CN115725545A - 高活性重组热敏型udg突变体及其原核表达载体 - Google Patents

高活性重组热敏型udg突变体及其原核表达载体 Download PDF

Info

Publication number
CN115725545A
CN115725545A CN202211127435.3A CN202211127435A CN115725545A CN 115725545 A CN115725545 A CN 115725545A CN 202211127435 A CN202211127435 A CN 202211127435A CN 115725545 A CN115725545 A CN 115725545A
Authority
CN
China
Prior art keywords
udg
mutant
thermosensitive
prokaryotic expression
udgm
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211127435.3A
Other languages
English (en)
Inventor
宋东亮
邬升杨
韦磊
李婕
刘想
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd
Original Assignee
Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd filed Critical Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd
Publication of CN115725545A publication Critical patent/CN115725545A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2497—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing N- glycosyl compounds (3.2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/02—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2) hydrolysing N-glycosyl compounds (3.2.2)
    • C12Y302/02027—Uracil-DNA glycosylase (3.2.2.27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种高活性重组热敏型UDG突变体，其特征为：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1、2或5中任一条所示。还公开了其原核表达载体。本发明在野生型热敏UDG(psychrophilicmarine bacterium)的基础上进行点突变，突变体能够显著提高UDG的热敏性，提高该酶在体外对含U模板的消化能力。通过在载体在N端融合表达SUMO蛋白，该重组蛋白可在大肠杆菌原核表达系统中进行上清表达后经亲和纯化大量获得。能够对qPCR等反应体系有更高的兼容性。其中效果最佳者为UDGm‑1；UDGm‑2；UDGm‑5。

