KR19980033558A

KR19980033558A - 동충하초 자실체 생산방법

Info

Publication number: KR19980033558A
Application number: KR1019980014788A
Authority: KR
Inventors: 성재모
Original assignee: 원종광; 성재모
Priority date: 1998-04-24
Filing date: 1998-04-24
Publication date: 1998-07-25
Also published as: KR100266082B1

Abstract

본 발명은 채집하여 분리된 동충하초 균주 중 자실체 형성 우수균주를 선발하고, 제조공정 중에 잡균의 혼입을 방지하며 활력을 유지할 수 있는 액체종균의 배양방법과 적정배지를 선발하여 경제적으로 대량배양 할 수 있는 동충하초 자실체 생산방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 동충하초의 원균을 평판 배양시키고 확대 배양시켜 동충하초종균을 준비하는 단계와; 동충하초 배양배지용 재료를 물과 함께 배지배양용기에 넣고, 이를 고온고압 살균솥에 넣어 멸균시켜서 동충하초 배양배지를 준비하는 단계 및; 상기 배양배지에 상기 종균을 접종시킨 후, 이를 배양시켜 동충하초 자실체를 수확하는 단계로 구성된 동충하초 자실체 생산방법에 있어서, 상기 동충하초종균의 준비단계에서는 잡균의 혼입을 방지하고 활력을 유지할 수 있는 액체종균을 사용하고, 상기 동충하초 배양배지의 준비단계에서는 곡물배지에 번데기를 첨가한 배지를 사용하며, 상기 종균접종 및 자실체 생산단계에서는 상기 번데기가 첨가된 상기 곡물배지의 전 표면을 자실체가 완전히 덮은 상태로 생육될 수 있도록 상기 동충하충 액체종균을 접종하는 것을 특징으로 하는 동충하초 자실체의 생산방법이 제공된다.

Description

동충하초 자실체 생산방법

본 발명은 신규한 동충하초 자실체 생산방법에 관한 것으로서, 특히, 고품질의 제품을 인공적인 방법으로 대량생산할 수 있는 동충하초 자실체 생산방법에 관한 것이다.

여기에서, 동충하초(冬蟲夏草)란 겨울에는 곤충의 몸에 있다가 여름에는 풀처럼 나오는 모습에서 연유되어 명명된 일종의 버섯이다.

이렇게 곤충에 침입하여 이를 기주로 충체 위에 자실체를 형성하는 동충하초 중 일부 종들은 고대로부터 중국에서 불로장생의 비약으로 결핵, 천식, 황달의 치료 및 아편중독의 해독제, 병후의 보양 및 강장제, 면역 기능 강화제로서 이용되어 온 고가의 한방약재이다 〔참조(1). Humber, R. A. 1990. Fungal pathogens of insects, spiders, and mites; isolation, preservation, and identification. USDA Agricultural Research Service; 참조(2). Jianzhe, Y., Xiaoloan, M., Qiming, M., Yichen, Z. and Huaan, W. 1989. Icons of medicinal fungi from China. Science Press. China. p. 575; 참조(3). Kobayasi, Y. 1940. The genusCordycepsand its allies. Sci. Rept. Tokyo Bunrika Daikaku, Sect. B., 5: 53-260; 참조(4). Shimizu, D. 1994. Color iconography of vegetable wasps and plant worms. Seibundo Shinkosha. Japan. pp. 381〕. 이렇게 전통적으로 약용으로 이용되고 있는 대표적인 동충하초로는 박쥐나방의 유충을 기주로 자실체를 형성하는 중국산 동충하초인C. sinensis, C. militaris, C. martialis, C. ophioglossoides, C. sobolifera, C. hawkesii, Beauveria bassiana등 약 7종의 동충하초가 현재 약용으로 이용되고 있다.

이런 동충하초는 주로 결핵, 황달의 치료와 강장제로서 이용되어 왔고, 아편 중독제로서도 효과가 인정되었으며 자실체의 주성분이기도 한 퀸산(quinic acid)의 이성체(異性體)인 코디세핀(cordycepin)이 항암작용이 있는 것으로 밝혀졌고〔Cunningham, K. G., W. Manson. F. S. Spring and S. A. Hutchinson. 1950. Cordycepin, a metabolic product from cultures ofCordyceps militaris(Linn.) Link. nature. 166. 949 참조〕, 자실체는 중국의 궁중요리로도 중요시되고 있으며, 일본에서도 동충하초가 약용으로 사용되었다〔예운운. 1985. 冬蟲夏草及人工蟲草菌絲硏究槪況. 海軍醫學硏究所. 10(12): 51-54 참조〕.

