CN117247919A - 突变型mmlv逆转录酶、编码基因、表达载体、宿主菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种突变型MMLV逆转录酶，其在SEQ ID No.1所示的野生型MMLV逆转录酶进行突变以降低其DDDP活性，所述突变型MMLV逆转录酶的DDDP活性在野生型MMLV逆转录酶的DDDP活性的30％以下。还公开了其编码基因、表达载体、宿主菌及应用。本发明通过氨基酸的一个或多个不同位点的突变，能够显著降低甚至完全缺失鼠白血病病毒逆转录酶突变体的依赖DNA的DNA聚合酶活力，不需要额外添加组分来抑制逆转录过程中二链cDNA的合成，正常的逆转录体系即可获得纯度极高的一链cDNA产物，从而在链特异性测序中具有极高的链特异性。
Description
技术领域
本发明专利涉及一种突变型MMLV逆转录酶、编码基因、表达载体、宿主菌及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
逆转录酶(Reverse transcriptase)，是以RNA为模板合成DNA的聚合酶的统称，是科学研究和医学检验分析中常用的工具酶，在现代生物技术领域发挥着重要作用，被广泛应用于转录组分析、病原体检测等各种场景。迄今为止，发现的逆转录酶有数十种，常用的逆转录酶有来自莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MMLV)的逆转录酶、来自人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)1型的逆转录酶和来自禽类白血病病毒(Avian leukemia virus，AMV)的逆转录酶，其中，鼠白血病病毒逆转录酶因其单亚基、逆转录效率较高等优势得到更广泛的应用和更好的商业化。
MMLV逆转录酶在1970年发现，被证实具有依赖RNA模板的DNA聚合酶活性(RNA-dependent DNA polymerase，RDDP)、依赖DNA模板的DNA聚合酶活性(DNA-dependent DNApolemerase，DDDP)、降解RNA-DNA杂合链中RNA的RNase H活性和不依赖模板的末端转移酶活性。根据不同需求，不同应用场景对这几个活性的要求也不一样。比如为了获得更好的稳定性和产物完整度，RNase H活性在大多数应用中都被缺失。DDDP在一些应用中被提高用来获得更高的逆转录效率和更多的产物，比如在低模板逆转录反应中。
而在转录组链特异性测序中，要求准确分析RNA来源于基因组的正义链还是反义链，因此在逆转录过程中，需严格要求只合成一链cDNA以保留RNA的方向性。目前现有的适用于链特异性测序的MMLV逆转录酶产品，通常需要额外添加抑制剂比如放线菌素D来抑制二链cDNA的合成，而这将带来更高的成本和不确定性。在单细胞转录组测序中，细胞中的基因组DNA会对逆转录反应造成干扰，在逆转录产物中引入基因组信息，虽然可以通过使用DNase来消化基因组DNA，但引入的DNase去除又是一个复杂的问题，步骤繁琐且去除不干净会对后续实验造成影响。如果逆转录酶能区分RNA模板和DNA模板，并且只以RNA为模板进行逆转录反应，则可以很好的解决基因组DNA污染的问题。
因此，亟需一种依赖DNA的DNA聚合酶活性极低甚至是缺失的逆转录酶，来弥补当前应用的不足，降低成本与风险。
发明内容
本发明的目的是提供一种突变型MMLV逆转录酶，具有降低甚至是缺失的DDDP活性。
本发明采用的技术方案为：一种突变型MMLV逆转录酶，其在氨基酸序列SEQ IDNo.1所示的野生型MMLV逆转录酶进行突变以降低其DDDP活性，所述突变型MMLV逆转录酶的DDDP活性在野生型MMLV逆转录酶的DDDP活性的30％以下。
优选的，突变型MMLV逆转录酶具有RDDP活性，且RNase H活性缺失。
优选的，所述突变型MMLV逆转录酶还具有以下一个或至少两个特性的提高：热稳定性、灵敏度、在RT-qPCR或RT-LAMP中与其他聚合酶的兼容性。
优选的，突变位点至少包括以下位点中的一个：E7、K120、P141、G178、L217、D224、P297、C310、D361、L362、T382、H438、Q461、E489、A536、E562、Q568、R657，且与野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列一致性在90％以上。更优选的，与野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列一致性在95％以上。更优选的，与野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列一致性在98％以上。在一些实施例中，突变位点至少包括以下位点中的一个：K120、G178、L217、Q461、A536、Q568。