Description

高活性重组热敏型UDG突变体及其原核表达载体
技术领域
本发明专利涉及一种高活性重组热敏型UDG突变体及其原核表达载体，属于生物技术领域。
背景技术
尿嘧啶DNA糖苷酶(Uracil DNA Glycosylase，UDG)能切断DNA中错误插入的尿嘧啶(U)碱基与糖基之间的N-糖苷键，移去尿嘧啶，留下无碱基位点，该位点可被其他酶(如DNA聚合酶和DNA连接酶)识别和修复。尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)启动DNA中尿嘧啶的修复,能减少由胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)碱基对向腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)碱基对的颠换率，防止和修复DNA中的错配，是生物体减少突变的自我保护机制之一。
另外，UDG也是防止PCR反应中假阳性的工具酶，UDG在体外通过催化水解含有U-DNA位点DNA链的尿嘧啶糖苷键(碱基切除),释放尿嘧啶并产生碱敏感的无嘧啶基位点(AP-DNA),使含dUTP的核酸不能作为模板被扩增，从而防止PCR反应中由于气溶胶等因素形成假阳性，该酶可作用于含尿嘧啶的单链和双链DNA，对双链DNA的活性低于单链DNA。热敏型UDG通常在较低温度下即可失活，比如，在打断核酸链上的dUTP核苷键后，通过50℃孵育即可失活，可与需要后续进行逆转录反应、qPCR及等温扩增反应等检测联用，提高检测的准确性，简化操作步骤。消除由于含U模板污染等问题而造成的假阳性
目前，常用的热敏型UDG主要来源为嗜冷海洋菌(psychrophilic marinebacterium)，但其较难通过大肠杆菌原核表达系统进行上清表达，且其多种性质不能满足多种与后续qPCR等的联用检测场景。主要存在以下缺陷：
1.嗜冷海洋菌来源的野生型UDG热失活温度高于50℃当与LAMP、RT-LAMP及qPCR等检测中使用时，在完成对本底含U模板消化后，无法在后续反应前完全失活，会对后续反转录及qPCR扩增后的含U目的产物进行持续消化，降低检测体系的灵敏性而造成假阴性。使易对后续反应造成抑制。
2.目前的热敏UDG的比活较低，在同等消化能力下，需投入的酶分子量较高，易对后续体系造成影响，如影响Taq酶的扩增效果或逆转录酶的产量。
3.目前热敏UDG无法通过原核表达系统进行上清表达，经变复性后纯化难度较高，且变复性蛋白无法维持其原本的蛋白结构，对其后续蛋白稳定性造成影响，进一步影响检测体系的稳定性及准确性。
这三个缺陷影响防污染qPCR LAMP及RT-LAMP检测的灵敏度、准确性和稳定性，影响了相关技术的普及和发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种高活性重组热敏型UDG突变体，相比野生型UDG，其热失活温度明显降低。
本发明在野生型热敏UDG(psychrophilic marine bacterium)[Molecularcloning,sequencing,and expressing of the heat-labile uracile-DNA Glycosylasefrom a marine psychrophilic bacterium,strain BMTU 3346]基础上分别进行His72Asn；Ser77Ala；Ala134Ser；Lys171His及Asn143Ser的单一位点突变，得到mUDG1～5，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1～5所示。然后在突变后蛋白序列的N端融合SUMO标签，使用大肠杆菌原核表达系统进行上清表达。构建的原核表达载体结构为：pET28a-N6H-SUMO-UDGm，N6H为N端His标签，SUMO为SUMO标签。
N6H-SUMO与UDGm间通过rTEV酶切位点连接，所述rTEV酶切位点的氨基酸序列为Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly(剪切位点在Gln-Gly之间)具体核酸序列为GAAAACCTGTATTTCCAGGGT。
本发明在野生型热敏UDG(psychrophilic marine bacterium)的基础上进行点突变，突变体能够显著提高UDG的热敏性，提高该酶在体外对含U模板的消化能力。通过在载体在N端融合表达SUMO蛋白，该重组蛋白可在大肠杆菌原核表达系统中进行上清表达后经亲和纯化大量获得。能够对qPCR等反应体系有更高的兼容性。其中效果最佳者为mUDG1；mUDG2；mUDG5。
附图说明
图1重组UDG载体构建示意图。
图2mUDGs突变体全U模板消化能力及热稳定性检测。
图3mUDGs突变体纯化效果图。
图4UDG突变体与野生型UDG对全U模板消化能力测试对比。
图5UDG突变体与野生型UDG热稳定性测试。
图6UDG与已有UDG产品在qPCR体系兼容性测试与非UDG体系对照。
图2、3、5中m1代表mUDG1，m2代表mUDG2，m3代表mUDG3，m4代表mUDG4，m5代表mUDG5。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。本实施例使用的引物序列如表1所示。
表1：引物序列
SEQ ID No. 序列名称 5’-3’
1 mUDG1-F TCCGACGCCGGGTAATCC
2 mUDG1-R CAGGCCAATCGGATTACCCG
3 mUDG2-F TCATCCGATTGGCCTGGCCTTTG
4 mUDG2-R TCCACGGCAAAGGCCAGGC
5 mUDG3-F TGCGTGCAGGTGCATCGGC
6 mUDG3-R GCGATGGCTGGCCGATGCAC
7 mUDG4-F GGCAATGATGCACGTTCTATGGCAC
8 mUDG4-R GAACTGGTGCCATAGAACGTGCATC
9 mUDG5-F TATTGAAAGCCCGCATAACAGCC
10 mUDG5-R CGCTCAGTGGGCTGTTATGC
11 UDGsub-F TCTCGTTTCATCGGTATCAT
12 UDGsub-R TCATCAGCGTGGTCGTG
13 hGAPDH-F GAAGGTGAAGGTCGGAGT
14 hGAPDH-R GAAGATGGTGATGGGATTTC
15 hGAPDH-P CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC 5’6-FAM，3’BHQ1
16 hGAPDH-P CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC 5’VIC，3’BHQ1
实施例1：重组热敏UDG突变体粗酶对全U模板及热稳定性检测
在本实施例中，根据热敏UDG的活性位点及DNA结合位点，挑选了一些保守的活性氨基酸位点进行突变，随后，测试热敏UDG突变体酶原液的性能。具体实施方式如下：
1)热敏UDG突变体原核表达菌株的制备
