ES2254380T3 - Fragmentos de ns2/3 del vhc y usos de los mismos. - Google Patents
Fragmentos de ns2/3 del vhc y usos de los mismos.Info
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Abstract
Un polipéptido constituido por un fragmento de una proteasa NS2/3 del virus de la hepatitis C (VHC), proteasa que se produce de forma natural como un precursor de la proteasa NS2/3 del VHC, en el que el fragmento tiene como su resto N-terminal un aminoácido que está en una posición del resto 903 al 913 en el precursor de la proteasa NS2/3 del VHC y como su resto del extremo C-terminal un aminoácido que está en una posición del resto 1206 al 1657 en el precursor de la proteasa NS2/3 del VHC, polipéptido que, cuando está en un homodímero, tiene actividad autoproteolítica.
Description
Fragmentos de NS2/3 del VHC y usos de los
mismos.
La presente invención se refiere a ensayos,
procedimientos de selección, polipéptidos, miméticos y
procedimientos de uso basados en un polipéptido derivado de la
proteasa NS2/3 del virus de la hepatitis C (VHC).
El virus de la hepatitis C (VHC) es el principal
agente causal de hepatitis no A, no B (H-NANB)
esporádica y transmitida por vía parenteral. Se cree que
aproximadamente el 1% de la población humana del planeta está
infectada. La infección por el virus puede dar lugar a hepatitis
crónica y cirrosis hepática y puede llevar a un carcinoma
hepatocelular. Actualmente no existe vacuna ni una terapia
establecida, aunque se ha conseguido un éxito parcial en una minoría
de casos mediante el tratamiento con
interferón-\alpha recombinante, solo o en
combinación con ribavirina. Por tanto, existe una necesidad urgente
de agentes terapéuticos nuevos y ampliamente eficaces.
Varias enzimas codificadas por virus son dianas
posibles para una intervención terapéutica, incluyendo una
autoproteasa (NS2-3), una serina proteasa (NS3), una
helicasa (NS3) y una ARN polimerasa dependiente de ARN (NS5B).
El dominio proteasa NS3 se localiza en el extremo
N-terminal de la proteína NS3 y es responsable de
la escisión intramolecular en el sitio NS3/4A y del procesamiento
intermolecular después del extremo 3' en las uniones NS4A/4B,
NS4B/5A y NS5A/5B.
NS3 se forma por la escisión proteolítica de la
molécula precursora NS2/3, que genera el extremo
N-terminal maduro de NS3. Esta reacción está
autocatalizada por la propia molécula precursora NS2/3.
Se cree que la actividad autocatalítica de la
proteasa NS2/3 es esencial para la replicación del VHC (Kolykhalov,
A. y col. (2000) J. Virol. 74 2046-2051) y, por
tanto, representa una diana terapéutica potencialmente importante en
el tratamiento de la infección por VHC.
Se desconoce el mecanismo exacto de la escisión
de NS2/3, pero se sabe que es una reacción intramolecular,
posiblemente cotransduccional, que está catalizada por la actividad
proteolítica de NS2/3 (Wu y col., TIBS 23, 92-94,
1998). Puesto que la actividad se estimula mediante la adición de
iones metálicos tales como Zn o Cd en ensayos de traducción in
vitro, la enzima se ha clasificado provisionalmente como una
metaloproteasa. El estudio del precursor NS2/3 ha sido complicado
debido a su actividad autoproteolítica, su insolubilidad y su
inestabilidad.
Aún no se ha informado de ensayos in vitro
que usen una proteasa NS2/3 purificada. La insolubilidad e
inestabilidad de la proteasa y su actividad autocatalítica han
impedido el desarrollo de estos ensayos.
La actividad proteasa de NS2/3 en sistemas de
traducción libres de células y en células transfectadas ha sido
descrita por Grakoui y col. (1993) PNAS 90,
10583-10587 y Hijikata y col. (1993) J. Virol 67,
4665-4675. Estos grupos encontraron que el sitio de
escisión de la proteasa NS2/3 está entre los restos 1026 y 1027
del polipéptido del VHC y se demostró que la escisión era
dependiente de Zn. Se determinó que la Cys993 y la His952 eran
esenciales para la escisión y también se requerían para la
actividad las secuencias entre los restos 827 y
1186-1207. También se identificó una actividad de
escisión en trans. Todos los estudios realizados por estos grupos
fueron en células o en extractos celulares.
Reed y col. (1995) J. Virol. 69,
4127-4136 informaron de la actividdad de escisión
en trans y la inhibición en trans de la escisión de la proteasa
NS2/3 en sistemas basado en células y también describieron la
secuencia específica de la reacción de escisión.
Pieroni y col. (1997) J. Virol 71,
6373-6380 describieron la producción del precursor
de NS2/NS3 en forma latente en un sistema de traducción libre de
células y también su reactivación mediante la adición de detergente.
Sin embargo, el sistema descrito no implicaba a la enzima
purificada.
La escisión en el sitio NS2/3 requiere tanto el
dominio NS3 de la proteasa (pero no su actividad serina proteasa)
como la proteína NS2 que empieza en el resto 810 del precursor
NS2/3 del VHC. Los primeros \sim100 restos de NS2 son altamente
hidrófobos y pueden asociarse con la membrana del RE en las células
infectadas. Esta porción hidrófoba puede ser responsable de la
escasa solubilidad de la proteína. Se ha demostrado que las
deleciones de la región N-terminal hasta el resto
923 suprime la actividad.
En base al trabajo experimental y a la
descripción de este documento, en diversos aspectos la presente
invención se basa en la obtención de polipéptidos de la proteasa
NS2/3 que se inician en uno de los resto del 903 al 913, es decir
903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, 910, 911, 912 ó 913 y termina en
el resto 1206, resto 1657 ó un resto entre el 1206 y el 1657.
Sorprendentemente, estos polipéptidos truncados
mantienen la actividad autoproteolítica de la proteasa de longitud
completa, pero se pueden purificar en la forma de precursor sin que
sufran autoescisión. Además, ésta es una forma dimérica del
polipéptido que se demuestra que es responsable de la actividad
autoproteolítica. Por tanto, el polipéptido activo es capaz de
dimerizarse para generar la actividad autoproteolítica.
La provisión de una molécula precursora activa
permite en definitiva la provisión de ensayos y procedimientos de
selección de agentes que pueden modular, especialmente inhibir, la
actividad autoproteolítica del precursor NS2/3 y que, por tanto,
tienen potencial terapéutico en el tratamiento del VHC.
Diversos aspectos de la presente invención
proporcionan un polipéptido que tiene actividad autoproteolítica y
que es capaz de expresarse en una forma inactiva sin autoescindirse
y posteriormente, activarse. La forma autoproteolítica del
polipéptido puede ser un homodímero.
La presente invención proporciona un polipéptido
o un fragmento del polipéptido que tiene una unión
N-terminal entre los restos 903 y 913 y una unión
C-terminal en o entre los restos 1206 y 1657. El
polipéptido o fragmento del polipéptido puede, por tanto, estar
truncado en su extremo C-terminal y puede comprender
la secuencia NS3 completa. Preferiblemente, el polipéptido o
fragmento del polipéptido incluye el dominio proteasa completo de
NS3. En realizaciones preferidas, la unión
C-terminal está en el resto 1206.
Las referencias de este documento a la secuencia
poliproteica del VHC y a los restos de ésta se refieren a una o más
de las secuencias poliproteicas del VHC de las bases de datos
siguientes: poliproteína de la cepa J del VHC, Nº de acceso de
Swissprot P26662; poliproteína de la cepa H del VHC, Nº de acceso de
Swissprot: P27958; poliproteína de la cepa H77, Nº de acceso de
Translated-Genbank AAB66324 o Nº de acceso de TREMBL
036579. Sin embargo, también pueden emplearse aislados de otras
cepas y genotipos del VHC de acuerdo con la presente invención.
Los aislados del VHC pueden derivar del VHC de
genotipo 1a, 1b, 1c, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e,
3f, 4a, 4b, 4c, 4d, 5a, 6a, 6b, 7a, 7b, 8a, 8b, 9a, 9b, 9c, 10a u
11a, como se describe en Tokita, M. y col. J. Gen. Virol. (1996)
77, 293-301 y Myakawa, Y. y col. Molecular Med.
Today (1995) 1, 20-25, o derivar del HVC de las
cepas H-FDA, H-AP,
VHC-1, VHC-J,
VHC-BK, HC-J6,
VHC-T, HC-J8 o
VHC-JT descritas en Grakoui y col. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1993) 90, 10583-10587.
La presente invención también proporciona un
polipéptido o un fragmento de polipéptido compuesto esencialmente
por una secuencia de aminoácidos que se inicia en el resto 903, 913
o en un resto localizado entre estos restos y que termina en el
resto 1206, 1657 o en un resto localizado entre estos restos. Por
tanto, el polipéptido o fragmento del polipéptido puede estar
truncado en su extremo C-terminal o puede
comprender la secuencia completa de NS3. Preferiblemente, el
polipéptido o fragmento de polipéptido incluye el dominio completo
de la proteasa NS3.
El polipéptido o fragmento de polipéptido, por
ejemplo, puede tener una unión N-terminal en el
resto 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, 910, 911, 912 ó 913 de la
poliproteína del VHC y una C-terminal en o entre los
restos 1206 y 1657, por ejemplo, resto 1250, 1300, 1350, 1400,
1450, 1500, 1550, 1600 ó 1650.
Un polipéptido puede estar en forma aislada y/o
purificada, libre o sustancialmente libre de material con el que
puede estar asociada, tal como otros polipéptidos, o (por ejemplo,
si se produce mediante expresión en una célula procariótica)
carente de glicosilación nativa, por ejemplo, sin glicosilar.
La presente invención también proporciona
polipéptidos que son variantes, derivados o mutantes de la
secuencia de aminoácidos. Un polipéptido que es una variante,
derivado o mutante puede tener una secuencia de aminoácidos que
difiera de la secuencia correspondiente de la poliproteína del VHC
(por ejemplo, la Nº de acceso de Swissprot: P26662 descrita
anteriormente) mediante una o más adiciones, sustituciones,
deleciones e inserciones de uno o más aminoácidos pero que, en
forma dimérica, tiene una actividad autoproteolítica y puede
expresarse en una forma inactiva y activarse posteriormente.
Las secuencias de aminoácidos pueden estar
compuestas de entre 293 y 754 restos, y se corresponden con la
secuencia de inicio en o entre los restos 903 y 913, extendiéndose
hasta una secuencia en o entre los restos 1206 y 1657 de la
proteasa nativa del VHC. Más preferiblemente, las secuencias pueden
estar compuestas de entre 293 y 303 restos, que se corresponden con
la secuencia de inicio en o entre los restos 903 y 913 y se
extiende hasta el resto 1206 de la proteasa del VHC nativo.
Un polipéptido que es una variante, derivado o
mutante de la secuencia de aminoácidos de la región correspondiente
de la secuencia de la poliproteína del VHC puede comprender una
secuencia de aminoácidos que comparta más de aproximadamente el 60%
de similitud, más de aproximadamente el 70% de similitud, más de
aproximadamente el 80% de similitud, más de aproximadamente el 90%
de similitud, más de aproximadamente el 95% de similitud o sea
sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de la
poliproteína NS2/3 del VHC. Generalmente, la similitud de
aminoácidos se define con respecto al algoritmo GAP (Genetics
Computer Group, Madison, WI) como se ha señalado anteriormente, o
al programa TBLASTN, de Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215:
403-10. La similitud permite la "variación
conservativa", es decir, la sustitución de un resto hidrófobo,
tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la
sustitución de un resto polar por otro, tal como arginina por
lisina, ácido glutámico por ácido aspártico o glutamina por
asparragina. Las variantes de secuencia de aminoácidos en
particular pueden diferir de una secuencia referida en este
documento en la inserción, adición, sustitución o deleción de 1
aminoácido, 2, 3, 4, 5-10, 10-20,
20-30, 30-50,
50-100, 100-150 o más de 150
aminoácidos.
La comparación de secuencia puede hacerse a lo
largo de la longitud completa de las secuencias relevantes
mostradas en ese documento.
Generalmente, como bien se entenderá, la
homología al nivel de aminoácidos es en cuanto a similitud o
identidad de aminoácidos. La similitud permite la "variación
conservativa", es decir, la sustitución de un resto hidrófobo tal
como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la
sustitución de un resto polar por otro, tal como arginina por
lisina, ácido glutámico por ácido aspártico o glutamina por
asparragina. La homología puede tomarse sobre la longitud completa
de una secuencia o sobre una parte, tal como 20, 30, 40, 50, 60,
70, 80, 90, 100, 120, 150, 200 nucleótidos o aminoácidos contiguos.
Cuando se dice que estas dos secuencias de nucleótidos comparten
"homología" o son "homólogos" se hace en base a la
comparación de secuencias. Para esto es irrelevante cualquier
relación filogenética. Los expertos en la materia se refieren de
forma habitual a la homología entre secuencias de nucleótidos sin
implicación del origen evolutivo. También puede decirse que dos
secuencias de nucleótidos homólogas son "similares" o tienen
un cierto porcentaje de similitud o un cierto porcentaje de
identidad.
En general, no es crítico cual de los diversos
algoritmos convencionales se use para determinar el grado de
homología de dos secuencias de nucleótidos con otra. Un algoritmo
preferido puede ser GAP, que usa el procedimiento de alineamiento
de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (1970) 48,
443-453) y está incluido en el Manual de Programas
o el Paquete de Wisconsin, Versión 8, septiembre 1994, (Genetics
Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE.UU.). En
ausencia de instrucciones contrarias, el experto entenderá que se
usen los parámetros por defecto con el objetivo de maximizar el
alineamiento, con una penalización por creación de hueco = 12 y una
penalización por extensión del hueco = 4.
