CN113087780B

CN113087780B - 一种荔枝抗病基因LcLTP及编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN113087780B
Application number: CN202110375650.4A
Authority: CN
Inventors: 孔广辉; 冯迪南; 李雯; 刘家琪; 黄伟雄; 司徒俊键; 习平根; 李敏慧; 姜子德
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-04-08
Filing date: 2021-04-08
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2041-04-08
Also published as: CN113087780A

Abstract

本发明公开了一种荔枝抗病基因LcLTP及编码蛋白和应用。本发明中从荔枝中分离得到一个荔枝抗病相关基因LcLTP，该基因全长cDNA为342bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1；该基因编码的蛋白是一个全长由113个氨基酸组成的脂质转移蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明通过转录模式分析和植物表达分析发现，LcLTP基因可提高植物对疫霉菌的抗性，因此，该荔枝抗病基因LcLTP可应用在提高植物抗病性或抗病植物育种方面。

Description

一种荔枝抗病基因LcLTP及编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于分子植物病理学技术领域，特别涉及一种荔枝抗病基因LcLTP及编码蛋白和应用。

背景技术

荔枝属于无患子科、常绿乔木，是我国南方地带重要的热带水果，具有重要经济价值；常分布于中国广东、福建、广西、四川等地，与香蕉、菠萝、龙眼同称为“南国四大果品”。

荔枝霜疫病和炭疽病是荔枝上为害最为严重的两大病害；其中荔枝霜疫病由荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii Chen ex Ko et al)引起，其通常通过孢子囊和游动孢子等侵染寄主。荔枝霜疫病可为害荔枝叶片、花穗、枝条、果实，产生褐色病斑，湿度大时可产生白色霜状霉层。该病造成的枝条、叶片和花穗干枯死亡以及果实腐烂都将影响荔枝的产量。因此荔枝霜疫病的防治十分重要。荔枝霜疫霉生长速度快，遗传转化技术成熟，因此荔枝与荔枝霜疫霉的互作模型提供了一个新的研究植物与病原菌互作体系，而基于荔枝与荔枝霜疫霉互作体系鉴定荔枝抗病基因及其应用则可为植物病害防控提供更多资源。

荔枝和荔枝霜疫霉的基因组测序完成较晚，因此分子生物学研究起步较晚，但是现在已经在短短数年间建立了荔枝霜疫霉与荔枝互作研究的体系，并发现了一些在互作过程中影响病害发生的关键基因。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种荔枝抗病基因LcLTP的编码蛋白。

本发明的另一目的在于提供编码所述荔枝抗病基因LcLTP。

本发明的再一目的在于提供所述荔枝抗病基因LcLTP的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种荔枝抗病基因LcLTP的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述的荔枝抗病基因LcLTP所编码的蛋白，是一个脂质转移蛋白，包括信号肽区域和LTP功能域两部分。

编码所述荔枝抗病基因LcLTP的编码蛋白的荔枝抗病基因LcLTP。

所述的荔枝抗病基因LcLTP的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述的荔枝抗病基因LcLTP在提高植物抗病性方面的应用。

所述的荔枝抗病基因LcLTP在提高植物抗病性方面的应用，为通过过表达荔枝抗病基因LcLTP，提高植物对疫霉菌的抗性。

所述的植物包括荔枝和烟草等。

所述的抗病性为对疫霉菌的抗性。

所述的疫霉菌包括荔枝霜疫霉菌和/或辣椒疫霉菌。

所述的荔枝抗病基因LcLTP在培育抗病植物中的应用。

所述的荔枝抗病基因LcLTP在培育抗病植物中的应用，为通过过表达荔枝抗病基因LcLTP，提高植物的抗性。

所述的植物包括荔枝和烟草等。

所述的抗病性为对疫霉菌的抗性。

所述的疫霉菌包括荔枝霜疫霉菌和/或辣椒疫霉菌。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明中的荔枝抗病相关基因LcLTP是从荔枝中分离的，该基因全长cDNA为342bp，该基因编码的蛋白是一个全长由113个氨基酸组成的脂质转移蛋白，通过转录模式分析和植物表达分析发现，LcLTP可以提高植物对疫霉菌的抗病性，因此，该荔枝抗病基因LcLTP可应用在植物抗病育种合成新的抗病基因等方面，是一个很有应用价值的抗病材料。