首先在野生型UDG序列N端连接N6H-SUMO序列，并以rTEV识别序列与UDG序列进行连接，N6H-SUMO氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。载体结构为pET28a-N6H-SUMO-UDG。野生型N6H-SUMO-rTEV--UDG的DNA序列如SEQ ID NO：7所示。在野生型的UDG作为突变处设计点突变引物参考点突变试剂盒说明书进行扩增及消化(Yeasen，11003ES10)，并转化到DH5α大肠杆菌感受态中，涂布到含卡那霉素的LB固体平板上37℃倒置培养过夜。
挑取状态良好的单克隆菌落于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm/min,震荡培养将菌液进行一代Sanger测序验证。
将测序验证成功的菌株进行质粒抽提，获得pET-28a-UDG突变体表达质粒，并转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态中，涂布到含卡那霉素的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜。挑去状态良好的单克隆菌落于含有
Figure BDA0003848793090000031
卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm/min,震荡培养至OD600达到0.6。加入终浓度为0.1mM IPTG，16℃过夜震荡诱导。
2)热敏UDG突变体酶原液的纯化
按照1:100的接种密度将含pET-28a-UDG突变体表达质粒的BL21(DE3)大肠杆菌接种至新的含卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡培养3h至OD600值达到0.5，加入终浓度为0.1mM的IPTG，18℃震荡培养18h。4000g 4℃离心收集菌体并称重保存于-80℃。按照菌重：破菌液1:10的比例重悬，在冰上进行超声破碎(超声2s停止4s)，12000g 4℃离心取上清后经Ni纯化后，获得热敏UDG粗酶液。
3)热敏UDG性能测试
将热敏UDG酶原液进行含U产物消化能力测试、热敏性及qPCR体系兼容性进行测试。
全U底物扩增，PCR扩增反应体系如表2所示，反应程序如表3所示，先取2μl产物进行电泳质检，产物大小200bp，单一条带则使用胶回收试剂盒直接纯化。使用纯化后产物进行含U底物消化能力及热敏性测试。
表2全U底物扩增的PCR扩增反应体系
总体系(50μl)
10×Taq buffer(Mg<sup>2+</sup>Free) 5μl
MgCl<sub>2</sub>(25mM) 3μl
pET28a 5ng
UDGsub-F(10μM) 2μl
UDGsub-R(10μM) 2μl
Taq DNA polymerase(5U/ul) 0.4μl
dNTPs(10mM) 0.25μl
dUTP(10mM) 2.75μl
补加ddH2O至 To 50μl
表3全U底物扩增的PCR反应程序
Figure BDA0003848793090000041
表4热敏UDG含U产物消化能力测试体系：
Mix 体积
10×Taq buffer(Mg<sup>2+</sup>Free) 1μl
BSA(1mg/ml) 0.1μl
PCR纯化产物(100ng/μl) 300ng
样品 0.5μl
补加ddH<sub>2</sub>O至 10μl
参照表4所示组分配制测试体系并分别加入测试样品，旋涡震荡混匀后，使用PCR仪37℃孵育12min后94℃热失活10min，将反应后的体系使用1％琼脂糖凝胶电泳检测其对含U模板的消化效果。结果如图2所示，mUDG1、mUDG2、mUDG5能够显著提高UDG的热敏性，这说明His72Asn；Ser77Ala；Asn143Ser这三个点突变能够在保证UDG酶活性的基础上显著提高UDG的热敏性，更佳符合下游应用场景的需求。
实施例2：热敏UDG酶突变体纯化
本实施例公布了mUDG的纯化具体方案
mUDG诱导表达
按照1:100的接种密度将含pet28a-mUDG表达质粒的BL21(DE3)大肠杆菌接种至新的含卡纳霉素的LB培养基中，37℃震荡培养4h至OD达到0.6时加入终浓度0.1mM的IPTG，18℃震荡培养16h，5000X g，4℃离心收集菌体。称取30g菌体加入180ml预冷的裂解缓冲液(20mM Tris-HCl,200mM NaCl,10％Glycerol,0.2mM PMSF)重悬菌体，超声破碎30min(超声2s停止4s)，12000g离心30min后，0.45μm滤膜过滤。将过滤后的上清经Ni-NTA纯化后获得粗酶液，将粗酶液经rTEV酶切后进行Ni-NTA纯化，将洗脱液再经苯基柱纯化后，获得纯度＞95％的酶液，-20℃保存于储存Buffer(20mM Tris，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mMDTT，60％Glycerol，0.1％NP-40,0.1％Tween20)中。产量约18万U，纯化结果如图3所示能够满足大规模生产的需求。
实施例3：UDG突变体与野生型UDG对全U模板的消化性能对比。
在本实施例中，通过对比mUDG与野生型热敏UDG对全U模板的消化能力，即测试在实施例1中热敏性较好的3个UDG突变体mUDG1，mUDG2，mUDG5在相同酶投入量下，测试其对定量全U模板的消化能力，首先参照表3配制反应体系，旋涡震荡混匀后，使用PCR仪37℃孵育12min后94℃热失活10min，将反应后的体系使用1％琼脂糖凝胶电泳检测其对含U模板的消化效果。结果如图4，突变后的UDG的比活力(U/μg)均比野生型UDG有不同程度的提升。
实施例4：UDG突变体与野生型UDG热敏性对比。
在本实施例中，验证了UDG突变体与野生型UDG的热敏性变化，具体实施方式见实施例1。结果如图5所示，mUDG1，mUDG2，mUDG5均比野生型UDG热敏性更高。
实施例5：mUDG与野生型UDG与qPCR反应体系兼容性对比。
在本实施例中，测试了UDG突变体与野生型突变体在FAM通道及VIC通道内检测其与qRT反应的兼容性，使用人源hGAPDH为检测基因，设计qPCR引物及探针，如表1SEQ IDNo.13-16所示，进行qRCR检测，配制反应体系如表5，设置qRT反应程序如表6。前期实验表明，野生型的UDG在qRT反应中会导致CT值有一定的延后，突变后的UDG突变体都能够在一定程度上减少由于UDG引入而带来的CT值延后的情况，其CT值更接近非UDG体系。结果如图6所示。
表5UDG与qPCR反应体系兼容性测试体系
25ul Mix体系 体积
2X buffer(Yeasen，13108) 12
酶mix 4
引物( 1
模板 5
10mM dUTP 0.75
UDG ase 1U/ul 0.5
H<sub>2</sub>O up to 25ul
表6UDG与qPCR反应体系兼容性测试反应程序
温度 时间 循环数
37℃ 10min 1
50℃ 10min 1
95℃ 5min 1
95℃ 10s 45
55℃ 40s(荧光采集) 45