La similitud u homología (los términos se usan
indistintamente) o identidad puede ser como se define y determina
en el programa TBLASTN de Altschul y col. (1990) J. Mol.
Biol. 215: 403-10, o BestFit, que es parte del
Paquete de Wisconsin, Versión 8, septiembre de 1994 (Genetics
Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE.UU.,
Wisconsin 53711). Las comparaciones de secuencia preferiblemente se
hacen usando FASTA y FASTP (véase Pearson y Lipman, 1988, Methods
in Enzymology, 183: 63-98). Los parámetros
preferiblemente se establecen usando la matriz por defecto, como
sigue: Gapopen (penalización para el primer resto en un hueco): -12
para proteínas/-16 para ADN; Gapext (penalización para restos
adicionales en un hueco): -2 para proteínas/-4 para ADN; longitud
de palabra KTUP: 2 para proteínas/6 para ADN.
La homología de la secuencia de ácidos nucleicos
puede determinarse mediante hibridación selectiva entre moléculas
en condiciones rigurosas.
Los experimentos preliminares pueden realizarse
por hibridación en condiciones poco rigurosas. Para la incubación
con una sonda, las condiciones preferidas son aquellas que son
suficientemente rigurosas como para ser un simple patrón con un
pequeño número de hibridaciones identificadas como positivas que
pueden ser investigadas adicionalmente.
Por ejemplo, las hibridaciones pueden realizarse,
según el procedimiento de Sambrook y col. (a continuación) usando
una solución de hibridación que comprende: SSC x 5 (donde > SSC=
= cloruro sódico 0,15 M; citrato sódico 0,15 M; pH 7), reactivo de
Denhardt x 5, SDS al 0,5-1,0%, ADN de esperma de
salmón fragmentado y desnaturalizado a 100 \mug/ml, pirofosfato
sódico al 0,05% y formamida hasta el 50%. La hibridación se realiza
a 37-42ºC durante al menos seis horas. Tras la
hibridación, los filtros se lavan como sigue: (1) 5 minutos a
temperatura ambiente en SSC x 2 y SDS al 1%; (2) 15 minutos a
temperatura ambiente en SSC x 2 y SDS al 0,1%; (3) 30 minutos - 1
hora a 37ºC en SSC x 1 y SDS al 1%; (4) 2 horas a
42-65ºC en SSC x 1 y SDS al 1%, cambiando la
solución cada 30 minutos.
Una fórmula común para calcular las condiciones
rigurosas requeridas para alcanzar la hibridación entre moléculas
de ácido nucleico de una homología de secuencia especificada es
(Sambrook y col., 1989): T_{m} = 81,5ºC + 16,6 Log [Na+] + 0,41
(% G+C) - 0.63 (% de formamida) - 600/ Nº de pb en doble cadena.
Como un ejemplo de la fórmula anterior, usando
[Na^{+}] = [0,368] y formamida al 50%, con el contenido en GC del
42% y un tamaño medio de sonda de 200 bases, la T_{m} es 57ºC. La
T_{m} de un ADN dúplex desciende en 1 -1,5ºC con cada descenso
del 1% de la homología. De este modo, las dianas con más de
aproximadamente el 75% de identidad de secuencias se observarían
usando una temperatura de hibridación de 42ºC. Esta secuencia se
consideraría sustancialmente homóloga a la secuencia del ácido
nucleico de la presente invención.
Es bien conocido en la técnica que aumentando
gradualmente la rigurosidad de la hibridación sólo permanezcan
algunos clones positivos. Otras condiciones adecuadas incluyen, por
ejemplo para la detección de secuencias que son aproximadamente el
80-90% idénticas, la hibridación durante la noche a
42ºC en Na_{2}HPO_{4} 0,25 M, pH 7,2 SDS al 6,5%, sulfato de
dextrano al 10% y un lavado final a 55ºC en SSC x 0,1, SDS al 0,1%.
Para la detección de secuencias que tienen una identidad mayor de
aproximadamente el 90%, las condiciones adecuadas incluyen la
hibridación durante la noche a 65ºC en Na_{2}HPO_{4} 0,25 M,
pH 7,2, SDS al 6,5%, sulfato de dextrano al 10% y un lavado final a
60ºC en SSC x 0,1, SDS al 0,1%.
El experto puede usar las técnicas descritas en
este documento y otras bien conocidas en la técnica para producir
grandes cantidades de polipéptido, por ejemplo, mediante la
expresión a partir del ácido nucleico codificador.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia
de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia
de aminoácidos como se describe anteriormente.
La secuencia codificadora puede ser la del gen
NS2/3 del VHC (cepa J del VHC, Nº de acceso de Genbank D90208; cepa
H del VHC, Nº de acceso de Genbank M67463; cepa H77 del VHC, Nº de
acceso de Genbank AF009606) o puede ser un mutante, variante o
derivado de esta secuencia. La secuencia puede diferir de la
secuencia de nucleótidos de NS2/3 del VHC mediante un cambio que es
una o más adiciones, inserciones, deleciones y sustituciones de uno
o más nucleótidos de la secuencia. Los cambios en una secuencia de
nucleótidos pueden dar lugar a un cambio de aminoácidos a nivel de
la proteína, o no, según determine el código genético.
De este modo, el ácido nucleico según la presente
invención puede incluir una secuencia diferente de la secuencia del
ácido nucleido de NS2/3 del VHC que aún codifica un polipéptido con
la misma secuencia de aminoácidos.
Generalmente, se proporciona un ácido nucleico
según la presente invención como un aislado, en forma aislada y/o
purificada o libre o sustancialmente libre de material con el que
se asocia de forma natural, tal como libre o sustancialmente libre
del ácido nucleico que flanquea el gen en el genoma viral, excepto
posiblemente una o más secuencias reguladoras para la expresión. El
ácido nucleico puede ser completa o parcialmente sintético y puede
incluir ADN genómico, ADNc o ARN. La secuencia codificadora
mostrada en este documento en una secuencia de ADN. Cuando el ácido
nucleico según la invención incluye ARN, debería interpretarse que
la referencia a la secuencia mostrada abarca la referencia al ARN
equivalente con la T sustituida por U.
El ácido nucleico puede proporcionarse como parte
de un vector que se puede replicar y la presente invención también
proporciona un vector que incluye un ácido nucleico como se expone
anteriormente, en particular cualquier vector de expresión a partir
del cual puede expresarse el polipéptido codificado en las
condiciones apropiadas, y una célula hospedadora que contiene
cualquiera de estos vectores o ácidos nucleicos. En este contexto,
un vector de expresión es una molécula de ácido nucleico que
incluye un ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés y
secuencias reguladoras apropiadas para la expresión del
polipéptido, en un sistema de expresión in vitro, por
ejemplo, lisado de reticulocitos, o in vivo, por ejemplo, en
células eucarióticas tales como células COS o CHO, o en células
procarióticos tales como E. coli. Las células que comprenden
los vectores como se describe anteriormente son un aspecto
adicional de la presente invención.
Generalmente, se proporciona un ácido nucleico
según la presente invención como un aislado, en forma aislada y/o
purificada, o libre o sustancialmente libre de material con el que
se asocia de forma natural, tal como libre o sustancialmente libre
del ácido nucleico que flanquea el gen en el genoma (por ejemplo,
viral), excepto posiblemente una o más secuencias reguladoras para
la expresión. El ácido nucleico puede ser completa o parcialmente
sintético y puede incluir ADN genómico, ADNc o ARN.
Los expertos pueden preparar fácilmente
secuencias de ácido nucleico que codifiquen los polipéptidos de la
presente invención usando la información y las referencias
contenidas en este documento y las técnicas conocidas en la materia
(por ejemplo, véase Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, y
Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley
& Sons, 1992). Estas técnicas incluyen (i) el uso de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar muestras
de este ácido nucleico, por ejemplo a partir de fuentes genómicas,
(ii) síntesis química o (iii) preparación de secuencias de ADNc.
Puede generarse ADN que codifique los polipéptidos y usarse en
cualquier forma adecuada conocida por los expertos en la materia,
incluyendo tomar el ADN codificador, identificar los sitios de
reconocimiento de enzimas de restricción adecuados en cualquier
lado de la porción que se va a expresar y cortar dicha porción del
ADN. A continuación, la porción puede unirse de forma operativa a
un promotor adecuado en un sistema de expresión convencional
disponible en el mercado. Otra aproximación recombinante es
amplificar la porción relevante del ADN con cebadores para PCR
adecuados.
Las modificaciones de una secuencia de ácido
nucleico pueden hacerse, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida a
sitio que lleva a la producción de un polipéptido modificado, por
ejemplo, teniendo en cuenta el codon de preferencia en las células
hospedadoras usadas para expresar el ácido nucleico.
Para obtener la expresión de las secuencias de
ácido nucleico de la invención, las secuencias pueden incorporarse
a un vector que tenga una o más secuencias control unidas de forma
operativa al ácido nucleico para controlar su expresión. Los
vectores pueden elegirse o construirse. Pueden contener secuencias
reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, fragmentos
de terminación, secuencias de poliadenilación, secuencias
potenciadotas, genes marcadores y otras secuencias según sea
apropiado, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico de modo que el
polipéptido o péptido se produce como una fusión y/o ácido nucleico
que codifica señales de secreción, de modo que el polipéptido
producido en la célula hospedadora se secreta a partir de la
célula. Los vectores puede ser plasmídicos, virales, por ejemplo,
fago o fagémido, según sea apropiado. Para detalles adicionales
véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2ª
edición, Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory
Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación
de ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de construcciones
de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN
en células y expresión génica y análisis de proteínas, se describen
en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col.
eds., John Wiley & Sons, 1992.
A continuación, el polipéptido puede obtenerse
transformando los vectores en células hospedadoras en las que el
vector es funcional, cultivando las células hospedadoras de modo
que se produzca el polipéptido y recuperando el polipéptido de las
células hospedadoras o del medio circundante.
Un aspecto adicional de la presente invención
proporciona una célula hospedadora que contiene un ácido nucleico
heterólogo como se describe en este documento.
Son bien conocidos los sistemas para clonar y
expresar polipéptido en una diversidad de células hospedadoras
diferentes. Las células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias,
células eucarióticas, tales como de mamíferos y levaduras y
sistemas de baculovirus. Las líneas celulares de mamífero
disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido
heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino, células
HeLa, células de riñón de cría de hámster, células COS y muchas
otras. Una bacteria hospedadora común preferida es E.
coli.
El ácido nucleico de la invención puede
integrarse en el genoma (por ejemplo, el cromosoma) de la célula
hospedadora. La integración puede promoverse mediante la inclusión
de secuencias que promuevan la recombinación con el genoma, según
técnicas convencionales. El ácido nucleico puede estar en un vector
extracromosómico dentro de la célula o de cualquier otra forma
identificable como heterólogo o extraño para la célula.
Un aspecto adicional proporciona un procedimiento
que incluye introducir una molécula de ácido nucleico de la
invención en una célula hospedadora. La introducción, que
generalmente puede (especialmente para la introducción in
vitro) denominarse sin limitación como "transformación",
puede emplear cualquier técnica disponible. Para las células
eucarióticas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección
con fosfato cálcico, DEAE-Dextrano,
electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción
usando retrovirus u otros virus, por ejemplo, vaccinia o, para
células de insectos, baculovirus. Para células bacterianas, las
técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro
cálcico, electroporación y transfección usando bacteriófago. Como
alternativa, podría emplearse la inyección directa del ácido
nucleico.
Pueden usarse genes marcadores, tales como genes
de resistencia o sensibilidad a antibióticos, en la identificación
de clones que contienen el ácido nucleico de interés, como es bien
conocido en la técnica.
La introducción puede seguirse provocando o
permitiendo la expresión a partir del ácido nucleico, por ejemplo,
cultivando células hospedadoras (que realmente pueden incluir
células transformadas aunque más probablemente las células serán
descendientes de las células transformadas) en condiciones para la
expresión del gen, de modo que se produzca el polipéptido
codificado. Si el polipéptido se expresa unido a un péptido líder
señal apropiado, éste puede secretarse de la célula al medio de
cultivo. Tras la producción mediante expresión, puede aislarse y/o
purificarse un polipéptido a partir de la célula hospedadora y/o
del medio de cultivo, según sea el caso, y posteriormente, usarse
como se desee, por ejemplo, en la formulación de una composición
que puede incluir uno o más componentes adicionales, tal como una
composición farmacéutica que incluye uno o más excipientes,
vehículos o transportadores farmacéuticamente aceptables (por
ejemplo, véase a continuación).
En vista de lo anterior, la presente invención
también proporciona un procedimiento para hacer un polipéptido
truncado de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención,
incluyendo el procedimiento la expresión a partir de un ácido
nucleico que codifica el polipéptido. Esto puede conseguirse
convenientemente cultivando una célula hospedadora que contenga el
ácido nucleico en cultivo en las condiciones apropiadas que causen
o permitan la expresión del polipéptido de la proteasa NS2/3 del
VHC, mientras que se minimiza la autoproteolisis. Las condiciones
preferidas incluyen un medio carente o bajo en Zn. Este impide el
plegamiento de la porción NS3 de la molécula precursora, impidiendo
así el autoprocesamiento y llevando a la formación de una proteína
insoluble que se acumula en cuerpos de inclusión.
Los procedimientos para la purificación de
proteínas insolubles expresadas en cuerpos de inclusión son bien
conocidos por los expertos en la materia. Convenientemente, se
emplea la filtración en gel en condiciones de desnaturalización
seguida de cromatografía en fase inversa.
La proteína desnaturalizada purificada puede
renaturalizarse tras la purificación mediante el ajuste de las
condiciones que permiten el replegamiento. Preferiblemente, esto se
consigue en un tampón de replegamiento en el que se reduce la
concentración del agente caotrópico (guanidina) mediante diálisis
hasta una concentración residual de 0,75 M, la fuerza iónica es
mayor de 200 mM de NaCl y la concentración de proteína es menos de
100 \mug/ml. La proteína soluble replegada se puede medir mediante
análisis del sobrenadante tras la ultracentrifugación de la muestra
replegada.
La proteína soluble replegada puede activarse
alterando las condiciones del tampón. Un tampón adecuado para la
activación de la proteasa puede incluir los siguientes
componentes:
Fuerza iónica equivalente a al menos 50 mM,
preferiblemente a al menos 100 mM o al menos 150 mM de NaCl, por
ejemplo, 200 mM, 250 mM o 300 mM de NaCl;
glicerol al 10-60%,
preferiblemente glicerol al 20-50%, por ejemplo,
glicerol al 30%, 40% o 50%;
CHAPS al 0,5%-3%, preferiblemente CHAPS al
1-2%, por ejemplo CHAPS al 1%, 1,5% o 2%;
pH 6,5-8,5, preferiblemente pH
7-8, por ejemplo pH 7, 7,5 u 8;
agente reductor 1-100 mM (por
ejemplo, cisteína o DTT), preferiblemente agente reductor
1-10 mM, por ejemplo, 1 mM, 3 mM, 5 mM o 10 mM de
agente reductor;
Zn^{++} 1-100 \muM,
preferiblemente Zn^{++} 5-50 \muM, por ejemplo
Zn^{++} 30 \muM, 40 \muM o 50 \muM.
Un procedimiento de activación es reducir la
concentración de proteína a 2,5 \mug/ml o menos en un tampón que
contiene TRIS 50 mM, pH 7,5, glicerol al 50%, CHAPS al 2%, NaCl 250
mM, DTT 3 mM, Zn^{++} 30 \muM (véase el Ejemplo 7).
Diversos aspectos de la presente invención
proporcionan ensayos y procedimientos para la selección y/u
obtención/identificación de una sustancia que modula, por ejemplo,
inhibe, reduce o interfiere con la actividad de la proteasa NS2/3
del VHC y para el uso de los polipéptidos de la proteasa NS2/3 del
VHC de la presente invención en estos procedimientos y ensayos de
selección. La actividad de la proteasa puede modularse mediante la
promoción o inhibición de la dimerización.
Un procedimiento de selección o ensayo para
identificar un agente que pueda modular la actividad de la proteasa
NS2/3 del VHC puede incluir:
(a) poner en contacto un agente de ensayo con un
polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención;
y
(b) determinar la actividad de la proteasa NS2/3
del VHC.
El polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC, que
se pone en contacto con el agente de ensayo, puede estar en la
forma monomérica o en la dimérica. Cuando el polipéptido es
monomérico, el agente de ensayo puede modular la formación de la
forma dimérica, la actividad proteolítica del dímero o ambas. Cuando
el polipéptido es dimérico, el agente de ensayo puede modular la
formación de la forma monomérica, la actividad proteolítica del
dímero o ambas.
La modulación de la formación de la forma
dimérica o monomérica puede conseguirse influenciando sobre el
equilibrio dinámico entre las dos formas.
Adicionalmente, un procedimiento de selección o
ensayo puede incluir la etapa de activación de la proteasa NS2/3
del VHC. Esta activación puede conseguirse cambiando las
condiciones del tampón.
Los polipéptidos de la proteasa NS2/3 del VHC de
la presente invención pueden formar homodímeros, de modo que un
agente que afecta a la dimerización del polipéptido puede modular
la actividad autoproteolítica.
La actividad de un polipéptido de la proteasa
NS2/3 del VHC de la presente invención puede determinarse evaluando
la proporción del polipéptido en la forma dimérica activa.
Por lo tanto, un procedimiento de selección o
ensayo para identificar un agente que pueda modular la actividad de
la proteasa NS2/3 del VHC puede incluir:
(a) poner en contacto un agente de ensayo con un
polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención;
y
(b) determinar la dimerización del polipéptido de
la proteasa NS2/3 del VHC.
La dimerización puede determinarse mediante
procedimientos convencionales bien conocidos para un experto, por
ejemplo, mediante el uso de cromatografía de filtración en gel,
anticuerpos o la dependencia de las cinéticas de escisión sobre la
concentración de proteína.
Un aspecto relacionado de la presente invención
proporciona el uso de un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC
de la presente invención para determinar la presencia en una
muestra de ensayo de un agente que tiene la capacidad de modular la
actividad de la proteasa NS2/3 del HVC nativa.
Un procedimiento para determinar la presencia en
una muestra de ensayo de un agente que tiene la capacidad para
modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC puede
incluir:
(a) poner en contacto un polipéptido de la
proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención con el agente de
ensayo; y
(b) determinar la actividad del polipéptido de la
proteasa NS2/3 del VHC.
Adicionalmente, el procedimiento puede incluir la
etapa de activación del polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC.
Esta activación puede conseguirse cambiando las condiciones del
tampón.
La activación del polipéptido puede comprender la
promoción de la formación de homodímeros del polipéptido.
Un agente que puede modular la actividad de la
proteasa NS2/3 del VHC puede afectar a la formación de la forma
dimérica activa.
Un procedimiento para determinar la presencia en
una muestra de ensayo de un agente que tiene la capacidad de
modular la dimerización de la proteasa NS2/3 del VHC puede
incluir:
(a) poner en contacto un polipéptido de la
proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención con el agente de
ensayo; y
(b) determinar la actividad proteasa de NS2/3 del
VHC.
La actividad en presencia de una sustancia de
ensayo puede compararse con la actividad del polipéptido de la
proteasa NS2/3 del VHC en medios y condiciones de reacción
comparables, en ausencia de la sustancia de ensayo. De ese modo
puede identificarse una sustancia de ensayo capaz de modular la
actividad. Una diferencia en la actividad del polipéptido de la
proteasa NS2/3 del VHC entre las condiciones tratada y no tratada es
indicativa de un efecto modulador de la sustancia o sustancias de
ensayo relevantes. La actividad puede relacionarse con el grado de
dimerización del polipéptido.
La sustancia de ensayo relevante puede alcanzar
un efecto modulador afectando (es decir, reduciendo o aumentando)
la dimerización de un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de
la presente invención. La presencia de un efecto modulador puede
determinarse evaluando la dimerización del polipéptido de la
proteasa NS2/3 del VHC.
Un procedimiento para determinar la presencia en
una muestra de ensayo de un agente que tiene la capacidad de
modular la dimerización de la proteasa NS2/3 del VHC puede
incluir:
(a) poner en contacto un polipéptido de la
proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención con el agente de
ensayo; y
(b) determinar la dimerización del polipéptido de
la proteasa NS2/3 del VHC.
La actividad puede determinarse mediante
cualquier procedimiento adecuado. Los ejemplos de estos
procedimientos incluyen una aproximación basada en HPLC en la que
una enzima activada se incuba durante un tiempo fijo y se separa el
precursor sin escindir de los productos en una columna de HPLC,
relacionándose la cantidad de producto medida mediante
fluorescencia con la actividad. Otra aproximación implica separar
el producto NS3 escindido del precursor NS2/3 y del producto NS2
mediante etiquetas 5' y cuantificar la cantidad de NS3 mediante un
ensayo convencional fluorimétrico o radiométrico.
Un procedimiento para determinar la presencia en
una muestra de ensayo de un agente que tiene la capacidad de
modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC, puede incluir
cuantificar la actividad de un polipéptido de la proteasa NS2/3 del
VHC de la presente invención y/o la cantidad de dicho agente en la
muestre y/o la cantidad de dimerización del polipéptido de la
proteasa NS2/3 del VHC.
En el caso apropiado, pueden incluirse uno o más
controles en los ensayos y procedimientos descritos en este
documento. Un experto podría fácilmente emplear los controles
adecuados.
Los agentes que modulan, por ejemplo, aumentan o
potencian la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC, pueden
identificarse usando condiciones que, en ausencia de un agente
positivo en el ensayo, destruye o reduce la actividad.
Los procedimientos para determinar la presencia,
y opcionalmente cuantificar su cantidad, de un agente en una
muestra de ensayo que tiene la capacidad de modular la actividad de
la proteasa NS2/3 del VHC pueden tener fines diagnósticos, por
ejemplo, en la evaluación de una terapia para tratar una afección
asociada con la infección por el VHC.
Un procedimiento de selección o ensayo puede
incluir purificar y/o aislar una sustancia de ensayo (por ejemplo,
un agente del que se va a ensayar la capacidad para modular la
actividad de la proteasa NS2/3 del VHC) a partir de una mezcla o
extracto, es decir, reducir el contenido de al menos un componente
de la mezcla y del extracto, por ejemplo, un componente con el que
la sustancia ensayado se asocia de forma natural. El procedimiento
de selección o ensayo puede incluir determinar la capacidad de una
o más fracciones de una mezcla o extracto de ensayo para modular la
actividad de la proteasa NS2/3 del VHC. La purificación y/o
aislamiento puede emplear cualquier procedimiento conocido por los
expertos en la materia.
Los expertos en la materia pueden variar el
formato preciso de cualquiera de los procedimientos de selección o
ensayo de la presente invención usando técnicas y conocimientos
habituales. El experto conoce bien la necesidad de emplear
experimentos de control apropiados.
En cualquier procedimiento de ensayo según la
invención, la cantidad de sustancia o compuesto de ensayo que puede
añadirse a un ensayo de la invención normalmente se determinará
mediante ensayo y error dependiendo del tipo de compuesto usado.
Típicamente, pueden usarse concentraciones de aproximadamente 0,001
nM a 1 mM o concentraciones mayores del posible compuesto
modulador/inhibidor, por ejemplo, de 0,01 nM a 100 \muM, por
ejemplo, de 0,1 a 50 \muM, tales como aproximadamente 10 \muM.
Pueden usarse concentraciones mayores cuando la sustancia de ensayo
es un péptido. Incluso una molécula que tiene un efecto débil puede
ser un compuesto cabeza de serie útil para investigación y
desarrollo adicional.
Puede aislarse y/o purificarse y/o investigarse
de forma adicional y/o producirse un compuesto o agente
identificado por cualquiera de los procedimientos proporcionados
por la presente invención. En otra parte de este documento se
describen diversos procedimientos y usos de estos compuestos. De
este modo, la presente invención proporciona procedimientos de
identificación de agentes que tienen la capacidad de modular la
actividad de la proteasa NS2/3 del VHC.
Un agente o sustancia empleada en un
procedimiento según la presente invención puede ser un compuesto
químico natural o sintético y puede ser una molécula orgánica,
inorgánica, péptido, ácido nucleico u otras. Los compuestos
adecuados que puede seleccionarse incluyen compuestos químicos
naturales o sintéticos usados en programas de selección de
fármacos. También pueden usarse extractos de plantas, microbios u
otros organismos que contienen diversos componentes caracterizados
o sin caracterizar.
Es digno de mencionar que la tecnología de
bibliotecas combinatorias proporciona una manera eficaz de probar
la capacidad de un número potencialmente extenso de sustancias
diferentes para modular una interacción. Estas bibliotecas y sus
usos son conocidos en la técnica para todas las formas de productos
naturales, pequeñas moléculas y péptidos, entre otros. En ciertas
circunstancias, puede preferirse el uso de bibliotecas
peptídicas.
Una clase de probables moduladores comprende
fragmentos peptídicos derivados de polipéptidos de la proteasa
NS2/3 del VHC de la presente invención, o alelos, mutantes o
derivados de estos fragmentos. Puede probarse la capacidad para
inhibir la autoproteolisis de fragmentos peptídicos de 5 a 40
aminoácidos, por ejemplo de 6 a 10 aminoácidos a partir de las
regiones del polipéptido donde tiene lugar la escisión o que son
responsables de la actividad.
Otros péptidos adecuados son los que modulan la
actividad de un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la
presente invención y que tienen una longitud de
50-55, 55-60, 60-65,
65-70, 70-75, 75-80,
80-85, 85-90, 90-95,
95-100 o más de 100 aminoácidos.
Otros péptidos adecuados son los que inhiben la
dimerización de un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la
presente invención y que tienen una longitud de
50-55, 55-60, 60-65,
65-70, 70-75, 75-80,
80-85, 85-90, 90-95,
95-100 o más de 100 aminoácidos.
El ácido nucleico que codifica estos fragmentos,
vectores y células hospedadoras que contienen estos ácidos
nucleicos y procedimientos de expresión del ácido nucleico que
codifica estos fragmentos son aspectos adicionales de la presente
invención.
Otros compuestos candidatos inhibidores pueden
basarse en el modelado de la estructura tridimensional del
polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC y el uso racional del
diseño de fármacos para proporcionar compuesto potenciales
inhibidores con características particulares de la forma molecular,
tamaño y carga.
Tras la identificación de una sustancia que
modula o afecta a la actividad proteasa, la sustancia puede
investigarse más en profundidad. Además, puede fabricarse y/o
usarse en la preparación, es decir, fabricación o formulación, de
una composición tal como un medicamento, composición farmacéutica o
fármaco. Éstas pueden administrarse a individuos.
En diversos aspectos, la presente invención
proporciona un modulador identificado mediante un procedimiento de
selección de la invención, por ejemplo, una sustancia que inhibe o
disminuye, aumenta o potencia la actividad de la proteasa NS2/3
del VHC.
Tras la identificación, el modulador puede
purificarse y/o investigarse más en profundidad y/o fabricarse.
Puede usarse un modulador para obtener miméticos peptídicos o no
peptídicos, por ejemplo, mediante procedimientos bien conocidos por
los expertos en la materia y descritos en este documento. Puede
usarse en un contexto terapéutico como se describe a
continuación.
Los anticuerpos dirigidos frente a un polipéptido
de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención forman una
clase adicional de probables compuestos inhibidores. Los
anticuerpos inhibidores candidatos pueden caracterizarse y puede
determinarse sus regiones de unión para proporcionar anticuerpos de
cadena única y fragmentos de los mismos que sean responsables de
afectar a la actividad proteasa.
