CN112940950A - 一株节菱孢菌属真菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株节菱孢菌属真菌菌株，所述的节菱孢菌属真菌菌株命名为Arthrinium arundinis T5‑2，于2020年10月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No.61237。本发明首次从甘蔗中分离筛选到一株Arthriniumarundinis T5‑2，该菌对能够分泌3‑硝基丙酸，产率较高，为生产3‑硝基丙酸带来领域带来广阔的应用前景；进一步的，本发明Arthrinium arundinis T5‑2还能分泌乙醇等醇类化学物质。

Description

一株节菱孢菌属真菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及的是一株节菱孢菌属真菌菌株及其应用。

背景技术

微生物是自然界中天然产物的主要来源，3-硝基丙酸(β-Nitropropionic acid)是黄曲霉、节菱孢、放线菌等真菌产生的有毒代谢产物，在某些高等植物中也有3-硝基丙酸存在。3-硝基丙酸是一非常有用的有机化工中间体，可用于合成β-氨基酸，还可用于制备阿利吉仑关键中间体。但是目前生产3-硝基丙酸的方法都较局限。

发明内容

本发明目的在于提供一株可分泌3-硝基丙酸及产乙醇的节菱孢菌属Arthriniumarundinis及其应用。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一株节菱孢菌属真菌菌株，命名为Arthrinium arundinis T5-2，于2020年10月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No.61237。

上述节菱孢菌属真菌菌株在生产3-硝基丙酸中的应用。

上述节菱孢菌属真菌菌株在生产乙醇中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益的技术效果：

本发明首次从甘蔗中分离筛选到一株Arthrinium arundinis T5-2，该菌对能够分泌3-硝基丙酸，产率较高，为生产3-硝基丙酸带来领域带来广阔的应用前景；进一步的，本发明Arthrinium arundinis T5-2还能分泌乙醇等醇类化学物质。

保藏信息说明

Arthrinium arundinis T5-2于2020年10月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC)，保藏号为GDMCC No.61237。

附图说明

图1为本发明Arthrinium arundinis T5-2菌落图。

图2为本发明Arthrinium arundinis T5-2培养后培养液中产生次生代谢物3-硝基丙酸。

图3为本发明测定了实施例2培养后培养液中的气体成分组成图。

图4为实施例2培养后培养液中挥发性成分的总离子流图。

具体实施方式

下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂、培养基等若无特殊说明，皆为市售所得。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1

1、筛选过程：

从全国不同省区采集霉变甘蔗样品，用无菌操作切取甘蔗块，点种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，28℃培养，待长出菌落后，挑取菌落边缘形态一致的菌丝进行多次纯化，采用PDA斜面4℃保存纯化菌株。观察菌落形态，并在显微镜下观察孢子形态和大小等特征。初步鉴定株为节菱孢属(Arthrinium)，然后采取ITS序列比对分析进一步验证，确定从甘蔗分离出来的菌种是Arthrinium arundinis。

2、菌落形态：

PDA菌落灰白色，平展，致密棉絮状，基质菌丝微黄(如图1所示)，菌丝由光滑、透明、分枝、有间隔的菌丝组成，直径2～3μm。分生孢子梗直立，有隔，淡棕色，光滑，退化为分生细胞。分生细胞呈淡棕色，光滑，长6～10μm，分生孢子深褐色，光滑，表面看呈球形，直径5～7μm，从侧面看呈双凸镜状，宽2～4μm，表面有一条白色的赤道狭缝。

3、分子鉴定：

(1)按照Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒(杭州博日科技有限公司的产品)的操作步骤，提取节菱孢属(Arthrinium)真菌的基因组DNA；

(2)以节菱孢属(Arthrinium.sp)真菌的基因组DNA为模板，分别采用引物对ITS(由ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′，如SEQ ID NO.1所示，和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，如SEQ ID NO.2所示组成)、引物对EF(由EF-728F：5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′如SEQ ID NO.3所示，和EF2：5′-GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT-3′如SEQ ID NO.4所示组成)进行PCR扩增，依次得到PCR扩增产物甲、PCR扩增产物乙，反应体系为40μL，由1μL模板、1μL上游引物(即引物名称中含有“-F”的引物)、1μL下游引物(即与上游引物对应的、引物名称中含有“-R”的引物)、20μL 2×Es Taq Master Mix和17μL ddH 20组成；

反应程序：94℃变性3min；94℃变性30s、56℃退火10s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃延5min；

(3)完成步骤(2)后，由广州擎科生物技术有限公司别对各个PCR扩增产物进行测序；

测序结果表明，PCR扩增产物甲、PCR扩增产物乙的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1(ITS)、SEQ ID NO.2(EF)；

(4)Genebank数据库比对，菌株T5-2与Arthrinium arundinis同源性在99％以上，Mega 6.0分析，鉴定该菌株为节菱孢菌芦竹节菱孢Arthrinium arundinis(Arthriniumarundinis从未在甘蔗中发现过)，菌株代号为T5-2，命名为Arthrinium arundinis T5-2。

实施例2

一、检测3-硝基丙酸

高效液相条件

1.检测器：PDA检测器

2.检测波长：210nm(3D扫描范围：190～290nm)

3.流动相：乙腈+20mmol/L磷酸二氢钾(调节pH＝3.0)＝20+80

4.色谱柱：Thermo syncronis C18 5μ(250×4.6mm)

5.柱温：35℃

6.进样量：10μL

3.样品处理

选取实施例1筛选过程中多次纯化的节菱孢霉菌Arthrinium arundinis T5-2菌株，接种在PDA培养基平板上，28℃培养7天后，用5mm打孔器打孔3个菌丝饼接入PYS液体培养基(马铃薯-酵母膏-蔗糖)，28℃、130r/min震荡培养14d。取已四层纱布过滤的PYS培养液5mL于50mL离心管中，加入15mL乙腈涡旋混匀1min，超声波提取20min后加入3g氯化钠，涡旋混匀2min后于4000rpm离心5min，上清液待净化。

取5mL上清液于已活化的PSA固相萃取柱(CNWBOND PSA SPE Cartridge 500mg6mL，活化过程：6mL乙腈活化)，保持流速为每秒1滴的速度流出柱子后不采取淋洗过程，直接以3mL的10％氨水甲醇溶液洗脱2次。收集洗脱液于三角瓶后于40℃旋转蒸干后用流动相溶解，过0.22μm滤膜后上机测试。

3-硝基丙酸的检测实验结果：测得3-硝基丙酸7.37ug/ml；本发明菌株培养时会产生浓烈的酒精味，于是测定了培养瓶中的挥发性成分，结果如图2所示。

二、挥发性成分检测

1.HS-SPME条件

先将SPME萃取头置于气相色谱仪进样口，在温度为250℃条件下老化15～20min备用。称取上述实施例2第3节中在PYS培养液中培养14天的过滤液3.0g放入20mL顶空萃取瓶中，加盖密封。放入70℃水浴锅中，恒温水浴60min。将老化好的SPME萃取头插入萃取瓶顶空部分，推出纤维头吸附30min

2.GC-MS条件

吸附完成后将SPME萃取头取出，插入气相色谱-质谱联用仪进样口解吸附3min，启动GC仪进行香气成分检测。每个样品平行测定3次。

2.1GC条件：DB-5MS气相毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)载气为纯氦气(99.99％)，分流进样，流速0.5mL/min；进样口温度250℃。柱箱程序升温起始柱温30℃保持5min，以4℃/min的速度升温到200℃保持5min.最后以10℃/min的速度升温到250℃保持7.5min

2.2MS条件GC-MS接口温度280℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；EI电离能量为70eV；全质谱扫描模式扫描质量范围35-550amu。

用上述方法检测到的挥发性成分如图3、图4所示为乙醇等醇类化学物质，其中乙醇含量最高。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西壮族自治区农业科学院

<120> 一株节菱孢菌属真菌菌株及其应用

<130> JC

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 554

<212> DNA

<213> Arthrinium arundinis

<400> 1

tgggagtaca ctccatacca tctgttacct acccagttat gcctcggcgt aagctcggtt 60

ggaggcaccc acagctaccc tgtagttgcg gactgccaaa tccaaccgcg gcccgccggc 120

ggtacactaa actctgtttt attttatatt ctgagcgtct tattttaata agttaaaact 180

ttcaacaacg gatctcttgg ttctggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta 240

atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc gcccatcagt 300

attctggtgg gcatgcctgt tcgagcgtca tttcaaccct taagcctagc ttagtgttgg 360

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<210> 2

<211> 451

<212> DNA

<213> Arthrinium arundinis

<400> 2

acgtactcat cccattcacg tccccaaatc attcccatat catcaataac gacgactggc 60

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tccatcgaga tttttctcac tttggagggg caactaaacc ctgtgtcccc actttcactg 180

cacaatttga cacaagcccc gcacgggcca aacaccccag aaattttcaa ttgaatttgc 240

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tatgcgtggg ttcttgacaa gctcaaggcc gagcgtgagc gtggtatcac catcgatatt 360

gctctgtgga agttcgagac tgaggagtac aatgtcaccg tcattgacgc tcccggtcac 420

cgtgatttca tcaagaacat gacagggggt a 451

Claims (3)

1.一株节菱孢菌属真菌菌株，其特征在于，所述的节菱孢菌属真菌菌株命名为Arthrinium arundinis T5-2，于2020年10月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No.61237。

2.如权利要求1所述节菱孢菌属真菌菌株在生产3-硝基丙酸中的应用。

3.如权利要求1所述节菱孢菌属真菌菌株在生产乙醇中的应用。

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