆流色谱分离柱，再泵入流动相，取仙鹤草粗提物用两相溶液溶解后进样，按梯度时间间隔分管收集洗脱液，分段合并，回收溶剂，得间苯三酚类化合物的混合物；

步骤(2)：第二次高速逆流色谱法分离纯化

采用由溶剂D、溶剂B、溶剂E组成的溶剂体系，各组分的体积比为D:B:E＝10:7:3，混合均匀，静置分层，分液得到上下两相溶液；以上相为固定相，下相为流动相，先将固定相填满逆流色谱分离柱，再泵入流动相，并将流动相的出液口与进液口连通以形成闭合回路；取步骤(1)分离得到的混合物用两相溶液溶解后进样，循环洗脱，直至分离得到间苯三酚类化合物的单体；

所述溶剂A为正己烷、环己烷、正庚烷、石油醚、乙腈中的一种或几种；所述溶剂B为二氯甲烷、三氯甲烷中的一种或几种；所述溶剂C为甲醇、乙醇中的一种或几种；所述溶剂D为正己烷；所述溶剂E为乙腈。

2.根据权利要求1所述的仙鹤草中间苯三酚类化合物的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中高速逆流色谱采用闭合回路循环的次数为7次。

3.根据权利要求1所述的仙鹤草中间苯三酚类化合物的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中的仙鹤草粗提物，由如下方法制得：将仙鹤草粉末用石油醚回流提取，过滤，合并滤液，回收溶剂，残渣经溶剂萃取后，浓缩，即得。

4.根据权利要求3所述的仙鹤草中间苯三酚类化合物的分离纯化方法，其特征在于，所述仙鹤草粗提物的制备方法中，提取溶剂选用石油醚60～90℃；萃取溶剂选用氯仿、5％氢氧化钠中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的仙鹤草中间苯三酚类化合物的分离纯化方法，其特征在于，所述两次高速逆流色谱法的分离条件为：柱温10～20℃，转速700～1000rpm，优选800～900rpm，流动相的流速为2～5mL/min，检测波长为285nm。

6.根据权利要求1～5任一项所述的仙鹤草中间苯三酚类化合物的分离纯化方法，其特征在于，所述溶剂A为体积比为1:1的正己烷与乙腈的混合液或体积比为1:1的石油醚与乙腈的混合液，溶剂B为二氯甲烷，溶剂C为甲醇。

7.根据权利要求6所述的仙鹤草中间苯三酚类化合物的分离纯化方法，其特征在于，所述第一次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为6:6:0.5:0.5的正己烷、乙腈、二氯甲烷、甲醇组成，所述第二次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为10:7:3的正己烷、二氯甲烷、乙腈组成。

8.根据权利要求6所述的仙鹤草中间苯三酚类化合物的分离纯化方法，其特征在于，所述第一次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为5:5:0.5的正己烷、乙腈、二氯甲烷组成，所述第二次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为10:7:3的正己烷、二氯甲烷、乙腈组成。

9.根据权利要求6所述的仙鹤草中间苯三酚类化合物的分离纯化方法，其特征在于，所述第一次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为6:6:0.5:0.5的石油醚、乙腈、二氯甲烷、甲醇组成，所述第二次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为10:7:3的正己烷、二氯甲烷、乙腈组成。

10.根据权利要求6所述的仙鹤草中间苯三酚类化合物的分离纯化方法，其特征在于，所述第一次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为5:5:1的石油醚、乙腈、二氯甲烷组成，所述第二次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为10:7:3的正己烷、二氯甲烷、乙腈组成。