그러나, 자연 상태에서 자실체의 채집은 상당히 어려워 공급이 한정되고 있으며 최근 생태계 파괴 및 공해로 인한 이상 기후현상 등으로 자실체의 자연 채취가 점점 어려워짐에 따라 자실체의 안정적 인공 생산 기술이 요구되고 있다〔Basith, M., and Madelin, M. F. 1968. Studies on the production of perithecial stromata byCordyceps militarisin artificial culture. Canadian Journal of Botany. 46: 473-480 참조〕.

이와 같은 동충하초를 이용하는 방법으로는 자실체를 채집하는 방법, 누에 번데기를 이용한 종균배양 및 재배방법, 그리고, 인공 배지를 이용한 대량배양 방법으로 크게 나눌 수 있다. 이중 야생의 자실체를 채집하여 이용하는 방법은 최근 생태계 파괴 및 공해로 인한 이상 기후현상 등으로 자실체의 채집은 상당히 어려워 필요량의 확보가 절대적으로 불가능하다.

오늘날 동충하초의 자실체 생산에 관한 기본개념은, 동충하초가 곤충을 기주로 하여 자실체를 형성한다는 사실을 들어, 동충하초 균을 곤충의 유충, 번데기, 성충 등에 접종하여 자실체를 생산하는 것이었다. 예컨대, 대한민국 특허공개 제97-68810호 (발명의 명칭 : 누에번데기를 이용한 번데기 동충하초의 종균 배양방법 및 재배방법)에서는 누에번데기를 수분함량이 65∼70%로 조절한 뒤 종균병에 넣고 멸균시킨 후 중간 배양된 번데기 동충하초 종균을 투입하여 누에 번데기와 종균이 잘 혼합되도록 교반하여 종균 배양하는 방법과, 수분공급용 배지를 수분함량이 90∼95%로 조절한 뒤 종균을 넣어 투입된 번데기 동충하초 종균 자체에서 자실체를 형성하는 방법을 공개하고 있다.

그러나, 상기의 선출원 발명에 의할 경우에는 값비싼 누에번데기로 종균을 만들므로 대량생산이 불가능하며, 종균의 활력이 떨어질 수도 있다. 그리고, 접종시 종균을 교반해야 하므로 작업이 비효율적이고 잡균에 오염될 수 있다. 더구나 수분공급용 배지의 수분함량이 90∼95%이므로 배지속까지 균이 배양되지 못하고 종균자체의 영양분만으로 자실체를 형성하게 되므로 고품질의 자실체를 생산할 수 없다. 그러므로, 상기의 방법은 사실상 효과적인 방법이라고 할 수 없다.

또한, 상기와 같은 동충하초 자실체 생산방법에 의할 경우에는, 동충하초가 곤충을 기주로 한다는 성질만을 이용한 관계로, 구입 단가가 비싼 번데기만을 이용하여 영양분 공급없이 수분만 공급하므로 대량생산이 어려운 근본적인 문제점이 있다.

또한, 대한민국 특허공개 제97-68809호 (발명의 명칭 : 동충하초 대량인공배양에 관한 신기술 및 배지조제방법)에서는 홍삼박을 이용하여 동충하초 자실체를 생산하는 방법을 기술하고 있다. 즉, 홍삼을 150℃에서 건조하여 수분이 5%이하가 되도록 건조한 후에 인삼재분기를 이용하여 미세하게 분말하여 동충하초균의 액체배양과 동충하초의 인공배양에 이용하여 동충하초 자실체를 제조하도록 기술하고 있다. 그러나, 이런 기술도 홍삼박이라는 고가의 재료를 사용하므로 동충하초 자실체의 제조비용이 고가라는 단점이 있다.

본 발명은 위와 같은 종래의 동충하초 자실체 생산의 문제점을 해결하기 위하여 개발된 것으로서, 채집하여 분리된 동충하초 균주 중 자실체 형성 우수균주를 선발하고, 제조공정 중에 잡균의 혼입을 방지하며 활력을 유지할 수 있는 액체종균의 배양방법과 적정배지를 선발하여 경제적으로 대량배양 할 수 있는 동충하초 자실체 생산방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 동충하초의 원균을 분리한 이후에, 전 배양공정과 액체종균 배양공정을 각각 엄격한 조건하에서 효율적으로 수행할 수 있고, 저렴하면서 효율적인 배지제조에 큰 특징이 있다.

또한, 본 발명은 동충하초의 생육시 자실체가 배양배지의 전 표면을 완전히 덮은 상태에서 생산된다는 점에 특징이 있다.

도 1은 본 발명의 한 실시예에 따른 동충하초 자실체 생산방법을 설명하기 위한 공정도.