Los anticuerpos pueden obtenerse usando técnicas
que son convencionales en la materia. Los procedimientos de
producción de anticuerpos incluyen inmunizar a un mamífero (por
ejemplo, ratón, rata, conejo, caballo, cabra, oveja o mono) con un
polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención.
Los anticuerpos pueden obtenerse a partir de animales inmunizados
usando cualquiera de una diversidad de técnicas conocidas en la
materia y seleccionarse para modular la actividad de la NS2/3 del
VHC usando un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la
presente invención. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de
inmunotransferencia o inmunoprecipitación (Armitage y col., 1992,
Nature 357: 80-82). El aislamiento de anticuerpos
y/o de células que producen anticuerpo a partir de un animal puede
ir acompañado de una etapa de sacrificio del animal.
Como alternativa o suplemento para inmunizar a un
mamífero con un péptido, puede obtenerse un anticuerpo específico
de un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente
invención a partir de una biblioteca producida por tecnología de
recombinación de dominios variables de inmunoglobulina expresados,
por ejemplo, usando bacteriófago lambda o bacteriófago filamentoso
que expresan dominios de unión de inmunoglobulina funcional a sus
superficies; por ejemplo, véase el documento WO92/01047. La
biblioteca puede ser virgen, construida a partir de secuencias
obtenidas de un organismo que no ha sido inmunizado con un
polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención (o
fragmentos del mismo) o puede ser una construida usando secuencias
obtenidas a partir de un organismo que ha estado expuesto al
antígeno de interés. Los anticuerpos candidatos pueden
seleccionarse por modular la actividad de NS2/3 del VHC usando el
polipéptido de la proteasa NS2/3.
Los anticuerpos según la presente invención
pueden modificarse de varias formas. De hecho, debe interpretarse
que el término "anticuerpo" abarca cualquier sustancia de
unión que tenga un dominio de unión con la especificidad requerida.
De este modo, la invención abarca fragmentos de anticuerpo,
derivados, equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos,
incluyendo moléculas sintéticas y moléculas cuya forma mimetiza la
de un anticuerpo, que permite a éste unirse a un antígeno o a un
epítope.
Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo, capaces
de unirse a un antígeno u otra pareja de unión son el fragmento Fab
compuesto por los dominios VL, VH, C1 y CH1; el fragmento Fd
compuesto por los dominios VH y CH1; el fragmento Fv compuesto por
los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, el
fragmento dAb compuesto por un dominio VH; regiones CDR aisladas y
fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos
fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra.
También están incluidos fragmentos Fv de cadena única.
Un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal
según la presente invención puede estar sometido a mutación
genética o a otros cambios. Adicionalmente, los expertos en la
materia entenderán que un anticuerpo monoclonal puede someterse a
las técnicas de la tecnología de ADN recombinante para producir
otros anticuerpos o moléculas quiméricas que retienen la
especificidad del anticuerpo original. Estas técnicas pueden
implicar la introducción del ADN que codifica la región variable de
la inmunoglobulina o las regiones determinantes de
complementariedad (CDR), de un anticuerpo en las regiones
constantes, o regiones constantes más las regiones del armazón, de
una inmunoglobulina diferente. Véase, por ejemplo, los documentos
EP184187A, GB2188638A o
EP-A-0239400. La clonación y
expresión de anticuerpos quiméricos se describen en los documentos
EP-A-0120694 y
EP-A-0125023.
Los hibridomas capaces de producir anticuerpos
con las características de unión deseadas están dentro del alcance
de la presente invención, así como lo están las células
hospedadoras, eucarióticas o procarióticas, que contiene ácidos
nucleicos que codifican anticuerpos (incluyendo fragmentos de
anticuerpos) y capaces de su expresión. También se describen
procedimientos de producción de los anticuerpos que incluyen
cultivar una célula capaz de producir el anticuerpo en condiciones
en las que se produce el anticuerpo y, preferiblemente, se
secreta.
Los anticuerpos también pueden usarse para
purificar y/o aislar polipéptidos de la proteasa NS2/3 del VHC de
la presente invención, por ejemplo, siguiendo la producción del
polipéptido mediante la expresión del ácido nucleico del mismo. Los
anticuerpos puede ser útiles en un contexto terapéutico (que puede
incluir profilaxis) para interrumpir la actividad de la proteasa
NS2/3 del VHC con miras a inhibir la replicación del VHC y, por
tanto, reducir o prevenir la infección por VHC. Por ejemplo, los
anticuerpos puede microinyectarse en células o tejidos, o
administrarse por vía sistémica. Los anticuerpos pueden emplearse
según la presente invención para otros fines terapéuticos y no
terapéuticos que se discuten en otra parte de este documento.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona en uso de un agente que es capaz de modular la
actividad de un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la
presente invención, en un procedimiento de diseño de un mimético
peptídico o no peptídico del compuesto, cuyo mimético es capaz de
modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC. El agente usando
en este procedimiento puede ser un agente identificado usando
procedimiento según la presente invención.
De forma similar, la presente invención
proporciona el uso de un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC
de la presente invención en un procedimiento de diseño de un
mimético peptídico o no peptídico de una proteasa NS2/3 del VHC,
cuyo mimético es capaz de modular la actividad de la proteasa NS2/3
del VHC.
Por lo tanto, se describe un procedimiento de
diseño de un mimético de un compuesto que tiene la actividad
biológica para modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC,
como se determina por los procedimientos de la presente invención,
o un procedimiento de diseño de un mimético de un polipéptido de la
proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención que tiene la
actividad biológica de modular la actividad de la proteasa NS2/3
del VHC, como se determina mediante los procedimientos de la
presente invención, comprendiendo dicho procedimiento:
(i) analizar una sustancia que tiene la actividad
biológica para determinar los restos de aminoácidos esenciales e
importantes para la actividad que define un farmacóforo; y
(ii) modelar el farmacóforo para diseñar y/o
seleccionar miméticos candidatos que tengan la actividad
biológica.
En la materia se conocen técnicas adecuadas de
modelado. Estas técnicas permiten el estudio de la interacción
entre un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente
invención y un compuesto modulador y diseñar compuestos que
contenga grupos funcionales ordenador de modo que puedan reproducir
esta interacción.
El diseñado de miméticos de un compuesto
farmacéuticamente activo conocido es una aproximación conocida para
el desarrollo de compuestos farmacéuticos basados en un compuesto
"cabeza de serie". Esto podría ser deseable cuando el compuesto
activo es difícil o caro de sintetizar o cuando no es adecuado para
un procedimiento de administración en particular, por ejemplo, los
compuestos de la presente invención que son péptidos pueden no
ajustarse bien como agentes activos para composiciones orales ya
que tienden a ser degradados rápidamente por las proteasas del
canal alimenticio.
Hay varias etapas que normalmente se siguen en el
diseño de un mimético a partir de un compuesto que tiene una
determinada propiedad como diana. En primer lugar, se determinan
las partes particulares del compuesto en particular que son
críticas y/o importantes para determinar la propiedad como diana. En
el caso de un péptido, esto puede hacerse variando sistemáticamente
los restos de aminoácidos del péptido, por ejemplo, sustituyendo
sucesivamente cada resto. Estas partes o restos que constituyen la
región activa del compuesto se conocen como su
"farmacóforo".
Una vez que se ha encontrado el farmacóforo, se
modela su estructura según sus propiedades físicas, por ejemplo,
estereoquímica, uniones, tamaño y/o carga, usando los datos de una
gama de fuentes, por ejemplo, técnicas espectroscópicas, datos de
difracción de rayos X y RMN. En este proceso puede usarse el
análisis por ordenador, mapeo de similitud (que modela la carga y/o
volumen de un farmacóforo, en lugar de la unión entre los átomos) y
otras
técnicas.
técnicas.
En una variante de la aproximación anterior, se
modela la estructura tridimensional de un ligando y su pareja de
unión. Esto puede ser especialmente útil cuando el ligando y/o la
pareja de unión cambian de conformación durante la unión,
permitiendo al modelo tener en cuenta esto en el diseño del
mimético.
A continuación, se selecciona una molécula molde
en la cual pueden injertarse grupos químicos que mimetizan al
farmacóforo. La molécula molde y los grupos químicos injertados en
ésta pueden seleccionarse convenientemente de modo que el mimético
se fácil de sintetizar, sea probablemente farmacológicamente
aceptable y no se degrade in vivo, mientras que retiene la
actividad biológica del compuesto cabeza de serie. A continuación,
el mimético o miméticos encontrados por esta aproximación pueden
analizarse para ver si tienen la propiedad diana o en qué extensión
muestra ésta. A continuación puede realizarse una optimización o
modificación adicional para llegar a uno o más miméticos finales
para ensayo in vivo o clínico.
El mimético o miméticos encontrados por
cualquiera de las aproximaciones descritas en este documento pueden
usarse en los procedimientos de ensayo de la presente invención
para determinar si tienen la capacidad de modular la actividad de
la proteasa NS2/3 del VHC.
Los miméticos obtenidos por un procedimiento de
la invención también se describen en este documento.
Como se usa en este documento, una variante de
una secuencia de aminoácidos indicada puede diferir en uno o más
restos de aminoácidos a partir de esa secuencia, mediante una o más
adiciones, inserciones, deleciones y sustituciones de uno o más
restos de aminoácidos. Este puede incluir alteraciones de 1, 2, 3,
4, 5 o más de 5 aminoácidos tales como sustituciones con respecto a
la secuencia indicada.
Esta variante de un polipéptido de la proteasa
NS2/3 del VHC de la presente invención, que tiene una secuencia
descrita en este documento, puede, en ciertas realizaciones, ser de
la misma longitud o más corto que esa secuencia. En otras
realizaciones, el polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la
presente invención (o una variante del mismo) puede estar incluido
en un polipéptido particularmente mayor cuando el polipéptido de la
proteasa NS2/3 del VHC se fusiona con una secuencia heteróloga o
extraña. Pueden incluirse, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 ó 5, 10, 20 o
más restos de aminoácidos adicionales, heterólogos a una forma
nativa del polipéptido específico de la proteasa NS2/3 del VHC, en
uno o en ambos extremos del polipéptido de la proteasa NS2/3 del
VHC.
Los derivados de polipéptidos incluyen el
polipéptido unido a una pareja de unión, por ejemplo una molécula
efectora, un marcador, un fármaco, una toxina y/o un vehículo o
molécula transportadora y/o una molécula que dirige tal como un
anticuerpo o fragmento de unión del mismo u otro ligando. Las
técnicas para unión de las parejas de unión, tanto peptídicas como
no peptídicas son bien conocidas en la técnica. En una
realización, la molécula vehículo es una secuencia peptídica de 16
aminoácidos derivada del homeodominio de Antennapedia (por
ejemplo, como el que se vende con el nombre de "Penetratina"),
que puede unirse a un péptido mediante un resto Cys terminal. La
molécula de "Penetratina" y sus propiedades se describen en el
documento WO 91/18981.
Los polipéptidos de la proteasa NS2/3 del VHC de
la presente invención y/o los agentes que modulan el péptido pueden
generarse completa o parcialmente mediante síntesis química, de
acuerdo con técnicas bien establecidas, tales como procedimientos
convencionales de síntesis de péptidos en fase líquida o,
preferiblemente en fase sólida, de las que se dispone de amplias
descripciones generales (véase, por ejemplo, en J. M. Stewart y J.
D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª Edición, Pierce
Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), en M. Bodanzsky y A.
Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag,
Nueva York (1984); y Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI
Inc., Foster City, California), o pueden prepararse en solución,
mediante el procedimiento en fase sólida o mediante cualquier
combinación de fase sólida, fase líquida y solución química.
También se describen diversos procedimientos
terapéuticos y usos de una o más sustancias seleccionadas entre (i)
un compuesto identificado según un procedimiento de la invención
que es capaz de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC;
(ii) un mimético de cualquiera de las sustancias anteriormente
mencionadas que es capaz de modular la actividad de la proteasa
NS2/3 del VHC.
El fin terapéutico/profiláctico de este
procedimiento o uso puede ser la modulación, por ejemplo,
interrupción o interferencia, de la actividad de la proteasa NS2/3
del VHC, para interrumpir, de este modo, la replicación del VHC y
por tanto, reducir o prevenir la infección por VHC.
En diversos aspectos adicionales también se
describe una composición farmacéutica, medicamento, fármaco u otra
composición para este fin, comprendiendo la composición una o más
de esas sustancias, el uso de esta sustancia en un procedimiento de
tratamiento médico, un procedimiento que comprende la
administración de esta sustancia o composición a un paciente, por
ejemplo, para el tratamiento (que puede incluir tratamiento
preventivo) de una afección médica, por ejemplo, una afección
asociada con la infección por VHC, el uso de esta sustancia en la
fabricación de una composición, medicamento o fármaco para la
administración para este fin, por ejemplo, para el tratamiento de
una afección asociada con la infección por VHC y un procedimiento
para fabricar una composición farmacéutica que comprende mezclar
esta sustancia con un excipiente, vehículo o transportador
farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, otros
ingredientes.
Las sustancias pueden usarse como agentes activos
solos o en combinación con otro o con cualquier otra sustancia
activa.
Cualquiera que sea la sustancia usada en un
procedimiento de tratamiento médico de la presente invención, la
administración preferiblemente es una "cantidad profilácticamente
eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz" (si se da
el caso, aunque la profilaxis puede considerarse terapia), siendo
ésta suficiente para mostrar beneficios en el individuo. La
cantidad real administrada y la proporción y transcurso de la
administración dependerán de la naturaleza y gravedad de lo que se
está tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo,
decisiones sobre la dosificación, etc., está dentro de la
responsabilidad de médicos de familia y de otros doctores en
medicina.
Una sustancia o composición puede administrarse
sola o en combinación con otros tratamientos, de forma simultánea o
secuencial dependiendo de la afección que se va a tratar.
Las composiciones farmacéuticas como se describen
en este documento y para su uso como se describe en este documento,
pueden incluir, además del ingrediente activo, un excipiente,
vehículo, tampón, estabilizados u otros materiales
farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la
materia. Estos materiales no deberían ser tóxicos y no deberían
interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza
precisa del vehículo u otro material dependerá de la vía de
administración, que puede ser oral o por inyección, por ejemplo,
cutánea, subcutánea o intravenosa.
Las composiciones farmacéuticas para
administración oral pueden estar en forma de comprimidos, cápsulas,
polvo o líquido. Un comprimido puede incluir un vehículo sólido tal
como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas
líquidas generalmente incluyen un vehículo líquido, tal como agua,
vaselina, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite
sintético. Puede incluirse solución salina fisiológica, dextrosa u
otra solución de sacáridos o glicoles, tales como etilénglicol,
propilénglicol o polietilénglicol.
Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea,
o inyección en el lugar de la enfermedad, el ingrediente activo
estará en forma de una solución acuosa aceptable por vía parenteral
que no tenga pirógenos y tenga pH, isotonicidad y estabilidad
adecuados. Los expertos en la material están bien capacitados para
preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos
isotónicos, tales como cloruro sódico para inyectables, inyección
de solución de Ringer o inyección de solución de Ringer con
lactato. Pueden incluirse, si se requieren, conservantes,
estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos.
En las formulaciones del vehículo pueden usarse
liposomas, especialmente liposomas catiónicos.
Ejemplos de técnicas y protocolos mencionados
anteriormente pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical
Sciences, 16ª Edición, Osol, A. (ed), 1980.
La sustancia o composición puede administrarse de
forma localizada en un lugar deseado o puede suministrarse de forma
que se dirija a células en particular.
Las terapias dirigidas pueden usarse para
suministrar más específicamente la sustancia activa a ciertos tipos
de células mediante el uso de sistemas de dirección tal como
anticuerpos o ligandos específicos de célula. Los sistemas
dirigidos pueden ser deseables por una diversidad de razones, por
ejemplo, si el agente es inaceptablemente tóxico o, por otro lado,
si necesitara una dosificación demasiado alta o si, por otro lado,
no fuera capaz de entrar en la célula diana.
En lugar de administrar estas sustancias
directamente, cuando las sustancias moduladoras son polipéptidos,
se pueden producir en las células diana mediante la expresión de un
ácido nucleico codificador introducido en las células, por ejemplo,
a partir de un vector viral. El vector puede dirigirse a las células
específicas que se van a tratar, o puede contener elementos
reguladores que son activadas más o menos selectivamente por las
células diana.
El ácido nucleico que codifica la sustancia, por
ejemplo un polipéptido capaz de modular la actividad de la proteasa
NS2/3 del VHC, puede usarse de este modo en procedimientos de
terapia génica, por ejemplo en el tratamiento de individuos, por
ejemplo, con el propósito de prevenir o curar (total o parcialmente)
un trastorno asociado con la infección por VHC.
En la técnica anterior se han usado vectores,
tales como vectores virales, para introducir ácido nucleico en una
amplia variedad de células diana diferentes. Típicamente, los
vectores se exponen a las células diana para que pueda tener lugar
la transfección a una proporción de célula suficiente como para
proporcionar un efecto terapéutico o profiláctico útil a partir de
la expresión del polipéptido deseado. El ácido nucleico
transfectado puede incorporarse permanentemente en el genoma de
cada célula diana, proporcionando un efecto duradero o,
alternativamente, el tratamiento puede tener que repetirse
periódicamente.
Se conocen en la técnica diversos vectores, tanto
vectores virales como vectores plasmídicos, véase la Patente de
EE.UU. Nº 5.252.479 y el documento WO 93/07282. En especial, se han
usado varios virus como vectores de transferencia génica,
incluyendo papovavirus, tales como SV40, virus vaccinia, virus del
herpes, incluyendo VHS y VEB, y retrovirus. Muchos protocolos de
terapia génica en la técnica anterior han usado retrovirus murinos
inactivados.
Como alternativa al uso de vectores virales en
terapia génica, otros procedimientos conocidos para introducir
ácido nucleico en las células incluye técnicas mecánicas, tales
como microinyección, transferencia mediada por liposomas y
transferencia de ADN mediada por receptor.
Un ejemplo de una técnica para dirigir
específicamente un ácido nucleico a células específicas, es la
transferencia génica mediada por receptor, en la que el ácido
nucleico se une a un ligando proteico a través de polilisina, siendo
el ligando específico para un receptor presente en la superficie de
las células diana.
Se puede proporcionar en un kit un agente o
sustancia con capacidad para modular la actividad de la proteasa
NS2/3 del VHC o una molécula de ácido nucleico que codifique un
polipéptido con esa capacidad, por ejemplo, sellado en un
recipiente adecuado que proteja su contenido del ambiente exterior.
Dicho kit puede incluir instrucciones de uso.
También se describe la purificación de un
polipéptido, proteína u otra sustancia que tenga la capacidad de
modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC. También se
describe una proteína, polipéptido, u otra sustancia purificada que
tiene la capacidad de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del
VHC. La proteína, polipéptido u otra sustancia purificada puede
estar pura a aproximadamente el 10%, más preferiblemente pura a
aproximadamente el 20%, más preferiblemente pura a aproximadamente
el 30%, más preferiblemente pura a aproximadamente el 40%, más
preferiblemente pura a aproximadamente el 50%, más preferiblemente
pura a aproximadamente el 60%, más preferiblemente pura a
aproximadamente el 70%, más preferiblemente pura a aproximadamente
el 80%, más preferiblemente pura a aproximadamente el 90%, más
preferiblemente pura a aproximadamente el 95% o sustancialmente
pura.
También se describe un procedimiento de
purificación de una proteína, polipéptido u otra sustancia que
tiene la capacidad de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del
VHC, el cual incluye poner en contacto la proteína, polipéptido u
otra sustancia con un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de
la presente invención.
Se puede poner en contacto una mezcla que incluya
una proteína, polipéptido u otra sustancia que tenga la capacidad
de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC con un
polipéptido inmovilizado de la proteasa NS2/3 del VHC de la
presente invención (por ejemplo, inmovilizado covalente o no
covalentemente, tal como a través de una molécula de unión
específica como estreptavidina o biotina) y las moléculas que no se
unen al polipéptido se eliminan con el lavado.
La proteína, polipéptido u otra sustancia que
tiene la capacidad de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del
VHC, en un procedimiento de purificación descrito en este
documento, puede estar en una mezcla de moléculas, tal como un
extracto celular, tal como una célula normal de un organismo tal
como un humano o una célula hospedadora recombinante que exprese la
proteína o polipéptido o su forma no fosforilada a partir del ADN
codificador, tal como una célula bacteriana, eucariótica (por
ejemplo, de mamífero o de levadura) o de insecto, tal como un
sistema de expresión de baculovirus.
Después de la purificación, la proteína,
polipéptido u otra sustancia que tiene la capacidad de modular la
actividad de la proteasa NS2/3 del VHC puede usarse como se desee,
por ejemplo, en un contexto terapéutico.
La Figura 1 muestra un esquema de un ensayo de
selección de alto rendimiento para inhibidores de la proteasa NS2/3
del VHC. En la etapa 1, la NS2/3 se repliega. A continuación, el
precursor se activa en un tampón apropiado para que se produzca la
escisión (etapa 2). El precursor sin escindir se captura a
continuación (etapa 4) y se mide la cantidad de NS3 libre en
solución (etapa 5).
La Figura 2 muestra el producto de la reacción de
escisión de NS2/3 separado por HPLC, como sigue. Una solución de
proteasa
H_{6}-907-1206-ASK4
5 \muM en clorhidrato de guanidina 6 M, Tris 25 mM, pH 8,7, DTT
100 mM se diluyó 50 veces en un tampón que contenía Tris 50 mM, pH
7,5, DTT 3 mM, glicerol al 50%, CHAPS al 1%, ZnCl_{2} 50 \muM,
NaCl 250 mM a una temperatura de 4ºC. Tras 5 minutos, la
temperatura se elevó a 23ºC, iniciando de este modo la reacción de
escisión. Las muestras se analizaron en una columna de cromatografía
de perfusión Poros R1/H (4,6 mm x 50 mm) equilibrada con H_{2}O
al 90%/TFA al 0,1% (tampón A) y acetonitrilo al 10%/TFA al 0,08%
(tampón B). La columna se desarrolló a un caudal de 2,5 ml/min
usando un cromatógrafo de líquidos de alta resolución de
Merck-Hitachi equipado con un detector de
fluorescencia. Se usó un gradiente del 10%-90% de tampón B durante
15 minutos para separar el precursor de sus fragmentos escindidos.
Los picos de proteína se detectaron mediante el seguimiento de
triptófano fluorescente (excitación a 280 nm, emisión a 350 nm) y
se cuantificó por integración del pico. La parte superior contiene
NS2/3 replegada, la parte media contiene NS2/3 D.N. activada y la
parte inferior contiene NS3 purificada.
La Figura 3 muestra un análisis de la reacción de
escisión de 300 nM de la proteasa
H_{6}-907-1206-ASK4
por HPLC. Panel izquierdo: análisis de la curva de tiempo de la
reacción de escisión de NS2/3. El área del pico de HPLC
correspondiente al producto de escisión NS3 se determinó por
integración del pico y se representó en función del tiempo de
incubación. Los datos pueden ajustarse a una ecuación exponencial
única de la que se deriva un valor de la constante de velocidad de
la reacción de primer orden observada. Panel derecho: dependencia
de la concentración de la autoescisión de NS2/3 a 23ºC. Las
constantes de velocidad de la reacción de primer orden de escisión
se determinaron en función de la concentración de proteína.
La Figura 4 muestra un diagrama de dos vectores
plasmídicos de expresión, pT7.7 (plásmido superior) y pCITE 2b (+)
(plásmido inferior) usados para la clonación de fragmentos de ADNc
que codifica la región NS2/3 de la poliproteína del VHC.
Se han generado plásmidos adecuados para la
expresión heteróloga de NS2/3 activa de tipo silvestre o mutantes
inactivos mediante clonación de fragmentos de ADNc amplificados por
PCR que codifica la región NS2/3 de la poliproteína del VHC en los
sitios de restricción apropiados.
Se conocen en la técnica varios plásmidos de
expresión para la expresión de proteínas heterólogas tanto
eucarióticas como procarióticas. En este ejemplo, el esqueleto del
vector pT7.7 se usa para la expresión heteróloga en células
procarióticas (E. coli), mientras que pCITE 2b (+) se usa
para la expresión heteróloga en células eucarióticas (Hep 3b) o en
sistemas de transcripción/traducción in vitro. En principio
se podrían usar otros sistemas de expresión con el mismo
propósito.
Se usaron como moldes los ADNc que codifican la
región no estructural de los aislados correspondientes a las cepas
J o H del VHC para la amplificación por PCR (cepa J del VHC, Nº de
Acceso del Genbank D90208; cepa H del VHC, Nº de Acceso del GenBank
M67463; cepa H77 del VHC, Nº de Acceso del Genbank AF009606). El
ADN se amplificó de forma habitual preparando una mezcla de reacción
de amplificación compuesta de 20 U/ml de ADN polimerasa Taq
mezclada en Tris-SO_{4} 60 mM (pH 9,1 a 25ºC),
(NH_{4})_{2}SO_{4} 18 mM, MgSO_{4} 2 mM, dGTP 200
\muM, dATP 200 \muM, dCTP 200 \muM, dTTP 200 \muM y
estabilizadores (PCR SuperMix High Fidelity, GibcoBRL, Nº Cat.
10790-020), denominado protocolo de PCR 1 en los
ejemplos siguientes.
De forma alternativa, se amplificó el ADN
preparando una mezcla de reacción de amplificación compuesta de
Tris-HCl 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50 mM, pH 8,3
(20ºC), dGTP 200 \muM, dATP 200 \muM, dCTP 200 \muM, dTTP 200
\muM y 2,5 U de ADN polimerasa Taq (ADN polimerasa Taq,
Boehringer Mannheim, Nº Cat. 1146 173), denominado protocolo de PCR
2 en los ejemplos siguientes.
En algunos casos, se usó una mezcla de reacción
de amplificación diferente, compuesta de Tris-HCl
10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,001%,
dGTP 200 \muM, dATP 200 \muM, dCTP 200 \muM, dTTP 200 \muM y
2,5 U de AmpliTaq Gold (tm) (Perkin Elmer, Nº Cat.
N808-0241), denominado protocolo de PCR 3 en los
ejemplos siguientes.
En todos los casos, el volumen de reacción fue de
25 \mul, los cebadores específicos estaban a
200-500 nM cada uno (concentración final) y el molde
de ADN estaba de forma habitual entre 20 y 100 ng (cantidad total
por reacción). Las reacciones se realizaron en hielo, se mezclaron
vigorosamente y se cargaron en el termociclador a 95ºC. La
amplificación por PCR se realizó durante 20-30
ciclos de 95ºC, 60 segundos. La hibridación se llevó a cabo en
general durante 15 segundos a una temperatura de 5ºC por debajo de
la temperatura de fusión más baja (valor de Tm) de los cebadores.
Los procedimientos para calcular los valores de Tm de la secuencia
oligonucleotídica son conocidos en la técnica y se pueden encontrar
en Sambrook y col. (1989). Molecular cloning, a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press.
La extensión se realizó a 72ºC (ADN polimerasa
Taq, Boehringer Mannheim) o a 68ºC (PCR SuperMix High Fidelity,
GibcoBRL) durante 60 segundos/Kb de longitud de la diana.
