CN101134977B - 一种好食脉孢霉固态发酵生产β-胡萝卜素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种好食脉孢霉固态发酵生产β-胡萝卜素的方法，该方法选用好食脉孢霉(N.sitophila)菌株17号为生产菌种，使用由豆渣麸皮配制成的培养基，或再包括一种或多种发酵助剂或发酵促进剂，采用固态发酵，或全光照固态发酵，好氧培养的培养方式，将产物孢子进行热盐酸破壁，丙酮提取剂提取，利用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经氧化铝、氧化镁柱层析分离纯化，即配制成所需含量、所需用途的β-胡萝卜素产品；本发明的优点是所选的菌株优良，生产方式易行，无污染而且又有利于进行综合利用，该方法不仅不受环境限制，而且还具有制备成本低廉，稳定、高产的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种好食脉孢霉固态发酵生产β-胡萝卜素的方法。
背景技术
β-胡萝卜素是联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会认定的A类优秀营养食品添加剂，世界年需求量在1000t以上，而目前全球的产量还仅有约600t，市场开发潜力很大。从经济方面考虑，如果按合成β-胡萝卜素400美元/kg计，推算世界年销售额达2.0-2.5亿美元，经济效益的发展前景也十分可观。
目前，天然β-胡萝卜素的生产方法主要有三种，第一种是直接从天然植物中提取，如通过从胡萝卜等含有微量β-胡萝卜素蔬菜中提取、分离，可获得一定量的天然β-胡萝卜素，采用这种方法生产的不足很显然是耗费原料多，产量低。第二种方法是通过大面积养殖盐藻获得，如大面积养殖杜氏盐藻，通过溶剂萃取法获得，这是目前国外生产天然β-胡萝卜素的主要手段。美国Natritite等数家公司和澳大利Betatene等公司通过养殖杜氏盐藻生产天然β-胡萝卜素，年生产能力均在30t以上，但是盐藻养殖受到外界环境条件的严格限制，使其规模均难于壮大，远远不能满足市场需求。第三种方法是通过微生物发酵生产，采用这种方法生产天然β-胡萝卜素因不受环境条件限制而受到重视，目前合成β-胡萝卜素的微生物主要有如巴西Nattell报道用甘蔗汁发酵培养粘红酵母，β-胡萝卜素产量为37.5mg/L。我国张素琴曾研究用分支杆菌发酵生产β-胡萝卜素，在最适条件下发酵6天总色素量为650mg/L，其中β-胡萝卜素量占43.17％。国外微生物发酵法主要是集中在丝状真菌(三孢布拉氏霉菌)和红酵母的研究上，其发酵水平已达中试或批量生产的程度。国内利用三孢布拉氏霉菌的研究也已通过中试。许多微生物中类胡萝卜素的含量较高，且微生物生产类胡萝卜素易于大规模工业化生产，因此很具开发潜力。从目前我国的国情来看，有关通过微生物发酵方法生产天然β-胡萝卜素的下一个努力目标就是在提高产率的同时，进一步降低其生产成本。
发明内容
本发明目的是提供一种好食脉孢霉固态发酵生产β-胡萝卜素的方法，该方法不仅不受环境限制，而且还具有制备成本低廉，稳定、高产的特点。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
(一)菌种的选取
本发明使用的菌种选用好食脉孢霉菌株Neurospora sitophila 17号，保藏号为CGMCC No.1836。该菌株是本申请人于1999年3月在中国北方酱类食品发酵中间产物酱块中分离、筛选得到的。
该菌株的形态特征如下：①该菌的分生孢子是串珠似的呈桔黄色。它的子囊有8个孢子，这些孢子的一半产生A类菌丝，另一半B类菌丝，因此，这个菌是一个异宗结合的菌。②它的产囊器是卷曲的，为许多细胞所组成，每个细胞含有几个细胞核。产囊器的基部细胞分枝，将产囊器包围起来成一拟薄壁组织的菌丝团。产囊器的上部细胞延长并分枝成为受精丝，接受异宗的小分生孢子或分生孢子，或与异宗分生孢子的芽管结合。因此，小分生孢子和分生孢子代替了雄器，甚至两种异宗菌丝的结合也能代替性器官的结合。