본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 동충하초의 원균을 평판 배양시키고 확대 배양시켜 동충하초종균을 준비하는 단계와; 동충하초 배양배지용 재료를 물과 함께 배지배양용기에 넣고, 이를 고온고압 살균솥에 넣어 멸균시켜서 동충하초 배양배지를 준비하는 단계 및; 상기 배양배지에 상기 종균을 접종시킨 후, 이를 배양시켜 동충하초 자실체를 수확하는 단계로 구성된 동충하초 자실체 생산방법에 있어서, 상기 동충하초종균의 준비단계에서는 잡균의 혼입을 방지하고 활력을 유지할 수 있는 액체종균을 사용하고, 상기 동충하초 배양배지의 준비단계에서는 곡물배지에 번데기를 첨가한 배지를 사용하며, 상기 종균접종 및 자실체 생산단계에서는 상기 번데기가 첨가된 상기 곡물배지의 전 표면을 자실체가 완전히 덮은 상태로 생육될 수 있도록 상기 동충하충 액체종균을 접종하며, 상기 액체종균은, 탄소원 2∼7%(w/v), 질소원 0.1∼1.0%(w/v), 그리고 나머지 증류수로 이루어진 전배양액의 준비단계와, 상기 전배양액에 평판배양된 동충하초 균주를 접종하는 단계 및, 상기 접종된 전배양액을 80∼200 rpm, 22∼30℃의 진탕배양기에서 6일∼8일간 배양시키는 단계로 이행하는 전배양공정과; 탄소원 2∼7%(w/v), 질소원 0.1∼1.0%(w/v), 그리고 나머지 증류수로 이루어진 액체배양액을 준비하는 단계와, 상기 액체배양액에 상기 전배양접종원을 무균적으로 자동접종시키되 상기 액체배양액 대 상기 전배양접종원을 20∼200 : 1 의 비율로 접종시키는 단계 및, 상기 접종된 액체배양액을 22∼28℃에서 0.1∼1.0 vvm 정도의 제균된 공기로 5일∼12일 동안 통기배양시키는 단계를 이행하는 액체배양공정에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 동충하초 자실체의 생산방법이 제공된다.

또한, 본 발명에 따르면, 상기 동충하초 배양배지에는 곡물 대 번데기가 16 : 1로 첨가되어 있는 것을 특징으로 하는 동충하초 자실체의 생산방법이 제공된다.

또한, 본 발명에 따르면, 상기 곡물은 현미 또는 안락미인 것을 특징으로 하는 동충하초 자실체의 생산방법이 제공된다.

또한, 본 발명에 따르면, 상기 현미 또는 안락미에는 보리, 밀, 옥수수, 콩, 율무, 수수 중의 어느 하나가 부가적으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 동충하초 자실체의 생산방법이 제공된다.

또한, 본 발명에 따르면, 상기 종균접종 및 자실체 생산단계에서 균사의 활착시에는 24℃전후의 온도를 유지하고, 자실체 형성시에는 20℃의 온도를 유지하는 것을 특징으로 하는 동초하초 자실체의 생산방법이 제공된다.

본 발명은 상기의 제반조건들(즉, 기술적 구성)이 본 발명에 의한 상기의 목적을 달성하기 위하여 서로 밀접 불가분적으로 구성되어 있다.

또한, 본 발명에 의한 동충하초의 자실체는 상기의 배양용기에서 이를 채취한 후에, 남비 또는 주전자 등에 넣고 물을 부어 직접 끓여서 마실 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시형태

이하, 본 발명의 바람직한 실시형태를 보다 상세히 설명한다.

(가). 동충하초의 종균준비단계

본 발명에 의한 동충하초 자실체 생산은 원균을 한국동충하초은행(KEFC)으로부터 분양 받거나, 채집 후 포자 분리된 동충하초의 원균을 평판 배양시키고 확대 배양시켜 동충하초종균을 준비하는 단계에서부터 시작된다. 즉, 동충하초의 종균준비단계는 통상의 방법으로 진행될 수 있으며, 곡립 등의 고체배지를 이용하여 배양한 고체종균과, 물에 소정의 영양물질을 용해시켜 배양한 액체종균이 있다.

(나). 동충하초의 배지준비단계

본 발명에 의한 동충하초 자실체 생산은 배양배지를 종래와 같이 누에번데기와 수분공급용 배지를 사용하지 않고, 현미, 알락미 등의 곡립에 누에번데기 가루를 첨가한 배지를 사용한다.

본 발명에 있어서, 상기와 같은 동충하초 배양배지를 사용한 이유는 배지의 전 표면을 자실체가 완전히 덮은 상태로 생육하며 균사 활착이 빠르고 형성된 자실체가 자연상태에서 발견되는 것과 유사한 비교적 건실한 자실체를 형성하기 때문이다.