Claims (3)

1.一种高活性重组热敏型UDG突变体，其特征为：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1、2或5中任一条所示。
2.权利要求1所述的高活性重组热敏型UDG突变体的原核表达载体。
3.根据权利要求2所述的原核表达载体，其特征在于：载体采用pET28a质粒，载体结构为pET28a-N6H-SUMO-UDGm，其中N6H为N端His标签，SUMO为SUMO标签，UDGm为高活性重组热敏型UDG突变体的编码DNA。
CN202211127435.3A 2022-03-22 2022-09-16 高活性重组热敏型udg突变体及其原核表达载体 Pending CN115725545A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2022102833809 2022-03-22
CN202210283380.9A CN114934032A (zh) 2022-03-22 2022-03-22 高活性重组热敏型udg突变体及其原核表达载体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115725545A true CN115725545A (zh) 2023-03-03

Family

ID=82862594

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210283380.9A Withdrawn CN114934032A (zh) 2022-03-22 2022-03-22 高活性重组热敏型udg突变体及其原核表达载体
CN202211127435.3A Pending CN115725545A (zh) 2022-03-22 2022-09-16 高活性重组热敏型udg突变体及其原核表达载体

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210283380.9A Withdrawn CN114934032A (zh) 2022-03-22 2022-03-22 高活性重组热敏型udg突变体及其原核表达载体

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN114934032A (zh)

Also Published As

Publication number Publication date
CN114934032A (zh) 2022-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2022037623A1 (zh) SARS-CoV-2病毒核酸等温快速检测试剂盒及检测方法
WO2020056924A1 (zh) 核酸检测方法
EP1224295B1 (en) Method and compositions for improved polynucleotide synthesis
US10787702B2 (en) Thermolabile exonucleases
CN113201578B (zh) 一种新型高温Argonaute蛋白TpsAgo表征及应用
CN113106087B (zh) 一种新型高温Argonaute蛋白的表征及应用
CN111057783A (zh) 基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群及rpoB突变的引物探针组及其应用
WO2023246032A1 (zh) 一锅法单链DNA环化扩增和CRISPR/Cas介导的核酸分子检测方法
CN114561374A (zh) 一种新型嗜热核酸内切酶突变体及其制备方法和应用
CN114592097A (zh) 鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.1和/或BA.3亚系的引物、探针及其应用
WO2023207909A1 (zh) 基于crispr的核酸检测试剂盒及其应用
CN117210437A (zh) 两种基因编辑工具酶鉴定及其在核酸检测中的应用
CN116179511B (zh) Cpf1蛋白在制备用于核酸检测的试剂盒中的应用
WO2023202303A1 (zh) 一种微rna检测方法及试剂盒
CN114807085B (zh) 一种Taq酶突变体及其应用
CN115725545A (zh) 高活性重组热敏型udg突变体及其原核表达载体
WO2023148235A1 (en) Methods of enriching nucleic acids
CN116410955A (zh) 两种新型核酸内切酶及其在核酸检测中的应用
CN107760697A (zh) 用于表达限制性内切酶FspI的甲基化保护菌株的筛选方法
CN112501166A (zh) 一种化学修饰的高稳定性rna及试剂盒和方法
WO2023246033A1 (zh) 一锅法滚环转录和CRISPR/Cas介导的核酸检测方法及试剂盒
US20240117449A1 (en) Detecting Listeria Monocytogenes with Helicase-Dependent Amplification Assay
CN117247919A (zh) 突变型mmlv逆转录酶、编码基因、表达载体、宿主菌及其应用
CN116411049A (zh) 用于核酸恒温扩增反应的酶组合产品及其应用
CN117737212A (zh) 一种恒温单管检测单碱基变异的方法及其检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination