CN117604162A - 一种利用rpa-rea技术检测基因的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子诊断领域，尤其涉及一种利用RPA‑REA技术检测基因的试剂盒及其应用。本发明所述试剂盒中包括RPA反应物和限制性内切酶，本发明利用RPA反应进行大量扩增，利用限制性内切酶进行最终的判别与鉴定，限制性内切酶将弥补RPA反应特异性不高的缺陷。限制性内切酶添加到RPA体系中，RPA反应与酶切反应同时进行，互不干扰。整个体系依靠RPA反应进行大量扩增；依靠限制性内切酶进行最终的判别与鉴定，得到确实、可信的结果。
Description
技术领域
本发明涉及分子诊断领域，尤其涉及一种利用RPA-REA技术检测基因的试剂盒及其应用。
背景技术
RPA(Recombinase Polymerase Amplification)技术即重组酶核酸酶扩增技术，是一种恒温扩增技术，用于分子诊断领域。由英国TwistDx公司发明并研发出一系列的产品，后被雅培收购。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。RPA技术原理是：重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。该技术的优势是37℃恒温扩增，高效、高灵敏，是目前较为理想的可以作为家庭分子诊断的技术之一。
RPA恒温扩增检测技术最主要的缺点是特异性不好，不能像常规的PCR技术通过精准的控制退火温度来调控其扩增反应的特异性，导致其应用受到很大的限制。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用RPA-REA技术检测基因的试剂盒及其应用。
本发明将RPA和限制性内切酶相结合，RPA负责恒温扩增，限制性内切酶负责特异性的识别核酸位点，提高原有RPA反应体系的特异性。
本发明的RPA-REA技术将限制性内切酶的“特异性”联合了RPA技术，限制性内切酶将弥补RPA反应特异性不高的缺陷。限制性内切酶添加到RPA体系中，RPA反应与酶切反应同时进行，互不干扰。整个体系依靠RPA反应进行大量扩增；依靠限制性内切酶进行最终的判别与鉴定，得到确实、可信的结果。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种利用RPA-REA技术检测基因的试剂盒，所述试剂盒包括RPA反应物和限制性内切酶。
RPA反应体系主要依赖于三种核心酶：重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶。重组酶会与引物结合形成酶-DNA复合物，并在双链DNA中寻找匹配的同源序列。一旦引物定位了同源序列，在重组酶的作用下就会发生链交换反应，被替换的DNA链与单链结合蛋白结合，防止进一步替换，随后DNA聚合酶启动DNA的合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。在这个体系中，三种酶的混合物在25℃-42℃下均有活性，最佳反应温度在37℃。RPA反应由两个引物起始整个合成事件，整个过程进行得非常快，一般可在二十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。
限制性内切酶可以特异性识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。自1968年首次发现限制性内切酶以来，直到今天它们仍然被广泛的应用于基因工程等诸多领域，是现代分子生物学研究中不可或缺的基本工具之一。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述RPA反应物包括重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶。所述试剂盒的反应体系为液体形式或冻干粉形式。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒中还包括RNA酶抑制剂。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒中还包括用于扩增目的基因的上游引物和下游引物。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒用于检测新型冠状病毒N位点，所述限制性内切酶为BsrBI。优选地，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所示下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒用于检测新型冠状病毒ORF1ab位点，所述限制性内切酶为PacI。优选地，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所示下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
本发明同时提供一种利用RPA-REA技术检测基因的方法，所述方法利用RPA反应进行大量扩增，然后利用限制性内切酶进行最终的判别与鉴定。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述RPA反应温度为37～42℃。
本发明的有益效果：
(1)特异性提高，可以检测单核苷酸突变，扩大了RPA的应用范围。
(2)减少假阳性反应，使结果更加可信。
附图说明
图1为RPA-REA检测N位点的多条引物同步反应结果图。
图2为RPA-REA检测新冠病毒N位点结果图。
图3为RPA-REA检测ORF1ab位点的多条引物同步反应结果图。
图4为RPA-REA检测新冠病毒ORF1ab位点的结果图。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
本发明将RPA和限制性内切酶相结合，以提高原有RPA反应体系的特异性，但对不同的检测靶标具体的限制性内切酶种类会各不相同。具体实施方式中只列举了其中几种，并不能因此将本发明的RPA-REA技术限定于只能采用这几种限制性内切酶。