(2)本发明通过探究荔枝在免疫应答过程中自身表达的基因情况，发现荔枝抗病相关基因LcLTP在荔枝抗荔枝霜疫霉反应中起着重要作用：荔枝在受到荔枝霜疫霉游动孢子侵染时，荔枝抗性基因LcLTP在荔枝叶片中的表达量增强，增强幅度可达倍；荔枝抗病相关基因LcLTP在荔枝枝条中的表达起伏，其变化证明了其在荔枝抗荔枝霜疫病反应中起重要作用。

(3)本发明将荔枝抗病相关基因LcLTP瞬时表达在烟草中，2天后接种辣椒疫霉，可以观察到LcLTP表达后病斑相对于阴性对照显著减小，且生物统计学分析显示，两个处理的病斑面积具有显著差异。

附图说明

图1是表达LcLTP和GFP对辣椒疫霉侵染烟草的影响图；其中，A为表达LcLTP对辣椒疫霉侵染烟草的影响；B为表达GFP对辣椒疫霉侵染烟草的影响。

图2是辣椒疫霉侵染烟草病斑面积的统计学分析图。

图3是侵染时期LcLTP在叶片中的表达水平图(图中，从左至右分别为侵染0、1.5、3、6、12、24、48小时LcLTP表达量)。

图4是侵染时期LcLTP在枝条中的表达水平图(图中，从左至右分别为侵染0、1.5、3、6、12、24、48小时LcLTP表达量)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

本发明实施例中涉及的荔枝霜疫霉菌(Peronophythora litchii Chen ex Ko etal)和辣椒疫霉菌为常规的疫霉菌，可通过商业途径或自然界分离获得。

本发明实施例中涉及的PVX载体和农杆菌GV3101可通过常规市售获得。

实施例1：LcLTP基因的克隆及获取

(1)通过对荔枝基因组分析预测到了荔枝可能编码LcLTP基因，我们设计了引物(上游引物LcLTP-F和下游引物LcLTP-R)，在荔枝cDNA中成功克隆得到LcLTP基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示：

LcLTP基因(SEQ ID NO:1；碱基组成：80A、87T、109G、66C)：

ATGGGAAGCACCAAGGGAACATCACTAGGTTTTATGGTATTAGTAGTTGTAGCTGTTGTGGGGAAGTGGGAGGTGAAGATGGCTGGTGCAGAACTTAGTGCAGCCCAGTGCAAGGAAGAGAGGAGAATTGGGCTGAATGAGTGCAAGCCAGTGGTGTATGGGAAGCTTCCGTCGCCGTCGTGCTGTGAGCGTGTAAGGGTGAGTCATGTTGAATGTGTGTGCCCTGTCATTACACCTAAGTTGGCTGCTCTTATTGATCTCAACCGTGCCATCCGCCTCATCGAAGGCTGCGGTAGAAGAGTCCCTCGCCACTTCAAGTGTGGAAGTATCACAACTCCTTGA。

LcLTP蛋白(SEQ ID NO:2)：

MGSTKGTSLGFMVLVVVAVVGKWEVKMAGAELSAAQCKEERRIGLNECKPVVYGKLPSPSCCERVRVSHVECVCPVITPKLAALIDLNRAIRLIEGCGRRVPRHFKCGSITTP。

上游引物LcLTP-F：

5’-CAGCTAGCATCGATTCCCATGGGAAGCACCAAGGGAACATCA-3’；

下游引物LcLTP-R：

5’-AATCTCTAGAGGATCCCCAGGAGTTGTGATACTTCCACACTTG-3’。

(2)以荔枝叶片为材料提取总RNA(核糖核酸)(Sangon Biotech试剂盒)然后进一步反转将mRNA转录为cDNA(5*Prime ScriptRT MaterMix扩增试剂)，再利用上述上下游引物经PCR从荔枝cDNA中扩增SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其中，

