KR100674123B1 - 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 기주로 한밀리타리스동충하초의 인공 재배방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 기주로 한 밀리타리스동충하초의 인공 재배방법에 관한 것이다.

본 발명의 동충하초의 재배방법은, 건강한 종령기의 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 선별하고, 찹쌀가루에서 3 ~ 5 일간 배양한 후, 100 ℃ 물에 30 ~ 50 초 동안 담근 후, 수분이 65 ~ 75 %가 되도록 건조시켜 전처리하고, 병입한 다음, 내부의 습도가 65 ~ 75 %를 유지할 수 있도록 번데기 가루를 첨가한 다음, 멸균하고, 멸균된 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충에 밀리타리스동충하초 균주를 접종하여 균사배양하고, 균사배양된 배양물을 생육실에서 자실체 형성을 유도하여 밀리타리스동충하초를 인공적으로 재배하는 것으로 구성된다.

본 발명에 의해, 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 이용하여 밀리타리스동충하초를 단기간 내에 대량 생산할 수 있는 재배방법이 제공된다.

흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충, 밀리타리스동충하초, 동충하초, 균사배양

Description

흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 기주로 한 밀리타리스동충하초의 인공 재배방법{ARTIFICIAL CULTIVATION METHOD OF CORDYCEPS MILITARIS USING PROTAETIAA ORIENTALIS LARVA}

도 1 : 본 발명의 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 기주로 한 밀리타리스동충하초의 인공 재배공정도

도 2 : 본 발명의 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 기주로 한 밀리타리스동충하초의 인공 재배시 250 lx 광조사 조건에서 배양한 균사체사진

A : 배양 3 일째 B : 배양 5 일째

C : 배양 7 일째 D : 배양 9 일째

도 3 : 본 발명의 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 기주로 한 밀리타리스동충하초의 인공 재배시 250 lx 광조사 조건에서 배양한 균사체사진

E : 암실 배양 9 일째

도 4 : 본 발명의 밀리타리스동충하초 재배 기간별 사진

A : 생육실 5 일째 B : 생육실 10 일째

C : 생육실 25 일째 D : 생육실 45 일째

도 5 : 본 발명의 밀리타리스동충하초의 재배 기간별 사진

E : 생육실 50일째

본 발명은 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 기주로 한 밀리타리스동충하초의 인공 재배방법에 관한 것이다.

흰점박이 꽃무지 풍뎅이는 딱정벌레목, 풍뎅이과, 꽃무지아과에 속하는 식식성(植食性)곤충으로서, 그 유충을 흔히 "굼벵이"라고 하는데 이 유충은 동의보감 등의 한방의서에 등장할 정도로 그 약용적 가치가 매우 높다.

흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충은 유기물이 풍부한 부식성의 토양과 건초더미 등에서 서식하며, 3령의 성숙유충 상태로 월동하는 것으로서, 성인병예방과 치료 및 간 기능 개선에 높은 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

현재 식품의약품 안전청 한약재료분류에서는 굼벵이를 제조라고 등재하고 있으며, 굼벵이의 종류는 많지만 독이 없고 약효가 뛰어난 굼벵이는 한 종류 뿐으로서, 구별하는 방법은 굼벵이를 채집하여 땅바닥에 놓으면 몸통이 뒤집어져서 발이 달린 복부를 하늘로 향하고 등은 땅에 붙인 채로 아주 빠른 속도로 이동하는 것이 약용 굼벵이인 흰점박이 꽃무지풍뎅이 유충이다.

한편, 동충하초는 고대로부터 중국에서 결핵, 천식, 황달의 치료 및 아편중독의 해독제, 병후의 보양 및 강장제, 면역기능 강화제로서 이용되어온 고가의 한 방약제이며, 밀리타리스동충하초의 자실체와 관련해서는 자실체의 주성분인 코디세핀이 항암작용이 있는 것으로 밝혀졌고(Cunningham, K.G., W.manson.F.S. Spring and S.A.Hutchinson. 1950. Cordycepin, a metabolic product from cultures of (Linn.)Link. nature, 166 ~ 949), 중국은 동충하초자실체를 궁중 요리로 이용하고 있으며, 일본은 동충하초를 약용으로 사용하고 있다.

이러한 동충하초는 자연 상태에서 채집되기도 하지만, 자연 상태에서의 자실체의 채집은 상당히 어려워 공급이 한정되고 있으며, 최근 생태계파괴 및 공해로 인한 이상기후현상 등으로 자실체의 자연채취가 점점 어려워짐에 따라 자실체의 안정적 인공생산 기술이 요구되고 있는 실정이다.

한국공개특허공보 제10-2005-0036382호(풍뎅이류 굼벵이를 이용한 동충하초와 그 생산방법)에는, 인공사육된 풍뎅이류 굼벵이가 번데기로 변태 중인 전용단계 또는 변태가 완료된 번데기 중의 하나를 동충하초의 기주로 하여 생산하는 방법에 관한 것이 공개되어 있다.