优选的，突变位点还包括以下位点中的至少一个：T24、M39、S56、S60、M66、P100、P111、P127、L139、K152、E176、M177、F199、D200、A259、T287、T306、G308、F309、T330、L333、W388、D449、L452、S453、T458、H459、N479、L491、A502、H503、G504、D524、H594、L603、L604、T605、S606、E607、G608、I611、D615、H634、I661、T662、L671。
优选的，突变位点至少包括以下突变中的一个：E7A或E7G、K120D或K120E、P141L、G178C、L217P、D224G、P297S、C310Y、D361G、L362P、T382A、H438R或H438K、Q461R或Q461K、E489G、A536T、E562G、Q568R或Q568K、R657C，且与野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列一致性在90％以上。
优选的，突变位点还包括以突变下中的至少一个：T24A、M39V、S56A、S60R、M66L、P100A、P111L、P127S、L139P、K152D或K152E、E176S、M177I、F199L、D200N或D200H、A259T、T287A、T306A、G308D、F309S、T330P、L333P、W388R、D449G或D449S、L452C、S453R、T458A、H459R或H459K、N479D、L491P、A502V、H503R或H503K、G504S、D524A、H594K、L603W、L604D或L604N或L604Y、T605I或T605V或T605F、S606F或S606H或S606Y或S606L、E607G、G608S、I611R、D615G、H634Y、I661T、T662A、L671P。
优选的，所述突变型MMLV逆转录酶的突变位点包含以下组合中的至少一个：
(1)L139P/K152E/T382A/G504S/D524A/L604D；
(2)K120E/G308D/D524A/L604Y/T605V/S606H；
(3)K152E/L333P/T382A/G504S/D524A/T662A
(4)K152E/L217P/D361G/T382A/D449G/G504S/D524A
(5)K152E/T287A/C310Y/T382A/G504S/D524A；
(6)K152E/T382A/G504S/D524A；
(7)K152E/T382A/H504K/G504S/D524A/E562G/Q568R；
(8)K152E/T382A/G504S/D524A/E607G/D615G；
(9)T24A/K152E/T382A/D449S/G504S/D524A；
(10)K120E/K152D/T382A/G504S/D524A/H634Y；
(11)P111L/P127S/D524A/L604N/T605I/S606F；
(12)L139P/L452C/S453R/Q461K/D524A/S606Y；
(13)M39V/P100A/D524A/G608S/I611R；
(14)E7A/K152E/D524A/G608S/I611R；
(15)E176S/M177I/G178C/F199L/D524A；
(16)S60R/M66L/K152E/T382A/G504S/D524A；
(17)E7G/P141L/K152E/T306A/T382A/E489G/G504S/D524A；
(18)K120D/K152D/F309S/T382A/G504S/D524A/T605F；
(19)P141L/K152E/D200N/T382A/G504S/D524A/S606L；
(20)K152E/T382A/T458A/H459R/G504S/D524A；
(21)P111L/K152E/T330P/T382A/G504S/D524A/Q568K；
(22)K152D/T382A/H459K/Q461R/N479D/G504S/D524A；
(23)K152E/L362P/T382A/H438K/G504S/D524A；
(24)K152E/T382A/H438R/L491P/G504S/D524A；
(25)S56A/K152E/P297S/T382A/G504S/D524A；
(26)K152D/T382A/H459R/G504S/D524A/R657C/I661T；
(27)K152E/T382A/A502V/H503K/G504S/D524A/A536T；
(28)K152E/T382A/H503R/G504S/D524A/L603W；
(29)K152D/T382A/W388R/G504S/D524A；
(30)K152E/A259T/T382A/G504S/D524A/H594K；
(31)K152D/D200H/D524A/G608S/I611R/L671P；
(32)K152E/D224G/T382A/Q461R/G504S/D524A；
或所述突变型MMLV逆转录酶具有与组合位点突变(1)-(32)的氨基酸序列一致性90％以上的氨基酸序列，且具有与对应组合位点突变的逆转录酶基本相同的DDDP活性。
优选的，上述突变型MMLV逆转录酶还具有与对应组合位点突变的逆转录酶基本相同的RDDP活性。
优选的，上述突变型MMLV逆转录酶还具有与对应组合位点突变的逆转录酶基本相同的RNase H活性。从而使得酶的性能与对应组合位点的酶基本相同。
上述的突变型MMLV逆转录酶的编码基因。
上述的突变型MMLV逆转录酶的表达载体。
优选的，所述表达载体为pET21b(+)。
上述的突变型MMLV逆转录酶的重组细胞。
优选的，所述重组细胞所用的宿主菌为大肠杆菌Rosetta。
上述的突变型MMLV逆转录酶在逆转录反应中的应用。
逆转录反应的应用场景通常包括转录组测序建库、RT-PCR、RT-qPCR或RT-LAMP。
一种逆转录试剂盒，其包含上述的突变型MMLV逆转录酶。
上述的突变型MMLV逆转录酶在转录组测序建库中的应用。优选地，所述转录组测序包括转录组特异性测序、单细胞转录组测序。
一种建库试剂盒，其包含上述的突变型MMLV逆转录酶。本发明提供的建库试剂盒从选用降低甚至完全缺失DDDP的MMLV逆转录酶出发，实现了在逆转录过程中，只能从模板RNA合成一链cDNA，很难以DNA为模板合成互补DNA链。因此在转录组链特异性建库中，逆转录反应产物中几乎没有二链cDNA，极好的保留了RNA的方向性，解决了链特异性测序的技术难点。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过氨基酸的一个或多个不同位点的突变，能够显著降低甚至完全缺失鼠白血病病毒逆转录酶突变体的依赖DNA的DNA聚合酶活力，不需要额外添加组分来抑制逆转录过程中二链cDNA的合成，正常的逆转录体系即可获得纯度极高的一链cDNA产物，从而在转录组测序建库中，比如链特异性测序和单细胞转录组测序等中具有极高的链特异性。
(2)本发明的突变型逆转录酶具有极低的依赖DNA的DNA聚合酶活性，同时具有以下一个或者多个特性的提高：热稳定性、灵敏度、在RT-qPCR或RT-LAMP中与其他聚合酶的兼容性等。
(3)本发明的突变型逆转录酶具有与野生型MMLV逆转录酶基本相当甚至更高的RDDP活性，可用于替代野生型MMLV逆转录酶进行常规的逆转录反应。
附图说明
图1为MMLV逆转录酶突变体的RDDP活力。
图2为MMLV逆转录酶突变体的DDDP活力。
图3为MMLV逆转录酶突变体在转录组测序中的链特异性。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明，但实施例的描述不对本发明的保护范围产生任何限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
下列实施例中所用的物质或仪器，如果未进行特殊说明的话，均可以从常规的商用渠道获取。
在本发明的一些实施例中，所述MMLV逆转录酶突变体包含D524A突变。第524位的天冬氨酸是MMLV逆转录酶RNase H活性的关键氨基酸位点，用丙氨酸或甘氨酸代替后，其RNase H活性被极大降低，同时MMLV逆转录酶的稳定性和持续合成能力被提升。在很多应用中，MMLV逆转录酶的RNase H活性都不被需要，因此在本发明的一些实施例中直接引入D524A突变。本发明人通过广泛而深入的研究，通过理性设计和定向进化手段，最终筛选出了依赖DNA的DNA聚合酶活性极低的突变体。在此基础上，完成了本发明。
实施例1
MMLV逆转录酶突变体的制备。
在野生型MMLV逆转录酶(以下也简称“WT”)的基础上进行人工改造，将编码突变型MMLV逆转录酶的脱氧核苷酸序列(对应的编码野生型MMLV逆转录酶氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID No.2)连接至载体pET21b(+)中获得重组载体，将重组载体转化到表达宿主大肠杆菌Rosetta中，获得重组菌株。培养重组菌株，在16℃下培养20小时诱导MMLV逆转录酶的表达。收集菌体后，进行破碎纯化，即获得MMLV逆转录酶突变体。
本发明中提及的突变型MMLV逆转录酶的突变位点参见表1，所述突变位点均是在SEQ ID No.1的基础上进行突变。
表1突变型MMLV逆转录酶的突变位点
实施例2
RDDP(MMLV逆转录酶突变体依赖RNA的DNA聚合酶活性)检测。
本发明通过测定体积活力和比活力来检测突变型逆转录酶的酶活力。MMLV逆转录酶酶活的定义为：在37℃下10min内将1nmol dNTP转化为多核苷酸所需的酶量定义为1个酶活单位(U)。突变型逆转录酶酶活测定采用焦磷酸定量法，以野生型MMLV逆转录酶为参照。
测定MMLV逆转录酶RDDP活性的原理是以单链mRNA为模板，Oligo dT为引物，经MMLV逆转录酶扩增后，产生DNA的同时伴随着焦磷酸的产生。采用焦磷酸试剂盒对产物进行定量时，产生的荧光值与焦磷酸成正比，即所测得的荧光值与逆转录酶酶活成正比。
焦磷酸检测试剂盒购自AAT Bioquest，MMLV逆转录酶酶活的测试具体实施方式如下：
(1)将MMLV逆转录酶根据蛋白质浓度稀释成若干浓度梯度；
(2)根据表2配制引物退火体系，其中mRNA模板来源于人293T细胞。
表2引物退火体系
| 组分 | 用量 |
| Oligo dT(50μM)(合成) | 1μL |
| dNTPs(10mM each)(YEASEN) | 0.5μL |
| mRNA模板 | 2μg |
| DEPC-H2O(YEASEN) | To 13μL |
在65℃孵育5min，置于冰上静置2min。
根据表3配制逆转录体系。
表3逆转录反应体系
| 组分 | 用量 |
| 上述反应Mix | 13μL |
| 5×RT Buffer | 4μL |
| Murine RNase Inhibitor(YEASEN) | 1μL |
| 逆转录酶 | 2μL |
振荡混匀，在金属浴中37℃反应15min，结束后立即置于冰上终止反应。
焦磷酸检测：在96孔酶标板中加入48μL DEPC水，2μL混匀的酶反应液，50μL焦磷酸工作液，酶标仪震荡混匀后，25℃孵育20min后，用酶标仪测量荧光值，根据荧光值计算突变型逆转录酶活力。突变型MMLV逆转录酶的RDDP活力结果如表4和图1所示。
表4突变型MMLV逆转录酶的RDDP活力检测结果
从表4逆转录酶活力数据和图1可以看出，本发明的突变型MMLV逆转录酶除了极少数比如Mut6和Mut10逆转录酶活力较低，大部分都很好的保留了逆转录酶活力。有些突变体具有比野生型更高的逆转录酶活力，如Mut2、Mut5、Mut7、Mut8、Mut9、Mut11、Mut13、Mut15、Mut23和Mut26，逆转录酶活力最高的Mut8能达到WT的1.8倍。
实施例3
DDDP(MMLV逆转录酶突变体依赖DNA的DNA聚合酶活性)检测。
本发明突变型逆转录酶酶活测定采用焦磷酸定量法，以野生型MMLV逆转录酶为参照。
测定MMLV逆转录酶DDDP活性的原理是以单链环DNA为模板，经MMLV逆转录酶扩增后，产生DNA的同时伴随着焦磷酸的产生。采用焦磷酸试剂盒对产物进行定量时，产生的荧光值与焦磷酸成正比，即所测得的荧光值与DDDP活性成正比。
焦磷酸检测试剂盒购自AAT Bioquest，MMLV逆转录酶DDDP活性的测试具体实施方式如下：
(1)将MMLV逆转录酶根据蛋白质浓度稀释成若干浓度梯度；
(2)根据表5配制引物退火体系。
表5引物退火体系
| 组分 | 用量 |
| 5x RT Buffer | 4μL |
| dNTPs(2.5mM each)(YEASEN) | 2μL |
| PhiX174DNA模板 | 0.5μL |
| Primer(10μM) | 1 |
| DEPC-H2O(YEASEN) | To 18μL |
在95℃孵育30s，置于冰上静置2min。
然后在上述退火反应体系加入待测酶2μL，振荡混匀，在37℃反应2min，结束后立即置于冰上终止反应。
焦磷酸检测方法参考实施例2。
突变型MMLV逆转录酶的DDDP活力结果如表6和图2所示。
表6突变型MMLV逆转录酶的DDDP活力结果
从表6和图2可以看出，本发明的突变型MMLV逆转录酶DDDP活力均能降至野生型的30％及以下，大部分能降至10％及以下，效果好的能降至1％以下比如Mut13、Mut16、Mut17、Mut19，甚至是完全检测不出DDDP活性比如Mut6、Mut11。