또한, 상기의 곡립은 배양기내 쌀과 쌀 사이에 존재하는 공간이 균사의 활착을 용이하게 하고 배지내 수분과 통기를 상당기간 유지시켜줌으로써 자실체의 형성을 용이하게 한다. 또한, 곡립의 수분함유량에 있어서, 배지내 수분 함유율은 균사의 활착에는 좋은 영향을 주지만 배지내 수분이 너무 많은 경우는 배지내 간극이 줄어들어 통기를 적절하게 유지시켜주지 못하므로 기중 균사의 생장이 촉진되고 자실체의 생산은 저해된다. 그러므로, 곡립의 종류에 따라 각각 수분 배합을 달리해야 한다.

본 발명에서는 용기에 곡립과 번데기가루를 넣고 수분 비율을 맞춘후 멸균시켜 동충하초 배양배지로 삼았다.

(다). 동충하초의 종균접종

본 발명에 의한 동충하초 자실체 생산은 상기의 배양배지를 만들고, 별도로 준비한 동충하초의 액체종균을 상기 배양배지의 표면에 접종한다.

본 발명에 있어서, 동충하초의 종균은 고체종균과 액체종균을 사용하는 것이 모두 가능하지만, 고체종균보다는 액체종균을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 이는 종래의 고체종균을 통상의 방법대로 이용할 경우, 고체종균이 상기의 배양배지의 표면에 접종된 후 균사체를 뻗어 성장하는데 많은 시일이 걸리고 배양이 잘 되지 않기 때문이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 동충하초의 액체종균을 통상적으로 행하여지는 액체종균을 사용할 수도 있으나, 본 발명자가 새롭게 개발한 동충하초의 액체종균을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 이런 본 발명자의 동충하초의 액체종균의 제조방법은 담자균류의 액체종균 제조방법에 준하므로 본 발명자의 대한민국 공개특허 제97-27291호 (발명의 명칭 : 담자균류의 액체종균 배양장치), 대한민국 공개특허 제97-27294호 (발명의 명칭 : 담자균류의 액체종균 배양방법 및 그 방법에 의한 액체종균) 및, 대한민국 공개특허 제97-27295호(발명의 명칭 : 담자균류의 액체종균 배양방법 및 그 배양장치 및 그 액체종균)에 상세히 설명되어 있다. 이렇게 공개된 액체종균의 제조방법을 살펴보면 다음과 같다.

원균을 분양받아 이를 평판배양시키는 공정과, 평판배양된 접종원을 전배양시키는 공정 및, 전배양된 접종원을 액체배양시키는 공정을 거치므로써 액체종균이 배양된다.

여기에서, 상기 전배양공정에서는, 먼저 탄소원 2∼7%(w/v), 질소원 0.1∼1.0%(w/v), KH₂PO₄0∼0.15%(w/v), MgSO₄ㆍ7H₂O 0∼0.15%(w/v), 그리고 나머지 증류수로 이루어진 전배양액을 준비한다. 그런 다음, 전배양액에 평판배양된 동충하초 균류를 접종하고, 이렇게 접종된 전배양물을 80∼200 rpm, 22∼30℃의 진탕배양기에서 6일∼8일간 배양시키는 과정을 수행한다.

또한, 상기 액체배양공정에서는, 먼저 탄소원 2∼7%(w/v), 질소원 0.1∼1.0%(w/v), KH₂PO₄0∼0.15%(w/v), MgSO₄ㆍ7H₂O 0∼0.15 %(w/v), 그리고 나머지 증류수로 이루어진 액체배양액을 준비한다. 그런 다음, 상기 액체배양액에 상기의 전배양접종원을 무균적으로 자동접종시키되 상기 액체배양액 대 상기 전배양접종원을 20∼200 : 1 의 비율로 접종시킨다. 이렇게 접종된 액체배양액을 22∼28℃에서 0.1∼1.0 vvm 정도의 제균된 공기로 5일∼12일 동안 통기배양시키는 과정을 수행한다.

여기에서, 탄소원으로는 설탕, 맥아당, 과당, 포도당, 자당, 맥아추출물 및, 물엿 중에서 하나 또는 둘이상을 선택적으로 사용할 수 있고, 질소원으로는 대두분 또는 펩톤 중에서 하나 또는 둘을 함께 사용할 수가 있다.

(라). 동충하초의 배양 및 자실체 생산

본 발명에 있어서는 동충하초 종균을 배양배지에 접종시킨 다음, 접종된 배지를 통상의 배양실로 옮기고, 배양이 끝나면 생육실로 옮겨 자실체를 생산한다. 이 경우, 상기 동충하초의 종균은 배양일수가 경과함에 따라 새로운 균사를 뻗어 배양배지의 표면으로부터 배양배지의 내부로 침투해 들어간다. 이러한 현상은 상기 배양배지의 배양용기를 투명 또는 반투명한 용기로 선택하면 쉽게 관찰할 수 있다. 이 때, 배양 온도는 24℃전후로 일정하게 유지시키고 형광등을 켜서 광을 일정하게 유지시킬 수 있어야 한다.

균사의 활착이 시작되어 배지 표면을 가득 메우기까지는 약 일주일이 걸린다. 처음에 옅은 베이지색을 띠던 균사의 표면은 점차 색이 진해지면서 짙은 주황색을 띠는 돌기모양의 균사 덩어리가 형성되기 시작한다. 이것은 자좌의 원기가 형성되기 시작한 것으로 형성된 원기가 생장하여 자낭각을 생산하기까지는 30∼40일이 소요되며, 자낭각이 성숙하여 외형상 완전한 형태의 자실체를 형성하기까지는 50∼60일이 소요된다. 동충하초의 자실체형성적온은 20℃를 전후로 한 온도범위에서 자실체 형성이 잘 되나 21℃이상에서는 자실체 형성보다는 균사의 영양생장이 오히려 활발하여 자실체의 생육을 저해한다.

이와 같이 생산된 동충하초는 용기를 벗겨서 자실체 부분만 취하여 건조시킨다.

실시예

이하, 본 발명에 따른 동충하초 자실체을 대량으로 생산하기 위한 방법을 양호한 실시예를 도면을 참조하여 설명한다.

이 실시예에 있어서 제시된 조건은 본 발명의 기술사상을 보다 상세히 설명하기 위한 것으로서 이를 예시한 것에 불과하다. 따라서, 본 발명은 하기의 실시예에 제시된 조건으로 한정되는 것이 아니며, 또한 그러한 의미로 해석되어서도 안된다.

도면에서, 도 1은 본 발명의 한 실시예에 따른 동충하초 자실체 생산방법을 설명하기 위한 공정도이다.

(가). 동충하초의 종균준비단계

본 발명에 의한 동충하초 자실체 생산은 원균을 동충하초 균주 분양 센터인 한국동충하초은행(KEFC)으로부터C. militaris74개 균주,C. scarabaeicola3개 균주,C. pruinosa2개 균주,C. kyushuensis5개 균주,C. sphecocephala14개 균주,C. bifusispora1개 균주,C. pentatomi1개 균주,Paecilomyces tenuipes5개 균주,C. tricentri1개 균주등 총 106개 균주를 공시균주로 분양 받아 사용하였다. 분양 받은 균주는 자실체형성 시험을 하여 우수균주를 선발하였다표 1, 표 2.

자실체 형성 균주 선발

	동 충 하 초
자실체 형성 균주	C. militaris, C. kyushuensis, C. sphecocephala, C. pruinosa, C. scarabaeicola, Paecilomyces tenuipes
자실체 형성하지 않는 균주	C. bifusispora, C. pentatomi,C. tricentri

공시 균주들을 이용한 자실체 형성 시험 결과C. militaris를 포함한 6종은 배양실내에서 인공적으로 자실체를 생산하는데 성공하였으나C. bifusispora를 포함한 3종은 자실체의 형성을 유도할 수 없었다.

감자한천배지와 누에번데기 분말을 혼합한 배지에서의 자실체형성 우수균주 선발

균주(KEFC)	자좌형성일	자낭각형성일	자실체수	자실체길이(cm)	50일 후 자실체건중량(g)
C129	18				0.09
C225-1	13	25	33	2.8	0.469
C228	13	23	36	6.2	0.862
C234	18				0.085
C115-1	18		12	1.5	1.898
C197	15	35	11	3.5	0.447
C210	15	34	8	5	0.437
C218	15	34	3	4	0.259
C249	9	23	81	5.8	0.790
C250	15	3	7	4.4	0.184
C257	15	30	7	3.5	0.308
C269	13	37	6	1.3	0.314
C273	13	23	16	4.5	0.556
C275-4	9				0.216
C281	21		2	1.5	0.045

공시 균주들을 감자한천배지와 누에번데기를 넣은 배지 상에 접종하여 20℃ 항온기에서 자실체형성을 유도한 결과C.militaris14균주와C. kyushuensis1균주를 자실체 형성 우수균주로서 선발할 수 있었다표 2.