한국공개특허공보 제10-2004-0076506호(파리 유충을 기주로 한 동충하초 재배방법)에는, 보다 저렴한 동충하초를 단기간 내에 대량 및 간편하게 재배함과 아울러, 파리 유충이 갖는 성장 물질 등 여러 유용한 성분을 갖는 동충하초를 재배할 수 있는 파리유충을 기주로 한 동충하초의 재배방법에 관한 것이 공개되어 있다.

한국등록특허공보 제10-0361165호(장수풍뎅이 유충을 기주로 한 동충하초 및 그 생산방법)에는, 장수풍뎅이 유충을 특수한 처리제로 전처리한 후에 동충하초 균주를 접종하여 배양하는 방법에 관한 것이 공개되어 있다.

그러나, 상기와 같이 여러 동충하초의 자실체 생산기술로 여러 곤충을 이용하여 자연 상태에서 자실체를 채집하는 방법, 인공배지를 이용한 대량 배양방법 등이 있으나, 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 기주로 하여 밀리타리스동충하초를 생산하는 방법에 대한 연구는 부족한 실정이다.

본 발명의 목적은 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 기주로 하여 밀리타리스동충하초를 안정적인 재배 및 단기간 내에 대량 생산할 수 있는 재배방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충이 갖고 있는 영양성분 및 약리작용과, 밀리타리스동충하초가 갖고 있는 영양성분 및 다양한 약리작용이 함께 더해져 종래의 동충하초에 비해 효과가 월등히 뛰어난 밀리타리스동충하초를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 기주로 한 밀리타리스동충하초의 인공 재배방법에 관한 것이다.

본 발명의 밀리타리스동충하초의 재배방법은, 건강한 종령기의 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 선별하고, 찹쌀가루에서 3 ~ 5 일간 배양한 후, 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 100 ℃의 물에 30 ~ 50 초 동안 담근 후, 수분이 65 ~ 75 %가 되도록 건조시켜 전처리하는 제1단계, 전처리한 풍뎅이유충을 병입하고, 누에번데기 가루를 풍뎅이유충의 중량대비 5 ~ 10 중량% 첨가한 다음, 121 ℃에서 1 시간 동안 멸균하는 제2단계, 멸균이 끝난 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충에 밀리타리스동충하초 균주를 접종하여 균사체를 배양하는 제3단계, 균사배양된 배양물을 생육실에서 자실체 형성을 유도하는 제4단계로 구성된 밀리타리스동충하초를 인공적으로 재배하는 것으로 구성된다.

본 발명의 주재료인 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충(Protaetia brevitarsis seulensis)은 분류학상 곤충강 딱정벌레목 풍뎅이과에 속하며, 1 년에 한번 생활사가 완결되는 1화성 곤충으로서, 7 ~ 9월경에 알에서 부화한 유충은 3 번의 탈피를 하여 번데기가 된 후 6 ~ 7월경에 성충으로 우화한다.

흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충은 민간에서 간 경화, 간암 등의 간 질환 및 간 기능 개선에 효능이 있는 것으로 알려져 있고, 이외에도 보양효과 및 각종 성인병 예방치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

일반적으로 동충하초는 곤충에서 자실체가 형성되는 자낭균류의 일종인 약용버섯으로서, 종래 동충하토는 박쥐나방과의 유충에서 나온 동충하초인 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis)를 지칭하였으며, 오늘날에는 곤충 뿐만 아니라 거미, 균류 등에서 나오는 버섯까지도 동충하초라 부르고 있다.

이러한 동충하초는 곤충의 종류에 따라 코디셉스 시넨시스 동충하초 (Cordyceps militaris) 및 눈꽃동충하초(Paecilomyces jap onica)로 구분되며, 밀 리타리스(번데기) 동충하초와 눈꽃(누에) 동충하초는 딱정벌레목 곤충(누에 또는 번데기)를 이용할 수 있다.

고대 중국에서는 3 대 명약으로 산삼, 녹용, 동충하초를 꼽고 있으며, 결핵, 천식, 황달의 치료 및 아편중독의 해독제, 병후의 보양 및 강장제, 면역기능 강화제로서 이용되어온 고가의 한방약제이며, 밀리타리스동충하초의 자실체와 관련해서는 자실체의 주성분인 코디세핀이 항암 및 면역증강작용이 있는 것으로 밝혀졌고 (Cunningham, K.G., W.manson.F.S. Spring and S.A.Hutchinson. 1950. Cordycepin, a metabolic product from cultures of (Linn.)Link. nature, 166 ~ 949), 중국은 자실체를 궁중 요리로 이용하고 있으며, 일본은 동충하초를 약용으로 사용하고 있다.

동충하초는 영양원이 살아있는 곤충의 구성 성분이 전환되는 것이므로 여기에서 나오는 여러 생리활성물질은 인간의 각종 질병치료에 이용되어 질 수 있는 가능성이 높은 것으로 알려져 있다.