Todas las reacciones de PCR estuvieron precedidas
de un único ciclo de desnaturalización de 1-2
minutos realizado a 95ºC (o 7 minutos para las reacciones
realizadas con Taq Gold) y se detuvo con un rápido descenso a 4ºC,
de forma alternativa, el descenso a 4ºC estuvo precedido de un
único ciclo realizado a 72ºC durante 7 minutos (para las
condiciones específicas, véase a continuación). El termociclador
era de Perkin Elmer (GeneAMP PCR System 9700).
A continuación figura una lista de los cebadores
oligonucleotídicos usados para la amplificación:
Las mutaciones se introdujeron en general
mediante amplificación por PCR de las secuencias de ADNc usando
cebadores mutagénicos. Este procedimiento es bien conocido por los
expertos en la materia y se describe en: Sambrook y col. (1989),
Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Ehrlich, H. A., (1989) PCR Technology Stockton
Press, Nueva York. y Zhao y col. (1993) Methods in Enzymology 217,
218. Las condiciones de la PCR son las descritas anteriormente.
También pueden introducirse mutaciones usando el
procedimiento de E.S.U. (Eliminación de Sitio Único) de Deng, W. P.
y Nickoloff, J. A., (1992) Anal. Biochem. 200,81, con el kit de
mutagénesis E.S.U. (Pharmacia Biotech, Nº Cat.
27-1699-01) o mediante subclonación
por enzimas de restricción de fragmentos que contienen la mutación
o mutaciones deseadas.
A continuación figura una lista de los cebadores
usados para la mutagénesis:
pT7.7 fue el vector elegido para la preparación
de las construcciones que se iban a usar en la expresión de
proteínas heterólogas en procariotas (Studier, F.W., Rosenberg,
A.H., Dunn, J.J. y Dubendorff, J.W. 1989. Methods in Enzymology
185, 60). El ADN de calidad CsCl_{2} (preparado según Sambrook y
col. 1989: Ref. anterior) se cortó con la enzima de restricción Nde
I (Boehringer Mannheim) durante 3 h a 37ºC y se rellenó con el
fragmento Klenow de la ADN polimerasa (Boehringer Mannheim)
siguiendo las instrucciones del fabricante, es decir, añadiendo 33
\muM de NTP y 1 U de enzima/\mug de plásmido durante quince
minutos a 25ºC. El plásmido relleno se cargó en un gel de TAE
agarosa al 1%, se tiñó con 5 \mug/ml de bromuro de etidio y se
sometió a electroforesis.
Tras la electroforesis, se escindió la banda
correspondiente al ADN del plásmido y se purificó del gel con el
kit Quiaex II (Quiagen, Nº Cat. 20021). Tras la elución, el
plásmido se desfosforiló con fosfatasa alcalina intestinal de
ternera (Boehringer Mannheim) siguiendo las instrucciones del
fabricante y la solución se purificó con el kit Quiaex II (Quiagen,
Nº Cat. 20021).
Las inserciones derivadas del protocolo de PCR 1
se fosforilaron directamente en la mezcla de PCR añadiendo ATP 5 mM
y 7,9 U de polinucleótido quinasa de T4 (Pharmacia, Nº Cat.
27-0736-02) durante 30 minutos a
37ºC. Después de la fosforilación, se cargaron los productos de PCR
en un gel de TAE agarosa al 1%, se tiñó con 5 \mug/ml de bromuro
de etidio y se sometió a electroforesis. Tras la electroforesis,
las bandas de interés se escindieron del gel y se eluyeron con el
kit Quiaex II.
Los ligamientos se realizaron mezclando el
plásmido con la inserción a una relación molar de 1:3 en una mezcla
de ligamiento compuesta de Tris-HCl 50 mM (pH 8,7),
DTT 10 mM, ATP 1 mM y 25 \mug/ml de albúmina sérica bovina con 400
U de ADN ligasa de T4 (New England Biolabs, Nº Cat. 202S) a 16ºC
durante al menos 1 hora; de forma alternativa, se usó el kit de
Ligamiento Rápido de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante
(Boehringer Mannheim, Nº Cat. 1635 379). Cuando fue posible, las
mutaciones se transfirieron de una construcción a otra mediante
enzimas de restricción.
A continuación figura una lista de las
construcciones preparadas en pT7.7 y usadas a lo largo de estos
ejemplos, [el sitio de clonación es Nde I para todas las
construcciones pT7.7]:
\vskip1.000000\baselineskip
pCITE 2b (+) (Novagen, Nº Cat.
69291-1) fue el vector elegido para preparar las
construcciones que se iban a usar en los experimentos de expresión
eucariótica o en ensayos de traducción in vitro. El ADN de
calidad CsCl_{2} se cortó con la enzima de restricción Nco I
durante 3 h a 37ºC y se rellenó con el fragmento Klenow de la ADN
polimerasa siguiendo las instrucciones del fabricante, es decir,
añadiendo 33 \muM de NTP y 1 U de enzima/\mug de plásmido
durante quince minutos a 25ºC. El plásmido relleno se cargó en un
gel de TAE agarosa al 1%, se tiñó con 5 \mug/ml de bromuro de
etidio y se sometió a electroforesis. Tras la electroforesis, la
banda correspondiente al ADN del plásmido se escindió y se purificó
del gel con el kit Quiaex II. Tras la elución, el ADN del plásmido
se desfosforiló con fosfatasa alcalina intestinal de ternera
siguiendo las instrucciones del fabricante y se purificó la
solución.
De forma alternativa, el plásmido se cortó con la
enzima de restricción MluN I y se desfosforiló siguiendo el
protocolo explicado anteriormente. En algunos casos, pCITE 2b (+)
se cortó con las enzimas de restricción MluN I y EcoR I y se
desfosforiló como anteriormente.
Las inserciones derivadas de los protocolos de
PCR 1 y 2 se fosforilaron directamente en la mezcla de PCR
añadiendo ATP 5 mM y 7,9 U de polinucleótido quinasa de T4 durante
30 minutos a 37ºC. Después de la fosforilación, los productos de
PCR se cargaron en un gel de TAE agarosa al 1%, se tiñeron con 5
\mug/ml de bromuro de etidio y se sometieron a electroforesis.
Tras la electroforesis la banda de interés se
escindió del gel y se eluyó con el kit Quiaex II. Cuando las
inserciones derivaban del protocolo de PCR 3, la estrategia de
clonación implicaba una primera etapa de clonación en pCRII.I
(Invitrogen, Nº Cat. K2000-01), a continuación los
fragmentes clonados se rescataron con las enzimas de restricción
MluN I y EcoR I, y se subclonaron en pCITE 2b (+). Cuando la
estrategia de clonación lo requería, las inserciones preparadas con
el protocolo de PCR 2 ó 3 se pulieron con ADN polimerasa de T4 (New
England Biolabs, Nº Cat. 203S) según las instrucciones del
fabricante y se purificaron como se explicó previamente.
Los ligamientos se realizaron mezclando el
plásmido con la inserción a una relación molar de 1:3 en una mezcla
de ligamiento compuesta por Tris-HCl 50 mM (pH
8,7), DTT 10 mM, ATP 1 mM y 25 \mug/ml de albúmina sérica bovina
con 400 U de ADN de T4 a 16ºC durante al menos 1 hora; de forma
alternativa se usó el kit de Ligamiento Rápido de ADN siguiendo las
instrucciones del fabricante.
Cuando fue posible, las mutaciones se
transfirieron de una construcción a otra mediante enzimas de
restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
A continuación figura una lista de construcciones
preparadas en pCITE 2b (+):
\vskip1.000000\baselineskip
Con fines de clonación y de propagación de ADN,
todas las construcciones se transformaron en células Top10 de E.
coli; la transformación se efectuó según el procedimiento de
CaCl_{2} de Sambrook y col. (Sambrook, J., Fritsch E.F.,
Maniatis, T., 1989, Molecular cloning, a laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory Press).
Todos los mutantes de deleción se generaron en el
contexto de la cepa J del VHC y posteriormente, se clonaron en un
vector pCITE y se analizaron en un sistema de transcripción y
traducción acopladas in vitro (véase más adelante) Los
mutantes de deleción que empezaban en los restos 903 y 907 mostraban
una actividad de escisión completa en comparación con una
construcción de tipo silvestre, que empezaba en el resto 810,
mientras que NS2/3 913-1027 era inactivo.
Todas las construcciones rindieron niveles
elevados (>5 mg/l) de expresión de proteína heteróloga en E.
coli. Se observó un alto nivel de autoprocesamiento, que
variaba del 50 al 80% después de 3 horas de inducción a 23ºC.
Los ensayos de traducción in vitro (TIV)
se realizaron con el Sistema de Lisado de Reticulocitos de Conejo o
con el Sistema Rápido de Transcripción y Traducción Acopladas TnT
T7 (Promega, Nº Cat. L4151 y L1170) siguiendo las instrucciones del
fabricante.
Se preparó el ADN adecuado para la TIV mediante
CsCl_{2} o con el Sistema de Purificación de ADN Wizard Plus SV
(Promega, Nº Cat. A1460). En general, el ADN se linearizó con la
enzima de restricción apropiada durante 3 h y se precipitó con
CH_{3}COONa/EtOH. En algunos casos, el ADN se extrajo con fenol a
partir de la solución antes de la precipitación con EtOH. A
continuación se resuspendió en agua el ADN precipitado y se cargó
una pequeña alícuota en un gel de TAE agarosa al 1%, se tiñó con
bromuro de etidio para comprobar la restricción y la concentración.
El ADN lineal se usó como molde para la transcripción in
vitro dirigida por la ARN polimerasa de T7 (Stratagene, Nº Cat.
600124).
El ARN transcrito se extrajo con fenol y se
precipitó con CH_{3}COONa/EtOH. A continuación se separó el ARN
del ADN molde mediante centrifugación a través de una columna para
centrífuga G-50 (Pharmacia, Nº Cat.
17-0043-01) (Sambrook, J., Fritsch
E.F., Maniatis, T., (1989). Molecular cloning, a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press.) El ARN purificado se precipitó
como anteriormente y se resuspendió en agua.
El ARN se tradujo de forma habitual preparando
una mezcla de reacción compuesta de CH_{3}COOK 30 mM, MgCl_{2}
360 \muM, mezcla de aminoácidos excepto metionina 30 \muM, 1
\mug de ARN, 10 \mul de lisado de reticulocitos, DTT 90 mM, 2
\mul de metionina marcada radioactivamente (Amersham, Nº Cat.
SJQ0079), 1 \mul de RNasin (Promega, Nº Cat. N2511) y agua hasta
33 \mul. Se usó el sistema TnT con ADN lineal en una mezcla de
reacción compuesta de 10 \mul de lisado de reticulocitos TnT,
CH_{3}COOK 30 mM, MgCl_{2} 360 \muM, mezcla de aminoácidos
excepto metionina 30 \muM, 1 \mug de ADN, DTT 21 mM, 2 ml de
metionina marcada radioactivamente, 1 \mul de RNasin y agua hasta
33 \mul.
Las proteínas marcadas radioactivamente se
separaron en SDS-PAGE. (Sambrook, J., Fritsch E.F.,
Maniatis, T., (1989). Molecular cloning, a laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory Press). Los geles se fijaron en una
solución de desteñido durante 30 minutos, y a continuación se
empaparon durante 30 minutos con Amplify (Amersham, Nº Cat. NAMP
100) con agitación suave, se secó en papel 3MM y se sometió a
autorradiografía.
Usando la metodología TIV, las versiones
truncadas en el extremo N-terminal de NS2/3 de la
cepa J del VHC que empiezan en los aminoácidos 903, 907, 913 y 919,
acabando todas en el aminoácido 1206 (Construcciones números 25, 28,
31 y 33 del Ejemplo 1) se compararon en TIV con la construcción
número 19, que tiene el extremo N-terminal
nativo.
Se obtuvo una autorradiograma de los productos
marcados expresados a partir de las construcciones de NS2/3. El
autorradiograma se preparó como sigue; las construcciones NS2/3 se
produjeron mediante la traducción in vitro en presencia de
metionina marcada con ^{35}S usando el Sistema Rápido de
Transcripción y Traducción Acopladas TnT T7. Después de 1 hora de
incubación a 23ºC, las reacciones se pararon mediante la adición de
tampón de muestra con SDS y se analizaron mediante SDS PAGE al
12,5%. Los geles se empaparon en AmplifyTM y se analizaron por
autorradiografía.
Los experimentos mostraban que las deleciones
N-terminales hasta el resto 907 se toleran sin
perjudicar la actividad catalítica de la proteasa NS2/3. Las
construcciones truncadas ofrecen la ventaja de estar desprovistas de
una gran porción N-terminal hidrófoba que podría
causar la agregación de la proteína durante la expresión
heteróloga.
Se investigó la actividad de la proteasa NS2/3
del VHC y su inhibición usando la expresión transitoria en células
eucarióticas.
Las células Hep3B o HeLa se adaptan bien a este
fin. Las células HeLa se siembran a una densidad de 6 x 10^{5}
células/placa y se infectan con el virus vaccinia
vTF7-3 a una multiplicidad de 5 UFP por célula. Esta
infección llevará a la expresión de la ARN polimerasa de T7 en las
células y se puede usar para expresar proteínas bajo el control de
un promotor de la ARN polimerasa de T7. El procedimiento se
describe ampliamente en Tomei y col., (1993) J. Virol. 67, 4017 y
Kohara y col., (1992) J. Gen. Vir. 73:
2313-2318.
Tras la adsorción durante 30 minutos a 37ºC, se
añadieron 3 ml de MEM de Eagle modificado por Dulbecco suplementado
con suero de ternera fetal al 10%. Las células se incubaron durante
un periodo adicional de 30 minutos a 37ºC. Se precipitaron en
fosfato cálcico 20 \mug de plásmido recombinante que contenía las
construcciones de la proteasa NS2/3 según las construcciones números
16-35, como se describe en Sambrook y col. (1989),
y se añadieron directamente a cada placa en un volumen de 500
\mul.