实施例4
MMLV逆转录酶突变体在转录组测序中的链特异性。
挑选实施例1的突变体，根据转录组链特异性测序流程，测试突变型MMLV逆转录酶的链特异性，以野生型为对照。转录组链特异性测序建库流程依照翌圣生物有限公司《UltimaDual-modemRNALibraryPrepKit兼容Illumina和MGI双平台以及双模式mRNA建库试剂盒》(Cat#12309)说明书进行，将其中的逆转录酶及放线菌素D替换为表7中的各个酶，进行链特异性测试。
突变型MMLV逆转录酶的测序链特异性结果如表7和图3所示。
表7突变型MMLV逆转录酶的测序链特异性结果
/>
从表7数据和图3可以看出，野生型逆转录酶在不添加放线菌素D的情况下，用于转录组测序的链特异性仅有50.91％，突变型MMLV逆转录酶的转录组测序链特异性显著提高，从野生型的50％提高至97％以上，大部分可以提高至98％以上，效果最好的可以达到98.97％。
综上所述，本发明通过对MMLV逆转录酶野生型的一个或者多个不同位点的氨基酸进行突变，在保留逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶活性的同时，显著降低了甚至是完全缺失了依赖DNA的DNA聚合酶活性。这使转录组测序的链特异性显著提高，可以减少在链特异性建库中二链合成抑制剂的使用，简化了实验流程，降低了实验成本和毒性。同样的，在其他需要排除DNA干扰的逆转录反应中，比如单细胞转录组测序，本发明的突变体也能以更经济、简便的方式达到相同甚至更好的效果。
Claims (15)
1.一种突变型MMLV逆转录酶，其特征在于在氨基酸序列SEQ ID No.1所示的野生型MMLV逆转录酶进行突变以降低其DDDP活性，所述突变型MMLV逆转录酶的DDDP活性在野生型MMLV逆转录酶的DDDP活性的30％以下。
2.根据权利要求1所述的突变型MMLV逆转录酶，其特征在于所述突变型MMLV逆转录酶具有RDDP活性，且RNase H活性缺失。
3.根据权利要求1或2所述的突变型MMLV逆转录酶，其特征在于所述突变型MMLV逆转录酶还具有以下一个或至少两个特性的提高：热稳定性、灵敏度、RT-qPCR或RT-LAMP中与其他聚合酶的兼容性。
4.根据权利要求1所述的突变型MMLV逆转录酶，其特征在于突变位点包括以下位点中的至少一个：E7、K120、P141、G178、L217、D224、P297、C310、D361、L362、T382、H438、Q461、E489、A536、E562、Q568、R657，且与野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列一致性在90％以上。
5.根据权利要求3或4所述的突变型MMLV逆转录酶，其特征在于突变位点包括K120、G178、L217、Q461、A536、Q568中任意一种或至少两种的组合。
6.根据权利要求3或4所述的突变型MMLV逆转录酶，其特征在于突变位点还包括以下位点中的至少一个：T24、M39、S56、S60、M66、P100、P111、P127、L139、K152、E176、M177、F199、D200、A259、T287、T306、G308、F309、T330、L333、W388、D449、L452、S453、T458、H459、N479、L491、A502、H503、G504、D524、H594、L603、L604、T605、S606、E607、G608、I611、D615、H634、I661、T662、L671。
7.根据权利要求3或4所述的突变型MMLV逆转录酶，其特征在于包括以下突变中的至少一个：E7A或E7G、K120D或K120E、P141L、G178C、L217P、D224G、P297S、C310Y、D361G、L362P、T382A、H438R或H438K、Q461R或Q461K、E489G、A536T、E562G、Q568R或Q568K、R657C，且与野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列一致性在90％以上。
8.根据权利要求6所述的突变型MMLV逆转录酶，其特征在于包括以下突变中的至少一个：T24A、M39V、S56A、S60R、M66L、P100A、P111L、P127S、L139P、K152D或K152E、E176S、M177I、F199L、D200N或D200H、A259T、T287A、T306A、G308D、F309S、T330P、L333P、W388R、D449G或D449S、L452C、S453R、T458A、H459R或H459K、N479D、L491P、A502V、H503R或H503K、G504S、D524A、H594K、L603W、L604D或L604N或L604Y、T605I或T605V或T605F、S606F或S606H或S606Y或S606L、E607G、G608S、I611R、D615G、H634Y、I661T、T662A、L671P。