그러나, 자연상태의 동충하초는 채집이 어렵고 지역이 한정되어 있을 뿐 아니라 채집되는 양이 극히 적기 때문에 동충하초를 이용한 제품의 개발이나 약리성분의 분석 및 활용이 현실적으로 어려운 실정이다.

따라서, 본 발명은 국내에서 채집된 밀리타리스동충하초균을 공시균주로 하고 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 기주로 하여 밀리타리스동충하초의 배양특성 및 자실체 형성조건을 조사하고, 인공재배에 관련된 요인들을 규명하여 밀리타리스동충하초의 안정적인 재배 및 대량생산을 위한 방법을 개발하는데 목적을 두고 연구 를 하였다.

본 발명의 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 기주로 한 밀리타리스동충하초의 인공 재배방법은, 먼저 건강한 종령기의 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 선별하고, 내부에 차있는 소화찌꺼기를 제거하기 위해 찹쌀가루에서 3 ~ 5 일 동안 배양한다.

상기의 배양이 끝난 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 100 ℃의 물에 30 ~ 50초 동안 담근 후, 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충의 내부 수분이 65 ~ 75%가 될 때까지 상온에서 건조하여 전처리한다.

상기와 같이 전처리를 하게 되면, 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충의 체내에 존재하는 세균을 살균함과 동시에 상기 유충의 외골격 조직변화를 방지하여 유충의 형태를 유지함은 물론, 외피의 손상을 방지하고, 수분조절 및 균 접종시 그 균의 내부 침투가 잘 이루어지게 된다.

전처리한 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 병입한 다음, 전처리한 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충의 내부 습도를 유지하기 위해 수분이 45 ~ 55 %인 누에번데기 가루를 풍뎅이유충의 중량대비 5 ~ 10 중량% 첨가한 후, 121 ℃에서 1 시간 동안 멸균처리 한다.

이때, 전처리한 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 병입한 후, 내부습도가 80 %이상인 경우 균의 활착이 저해되며, 60 %이하인 경우 자실체 형성이 부실하므로 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충의 내부 습도는 65 ~ 75 %로 유지하는 것이 바람직하다.

또한, 멸균 후 외부습도가 과도하면 초기의 종균 성장에 저해요인으로 작용할 수 있으므로, 멸균 중 유충의 내, 외부 습도가 과도해짐을 억제해주는 누에번데기 가루를 멸균하기 전에 풍뎅이유충의 중량대비 5 ~ 10 중량%를 첨가하여 습도를 조절한다.

이때, 누에번데기 가루가 함유하는 수분이 40 %이하인 경우 배양 용기 내 유충의 습도조절이 어려우며, 60 %이상인 경우 균사체 배양시 유충의 내부성장보다는 외부성장을 하게 되어 자실체 형성효율이 떨어지는 문제점이 발생함으로 누에번데기 가루는 45 ~ 55 %의 수분을 함유하고 있는 누에번데기 가루를 이용한다.

또한, 누에번데기 가루는 5 % 미만으로 첨가하는 경우 배양 용기 내 유충의 습도조절이 어려우며, 10 %를 초과하는 경우에는 균사체 배양시 유충의 내부성장보다는 외부성장을 주로 하게되어, 풍뎅이유충의 중량대비 5 ~ 10 중량%를 첨가하는 것이 바람직하다.

이렇게 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 전처리 및 멸균처리하여 기주를 준비한 다음, 여기에 밀리타리스동충하초 균주를 접종하고, 균사체를 배양한다.

본 발명에서 이용하는 균사체는 균공시균주로 밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris)와 야생에서 채집한 균주로부터 균사체를 분리하여 이용한다.

채집한 균주는 자실체로부터 포자와 조직을 무균적으로 분리하여 배양하며, 균주의 배양은 감자한천배지(PDA배지)를 사용하고, 25 ℃에서 8 ~ 10 일간 배양한 다음 냉장 보관하거나, 50 % 글리세롤 스톡(glycerol stock) 배지에 보관한다.

보관된 균주는 감자한천배지(Potato Dextrose Agar ; PDA)에서 15 ~ 35 rpm, 23 ~ 27 ℃로 4 ~ 6 일간 배양한다.

상기의 배양된 균사체의 가장자리 부분을 잘라낸 다음, 그 절편을 감자추출 배지에 접종하고, 23 ~ 27 ℃에서 진탕 배양하여 액체종균을 배양한다.

이때, 감자추출물 배지는 천연물 배지로서 PDB(합성배지)보다 가격이 저렴하고 균사체의 영양 성장시 충분한 활력을 제공함으로써, 대량으로 종균을 배양하는데 용이하기 때문에 상기의 잘라낸 절편을 감자추출배지에 접종시켜 액체종균을 배양한다.

상기의 액체종균을 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충이 병입되어 있는 배양병에 풍뎅이유충 기주의 중량대비 5 중량%이하로 접종한 후, 온도는 23 ~ 27℃, 습도는 70 % 미만으로 하며, 환기는 7 ~ 8 회/1 일 조건에서 9 ~ 10 일 동안 배양한다.