균사가 배지 전반에 걸쳐 활착 되기까지는 약 일주일이 소요되며 일단 배지전반에 활착된 균사는 담황색을 띠다가 점차 짙은 주황색을 띠게 된다. 자좌발생 개시일이 가장 빠른 것은 C249 균주와 C275-4 균주로 접종 후 9일째부터 자좌의 발생이 시작되었다. 자좌의 발생 후 자낭각을 형성하기까지는 접종 후 23일에서 35일 사이이며 보통 나생형의 자낭각을 형성한다. 자좌의 생장은 성숙한 자낭각을 형성하므로써 종료되는데 35일간 배양하여 자좌의 갯수 및 자좌의 크기를 측정한 결과 C225-1, C228, C197, C249, C273 다섯균주에서 자실체 형성이 가장 왕성하였다.

현미와 누에번데기 첨가 배지에서의 자실체형성 우수균주 선발

균주(KEFC)	자실체형성	자낭각형성	자실체수	자실체길이(mm)	자실체건중량(g)
C234	+++	-	22	52	12.24
C239	+++	+	10	24	11.45
C245	+++	+	13	41	13.4
C246	+++	+	23	54	14.94
C257	+++	-	21	48	13.15
C273	+++	+	47	64	15.17
C275-2	+++	-	10	20	12.93
C281	+++	+	31	47	12.5
C418	+++	+	19	49	16.82
C420	+++	+	47	63	11.55
C18	++	+	24	45	8.28
C247	++	-	1	15	8.27
C250	++	-	13	26	9.79
C251-1	++	+	3	54	4.94
C274	++	-	13	21	10.51
C412	++	+	22	42	8.11
C415	++	+	25	40	8.11
C171	+	+	4	33	7.22
C237	+	+	9	23	7.85
C252	+	+	17	32	9.6
C259	+	+	9	48	7.78
C298	+	+	14	30	7.34
C406	+	+	22	42	7.66
C411	+	+	11	41	7.8

※ +++ : 자실체 형성 우수, ++ : 자실체 형성 보통, + : 자실체 형성 저조

현미와 번데기를 첨가하여 조제한 배양기내에서 자실체형성을 유도한 결과 자실체형성 우수균주로서 최종C. militaris25균주,C. scarabaeicola2균주 등 27개 균주를 선발할 수 있었다.

위와 같이 선발된 자실체형성 우수균주를 평판 배양시키고 확대 배양한다. 페트리접시에서의 평판배양은 통상의 방법으로 실시할 수 있다.

확대 배양된 동충하초 균사체가 약 80% 자랐을 때, 이를 액체종균으로 배양시키기 위하여 그 전 단계인 전 배양과정으로 이행한다. 이는 확대 배양된 동충하초의 균사체 조각을 표 4와 같은 조성의 액체배지에 접종시킴으로써 이루어진다.

동충하초의 액체종균 배양용 조성비 (단위: g)

성 분	접종원(500㎖)	액체배지(10ℓ)
황 백 당	15	300
대 두 분	1.5	30
증 류 수	나머지	나머지

위와 같은 접종원 배지에 균사체를 접종시켜 25±1℃, 80∼150rpm에서 7∼10일간 진탕 배양시켜서 접종원을 얻고, 상기의 액체배지에 접종하여 25±1℃, 제균된 공기 0.5 vvm의 양으로 7∼10일간 배양하여 액체종균을 얻는다.

앞서 설명한 바와 같은 표 4의 동충하초의 액체종균 배양성분을 이용하여 액체종균을 얻은 것은 다음과 같은 시험결과에 따른 것이다.

균사생장에 대한 탄소원의 영향

탄소원 종류	엿	옥수수 가루	옥수수 전분	포도당	당밀	감자전분	밀가루	황백당
균사생장	++	+++	++	+	++	++	+++	++++

※ ++++ : 매우우수, +++ : 우수, ++ : 보통, + : 저조

균사생장에 대한 질소원의 영향

질소원 종류	옥수수 침지액	펩톤	대두분	효모즙
균사생장	++	+++	++++	+++

※ ++++ : 매우우수, +++ : 우수, ++ : 보통, + : 저조

균사생장에 대한 무기염류의 영향

무기염 종류	대조구	염화칼슘	황산칼슘	인산칼슘	황산마그네슘
균사생장	+++	+++	+++	+++	+++

※ ++++ : 매우우수, +++ : 우수, ++ : 보통, + : 저조

표 5 내지 도 7에서 알 수 있듯이, 탄소원 시험에서는 황백당, 옥수수가루, 밀가루 등에서 균체량이 많았고, 질소원 시험에서는 대두분에서 균사생장이 가장 우수 하였으며, 효모추출액, 펩톤, 옥수수침출액 순으로 균사생장이 감소하였다. 또한, 무기염류 시험에서는 첨가에 따른 뚜렷한 효과를 확인할 수 없었다.