A las 4 horas de la transfección se sustituyó el
medio por MEM sin metionina (Gibco Nº Cat.
31900-020) y las células se dejaron sin alimento
durante 1 hora a 37ºC. A continuación las células se marcaron
radioactivamente durante 3 horas con 400 \muCi de marcaje
Tran^{35}S (ICN, Cat Nº 51006) en 2 ml de MEM sin metionina y
suplementado con suero de ternera fetal al 2% dializado. Se
recogieron las células y se resuspendieron en Tris 20 mM pH 8,0,
NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, fluoruro de
fenilmetilsulfonilo 1 mM, EDTA 1 mM y ditiotreitol 1 mM.
La expresión y actividad de la proteasa NS2/3 se
puede determinar en los extractos celulares tras la
inmunoprecipitación con antisueros específicos. Con este propósito,
se añadieron dodecil sulfato sódico y ditiotreitol al extracto
celular a una concentración final del 2% y 10 mM, respectivamente. A
continuación se incubaron los lisados a temperatura ambiente
durante 1 hora y se calentaron a 95ºC durante 10 minutos. Se
preadsorbieron 10 \mul de antisueros durante 1 hora a 4ºC en un
volumen de 400 \mul de Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, Triton
X-100 al 1% con los extractos de células HeLa
infectadas con vT7F3 distribuidos sobre filtros de
nitrocelulosa.
Después, la suspensión de anticuerpo se incubó
con 60 \mul de proteína A Sefarosa durante 1 hora a 4ºC. La
resina se sedimentó por centrifugación, se lavó tres veces en Tris
20 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1% y se
resuspendió en 400 \mul del mismo tampón. Se añadieron 20 \mul
de lisado celular a la resina y se incubó durante 1 hora a 4ºC.
La suspensión de proteína A Sefarosa se puso
posteriormente sobre 0,9 ml de Tris 5 mM pH 7,4, EDTA 16,5 mM,
deoxicolato sódico al 0,1%, Nonidet P-40 al 0,25%,
sacarosa al 30% (p/v) y se sedimentó mediante centrifugación en una
microcentrífuga a temperatura ambiente. El sedimento se lavó dos
veces con el mismo tampón sin sacarosa y una vez con agua. Las
muestras se analizaron mediante autorradiografía tras la separación
por electroforesis en SDS-poliacrilamida.
En la técnica se conocen varios sistemas para la
expresión heteróloga de la proteasa NS2/3 activa. En el ejemplo
presente, se usó E. coli para la expresión de la proteasa
NS2/3. Estas células también se dirigieron a expresar la proteína
NS2/3 en una forma sin escindir, según el procedimiento explicado a
continuación. Se pueden usar otros sistemas de expresión bacterianos
o eucarióticos para el mismo propósito.
Se usaron vectores pT7-7 que
contenían secuencias de la proteasa NS2/3 truncadas según las
construcciones números 1-15 para transformar E.
coli BL21 (DE3). Las células se cultivaron en medio mínimo M9
suplementado con biotina 50 \muM, tiamina a 2,4 \mug/ml,
FeSO_{4} a 3,4 \mug/ml y ZnCl_{2} 200 \muM a 37ºC hasta una
densidad óptica a 500 nm de 0,8. La temperatura se bajó hasta los
23ºC y se inició la inducción de la proteína mediante la adición de
200 \mul de IPTG. Después de 3 horas, las células se recogieron
mediante centrifugación.
Los extractos celulares pueden analizarse
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes. Este experimento proporcionó evidencia de la
inducción eficaz de la proteína precursora NS2/3 además de dos
proteínas que migraban con el peso molecular aparente de los
productos de escisión NS3 y NS2 esperados.
Puesto que el precursor NS2/3 sufre un
autoprocesamiento sustancial durante su inducción, claramente en
estas condiciones no es posible obtener grandes cantidades de
proteína precursora pura sin escindir. Se intentaron, por tanto,
dos estrategias para disminuir o detener la reacción de
autoprocesamiento durante la inducción de la proteína.
La inducción a 15ºC disminuía la cantidad total
de proteína producida, pero afectaba sólo ligeramente el grado
relativo de autoprocesamiento. Un descenso adicional de la
temperatura conduce a una deficiencia grave en la producción de la
proteína. Por tanto, parecía que la cantidad relativa de precursor
que se podía purificar potencialmente no se incrementaba mediante
de la modulación de la temperatura durante la inducción.
Se sabe que la proteína NS3 contiene cantidades
estequiométricas de cinc que son necesarias para su plegamiento y
estabilidad (De Francesco y col., 1996). Si la proteína NS3 se
induce en E. coli cultivada en medio mínimo sin cinc
añadido, no se plegará apropiadamente y forma agregados conocidos
como cuerpos de inclusión. Las construcciones de proteasa NS2/3
truncada dirigirán la formación de proteína insoluble si se
expresan en E. coli cultivada en medio M9 mínimo sin
suplementar con iones de cinc. En estas condiciones, la mayoría de
la proteína NS2/3 se encuentra como un precursor no escindido y en
un gel teñido con Coomassie, sólo se veían cantidades muy bajas del
producto de escisión NS3. Por tanto, este procedimiento proporciona
una forma de expresión de la proteasa NS2/3 en forma latente sin
escindir.
En resumen, para obtener un precursor de NS2/3
catalíticamente competente en una forma inactiva latente que
potencialmente sea susceptible de purificación, se realizó la
inducción de la proteína en medio de crecimiento mínimo sin
cinc.
Para obtener la proteasa NS2/3 en forma pura a
partir de las células bacterianas, se cultivó E. coli en
medio mínimo sin iones de cinc añadidos y se indujo la producción
de proteínas NS2/3 usando las construcciones números
1-15 (véase el Ejemplo 1), como se explica
anteriormente.
Las células se recogieron por centrifugación y el
sedimento de células se lavó con tampón PBS (fosfato sódico 25 mM,
pH 7,5, NaCl 140 mM). A continuación el sedimento lavado se
resuspendió en tampón de lisis (40 ml/l de medio de crecimiento)
con fosfato sódico 25 mM, pH 6,5, DTT 3 mM, NaCl 500 mM, CHAPS al
0,5% y glicerol al 15%. Tras la rotura de las paredes celulares
bacterianas usando una prensa francesa, se añadió MgCl_{2} 10 mM
al homogeneizado que se incubó a continuación durante 30 minutos a
4ºC en presencia de 6 U/\mul de ADNasa. El homogeneizado se
centrifugó durante 15 minutos a 12.000 xg.
El sedimento de la centrifugación contenía la
proteína NS2/3 además de otras proteínas bacterianas contaminantes.
Se lavó dos veces con tampón de lisis, una vez con tampón de lisis
suplementado con NP-40 al 1% y una vez con fosfato
sódico 20 mM, pH 7,5, DTT 3 mM. El sedimento final típicamente
contenía una proteína NS2/3 pura al 80%.
La proteína puede purificarse adicionalmente
usando el procedimiento siguiente. El sedimento se resuspendió en
clorhidrato de guanidina 7 M, Tris 25 mM pH 8,7, DTT 100 mM y se
cargó en una columna de filtración en gel Superdex 75 26/60
(Pharmacia) equilibrada con clorhidrato de guanidina 6 M, Tris 25 mM
pH 7,5, DTT 3 mM, NaCl 150 mM y desarrollada a un caudal de 2
ml/min. Las fracciones que contenían NS2/3 se mezclaron y se
cargaron en una columna de cromatografía de fase inversa Source
15RPC de 0,5 x 20 cm (Pharmacia) equilibrada en H_{2}O al 90%,
TFA al 0,1% (disolvente A) y acetonitrilo al 10%, TFA al 0,08%
(disolvente B).
Se usó un gradiente de 10% de disolvente B a 90%
de disolvente B durante 1 hora a un caudal de 4 ml/min para eluir
de la columna la proteína NS2/3 en una forma pura. Las fracciones
que contenían NS2/3 se mezclaron, se liofilizaron y la proteína se
resolubilizó en clorhidrato de guanidina 7 M, Tris 25 mM, pH 8,7,
DTT 100 mM.
Típicamente, la proteína tenía una pureza >95%
y se obtuvo con un rendimiento >2 mg/l de cultivo bacteriano. La
proteína purificada se caracterizó mediante espectrometría de masas
por electropulverización, verificando, de este modo, que no se
producían modificaciones de la proteína durante el procedimiento de
expresión o purificación.
La masa encontrada por esta técnica para NS2/3
H6-907-1206-ASK4 fue
de 33.694 Da y se correspondía con su masa teórica calculada a
partir de la composición de aminoácidos. Esto documenta que no se
han producido modificaciones detectables de las proteínas durante
este procedimiento de purificación. Esta noción además está
corroborada por el análisis de la secuencia de aminoácidos
N-terminales realizada usando la degradación de
Edman en un secuenciador en fase gaseosa. Este análisis dio la
secuencia N-terminal esperada
M-H-H-H.
Los rendimientos de proteína pura que se
obtuvieron variaban considerablemente entre las diferentes
construcciones 1-15 enumeradas en el Ejemplo 1. Los
niveles más altos de expresión de la proteína bacteriana se
obtuvieron con las construcciones etiquetadas con His + Lys usando
células BL-21 de E. coli. La expresión de
las construcciones mutantes basadas en NS2/3
907-1206 ASK_{4} era muy baja y tuvo que ser
optimizada. Para estas construcciones, los niveles más altos de
expresión se obtuvieron usando células B834 de E. coli y
medio mínimo.
Se estableció una selección sistemática de las
condiciones de replegamiento variando los parámetros siguientes:
metodología de replegamiento (diálisis, dilución rápida, dilución
seriada, concentración de proteína (10-100
\mug/ml), pH (6-9), fuerza iónica
(25-275 mM), aditivos polares (arginina 0,5 M),
aditivos no polares (glicerol al 20%, sacarosa al 1%),
concentración caotrópica residual (guanidina 0-0,75
M), detergente (CHAPS al 2%), PEG 4000 (0,05%), temperatura
(4-23ºC) y concentración de Zn^{++}
(30-100 \muM). En todos los experimentos, se
controló la recuperación del precursor soluble tras la
ultracentrifugación.
Usando esta metodología, se identificaron los
siguientes factores como importantes para la recuperación de la
proteína soluble tras el replegamiento: eliminación del agente
caotrópico mediante diálisis, concentración de proteína <100
\mug/ml, concentración de agente caotrópico residual de guanidina
0,75 M en el tampón de replegamiento, fuerza iónica >200 mM de
NaCl. En condiciones de replegamiento adecuadas, puede encontrarse
más del 80% de precursor replegado en el sobrenadante tras una
ultracentrifugación a 120.000 xg.
A partir de esto se desarrollaron dos
procedimientos que pueden usarse con fines diferentes. El
procedimiento A permite generar una proteína replegada a
concentraciones micromolares que no sufre escisión a menos que se
transfiera a un tampón apropiado capaz de sostener la reacción de
escisión. El procedimiento B permite el replegamiento de la
proteína NS2/3 sin plegar en un tampón que sostiene simultáneamente
la reacción de escisión.
Procedimiento
A
200 \mul de una solución que contiene
polipéptido de la proteasa NS2/3 3 \muM en clorhidrato de
guanidina 6 M, Tris 25 mM, pH 8,7, DTT 100 mM se dializaron frente
a 20 ml de Tris 50 mM, pH 7,5, ZnCl_{2} 50 \muM, DTT 3 mM, NaCl
250 mM, clorhidrato de guanidina 750 mM usando una membrana de
diálisis SpectraPor con un punto de corte de 10 kDa. La diálisis se
realiza a 4ºC. Después de dos horas, la solución de proteína se
puede retirar, dividir en alícuota y congelar rápidamente en
nitrógeno líquido. No se produce escisión durante esta diálisis y
la proteína puede activarse para sufrir escisión tras la adición de
un tampón que activa la reacción de escisión como se explica más
adelante.
Procedimiento
B
Una solución de polipéptido de proteasa NS2/3 5
mM en clorhidrato de guanidina 6 M, Tris 25 mM, pH 8,7, DTT 100 mM
se diluye 50 veces en un tampón que contenía Tris 50 mM, pH 7,5,
DTT 3 mM, glicerol al 50%, CHAPS al 1%, ZnCl_{2} 50 \muM, NaCl
250 mM a una temperatura de 4ºC. Tras 5 minutos la temperatura se
eleva a 23ºC iniciando, de este modo, la reacción de escisión.
Para ambos procedimientos, A y B, son posibles
variaciones en la composición de los tampones y en la concentración
de proteína y sus consecuencias se explican con más detalle más
adelante. El rendimiento de proteína activa replegada varía entre
el 30% y el 80% y depende de la composición del tampón, la
composición de aminoácidos de la proteína NS2/3 y su pureza.
Las proteínas replegadas según el procedimiento A
se diluyeron al menos 5 veces en un tampón que tenía la siguiente
composición (tampón de actividad): Tris 50 mM, pH 7,5, DTT 3 mM,
glicerol al 50%, CHAPS al 1%, ZnCl_{2} 50 \muM, NaCl 250
mM.
A intervalos calculados, se retiraron alícuotas
del tampón de actividad que contenían la proteasa NS2/3 replegada,
la reacción se detuvo mediante la adición de dodecil sulfato sódico
al 0,1% y las muestras se cargaron en un gel de poliacrilamida al
12,5% con dodecil sulfato sódico y tras la electroforesis, se
analizaron por tinción con plata o mediante inmunotransferencia.
Las proteínas replegadas según el Procedimiento B
simplemente se incubaron a 23ºC hasta dos horas y se analizaron de
la misma forma.
Después de dos horas de incubación en estas
condiciones, se detectó una banda intensa que migraba con el peso
molecular de NS3 truncada en inmunotransferencias teñidas con
anticuerpos anti NS3.