이때, 액체종균을 기주의 5 중량%이상 접종하면 성장시 균괴를 형성하여 자실체 발이 시 발이 수 저하 및 성장을 저해할 수 있기 때문에 상기 유충이 함유된 배양병에 5 중량% 이하로 접종한다.

또한, 동충하초균의 균사배양 최적온도는 23 ~ 27 ℃, 습도는 70 % 미만이며, 고온 다습한 경우 균사체 성장이 더디며 세균에 의한 오염률이 높으며 환기가 부족한 경우엔 균사체의 성장이 더딘 문제점이 발생함으로 상기 접종 시 온도가 23 ~ 27 ℃, 습도가 70 % 미만, 환기 7 ~ 8회/1일 실시하여 배양한다.

상기와 같이 밀리타리스동충하초 균사체를 배양한 다음, 자실체를 형성시킨다.

흰점박이 꽃무지 유충의 내부에 동충하초균이 번성하여 하얗게 차있는 상태의 것을 생육실로 옮겨 자실체 형성을 유도한다.

생육실에서의 배양 기본조건은 온도 16 ~ 20 ℃, 습도 82 ~ 98 %, 광도 490 ~ 510 lx를 유지해야 하며, 환기는 3 ~ 5 회/1일 실시한다.

자실체의 성숙기간은 5 주가 소요되며 처음 균 접종 후 60 여일 뒤에는 완전히 성장한 동충하초를 수확한다.

이때, 자실체의 형성을 유도하기 위한 최적 온도는 16 ~ 20 ℃이며, 더 낮은 경우 발이가 될 수 있지만 충분히 성장하지 않을 뿐 아니라 느리게 성장한다.

또, 20 ℃를 초과하는 경유에는 자실체 형성이 유도되지 않는다.

또, 습도의 경우는 초기(3 일정도)에 98 %초과의 많은 습도가 요구되고, 발이가 진행된 후에는 82 ~ 98 %사이로 유지하면 된다 .

82 % 미만인 경우 자실체가 형성된다 하더라도 충분히 자라지 않거나 덩어리로 뭉치는 경우가 생기며, 포자가 일찍 생기는 문제가 발생한다.

습도가 98 % 초과인 경우에서 일주일 간 배양하며 자실체 형성여부를 확인 한 다음, 발이 된 자실체의 크기가 2 mm 이상 되면 뚜껑을 열어 습도 95 %이하로 충분히 가습하고, 생육실 기본배양조건에서 자실체가 충분히 성숙할 때까지 배양해야 하는 번거로운 문제점이 발생한다.

또한, 광도가 490 lx 미만일 경우에는 자실체의 성장이 더디거나 성장이 도중에 멈추게 되며, 광도가 510 lx 초과인 경우에는 하얀 균사가 형성되며 포자가 일찍 형성된다.

자실체의 성숙기간은 5 주 정도가 소요되며 처음 균 접종 후 60 여일 뒤에는 완전히 성장한 동충하초를 수확한다.

본 발명의 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 기주로 한 밀리타리스동충하초의 인공재배방법에 대해 상세히 설명하면 다음과 같다.

<밀리타리스동충하초의 인공재배방법>

1. 제1단계 : 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충의 전처리

건강한 종령기의 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 선별하고, 내부에 차있는 소화찌꺼기를 제거하기 위해 찹쌀가루에서 3 ~ 5 일 동안 배양한다.

찹쌀가루에서 배양이 끝난 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 100 ℃의 물에 30 ~ 50 초 동안 담근 후, 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충의 내부 수분이 65 ~ 75 %가 될 때까지 상온에서 건조한다.

2. 제2단계 : 멸균처리

전처리한 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 병입한 다음, 전처리된 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충의 내부 습도를 유지하기 위해 수분이 45 ~ 55 %인 누에번데기 가루를 풍뎅이유충의 중량대비 5 ~ 10 중량% 첨가한 후, 121 ℃에서 1 시간 동안 멸균한다.

3. 제3단계 : 밀리타리스동충하초 균사체의 배양

공시균주로 밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris)와 야생에서 채집한 균주로부터 균사체를 분리하여 이용한다.

채집한 균주는 자실체로부터 포자와 조직을 무균적으로 분리하여 배양하였으며, 균주의 배양은 PDA배지를 사용하였고 25 ℃에서 8 ~ 10일간 배양한 다음 냉장 보관하거나, 50 % 글리세롤 스톡(glycerol stock) 배지에 보관한다.

보관된 균주는 감자한천배지(Potato Dextrose Agar ; PDA)에서 15 ~ 35 rpm, 23 ~ 27 ℃로 4 ~ 6 일간 균사체를 배양한다.

상기의 배양된 균사체의 가장자리 부분을 잘라낸 다음, 그 절편을 감자추출 배지에 접종하고, 23 ~ 27 ℃에서 진탕 배양하여 액체종균을 배양한다.

상기 배양된 액체종균은 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충이 함유된 배양병에 풍뎅이유충 기주의 중량대비 2 ~ 5 중량% 접종한 후, 온도 23 ~ 27 ℃, 습도 70 % 미만, 환기 7 ~ 8 회/1 일 조건에서 9 ~ 10 일간 배양하여 밀리타리스동충하초 균사체를 배양한다.

4. 제4단계 : 자실체 형성유도

흰점박이 꽃무지 유충의 내부에 동충하초균이 번성하여 하얗게 차있는 상태의 것을 생육실로 옮겨 자실체 형성을 유도한다.

생육실에서의 배양 기본조건은 온도 16 ~ 20 ℃, 습도 82 ~ 98 %, 광도 490 ~ 510 lx를 유지해야 하며, 환기는 3 ~ 5 회/1일 실시한다.

자실체의 성숙기간은 5 주가 소요되며 처음 균 접종 후 60 여일 뒤에는 완전히 성장한 동충하초를 수확한다.

이하, 본 발명의 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 기주로 한 밀리타리스동충하초의 인공재배방법에 대하여 실시예와 실험예를 통하여 더욱 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 기주로 한 밀리타리스동충하초의 인공재배

종령기 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 준비하였다.

공시균주로는 영농조합법인 까치마을에서 분양받은 밀리타리스동충하초( Cordyceps militaris)와 야생에서 채집한 균주로부터 균사체를 분리하여 준비하였다.

준비한 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 100 ℃의 물에서 50 초간 삶은 후, 내부 습도가 70 %가 될 때까지 건조하였다.

건조된 흰점박이 꽃무지 풍뎅이 유충 100 g을 병입한 다음, 수분이 50 %인 누에번데기 가루를 10 g 첨가한 후, 121 ℃에서 1 시간 동안 멸균처리하여 준비하였다.

채집한 균주는 자실체로부터 포자와 조직을 무균적으로 분리하여 배양하였으며, 균주의 배양은 감자한천배지(Potato Dextrose Agar ; PDA)를 사용하였고 25 ℃에서 10 일간 배양한 다음 냉장 보관하였다.

보관된 균주는 감자한천배지(Potato Dextrose Agar ; PDA)에서 30 rpm, 25 ℃로 5 일간 균사체를 배양하였다.

상기의 배양된 균사체의 가장자리 부분을 잘라낸 다음, 그 절편을 감자추출 배지에 접종하고, 25 ℃에서 진탕 배양하여 액체종균을 배양하였다.

흰점박이 꽃무지 풍뎅이 유충 100 g이 함유된 배양병에 상기 배양된 종균 5 ㎖를 접종한 다음, 온도 25 ℃, 습도 60 %, 환기 8회/1일 조건에서 10 일간 배양하여 동충하초 균사체를 준비하였다.

온도가 20 ℃, 습도 90 %, 광도 500 lx인 생육실에서 상기 배양된 동충하초 균사체를 넣어두어 자실체 형성을 유도하였다.

처음 균 접종 후 60 일 뒤에 완전히 성장한 동충하초를 수확하였다.

<실험예 1> 흰점박이 꽃무지 유충 전처리 실험결과

흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충(종령기)을 준비하였다.

유충은 처리하기 전 찹쌀가루에서 3 ~ 4 일 동안 배양하여 내부 소화되지 않은 물질을 배설하게 하였다.

유충 보관은 먼저 살아있는 유충을 끓는 물에 5 분 이내로 침적시킨 다음 바로 -20 ℃에 냉동 보관한 것과 냉동처리한 후 필요 시 끓는 물에 침적시켜 사용하는 군으로 구분하여 준비하였다.

그 결과, 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 밀리타리스동충하초를 이용하기 위해 건강한 종령기의 유충을 선별하고, 내부에 차있는 소화찌꺼기를 제거하기 위해 찹쌀가루에서 3 ~ 4 일간 배양한 결과, 3 일경과한 유충은 30 % 정도, 4 일 경과한 것은 50 %, 5 일 경과한 것은 60 % 정도 소화찌꺼기가 제거되었다.

시간이 경과함에 따라 유충의 활력이 떨어지는 것을 감안할 때 처리기간을 5일 이내로 하여 준비된 유충을 사용하는 게 가장 적합함을 알 수 있었다.

균사를 접종하기 전 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 끓는 물에서 5 분간 침적한 후 사용한 것과 처리하지 않은 것을 비교한 결과 처리하지 않은 경우는 전배양실에서 균사체성장 초기에는 양호하였으나 시간이 지남에 따라 유충 내부로의 침투가 불량하였으며 내부 성장이 이루어지지 않아 자실체형성에 어려움이 있었다.

끓는 물에 처리한 경우에는 유충의 외부성장 및 내부성장이 양호하였다.

이는 유충의 단단한 외골격이 boiling하는 동안 유화되어 균사체의 내부 침 투가 용이했던 것으로 보이며, 처리시기는 냉동 전,후와 관계가 없었다.

따라서, 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 100 ℃ 물에 50 초간 삶은 다음, 건조한 후, 내부 습도를 65 ~ 75 %로 유지하도록 하여 제조한 것이 가장 적합함을 알 수 있었다.

<실험예 2> 누에번데기 가루 첨가량에 따른 균사체 성장속도 및 균총의 형태를 조사 결과

1. 사용균주

본 실험에 사용한 공시균주로는 영농조합법인 까치마을에서 분양받은 밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris)와 야생에서 채집한 균주로부터 균사체를 분리하여 사용하였다.

채집한 균주는 자실체로부터 포자와 조직을 무균적으로 분리하여 배양하였으며, 균주의 배양은 PDA배지를 사용하였고 25 ℃에서 8 ~ 10일간 배양한 다음, 50 % glycerol stock 배지에 냉장보관하였다.

2. 균사체 배양

전처리한 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충에 접종할 액체종균은 감자추출배지를 만들어 사용하였다.

균사체 성장을 위한 배지는 PDA 및 감자추출배지(감자추출액 300 ㎖/ℓ, 설탕 3 %, pH 6.0)를 이용하였으며, 각각의 배지는 121℃에서 20 분간 멸균한 후 평 판배지 및 액체배지를 조제하였다.

PDA배지에서 형성된 균총의 아선단을 4 mm cork borer를 이용하여 균총을 떼어낸 후, 떼어낸 조각 2 개를 감자추출배지 500 ㎖에 접종한 다음 25 ℃에서 150 rpm으로 5 일간 진탕 배양하였다.

따라서, 직경 2 ~ 3 mm의 크기가 균일한 균총이 형성되어 이를 기본 액체종균으로 사용하였다,

배양용 병에 흰점박이 꽃무지 풍뎅이 유충량 100 g, 수분은 70 %로 조정하였으며, 이를 배양병 넣은 후, 배양된 균사체 10 ㎖를 접종하였다.

균사체의 배양을 용이하게 하기 위해 감자추출액체배지에 누에번데기 가루를 0.5 ~ 4%를 각각 첨가하여 균사체 성장속도 및 균총의 형태를 조사하였다.

그 결과, 아래의 표 1에 나타내었다.

<표 1> 감자추출 액체배지에서 누에번데기 첨가량에 따른 균사 성장율

누에번데기가루(%)	균사체 성장률(w/v)	균사체 직경(mm)
0	0.55	3.8
0.5	0.65	3.2
1	72.7	3.1
2	88.4	2.8
4	88.7	2.6

상기의 표 1의 결과에서 보는 바와 같이, 번데기 동충하초의 균사생장 및 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충의 내부 감염력을 높이기 위해, 감자추출액체배지(200 ㎖/500 ㎖ flask)에 누에번데기가루를 0.5 %, 1 %, 2 %, 4 % 되게 첨가하여 배양한 결과, 2 %와 4 % 첨가배지에서 균사체의 성장률이 0.88(w/v)로 가장 양호하였으며, 균총의 직경이 2.8±0.5 mm로 균일하였다.

전 배양 시기에 누에번데기 첨가에 따른 균사의 침투력을 조사한 결과, 전처리한 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충의 외부성장은 비슷하였으나, 내부성장의 경우는 2 % 누에번데기 가루를 첨가한 배지에서 유도된 균사체를 배양병에 접종했을 때 처리하지 않은 균사체의 성장에 비해 3 ~ 5일 빠르게 침투되었으며, 침투 후 내부 성장도 처리하지 않은 대조구(42 %)에 비해 약 2.4배(≥98%)정도 양호하게 나타났다.

<실험예 3> 배양조건 조사결과

자실체 형성은 전배양 및 생육실배양 두 단계로 구분하여 실시하였다.

자실체 형성에 적합한 환경특성을 조사하기 위해 배양온도, 습도, 환기량 및 광도(㏓)를 각각 조사하였다.

배양온도는 16 ~ 28 ℃범위에서 2 ℃간격으로 생장율 및 발이울을 각각 측정하였으며, 습도는 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %에서 단계별로 다르게 배양하였다.

환기는 전배양 시기에 1 일 4 회(30 min) 실시하였고, 배양실로 옮긴 다음에는 1 일 6 회(15 min) 실시하였다.

그리고 자실체 형성에 미치는 빛의 영향을 살펴보기 위해 전배양실은 암실처리를 하고 접종한 병을 9 ~ 12 일간 배양한 다음, 배양실로 옮기고 자실체를 유도하였다.

발이시기의 광량은 10 ㏓, 100 ㏓, 500 ㏓, 800 ㏓, 1000 ㏓로 조절하였으며, 30 일간 배양한 자실체의 길이, 자실체 수, 병당 자실체 무게 등을 각각 조사 하였다.

1. 동충하초 배양시 배양실에서 가장 적합한 배양조건 조사한 결과를 도 2,3에 나타내었다.

