CN107573122A - 牛樟芝的液体发酵培养方法及培养基 - Google Patents

牛樟芝的液体发酵培养方法及培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牛樟芝的液体发酵培养方法及培养基。培养基，包含碳源和氮源，其特征在于，所述的碳源为乳糖、麦芽糖或可溶性淀粉，所述的氮源为酵母粉、牛肉膏、麸皮浸出液或黄豆粉。培养方法包括：将牛樟芝菌种活化后制成种子液，然后将种子液接种于所述的培养基中进行发酵培养。本发明筛选合适的发酵培养基，通过液体发酵方法可以成功培养牛樟芝，且牛樟芝的产量很高，培养时间短，条件易于控制和操作。

Description

牛樟芝的液体发酵培养方法及培养基
技术领域
本发明涉及牛樟芝的培养，尤其涉及一种牛樟芝的液体发酵培养方法及培养基。
背景技术
牛樟芝，学名为Autrodia ciuuamomea，又名樟芝、牛樟菇·樟生薄孔菌等，是担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌属的珍贵药用真菌，子实体表面呈淡红褐色或黄色，寄生在中国台湾特有树种牛樟树上与其共生生长，数量非常稀少，且生长速度非常缓慢。牛樟芝是1990年才被生化界发表的新种，其生长区域为中国台湾山区海拔450-2000米山林间，只生长在中国台湾特有百年以上的牛樟树树干腐朽之心材内壁，或枯死倒伏之牛樟树木材潮湿表面，因其采集不易，因此牛樟芝近年已被政府列为国宝级生物之一。
牛樟芝有很多的生理活性成分，如三萜类化合物、多糖体、腺苷、超氧歧化酶、蛋白质(含免疫蛋白)、微量元素、维生素、凝集素、核酸、纤维素、固醉累、氨基酸物质等。牛樟芝的有效成分中三萜类化合物很是特别，高达200多种以上，是其他菌类无法相比的，200多种三萜类化合物使牛樟芝具有抗癌、保肝等功效。由于樟芝在中国台湾被视为独特而珍贵的药用真菌，因此具有极高的研究和商业价值，也是目前中国台湾最昂贵的野生真菌，被广泛称为“神芝”，素有“药芝之王”、“中国台湾森林中之红宝石”的美誉。
由于其独特的生长特性，牛樟芝的产量极其少，已经满不足了现在社会的需求。
发明内容
发明目的：为解决现有技术中牛樟芝自然生长缓慢产量低、生长条件苛刻等问题，本发明的目的之一是提供一种用于牛樟芝发酵的培养基，本发明的目的之二是提供一种牛樟芝的液体发酵培养方法。
技术方案：本发明所述的用于牛樟芝发酵的培养基，包含碳源和氮源，所述的碳源为乳糖、麦芽糖或可溶性淀粉，所述的氮源为酵母粉、牛肉膏、麸皮浸出液或黄豆粉。
所述碳源的浓度为2.5～4.0g/100mL。
所述氮源的浓度为0.7～2.0g/100mL。
具体的，所述的用于牛樟芝发酵的培养基组成包括：马铃薯150～250g/L+碳源+氮源+磷酸二氢钾1～2g/L+硫酸镁0.5～1g/L+维生素B1 0.1～0.2g/L。
进一步的，所述的用于牛樟芝发酵的培养基组成包括：马铃薯200g/L+碳源 +氮源+磷酸二氢钾1g/L+硫酸镁0.5g/L+维生素B1 0.1g/L。
所述的用于牛樟芝发酵的培养基的配制方法包括：将马铃薯去皮切成小块称取150～250g/L，加入水后煮沸20～30min，过滤去渣取汁，加配方量的其他成分即可。
本发明还提供了一种牛樟芝的液体发酵培养方法，包括：
将牛樟芝菌种活化后制成种子液，然后将种子液接种于所述的培养基中进行发酵培养。
所述种子液的制备方法为：将牛樟芝菌种活化后接种于PDA液体培养基中 25～28℃振荡培养培养10～15d。
所述发酵培养的温度为25～28℃，时间为15～20d。
发酵培养方法的接种量为5～10％。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明筛选合适的发酵培养基，通过液体发酵方法可以成功培养牛樟芝，且牛樟芝的产量很高，培养时间短，条件易于控制和操作。
附图说明
图1为碳源为乳糖的发酵培养结果图；
图2为碳源为麦芽糖的发酵培养结果图；
图3为碳源为可溶性淀粉的发酵培养结果图；
图4为氮源为酵母粉的发酵培养结果图；
图5为氮源为麸皮浸出液的发酵培养结果图；
图6为氮源为牛肉膏的发酵培养结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
1.牛樟芝菌株的引进、分离
通过从我国台湾省(原产地)获得具有牛樟芝原木，采用组织分离法对菌株进行纯化培养，经鉴定，获得牛樟芝菌株。
2.牛樟芝菌种活化及种子液的配制
制马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA固体培养基)：称取200g土豆切成块，加水煮沸20－30min，用纱布过滤，加热，再加入葡萄糖20g和琼脂10g，均匀搅拌待琼脂溶解后，加水分至1000mL，分装在三角瓶中，包扎，(121℃)灭菌30min。培养基灭菌结束后稍冷在无菌的条件下倒平板，待其凝固将保藏的菌种接于平板培养中，置在25℃恒温、避光培养20d，再进行种子液体的制备。
配制马铃薯葡萄糖液体培养基(PDA液体培养基)：称取新鲜的马铃薯去皮切成小块200g，加水煮20－30min，用四层纱布将其过滤，加热，再加入葡萄糖 20g，搅拌至完全溶解后，加水补至1000mL,分装于三角瓶(250mL)内，每瓶装量为150mL，封口后将其放入高压灭菌锅0.1MPa(121℃)灭菌30min降压后取出，待冷却到室温后，在无菌的条件下将活化的菌种用直径0.5cm的打孔棒打孔，每瓶接4块菌饼块，置在28℃恒温振荡培养箱(150r/min)中培养15d。
3摇瓶发酵基础培养基的配制
3.1不同碳源发酵培养基的配制
配方1：将新鲜的马铃薯去皮切成小块称取200g/L，加入1000mL的蒸馏水在电磁炉上煮沸30min，用八层纱布将其过滤去渣取汁，加酵母粉5g/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)1g/L、硫酸镁(MgSO4)0.5g/L、维生素B1 0.1g/L，pH值自然，将配制好的培养液分装于250mL三角瓶中，每瓶装100mL，每瓶各加入 2g葡萄糖，5个重复。
配方2：将新鲜的马铃薯去皮切成小块称取200g/L，加入1000mL的蒸馏水在电磁炉上煮沸30min，用八层纱布将其过滤去渣取汁，加酵母粉5g/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)1g/L、硫酸镁(MgSO4)0.5g/L、维生素B1 0.1g/L，pH值自然，将配制好的培养液分装于250mL三角瓶中，每瓶装100mL，每瓶各加入2g 蔗糖，5个重复。
配方3：将新鲜的马铃薯去皮切成小块称取200g/L，加入1000mL的蒸馏水在电磁炉上煮沸30min，用八层纱布将其过滤去渣取汁，加酵母粉5g/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)1g/L、硫酸镁(MgSO4)0.5g/L、维生素B1 0.1g/L，pH值自然，将配制好的培养液分装于250mL三角瓶中，每瓶装100mL，每瓶各加入 2g红糖，5个重复。
配方4：将新鲜的马铃薯去皮切成小块称取200g/L，加入1000mL的蒸馏水在电磁炉上煮沸30min，用八层纱布将其过滤去渣取汁，加酵母粉5g/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)1g/L、硫酸镁(MgSO4)0.5g/L、维生素B1 0.1g/L，pH值自然，将配制好的培养液分装于250mL三角瓶中，每瓶装100mL，每瓶各加入 2g麦芽糖，5个重复。
配方5：将新鲜的马铃薯去皮切成小块称取200g/L，加入1000mL的蒸馏水在电磁炉上煮沸30min，用八层纱布将其过滤去渣取汁，加酵母粉5g/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)1g/L、硫酸镁(MgSO4)0.5g/L、维生素B1 0.1g/L，pH值自然，将配制好的培养液分装于250mL三角瓶中，每瓶装100mL，每瓶各加入 2g可溶性淀粉，5个重复。
配方6：将新鲜的马铃薯去皮切成小块称取200g/L，加入1000mL的蒸馏水在电磁炉上煮沸30min，用八层纱布将其过滤去渣取汁，加酵母粉5g/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)1g/L、硫酸镁(MgSO4)0.5g/L、维生素B1 0.1g/L，pH值自然，将配制好的培养液分装于250mL三角瓶中，每瓶装100mL，每瓶各加入 2g乳糖，5个重复。
3.2不同氮源发酵基础培养基的配制
配方1：将新鲜的马铃薯去皮切成小块称取200g/L，加入1000mL的蒸馏水在电磁炉上煮沸30min，用八层纱布将其过滤去渣取汁，加葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)1g/L、硫酸镁(MgSO4)0.5g/L、维生素B1 0.1g/L，pH值自然，将配制好的培养液分装于250mL三角瓶中，每瓶装100mL，每瓶加入0.5g 酵母粉，5个重复。
配方2：将麸皮过筛称取25g，加500mL蒸馏水，在电炉上煮沸30min过滤去渣取汁，再将新鲜的马铃薯去皮切成小块称取100g，在电炉上煮沸30min，用八层纱布将其过滤去渣取汁，外加葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)1g/L、硫酸镁(MgSO4)0.5g/L、维生素B1 0.1g/L，pH值自然，将配制好的培养液分装于250mL三角瓶中，每瓶装100mL，5个重复。
配方3：将黄豆粉过筛称取25g，加500mL蒸馏水，在电炉上煮沸30min过滤去渣取汁，再将新鲜的马铃薯去皮切成小块称取100g，在电炉上煮沸30min，用八层纱布将其过滤去渣取汁，外加葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)1g/L、硫酸镁(MgSO4)0.5g/L、维生素B10.1g/L，pH值自然，将配制好的培养液分装于250mL三角瓶中，每瓶装100mL，5个重复。
配方4：将菜籽饼称取25g，加500ml蒸馏水，在电炉上煮沸30分钟用八层纱布将其过滤取浸汁去渣取汁，再新鲜的马铃薯去皮切成小块称取100g，在电炉上煮沸30分钟，用八层纱布将其过滤，外加葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾 (KH2PO4)1g/L、硫酸镁(MgSO4)0.5g/L、维生素B1 0.1g/L，pH值自然，将配制好的培养液分装于250mL三角瓶中，每瓶装100mL，5个重复。
配方5：将新鲜的马铃薯去皮切成小块称取200g/L，加蒸馏水在电炉上煮沸 30分钟，用八层纱布将其过滤去渣取汁，外加葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾 (KH2PO4)1g/L、硫酸镁(MgSO4)0.5g/L、维生素B1 0.1g/L，PH值自然的加富培养基，将培养液分装于250mL三角瓶中，每瓶装100mL，每瓶加入0.5g 蛋白胨，5个重复。
配方6：将新鲜的马铃薯去皮切成小块称取200g/L，加蒸馏水在电炉上煮沸30min，用八层纱布将其过滤去渣取汁，外加葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾(KH2PO4) 1g/L、硫酸镁(MgSO4)0.5g/L、维生素B1 0.1g/L，PH值自然的加富培养基，将培养液分装于250mL三角瓶中，每瓶装100mL，每瓶加入0.5g牛肉膏，5 个重复。
3.3不同浓度碳、氮源发酵培养基的配制
在以上试验的基础上，筛选出最适碳源、氮源，在基础培养基的基础上，设计不同的碳源、氮源浓度，以筛选出最适碳源、氮源的适佳发酵培养浓度。配制方法同上。
4摇瓶发酵接种与培养
将碳氮源发酵培养基冷却至室温后，在无菌的条件下，将选好的种子液，用菌种破碎器进行破碎。再用可调式微量移液器，移取5mL接入摇瓶，置于28℃恒温振荡培养箱(150r/min)中培养20d。
培养中直接观察培养液的色泽和澄清度，是否有污染，菌丝球生长均匀度、形状和大小，记录各个配方菌丝的生长情况。
5摇瓶发酵培养菌丝球鲜、干重的测定
发酵培养结束后，培养液经网筛过滤，蒸馏水冲洗数次，洗去菌球上面的培养基，用12层吸收水纸吸水1min后进行称重并记录数据，然后将其放入60℃电热恒温鼓风干燥箱干燥6-8h，烘干至恒重后称重并记录数据。
6培养结果与分析
6.1不同碳源对牛樟芝的发酵培养影响
不同的碳源对菌丝生长存在一定差异，由于营养类型的不同对牛樟芝菌丝的长势存在一定的影响，如表1和图1-3。
表1 不同的碳源对菌丝体生长的影响
由表1和图1-3，可以看出6种不同碳源对牛樟芝菌丝生长速率，菌丝球大小具有明显的差异，从对菌丝体生长量来看，为乳糖>麦芽糖>可溶性淀粉>葡萄糖>红糖>蔗糖。综合牛樟芝菌丝的长势，生长量，菌丝球的均匀度，其中乳糖作碳源的培养基效果最佳。
6.2不同氮源对牛樟芝的发酵培养影响
不同的氮源对菌丝生长存在一定差异，由于营养类型的不同对牛樟芝菌丝的长势存在一定的影响，如表2和图4-6。
表2 不同的碳源对菌丝体生长的影响
由表2和图4-6,可以看出6种不同碳源对牛樟芝菌丝生长速率，菌丝球大小具有明显的影响，从对菌丝体生长量来看，为酵母粉>牛肉膏>麸皮浸出液>黄豆粉>蛋白胨>菜籽饼，综合牛樟芝菌丝的长势，其中酵母粉的培养基效果最佳。
6.3不同浓度乳糖对牛樟芝的发酵培养影响
不同的浓度氮源对菌丝生长存在一定差异，由于营养成分添加量的不同对牛樟芝菌丝的长势存在一定的影响，如表3。
表3 不同浓度乳糖对牛樟芝的生长的影响
由表3,可以看出6种不同浓度乳糖碳源对牛樟芝菌丝生长速率，菌丝球大小具有明显的影响，从对菌丝体生长量来看，其中3g.(100mL)-1)浓度的培养基效果最佳。
6.4不同浓度酵母粉对牛樟芝的发酵培养影响
考察酵母粉浓度时，培养基的配方及制备方法为：
将新鲜的马铃薯去皮切成小块称取200g/L，加蒸馏水在电炉上煮沸30min，用八层纱布将其过滤去渣取汁，外加磷酸二氢钾(KH2PO4)1g/L、硫酸镁 (MgSO4)0.5g/L、维生素B10.1g/L，PH值自然的加富培养基，将培养液分装于250mL三角瓶中，每瓶装100mL，每瓶加入酵母粉及3g乳糖，5个重复。
不同的浓度酵母粉对菌丝生长存在一定差异，由于营养成分量的不同对牛樟芝菌丝的长势存在一定的影响，如表4。
表4 不同浓度酵母粉对牛樟芝的生长的影响
由表4,可以看出6种不同浓度酵母粉氮源对牛樟芝菌丝生长速率，菌丝球大小具有明显的影响，从对菌丝体生长量来看，其中1g.(100mL)-1)浓度的培养基效果最佳。

Claims (8)

1.一种用于牛樟芝发酵的培养基，包含碳源和氮源，其特征在于，所述的碳源为乳糖、麦芽糖或可溶性淀粉，所述的氮源为酵母粉、牛肉膏、麸皮浸出液或黄豆粉。
2.根据权利要求1所述的用于牛樟芝发酵的培养基，其特征在于，所述碳源的浓度为2.5～4.0g/100mL。
3.根据权利要求1所述的用于牛樟芝发酵的培养基，其特征在于，所述氮源的浓度为0.7～2.0g/100mL。
4.根据权利要求1所述的用于牛樟芝发酵的培养基，其特征在于，组成包括：马铃薯150～250g/L+碳源+氮源+磷酸二氢钾1～2g/L+硫酸镁0.5～1g/L+维生素B1 0.1～0.2g/L。
5.一种牛樟芝的液体发酵培养方法，其特征在于，包括：
将牛樟芝菌种活化后制成种子液，然后将种子液接种于权利要求1～4任一项所述的培养基中进行发酵培养。
6.根据权利要求5所述的牛樟芝的液体发酵培养方法，其特征在于，所述种子液的制备方法为：将牛樟芝菌种活化后接种于PDA液体培养基中25～28℃振荡培养培养10～15d。
7.根据权利要求5所述的牛樟芝的液体发酵培养方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为25～28℃，时间为15～20d。
8.根据权利要求5所述的牛樟芝的液体发酵培养方法，其特征在于，接种量为5～10％。
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