9.根据权利要求1所述的突变型MMLV逆转录酶，其特征在于所述突变型MMLV逆转录酶包括以下组合位点突变中的至少一个：
(1)L139P/K152E/T382A/G504S/D524A/L604D；
(2)K120E/G308D/D524A/L604Y/T605V/S606H；
(3)K152E/L333P/T382A/G504S/D524A/T662A；
(4)K152E/L217P/D361G/T382A/D449G/G504S/D524A；
(5)K152E/T287A/C310Y/T382A/G504S/D524A；
(6)K152E/T382A/G504S/D524A；
(7)K152E/T382A/H504K/G504S/D524A/E562G/Q568R；
(8)K152E/T382A/G504S/D524A/E607G/D615G；
(9)T24A/K152E/T382A/D449S/G504S/D524A；
(10)K120E/K152D/T382A/G504S/D524A/H634Y；
(11)P111L/P127S/D524A/L604N/T605I/S606F；
(12)L139P/L452C/S453R/Q461K/D524A/S606Y；
(13)M39V/P100A/D524A/G608S/I611R；
(14)E7A/K152E/D524A/G608S/I611R；
(15)E176S/M177I/G178C/F199L/D524A；
(16)S60R/M66L/K152E/T382A/G504S/D524A；
(17)E7G/P141L/K152E/T306A/T382A/E489G/G504S/D524A；
(18)K120D/K152D/F309S/T382A/G504S/D524A/T605F；
(19)P141L/K152E/D200N/T382A/G504S/D524A/S606L；
(20)K152E/T382A/T458A/H459R/G504S/D524A；
(21)P111L/K152E/T330P/T382A/G504S/D524A/Q568K；
(22)K152D/T382A/H459K/Q461R/N479D/G504S/D524A；
(23)K152E/L362P/T382A/H438K/G504S/D524A；
(24)K152E/T382A/H438R/L491P/G504S/D524A；
(25)S56A/K152E/P297S/T382A/G504S/D524A；
(26)K152D/T382A/H459R/G504S/D524A/R657C/I661T；
(27)K152E/T382A/A502V/H503K/G504S/D524A/A536T；
(28)K152E/T382A/H503R/G504S/D524A/L603W；
(29)K152D/T382A/W388R/G504S/D524A；
(30)K152E/A259T/T382A/G504S/D524A/H594K；
(31)K152D/D200H/D524A/G608S/I611R/L671P；
(32)K152E/D224G/T382A/Q461R/G504S/D524A；
或所述突变型MMLV逆转录酶具有与组合位点突变(1)-(32)的氨基酸序列一致性90％以上的氨基酸序列，且具有与对应组合位点突变的逆转录酶基本相同的DDDP活性。
10.权利要求1-9中任一项所述的突变型MMLV逆转录酶的编码基因或表达载体。
11.表达权利要求1-9中任一项所述的突变型MMLV逆转录酶的重组细胞。
12.权利要求1-9中任一项所述的突变型MMLV逆转录酶在逆转录反应中的应用。
13.一种逆转录试剂盒，其特征在于包含权利要求1-9中任一项所述的突变型MMLV逆转录酶。
14.权利要求1-9中任一项所述的突变型MMLV逆转录酶在转录组测序建库中的应用。
15.一种建库试剂盒，其特征在于包含权利要求1-9中任一项所述的突变型MMLV逆转录酶。
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2023
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