배양실의 배양온도는 24 ℃에서 가장 양호하였으며, 빛을 250 lx로 하여 조사하면서 배양한 경우 빛이 없는 암실에서 배양한 것과 균사의 성장률에는 크게 영향이 없었으나, 빛을 조사하면서 배양을 하는 경우 균사체는 굼벵이 표면에 밀착하면서 성장하였고 배양 5일째부터 균총은 주황색으로 발색이 나타나기 시작하였으며, 9 일 이상 배양한 굼벵이의 내부성장을 조사한 결과, 전처리된 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충의 대부분(약 98%)이 체강의 절반을 균사체로 채워져 있었다.

반면, 암배양의 경우는 균사체가 전처리된 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충표면에 밀착되지 않고 흰색의 솜털모양으로 성장하였으며, 전처리된 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충의 내부 성장보다는 외부에 균총을 형성하는 경향이 강하게 나타났다(도 2, 3).

2. 배양시 환기량에 따른 실험결과를 아래의 표 2에 나타내었다.

환기는 1 회당 30 분간 실시하였다.

<표 2> 환기량에 따른 균사생장률

Aeration (No./day)	Mycelial density	contamminaton rate (%)	Inner growth rate (%)
1	+a	12.5	58
2	++	8.8	69
4	+++	5.1	98
8	+++	5.5	96

+^a : thin, ++ : moderate, +++ : compact

표 2에서 보는 바와 같이, 1 일 4 회 환기처리한 경우 균사체가 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충의 표면에 밀착한 상태로 가장 양호한 성장을 보였으며, 오염률(5.1% 이상)도 최소로 나타났다.

환기량이 적은 경우 전처리된 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충의 내부에서의 균사성장이 더디고 세균에 의한 오염률이 12.5 %로 높게 나타났으며, 특히 세균 오염이 많이 발생하는 여름철의 경우는 오염률이 최고 20 %까지 올라갔다.

3. 배양실에서의 배양일수와 생육실에서의 자실체 형성효율을 조사한 결과를 아래의 표 3에 나타내었다.

<표 3> 자실체 형성효율 실험결과

Temperature (℃)	Length of fruiting body(mm)	Diameter of fruiting body(mm)	Number of fruiting body(No.)
16	103.6	3.3	91
18	108.8	3.5	97
20	97.5	3.9	72
24	82.6	6.3	22
28	59.2	5.4	9

생육실로 옮긴 배양병은 7 일정도 뚜껑을 덮어둔 상태에서 적응시킨 후 뚜껑 을 열고 충분한 습도가 공급되도록 하였다.

전처리된 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충의 내부에서의 성장이 충분히 이루어진 9 일 이상 배양한 배양병에서 양호한 결과를 보였으며, 내부에서의 성장과 외부에서의 성장이 충분히 이루어지지 않은 상태에서 생육실로 옮긴 경우, 초기 발이는 양호했으나 10 일이 경과한 배양병에서 균사체가 사멸되고 자실체가 무너지는 현상이 나타났다.

또한, 배양실에서의 과도한 균사생장은 전처리된 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충표면으로 두꺼운 균사체층이 형성되어 초기 발이 후 균일한 크기의 자실체 성숙을 저해함으로써 소수의 비정형적인 자실체가 형성되었다.

자실체의 형성에 적합한 온도를 조사하기 위해 전배양실(24 ℃)에서 9 일 이상 균사배양을 한 배양병을 발이실로 옮기고 16, 18, 20, 24, 28℃에서 자실체 형성을 유도하기 위해 18 ℃에서 50 일 배양한 결과, 자실체의 발이수가 97±10개, 직경은 3.5±0.5 mm. 길이는 108.8±5 mm로 가장 양호한 발이 형태를 보였다(표 3).

4. 광조사량이 자실체 형성에 미치는 영향 및 광조사 기간별 발이율을 조사한 결과, 아래의 표 4, 5에 나타내었다.

<표 4> 광조사량이 자실체 형성에 미치는 영향

Illumination (lx)	Length of fruiting body (mm)	Diameter of fruiting body (mm)	Number of fruiting body
10	22.8	6.8	8
100	89	5.2	32
500	98.5	4.1	99
800	108.6	3.9	107
1000	108.3	3.9	105

<표 5> 광조사 기간별 발이율

Illumination (day)	Length of fruiting (mm)	Diameter of fruiting body(mm)	Number of fruiting body
1	18.8	7.8	6.9
5	57.2	6.3	29.7
10	62.4	5.9	65.6
20	109.5	3.9	109
40	113.2	4.0	111

광조사가 없는 암실상태에서의 자실체 형성은 거의 이루어지지 않았으며, 균사상태로만 성장이 지속되거나 균괴 형태로 성장하였다.

또한, 소수의 자실체가 형성되기는 하지만 자실체의 크기가 균일하지 않고 직경이 5 ~ 10 mm 정도의 커다란 자실체 몇 개만이 성장하는 경향을 보였다.

발이 및 자실체 성장에 필요한 광량은 800 ㏓ 이상에서 양호하였다.

자실체의 길이 및 직경은 각각 108±3 mm, 3.9±0.2 mm로 나타났으며, 발이수는 800 ㏓에서 가장 양호(107±12개/병)하였다(표 4).