(나). 동충하초의 배지준비단계

800㎖의 반투명 플라스틱용기에 곡립 80g과 누에번데기 조각 5g을 넣고, 곡립이 현미일 경우에는 현미 : 수분함량이 1 : 2.5의 비율로, 알락미일 경우에는 알락미 : 수분함량이 1 : 3.5의 비율로 수분을 조절한 후, 이를 121℃에서 20분간 멸균하여 배양배지로 삼는다.

배지종류 및 수분함량에 따른 자실체 형성시험

배 지	수 분 함 량 (㎖)
배 지	30	50	70	50(누에번데기 첨가)
현미(20g)	++	++	++	+++
알락미(20g)	+	+	+++	++
감자한천배지	-	-	-	++

곡립배지에서의 동충하초균사생장과 자실체 형성시험

배 지	균사생장	자실체형성
쌀5g + 물60㎖	+	+++
감자5g + 물60㎖	++	+++
옥수수5g + 물60㎖	+++	++
쌀5g + 옥수수5g + 물60㎖	+++	+++

※ +++ : 우수, ++ : 보통, + : 저조

표 9에서 알 수 있듯이, 쌀5g, 옥수수5g에 물을 60㎖ 넣고 배양한 것이 균사생장과 자실체형성이 잘 되었다.

누에번데기배지에서의 동충하초균사생장과 자실체 형성시험

배 지	균사생장	자실체형성
누에번데기20g + 물100㎖	+++	++
누에번데기20g + 한천배지20㎖	+++	+++
누에번데기20g	++	++

※ +++ : 우수, ++ : 보통, + : 저조

표 10에서 알 수 있듯이, 누에번데기에 한천배지를 첨가한 것이 균사의 생장도 빠르고 자실체의 형성도 좋았으며 누에번데기에 물을 가한 것에서도 균사생장 및 자실체의 형성이 좋았다.

(다). 동충하초의 종균접종

위에서 준비한 동충하초 액체종균을 상기배지에 접종시킨다. 이 때, 상기의 액체종균이 곡류배지 위에 골고루 퍼져서 그 표면을 뒤덮을 정도로 접종시킨다. 접종시에 잡균의 혼입을 방지하기 위해 무균실에서 행한다.

(라). 동충하초의 배양 및 자실체 생산

접종된 동충하초 배지를 습도 70∼80%, 온도 24℃내외, 형광등을 켜서 광을 유지시킬 수 있는 배양실에서 10∼15일 동안 배양시킨다.

자실체 형성에 적합한 온도를 구명하고자 20℃와 24℃의 항온기내에서 자실체의 인공생산을 유도한 시험에서 균사의 초기 활착은 24℃에서 우수하였으나, 일단 자좌가 형성되기 시작하면 20℃에서의 자좌 형성속도가 빨라지며 자낭각을 생산하는 성숙한 자실체를 형성한다. 24℃에서는 자실체의 생산보다는 기중균사의 생장이 왕성하여 자실체의 생장이 저해받으며 형성된 자실체 또한 자낭각을 생산하지 않는 불완전한 형태의 것이었다. 그러므로 자실체 형성 적정 온도는 20℃가 적합한 것으로 밝혀졌다.

현미와 누에번데기를 넣어 만든 배양기내에서의 자실체형성은 약 50일 내지 65일 사이에 완전한 형태의 자실체형성을 볼 수 있었는데 균사가 배지전반에 활착 되기까지는 10∼15일이 소요되며, 일단 활착된 균사는 초기에 우유빛을 띠다가 점차 균사전반에 걸쳐 황색빛을 띠는 부분이 발달한다. 이 때는 배양실 온도를 20℃, 습도 80∼90%, 빛의 밝기 500∼1000Lux로 유지하여 주면 배지표면에 자라는 균사의 색이 솜털모양의 상태로 변하며 15∼18일이 지나면 번데기의 표면에 짙은 주황색을 띠는 돌기모양의 균사 덩어리가 형성되기 시작하면 자좌의 발생이 시작된다. 자좌의 발달은 초기에 길이 신장을 하며 자좌의 상단부가 곤봉형태로 두터워지면서 이 부분에서 자낭각을 형성하게 된다. 형성된 자낭각이 성숙하면 자실체의 생장은 멈추며 점차 퇴화하기 시작하고, 자실체의 두부에 형성된 자낭각은 자연상태에서 발견되는 것보다 다소 위축되어 있으나 자낭과 자낭포자의 형태는 자연상태에서 발견되는 것과 동일한 것으로 관찰되었다. 자실체형성이 우수한 균주들에 있어서 이러한 일반적인 특징들과는 반대로 배지표면에 균사의 생장이 지나치게 왕성한 균주들에 있어서는 자실체의 발달이 저해되는 것으로 밝혀졌다.

본 발명에 의해 동충하초 자실체를 생산할 경우, 종래와는 달리 우리 주변에서 쉽게 구할 수 있는 곡립을 주재료로 사용하므로 배양원료의 구입이 용이하고, 배양원료를 확보하는데 곤란성이 없으므로 대량생산이 가능한 장점이 있다.

또한, 본 발명에 의한 동충하초 자실체 생산시 자실체 형성 우수균주를 선발하여 사용하므로 높은 수율의 자실체를 획득할 수 있고, 적정배지를 선발하여 제조공정에 이용하므로 고품질의 우수한 동충하초 자실체를 생산할 수 있다.

또한, 종래의 고체종균 배양법에 비해 액체종균으로 접종하므로써 잡균의 감염에 의한 불량품의 발생이 현저하게 줄어들게 되는 효과가 있을 뿐만 아니라, 배양배지 전 표면을 완전히 덮은 상태에서 자실체가 생산되므로 생산효율을 높여서 대량생산이 가능하게 된다.

또한, 본 발명에 의해 대량생산된 동충하초로부터, 각종의 물리·화학적 방법을 통하여 그의 약효성분을 추출함으로써, 각종의 의약재료로 사용할 수 있다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 그 실시예를 들어 상세히 설명하였으나, 이는 본 발명의 기술사상을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 그에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자이면, 상기의 명세서를 기준으로 하여 본 발명의 기술사상의 범위 내에서 다양한 형태의 모방 및 변형이 가능함을 알 수 있을 것이다. 예컨대, 본 발명에 의한 동충하초 배양배지를 제조하는데 있어서, 보리, 밀, 옥수수, 콩, 율무, 수수 등을 첨가할 수도 있다.

Claims

동충하초의 원균을 평판 배양시키고 확대 배양시켜 동충하초종균을 준비하는 단계와; 동충하초 배양배지용 재료를 물과 함께 배지배양용기에 넣고, 이를 고온고압 살균솥에 넣어 멸균시켜서 동충하초 배양배지를 준비하는 단계 및; 상기 배양배지에 상기 종균을 접종시킨 후, 이를 배양시켜 동충하초 자실체를 수확하는 단계로 구성된 동충하초 자실체 생산방법에 있어서,

상기 동충하초종균의 준비단계에서는 잡균의 혼입을 방지하고 활력을 유지할 수 있는 액체종균을 사용하고, 상기 동충하초 배양배지의 준비단계에서는 곡물배지에 번데기를 첨가한 배지를 사용하며, 상기 종균접종 및 자실체 생산단계에서는 상기 번데기가 첨가된 상기 곡물배지의 전 표면을 자실체가 완전히 덮은 상태로 생육될 수 있도록 상기 동충하충 액체종균을 접종하며,

상기 액체종균은, 탄소원 2∼7%(w/v), 질소원 0.1∼1.0%(w/v), 그리고 나머지 증류수로 이루어진 전배양액의 준비단계와, 상기 전배양액에 평판배양된 동충하초 균주를 접종하는 단계 및, 상기 접종된 전배양액을 80∼200 rpm, 22∼30℃의 진탕배양기에서 6일∼8일간 배양시키는 단계로 이행하는 전배양공정과; 탄소원 2∼7%(w/v), 질소원 0.1∼1.0%(w/v), 그리고 나머지 증류수로 이루어진 액체배양액을 준비하는 단계와, 상기 액체배양액에 상기 전배양접종원을 무균적으로 자동접종시키되 상기 액체배양액 대 상기 전배양접종원을 20∼200 : 1 의 비율로 접종시키는 단계 및, 상기 접종된 액체배양액을 22∼28℃에서 0.1∼1.0 vvm 정도의 제균된 공기로 5일∼12일 동안 통기배양시키는 단계를 이행하는 액체배양공정에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 동충하초 자실체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 동충하초 배양배지에는 곡물 대 번데기가 16 : 1로 첨가되어 있는 것을 특징으로 하는 동충하초 자실체의 생산방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 곡물은 현미 또는 안락미인 것을 특징으로 하는 동충하초 자실체의 생산방법.
제3항에 있어서, 상기 현미 또는 안락미에는 보리, 밀, 옥수수, 콩, 율무, 수수 중의 어느 하나가 부가적으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 동충하초 자실체의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 종균접종 및 자실체 생산단계에서 균사의 활착시에는 24℃전후의 온도를 유지하고, 자실체 형성시에는 20℃의 온도를 유지하는 것을 특징으로 하는 동초하초 자실체의 생산방법.