PCR程序如下：95℃，3min；95℃，15sec；57℃，15sec；72℃，90sec；34个循环；72℃，5min。

(3)对PCR产物进行纯化，扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳分离。将含有目的片段的琼脂糖凝胶切胶后收集在2ml离心管中，使用Omega Gel Extraction Kit试剂盒回收。经测序验证，得到序列SEQ ID NO:1的基因片段。

实施例2：烟草瞬时表达LcLTP

(1)烟草瞬时表达载体构建：

①目的片段与载体连接：将扩增出的LcLTP目的片段用同源重组酶与PVX载体连接(链接位点：SmaI)，获得含SEQ ID NO:1序列的重组质粒；将GFP序列(SEQ ID NO:3)用同源重组酶与PVX载体连接(链接位点：SmaI)，获得含有GFP绿色荧光蛋白的重组质粒PVX::GFP，在大肠杆菌JM109菌株中繁殖后，提取质粒，将重组质粒PVX::GFP和含有SEQ ID NO:1序列的重组质粒转入农杆菌GV3101中。

GFP基因(SEQ ID NO:3)：

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGCGGCCGCGTACCCATACGATGTTCCTGACTATGCCGAGTATCCATATGACGTTCCAGATTACGCTGTCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTGA。

②烟草瞬时表达：将重组质粒PVX::GFP和含有SEQ ID NO:1序列重组质粒的农杆菌单菌落挑至2ml含有卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，28℃180r·min^-1培养1～2天；以含有GFP对照载体的农杆菌为对照。4000r·min^-1离心4min收集菌体，用预冷的MgCl₂轻吹菌体沉淀后4000r·min^-1离心4min，重复三次。用MgCl₂调整菌液OD值为0.4～0.6后分别注射烟草，两种农杆菌各注射半边烟草叶片。

③2天后剪下注射过的烟草叶片，用打孔器打下辣椒疫霉菌饼，菌丝面朝下接种于烟草叶片背面，叶片两边相同位置各接种一块菌饼，放于塑料盒中保湿。

④两天后在紫外光下观察辣椒疫霉侵染病斑大小。结果如图1和图2所示：将荔枝抗病相关基因LcLTP瞬时表达在烟草中，2天后接种辣椒疫霉，可以观察到LcLTP表达后病斑相对于阴性对照显著减小，且生物统计学分析显示，两个处理的病斑面积具有显著差异。

实施例3：游动孢子侵染荔枝叶片及枝条

1、荔枝霜疫霉培养

将实验室保存的荔枝霜疫霉菌株菌丝块接于胡萝卜培养基上，于培养室27℃放置培养一周。

2、游动孢子悬浮液制备

将无菌水倒在荔枝霜疫霉平板上，使用毛刷将荔枝霜疫霉菌丝通过过滤器收集于50ml离心管中，18℃放置2h待其释放游动孢子，当显微观察到孢子囊释放游动孢子后，过滤收集游动孢子悬浮液。

3、侵染实验

采摘荔枝叶片及枝条，用无菌水清洗后分别浸泡于无菌水和游动孢子悬浮液中，以无菌水浸泡为对照，后分别于0、1.5、3、6、12、24、48h收集叶片及枝条样品，经液氮处理后保存于-80℃冰箱中。