광조사 기간은 발이실 배양 초기부터 20일 이상 처리한 경우, 자실체 발이수가 109개 이상으로 높게 나타났으며, 자실체의 길이, 직경 및 형태도 109±3 mm, 3.9±0.2 mm로 양호하였다(표 5).

5. 습도가 자실체 형성에 미치는 영향 및 습도처리 기간별 발이율을 조사한 결과, 아래의 표 6, 7에 나타내었다.

<표 6> 습도가 자실체 형성에 미치는 영향

Humidity (%)	Length of fruiting body (mm)	Diameter of fruiting body (mm)	Number of fruiting body	Weight of fruiting body (b/bottle)
50	78.5	9.2	14	5.8
70	98.2	5.9	32	14.3
80	109.3	4.3	67	28.2
90	113.2	3.8	109	31.5
95	116.8	3.8	112	32.9

<표 7> 습도처리 기간별 발이율

Humidity (day)	Length of fruiting body (mm)	Diameter of fruiting body (mm)	Number of fruiting body (No.)	Weight of fruiting body (g/bottle)
5	67.3	5.2	35	12.8
10	109.5	4.1	82	31.7
20	112.9	3.9	112	32.2
40	116.1	3.8	113	33.7

자실체 형성에 필요한 습도의 경우 95 %이상에서 자실체의 발이 수가 배양병당 112±10개로 가장 높게 나타났으며, 자실체의 길이, 직경도 각각 116.8±4 mm, 3.8±0.3 mm로 양호하게 형성되었다(표 6).

습도의 처리기간은 40 일 이상 유지하는 것이 가장 좋게 나타났으며, 자실체 형성 20 일 후에는 95 % 이상에서 오히려 자실체가 물러지는 현상이 자주 나타났으며, 최소 습도(90 %)를 유지했을 때 양호한 자실체의 성숙이 이루어졌다(표 7).

본 발명에 의해 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 이용하여 밀리타리스동충하초를 안정적이면서, 단기간 내에 대량 생산할 수 있는 재배방법이 제공된다.

또한, 본 발명에 의해 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충이 갖고 있는 영양성분 및 약리작용과, 밀리타리스동충하초가 갖고 있는 영양성분 및 다양한 약리작용이 함께 더해져 종래의 동충하초에 비해 효과가 월등히 뛰어난 밀리타리스동충하초가 제공된다.

Claims (4)

1. 동충하초의 재배방법에 있어서,

   건강한 종령기의 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 선별하고, 찹쌀가루에서 3 ~ 5 일간 배양한 후, 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 100 ℃의 물에 30 ~ 50 초 동안 담근 다음, 풍뎅이유충의 수분이 65 ~ 75 %가 되도록 건조시켜 전처리하는 제1단계,

   전처리한 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 병입하고, 누에번데기 가루를 첨가한 다음, 멸균처리하는 제2단계,

   제2단계의 멸균처리가 끝난 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충 기주에 밀리타리스동충하초 균주를 접종하여 균사체를 배양하는 제3단계,

   생육실에서 제3단계를 거친 균사배양된 배양물로부터 자실체 형성을 유도하는 제4단계로 구성된,

   흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 기주로 한 밀리타리스동충하초의 인공 재배방법.
2. 제1항에 있어서,

   제2단계의 멸균처리시, 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충 내부의 습도가 65 ~ 75 %를 유지할 수 있도록 누에번데기 가루를 풍뎅이유충의 중량대비 5 ~ 10 중량% 첨가한 다음, 121 ℃에서 1 시간 동안 멸균하는 것이 특징인,

   흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 기주로 한 밀리타리스동충하초의 인공 재배방법.
3. 제1항에 있어서,

   제3단계의 균사체 배양시, 밀리타리스동충하초 균주는 감자한천배지(Potato Dextrose Agar ; PDA)에서 15 ~ 35 rpm, 23 ~ 27 ℃로 4 ~ 6 일간 배양하고, 이 배양된 균사체의 가장자리 부분을 잘라낸 다음, 그 절편을 감자추출 배지에 접종하고, 23 ~ 27 ℃에서 진탕 배양하여 액체종균을 배양하고,

   이 액체종균을 흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충이 함유된 배양병에 풍뎅이유충 기주의 중량대비 2 ~ 5 중량% 접종한 후, 온도 23 ~ 27 ℃, 습도 70 % 미만, 환기 1 일 7 ~ 8회 조건에서 9 ~ 10 일간 배양하여 밀리타리스동충하초 균사체를 배양하는 것이 특징인,

   흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 기주로 한 밀리타리스동충하초의 인공 재배방법.
4. 제1항에 있어서,

   제4단계의 자실체 형성유도시, 생육실에서의 배양 기본조건은 온도 16 ~ 20 ℃, 습도 82 ~ 98 %, 광도 490 ~ 510 lx를 유지하며, 환기는 1 일 3 ~ 5 회 실시하 는 것을 특징으로 하는,

   흰점박이 꽃무지 풍뎅이유충을 기주로 한 밀리타리스동충하초의 인공 재배방법.

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