除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法(例如，分子生物学和核酸化学实验方法)。参见例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；和Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)，其全部通过引用合并入本文。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。
本发明的RPA-REA技术检测基因的原理是：
RPA恒温扩增检测技术最主要的缺点是特异性不好，不能像常规的PCR技术通过精准的控制退火温度来调控其扩增反应的特异性。导致其应用受到很大的限制。限制性内切酶是可以特异性的识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。自1968年首次发现限制性内切酶以来，直到今天它们仍然被广泛的应用于基因工程等诸多领域，是现代分子生物学研究中不可或缺的基本工具之一。
RPA-REA技术将限制性内切酶的“特异性”联合了RPA技术，限制性内切酶将弥补RPA反应特异性不高的缺陷。限制性内切酶添加到RPA体系中，RPA反应与酶切反应同时进行，互不干扰。整个体系依靠RPA反应进行大量扩增；依靠限制性内切酶进行最终的判别与鉴定，得到确实、可信结果。
实施例1新冠病毒基因组中N蛋白对应的序列的检测
(1)N基因序列的提取与比对(GenBank：NC_045512.2)中提取N的序列(28274-29533)；
(2)对提取的序列进行限制性内切酶的分析：对比新冠病毒多个突变体的N的序列，选择序列保守区的共有的酶切位点(BsrBI)为检测位点，防止漏检。
(3)设计RPA引物和检测探针：
上游RPA引物：TGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTT
下游RPA引物：GTCTGGTAGCTCTTCGGTAGTAGCCAATTTGGTCAT
探针为：[FAM-dT]TCA[Cy3-dC]CGC[BHQ2-dT]CTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGG
(4)引物的筛选：在上游和下游引物的基础上，优化设计10对引物，经过同等条件的扩增测试，结果如下图1所示，其中第9和第10对引物既有结果而且杂带少，是更优的选择。
表1引物和探针序列
(5)QPCR检测步骤：
①按如下体积配置试剂，并轻轻混匀：
表2试剂组成
| 物质 | 体积 |
| 上游引物(10μm) | 2.4μL |
| 下游引物(10μm) | 2.4μL |
| RPA反应物 | 29.5μL |
| 模板、RNA酶抑制剂和水 | 12.2μL |
| BsrBI | 1uL |
| 总体积 | 47.5μL |
②每个样本中添加2.5μL 280mM的镁离子混匀。
③37℃-42℃反应5min，轻微混匀。继续反应20-40min，检测反应出的荧光信号，判定检测结果。
实施例2：新型冠状病毒ORF1ab位点的检测
(1)ORF1ab基因序列的提取与比对(GenBank：NC_045512.2)中提取ORF1ab的序列(266..13483)。
(2)对提取的序列进行限制性内酶切的分析：
对比新冠病毒多个突变体的N的序列，选择序列保守区的共有的酶切位点(PacI)为检测位点，防止漏检。
(3)设计RPA引物和检测探针：
上游RPA引物：ACAACAAAGATAGCACTTAAGGGTGGTAAAATT
下游RPA引物：ACATGACATGAACAGGTGTTATTAAATAGAAAA
探针为：TAATAATTGGTTGAAGCAGT[FAM-dT]A[A-Cy5]T[BHQ1-dT]AAAGTTACACTTGTGTTCCT
(4)引物的筛选
在上游和下游引物的基础上，优化设计同6对引物，经过同等条件的扩增测试，结果如图3所示，其中1-5对引物都较好，第6对引物没有反应，其中第1对引物的产物最亮，为首选引物对。
表3引物序列
(5)QPCR检测步骤：
①按如下体积配置试剂
至总体积47.5μL，轻轻混匀。
②每个样本中添加2.5μL 280mM的镁离子混匀。
③37℃-42℃反应5min，轻微混匀。继续反应20-40min，检测反应出的荧光信号，判定检测结果。
表4 RPA-REA与RPA检测冠状病毒的特异性比较
由上表结果可以看出，RPA-REA技术的检测特异性要优于单纯的RPA反应，RPA检测其他的新冠病毒会有很多交叉反应，特异性不好。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种利用RPA-REA技术检测基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RPA反应物和限制性内切酶。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA反应物包括重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括RNA酶抑制剂。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括用于扩增目的基因的上游引物和下游引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测新型冠状病毒N位点，所述限制性内切酶为BsrBI。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，所示下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测新型冠状病毒ORF1ab位点，所述限制性内切酶为PacI。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO: 4所示，所示下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
9.一种利用RPA-REA技术检测基因的方法，其特征在于，所述方法利用RPA反应进行大量扩增，然后利用限制性内切酶进行最终的判别与鉴定。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述RPA反应温度为37～42°C。
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