该菌株的分离步骤：①制备PDA固体培养基，并倒平板；②将从酿造厂发酵车间提取的污染物制成不同浓度稀释菌悬液；③将上述不同浓度的菌悬液采用平板涂布法涂布在PDA平板的培养基表面；④将涂布好的平板倒置于28℃培养箱中恒温培养72小时；⑤将培养后呈桔黄色的孢子挑取进行镜检；⑥确定菌种为单孢子后进行纯种分离，然后进行菌种筛选，得性状稳定菌株；
该菌株的培养：将该项菌株接种在PDA培养基上，培养温度为28℃。①在PDA平板培养基上生长，前期培养24小时，菌落为较疏松的树枝状表面呈白色，菌丝呈毛绒状；生长48小时后，气生菌丝和基内菌丝颜色一致，菌丝体开始断裂有逐渐形成孢子的趋势；72小时后菌丝量生长减少，平皿边缘有大量孢子生成，平板表面呈桔黄色，镜检可清晰看到桔黄色的孢子。②在PDA斜面培养基上，试管底部有大量菌丝，因为该菌为好氧菌，在试管口部则形成堆积的桔黄色孢子环。
(二)采用好食脉孢霉固态发酵生产β-胡萝卜素工艺过程
1、生产菌种：
选用上述的好食脉孢霉菌株Neurospora sitophila 17号为生产菌种，直接使用该菌株就可以满足生产需要，但是，如果将该菌株进行紫外线照射后，β-胡萝卜素的产率会更高一些。紫外线照射方法为：将脉孢霉原菌种孢子浓度1×106/ml的菌悬液距15w紫外灯25cm处照射，照射时间1.5分钟。
2、发酵培养基：
培养基固态物质的组成：豆渣85-92％、麸皮添加量8-15％、培养基含水量77-79％、pH值6.0。在此基础上可添加一种或多种发酵助剂或发酵促进剂，121℃灭菌30分钟。
上述方案中所述的豆渣，指的是用传统方法生产豆腐或豆浆时，离心分离豆浆后剩余的豆腐渣。
发酵助剂可以选用番茄汁、桔皮汁、VB1、VB2中的一种或多种；添加发酵促进剂可以选用span20、吐温80、吐温20中的一种或多种。
3、培养条件：
A、培养方式：固态发酵方式，好氧培养；或全光照固态发酵方式，好氧培养。
B、培养温度：最适培养温度为28-30℃；
C、培养时间：96-120小时
C、pH范围：最适pH值5.8-6.0。
4、产品的提取分离：
好食脉孢霉固体发酵产β-胡萝卜素，其产物存在于孢子中，故提取产物时需进行孢子破壁。破壁方式为热盐酸破壁，采用丙酮提取剂提取β-胡萝卜素，利用旋转蒸发仪进行蒸发浓缩除去有机溶剂，经氧化铝、氧化镁柱层析分离纯化，即配制成所需含量、所需用途的β-胡萝卜素产品。
本发明的主要优点首先是所选的菌株优良：好食脉孢霉(Neurosporasitophila)为可食用的安全菌株，采用该菌发酵生产β-胡萝卜素，具有生长繁殖周期短、营养要求简单、菌体营养丰富并可综合利用等优点，并可通过优化发酵工艺条件提高脉孢菌产孢子量，对提高β-胡萝卜素的产率有很大益处。本发明的另一个优点是成本低：该方法发酵生产β-胡萝卜素是以豆渣为主要发酵底物。豆渣作为大豆制品加工业的副产物其价格低廉，现今豆渣主要用做饲料，利用率低而且污染环境，利用豆渣为原料发酵生产胡萝卜素可达到低成本高效益的目的。本发明还有一个优点就是生产方式易行：采用该菌固态发酵生产β-胡萝卜素，具有工艺简单、投资少、能耗低、原料不需处理可直接生产、发酵过程无需严格的无菌操作，同时减少废水处理工序并对环境污染小。
本发明使用的菌种好食脉孢霉菌株Neurospora sitophila 17号已于2006年10月12日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)提供了保藏，分类命名Neurospora sitophlia，鉴定参据17号，保藏号CGMCC No.1836。
具体实施方式：
实施例1：利用基础培养基进行固态发酵生产β-胡萝卜素的一种方法
豆渣90％、麸皮添加量10％、培养基含水量77-79％，pH值6.0，在121℃灭菌30分钟。
培养基灭菌后冷却至30℃，然后采用6～9×106个/ml孢子菌悬液接种，接种量为9％。放置恒温培养箱28-30℃好氧培养，培养时间96-120小时。发酵结束后收集孢子体并进行热酸破壁，破壁后采用丙酮有机溶剂进行多次分离提取，其β-胡萝卜素菌体产率为708.36μg/g。
实施例2：利用基础培养基中添加发酵助剂-番茄汁进行固态发酵生产β-胡萝卜素的一种方法
基础培养基100g，豆渣85％、麸皮添加量15％、培养基含水量77％中添加2ml/100ml番茄汁，其添加量为7.5ml，pH值6.0，在121℃灭菌30分钟。
培养基灭菌后冷却至30℃，然后采用6～9×106个/ml孢子菌悬液接种，接种量为9％。放置恒温培养箱28-30℃好氧培养，培养时间96-120小时。发酵结束后收集孢子体并进行热酸破壁，破壁后采用丙酮有机溶剂进行多次分离提取，其胡萝卜素菌体的产率为984.13μg/g。
实施例3：利用基础培养基中添加发酵助剂-桔皮汁进行固态发酵生产β-胡萝卜素的一种方法
基础培养基100g，豆渣92％、麸皮添加量8％、培养基含水量77％中添加6g/100ml桔皮汁，其添加量为6.25ml。pH值6.0，在121℃灭菌30分钟。
培养基灭菌后冷却至30℃，采用6～9×106个/ml孢子菌悬液接种，接种量为9％。放置恒温培养箱28-30℃好氧培养，培养时间96-120小时。发酵结束后收集孢子体并进行热酸破壁，破壁后采用丙酮有机溶剂进行多次分离提取，其胡萝卜素菌体的产率为858.21ug/g。
实施例4：利用基础培养基中添加发酵助剂-VB1进行固态发酵生产β-胡萝卜素的一种方法
基础培养基100g，豆渣91％、麸皮添加量9％、培养基含水量77％中添加添20mg/L VB1，其添加量为6ml。pH值6.0，在121℃灭菌30分钟。
培养基灭菌后冷却至30℃，采用6～9×106个/ml孢子菌悬液接种，接种量为9％。放置恒温培养箱28-30℃好氧培养，培养时间96-120小时。发酵结束后收集孢子体并进行热酸破壁，破壁后采用丙酮有机溶剂进行多次分离提取，其胡萝卜素菌体的产率为877.27ug/g。
实施例5：利用基础培养基中添加发酵助剂-VB2进行固态发酵生产β-胡萝卜素的一种方法
基础培养基100g，豆渣88％、麸皮添加量12％、培养基含水量77％中添加添20mg/L VB2，其添加量为10.5ml。pH值6.0，在121℃灭菌30分钟。
培养基灭菌后冷却至30℃，采用6～9×106个/ml孢子菌悬液接种，接种量为9％。放置恒温培养箱28-30℃好氧培养，培养时间96-120小时。发酵结束后收集孢子体并进行热酸破壁，破壁后采用丙酮有机溶剂进行多次分离提取，其胡萝卜素菌体的产率为821.17ug/g。
实施例6：利用基础培养基中添加多种发酵助剂-番茄汁、桔皮汁、VB2、VB1进行固态发酵生产β-胡萝卜素的一种方法
基础培养基100g，豆渣90％、麸皮添加量10％、培养基含水量77％中添加2ml/100ml番茄汁、6g/100ml桔皮汁、20mg/l VB2、20mg/l VB1，其添加量为番茄汁4.75ml、桔皮汁6.25ml、VB2 7ml、VB1 9ml。pH值6.0，在121℃灭菌30分钟。
培养基灭菌后冷却至30℃，采用6～9×106个/ml孢子菌悬液接种，接种量为9％。放置恒温培养箱28-30℃好氧培养，培养时间96-120小时。发酵结束后收集孢子体并进行热酸破壁，破壁后采用丙酮有机溶剂进行多次分离提取，其胡萝卜素菌体的产量为997.14ug/g。
实施例7：利用基础培养基中添加发酵促进剂--span20进行固态发酵生产β-胡萝卜素的一种方法
基础培养基100g，豆渣90％、麸皮添加量10％、培养基含水量77％中添加span20原液为5ml。pH值6.0，在121℃灭菌30分钟。
培养基灭菌后冷却至30℃，采用6～9×106个/ml孢子菌悬液接种，接种量为9％。放置恒温培养箱28-30℃好氧培养，培养时间96-120小时。发酵结束后收集孢子体并进行热酸破壁，破壁后采用丙酮有机溶剂进行多次分离提取，其胡萝卜素菌体的产量842.96ug/g。
实施例8：利用基础培养基中添加发酵促进剂-吐温80进行固态发酵生产β-胡萝卜素的一种方法
基础培养基100g，豆渣90％、麸皮添加量10％、培养基含水量77％中添加吐温80原液为5ml。pH值6.0，在121℃灭菌30分钟。
培养基灭菌后冷却至30℃，采用6～9×106个/ml孢子菌悬液接种，接种量为9％。放置恒温培养箱28-30℃好氧培养，培养时间96-120小时。发酵结束后收集孢子体并进行热酸破壁，破壁后采用丙酮有机溶剂进行多次分离提取，其胡萝卜素菌体的产量698.92ug/g。
实施例9：利用基础培养基中添加发酵促进剂-吐温20进行固态发酵生产β-胡萝卜素的一种方法
基础培养基100g，豆渣90％、麸皮添加量10％、培养基含水量77％中添加吐温20原液为5ml。pH值6.0，在121℃灭菌30分钟。
培养基灭菌后冷却至30℃，采用6～9×106个/ml孢子菌悬液接种，接种量为9％。放置恒温培养箱28-30℃好氧培养，培养时间96-120小时。发酵结束后收集孢子体并进行热酸破壁，破壁后采用丙酮有机溶剂进行多次分离提取，其胡萝卜素菌体的产量673.11ug/g。
本发明采用采用好食脉孢霉固态发酵生产β-胡萝卜素的所用分离纯化及检测方法：
①β-胡萝卜素提取液的分离纯化
分别以氧化铝、氧化镁作为固定相进行柱层析分离纯化，氧化铝层析柱规格Φ17×400mm，填充高度350mm。氧化镁层析柱规格Φ17×300，填充介质满柱。氧化铝、氧化镁分步提纯，丙酮为洗脱剂，上样浓度为2.33mg/ml，上样体积1ml。
②β-胡萝卜素的光谱扫描
使用TU-1901型双光束紫外可见分光光度计，将丙酮做空白将标样β-胡萝卜素(500μg/ml)进行波长(300nm-600nm)扫描，为标准光谱曲线。然后将提纯样进行与标样相同的波长扫描，对照标样图谱得提纯样纯度。
③高效液相色谱法
设定HPLC条件：
柱：ODS C18 3.9＊150mm
检测器：436nm固定波长或可变波长的450nm
流速：0.5mL/min
流动相：90％乙腈；10％甲醇
进样：进样量为10μL，上柱保留时间在2～6min
测定结束后将标样和试样进行比较并计算峰高及峰面积。
Claims (2)
1.一种好食脉孢霉固态发酵生产β-胡萝卜素的方法，其特征是该方法所使用的菌种为好食脉孢霉菌株Neurospora sitophila 17号，保藏号为CGMCC No.1836，该菌株的形态特征如下：一是其分生孢子是串珠似的呈桔黄色，子囊有8个孢子，这些孢子的一半产生A类菌丝，另一半B类菌丝，因此，这个菌是一个异宗结合的菌；二是它的产囊器是卷曲的，为许多细胞所组成，每个细胞含有几个细胞核；产囊器的基部细胞分枝，将产囊器包围起来成一拟薄壁组织的菌丝团；产囊器的上部细胞延长并分枝成为受精丝，接受异宗的小分生孢子或分生孢子，或与异宗分生孢子的芽管结合；因此，小分生孢子和分生孢子代替了雄器，甚至两种异宗菌丝的结合也能代替性器官的结合；所用培养基中固态物质的组成是：豆渣85--92％、麸皮添加量8--15％、培养基含水量77-79％、pH值6.0，121℃灭菌30分钟；所采用的培养条件是固态发酵方式好氧培养，或全光照固态发酵方式好氧培养，最适培养温度为28-30℃；培养时间为96-120小时，最适pH值5.8-6.0；提取产物前先进行孢子破壁，破壁方式为热盐酸破壁，采用丙酮提取剂提取，利用旋转蒸发仪进行蒸发浓缩除去有机溶剂，经氧化铝、氧化镁柱层析分离纯化，即配制成所需含量、所需用途的β-胡萝卜素产品。
2.根据权利要求1所述的一种好食脉孢霉固态发酵生产β-胡萝卜素的方法，其特征是所用菌种在使用前须先经紫外线照射，照射方法是脉孢霉原菌种孢子浓度1×106/ml的菌悬液距15w紫外灯25cm处照射，照射时间1.5分钟。
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