4、侵染荔枝叶片及枝条RNA提取

采用Sangon Biotech试剂盒提取荔枝叶片及枝条总RNA。用5*Prime ScriptRTMaterMix扩增试剂合成cDNA。

5、RT-PCR检测LcLTP转录模式

表1荧光定量PCR引物信息

RT-PCR反应程序如下：95℃预变性30s；40个循环；95℃变性30s；60℃退火和延伸30s；40个循环。

循环结束后绘制溶解曲线：60℃～95℃，每1℃收集荧光信号。利用RT-PCR仪做定量RT-PCR分析，侵染后不同时间点LcLTP表达情况分析。

4、结果：

结果如图3和4所示，荔枝叶片在受到荔枝霜疫霉游动孢子侵染时，荔枝抗性基因LcLTP在荔枝叶片中的表达量增强，增强幅度可达倍；荔枝抗病相关基因LcLTP在荔枝枝条中的表达起伏，其变化证明了其在荔枝抗荔枝霜疫病反应中起重要作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种荔枝抗病基因LcLTP及编码蛋白和应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LcLTP基因

<400> 1

atgggaagca ccaagggaac atcactaggt tttatggtat tagtagttgt agctgttgtg 60

gggaagtggg aggtgaagat ggctggtgca gaacttagtg cagcccagtg caaggaagag 120

aggagaattg ggctgaatga gtgcaagcca gtggtgtatg ggaagcttcc gtcgccgtcg 180

tgctgtgagc gtgtaagggt gagtcatgtt gaatgtgtgt gccctgtcat tacacctaag 240

ttggctgctc ttattgatct caaccgtgcc atccgcctca tcgaaggctg cggtagaaga 300

gtccctcgcc acttcaagtg tggaagtatc acaactcctt ga 342

<210> 2

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LcLTP蛋白

<400> 2

Met Gly Ser Thr Lys Gly Thr Ser Leu Gly Phe Met Val Leu Val Val

1 5 10 15

Val Ala Val Val Gly Lys Trp Glu Val Lys Met Ala Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Ser Ala Ala Gln Cys Lys Glu Glu Arg Arg Ile Gly Leu Asn Glu Cys

35 40 45

Lys Pro Val Val Tyr Gly Lys Leu Pro Ser Pro Ser Cys Cys Glu Arg

50 55 60

Val Arg Val Ser His Val Glu Cys Val Cys Pro Val Ile Thr Pro Lys

65 70 75 80

Leu Ala Ala Leu Ile Asp Leu Asn Arg Ala Ile Arg Leu Ile Glu Gly

85 90 95

Cys Gly Arg Arg Val Pro Arg His Phe Lys Cys Gly Ser Ile Thr Thr

100 105 110

Pro

<210> 3

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GFP基因

<400> 3

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaaggcg 720

gccgcgtacc catacgatgt tcctgactat gccgagtatc catatgacgt tccagattac 780

gctgtctacc catacgatgt tccagattac gcttga 816

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LcLTP-F

<400> 4

cagctagcat cgattcccat gggaagcacc aagggaacat ca 42

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LcLTP-R

<400> 5

aatctctaga ggatccccag gagttgtgat acttccacac ttg 43

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LcLTP-RTF

<400> 6

tgtagctgtt gtggggaagt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LcLTP-RTR

<400> 7

cagggcacac acattcaaca 20

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ACTIN-RTF

<400> 8

accgtatgag caaggaaatc actg 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ACTIN-RTR

<400> 9

tcgtcgtact caccctttga aatc 24

Claims

1.一种荔枝抗病基因LcLTP的编码蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.编码权利要求1所述的荔枝抗病基因LcLTP的编码蛋白的荔枝抗病基因LcLTP。

3.根据权利要求2所述的荔枝抗病基因LcLTP，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.权利要求2或3所述的荔枝抗病基因LcLTP在提高植物抗病性方面的应用，其特征在于：通过过表达荔枝抗病基因LcLTP，提高植物对疫霉菌的抗性；

所述的植物为烟草；

所述的疫霉菌为辣椒疫霉菌。

5.权利要求2或3所述的荔枝抗病基因LcLTP在培育抗病植物中的应用，其特征在于：通过过表达荔枝抗病基因LcLTP，提高植物对疫霉菌的抗性；

所述的植物为烟草；

所述的疫霉菌为辣椒疫霉菌。