En el SDS-PAGE teñido con plata
se detectaron dos bandas correspondientes con el PM de las
proteínas NS2 y NS3 truncadas, además del precursor sin escindir. Se
estimó que aproximadamente el 30% de la proteína precursora había
sido procesada en este experimento.
Un formato más conveniente y cuantitativo de un
ensayo de proteasa NS2/3 implica la separación del precursor y de
los productos mediante HPLC. Se desarrolló el siguiente
procedimiento: las proteínas replegadas según el procedimiento A o B
se incubaron en tampón de actividad a 23ºC. A intervalos
calculados, se retiraron alícuotas de 200 \mul y se añadieron 20
\mul de TFA al 10% para detener la reacción. La solución se
inyectó en una columna de cromatografía de perfusión Poros R1/H
(4,6 mm x 50 mm, PerSeptive Biosystems, Nº Cat.
1-1014-24) equilibrada con H_{2}O
al 90%/TFA al 0,1% (tampón A) y acetonitrilo al 10%/TFA al 0,08%
(tampón B).
La columna se desarrolló a un caudal de 2,5
ml/min usando un cromatógrafo de líquidos de alta resolución de
Merck-Hitachi equipado con un detector de
fluorescencia. Se usó un gradiente del 10%-90% de tampón B durante
15 minutos para separar el precursor de sus fragmentos escindidos.
Usando el control de triptófano fluorescente (excitación a 280 nm,
emisión a 350 nm) de forma fiable, se pueden detectar y cuantificar
mediante integración del pico menos de 5 nM.
La Figura 2 muestra dos cromatogramas típicos
registrados a tiempo cero y tras la incubación durante una noche de
NS2/3
H6-907-1206-ASK4
(construcción número 3) en el tampón de actividad. El pico marcado
"NS3" migra junto con una proteína convencional que abarca los
aminoácidos 1027-1206 y que lleva la extensión C-
terminal ASKKKK. Para verificar adicionalmente que durante la
reacción de autoescisión de la proteasa NS2/3 purificada el
procesamiento se producía en el sitio de escisión auténtico, se
aisló y caracterizó el producto de escisión NS3 usando el análisis
de secuencia N-terminal mediante la degradación de
Edman. La secuencia obtenida fue
A-P-I-T, que
corresponde a los restos 1027-1030 de la
poliproteína del VHC e indicaba claramente que se había producido la
escisión en el sitio de NS2/3 auténtico.
Estimamos una constante de velocidad de primer
orden de 0,06 min^{-1} para la reacción de escisión y una t/2 de
11,5 minutos. Estos datos no son diferentes a los datos publicados
sobre la reacción de escisión de las construcciones NS2/3 de
longitud completa en un sistema de transcripción/traducción in
vitro, en el que se encontró una t/2 de 10 - 15 minutos y una
escisión máxima del 70%.
Usando varias preparaciones enzimáticas
diferentes, obtuvimos entre el 15 y el 80% de escisión y
velocidades de 0,03 min^{-1} - 0,07 min^{-1}. Los fragmentos de
escisión se sometieron al análisis de secuencia
N-terminal para verificar que la escisión se
producía en el sitio de escisión auténtico.
También se investigó la actividad proteasa NS3
del precursor NS2/3
H_{6}-907-1206-ASK_{4}
replegado. No se apreciaron cambios significativos en la actividad
proteasa NS3 durante una reacción de autoescisión que llevaba al
30% de procesamiento después de dos horas de incubación. El grado
de actividad proteasa NS3 era compatible con la presencia de
aproximadamente el 25% de moléculas activas, asumiendo que la
actividad específica de la proteasa NS3 no cambia en el precursor
NS2/3
H_{6}-907-1206-ASK_{4}.
Estos experimentos demuestran que la cantidad de
proteína catalíticamente competente que puede recuperarse tiene
tanto la actividad proteasa NS2 como la NS3. El resto de la
proteína probablemente está mal plegada.
El procedimiento de HPLC para detección de
productos de escisión que surgen tras la incubación de la proteasa
NS2/3 purificada y replegada en tampón de actividad puede usarse
para cuantificar los parámetros cinéticos de la reacción y para
determinar la influencia de las diferentes condiciones
fisicoquímicas sobre su velocidad.
La Figura 3 muestra el transcurso de una escisión
típica. Se incubó la proteasa NS2/3 30 nM en Tris 50 mM, pH 7,5,
DTT 3 mM, glicerol al 50%, CHAPS al 1%, ZnCl_{2} 50 \muM, NaCl
250 mM y la reacción de escisión se siguió midiendo la cantidad de
producto de escisión NS3 formado con el tiempo. Esto se hizo
integrando el área del pico de HPLC de NS3.
En la Figura 3, panel izquierdo, se muestra una
representación del área del pico NS3 frente al tiempo. Los valores
se pueden ajustar mejor a una ecuación exponencial simple, que
permite la asignación de una constante de velocidad aparente. Se
encontró que esta constante de velocidad está se ve afectada por la
variación de diversos parámetros, tal como fuerza iónica,
concentración de glicerol, pH, concentración de detergente.
Un hallazgo inesperado es el hecho de que la
constante de velocidad también muestra dependencia de la
concentración de proteína (Figura 3, panel derecho). Esto es
indicativo de que las especies activas son un multímero. De hecho,
la cromatografía de filtración en gel mostró evidencias de que se
habían formado especies diméricas en solución. La dimerización es
una nueva propiedad de la proteasa NS2/3 que podría usarse para
desarrollar una estrategia dirigida a encontrar inhibidores de
NS2/3 que interfieran con la formación de dímeros.
La invención también proporciona metodologías que
se pueden usar para identificar inhibidores de la reacción de
escisión. Estos inhibidores pueden encontrarse mediante selección
de colecciones o bibliotecas combinatorias de compuestos para la
actividad inhibidora de la proteasa NS2/3. De forma conveniente,
las moléculas orgánicas pequeñas se solubilizan en DMSO y se añaden
al ensayo. En todos los ensayos siguientes se tolera la adición de
hasta el 10% de DMSO sin perjuicio sustancial de la actividad de
escisión de la proteasa NS2/3.
Los siguientes procedimientos son ejemplos de
procedimientos de ensayo que se pueden usar:
En este documento se describen plásmidos de
expresión adecuados para la expresión transitoria de la proteasa
NS2/3 en células eucarióticas (construcciones pCITE números
16-35; Ejemplo1). Estos plásmidos contienen la
proteasa NS2/3 bajo el control de un promotor de la ARN polimerasa
de T7. El uso de este sistema para controlar la expresión de
proteínas heterólogas en células eucarióticas y, más
específicamente, para controlar la actividad de proteasas virales,
es bien conocido en la técnica (Tomei, L. y col. (1993). J. Virol.
67, 4017) y se describe en el Ejemplo 3.
La inhibición de la actividad proteasa NS2/3 por
moléculas añadidas externamente tiene como resultado la disminución
de los niveles de productos de escisión que se pueden determinar
tras el marcaje radioactivo de las proteínas y el aislamiento de la
proteasa NS2/3 y su producto de escisión NS3 mediante
inmunoprecipitación con antisueros anti NS3, usando procedimientos
establecidos conocidos en la técnica.
La proteasa NS2/3 activa puede generarse usando
un sistema de transcripción y traducción acopladas in vitro
o mediante traducción in vitro de las moléculas de ARN
apropiadas como se explica anteriormente (Ejemplo 2).
La invención proporciona plásmidos adecuados para
la producción de la proteasa NS2/3 dirigida por la ARN polimerasa
de T7 que codifica moléculas de ARN según procedimientos conocidos
por los expertos en la materia. Los inhibidores se añaden a la
mezcla de reacción y su potencia se determina mediante experimentos
de valoración.
El marcaje radioactivo de las proteínas por
adición de aminoácidos marcados radioactivamente y el posterior
análisis en SDS-PAGE y autorradiografía permite
controlar la inhibición de la actividad de la proteasa N2/3 por una
disminución en la cantidad de productos de escisión
radioactivos.
Las construcciones de proteasa NS2/3
proporcionadas por esta invención se purifican y repliegan según
los procedimientos de esta invención y se incuban en 200 \mul de
tampón de actividad (Tris 50 mM, pH 7,5, DTT 3 mM, glicerol al 50%,
CHAPS al 1%, ZnCl_{2} 50 \muM, NaCl 250 mM) u otro tampón
adecuado para mantener la actividad de escisión. Típicamente, en el
ensayo se usan de 30 nM a 300 nM de proteasa NS2/3 y se incuba en
el tampón apropiado en presencia o ausencia de hasta el 10% (v/v)
de una solución de compuestos orgánicos en DMSO. A la concentración
más baja de proteína, la proteasa NS2/3 está presente en la
solución tanto como dímero activo como monómero inactivo. Esto
conduce a una velocidad de reacción total más lenta.
El uso de concentraciones de proteínas similares
o por debajo de la constante de equilibrio de disociación del
dímero puede ser ventajoso si se desea encontrar inhibidores de la
formación de dímeros. Además, una concentración baja de proteína
también puede ser necesaria para determinar la actividad de
inhibidores muy potentes. A concentraciones de proteína por encima
de 100 nM la mayoría de la proteína estará presente como dímero
activo y la reacción de escisión será más rápida que a una
concentración baja de proteína (véase también la Figura 3).
Dependiendo de la concentración de proteína usada
en el ensayo, la reacción se deja desarrollar durante 10 a 30
minutos y se detiene bien por inactivación de la proteasa NS2/3
mediante de la adición de 20 ml de TFA al 10% (si la escisión se
detecta por HPLC) o de tampón de muestra con SDS (si la escisión se
detecta en SDS-PAGE). En cada caso, la reacción se
detiene en el intervalo lineal de la curva de tiempo (Figura 3).
Esto es importante puesto que la desviación de la linearidad puede
conducir a un subestimación de la potencia de los inhibidores
añadidos.
Posteriormente, la cantidad de producto de
escisión formado en ausencia de inhibidor se compara con la
cantidad del mismo producto de escisión formado en presencia de
inhibidor añadido. El % de inhibición se calcula a partir de esta
comparación y se determina a diferentes concentraciones de
inhibidor, lo que conduce a una determinación exacta de la potencia
del compuesto inhibidor. Ni la generación del fragmento de escisión
NS3 ni del NS2 se puede controlar con este propósito.
Usando SDS-PAGE como
procedimiento de detección, es conveniente realizar una
inmunotransferencia con antisueros específicos de NS2 o de NS3 para
mejorar la sensibilidad. La intensidad de las bandas puede
estimarse mediante densitometría u otras técnicas de imagen
conocidas en la técnica.
El procedimiento de detección preferible es HPLC
que permite la detección cuantitativa de NS2/3 sin escindir y de
ambos fragmentos de escisión, NS2 y NS3, en pocos minutos. El
ensayo puede usarse para seleccionar colecciones de compuestos
químicos usando ensamblaje y análisis automatizados de muestras. En
la Figura 2 se muestra un ejemplo de ejecución de HPLC que documenta
la separación y cuantificación de NS2/3, NS2 y NS3.
Las grandes colecciones de compuestos o
bibliotecas combinatorias que a menudo contienen >10^{5}
entidades químicas distintas, son fuentes prometedoras para
compuestos cabeza de serie en un programa de desarrollo de fármacos.
El manejo de estas grandes cantidades de compuestos requiere
tecnologías robóticas y un ensayo que pueda realizarse en un
formato de microplaca. La invención, por tanto, también proporciona
procedimientos para ensayar la actividad de la proteasa NS2/3 en un
ensayo en microplaca.
El ensayo, que se explica en la Figura 1, se
realizó como sigue: mediante manipulación genética se introdujo una
etiqueta de seis histidina en el extremo N-terminal
del polipéptido de la proteasa NS2/3. La proteína etiquetada se
purificó como se especifica anteriormente y se replegó siguiendo los
procedimientos de replegamiento A o B. Por cuestiones de
simplicidad, se prefirió el procedimiento de replegamiento B, por
lo que el polipéptido de la proteasa NS2/3 desnaturalizado con la
etiqueta de histidina se diluyó en 100 \mul de tampón de
actividad (Tris 50 mM, pH 7,5, 2-mercaptoetanol 3
mM, glicerol al 50%, CHAPS al 1%, ZnCl_{2} 50 \muM, NaCl 250
mM) a una concentración final de 50 nM.
La incubación durante 15 minutos a 23ºC da lugar
a un procesamiento parcial de la proteasa NS2/3. El tiempo de
incubación se eligió para obtener aproximadamente el 10% de
procesamiento. Sólo el fragmento de escisión NS2 y el precursor
NS2/3 sin escindir poseen etiquetas de histidina. Estas histidinas
pueden captarse mediante la adición de una resina de afinidad por
metales. Por lo tanto, tras el periodo de incubación, se añadieron
100 \mul de una suspensión al 50% (v/v) de una resina de afinidad
por metales Talon (Clontech, Nº Cat. 8901-3)
equilibrada en Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 250 mM. La resina
secuestraba las especies con etiquetas de histidina y dejaban la
molécula NS3 sin etiqueta en solución.
La molécula NS3 generada durante la reacción de
procesamiento de la proteasa NS2/3 tiene una actividad serina
proteasa. Esta actividad puede usarse como lectura de la reacción
de procesamiento entre NS2 y NS3. De hecho, la actividad catalítica
de NS3 amplificará cada suceso de procesamiento de NS2/3, por
ejemplo, a través de la renovación de un sustrato NS3
fluorogénico.
Tras la sedimentación de la resina, se retiró una
alícuota de 40 \mul del sobrenadante y se añadió a un pocillo de
una segunda microplaca de 96 pocillos que contenía 200 \mul de
Tris 50 mM pH 7,5, Triton X-100 al 0,1%, DTT 10 mM,
glicerol al 15%, NaCl 150 mM y Pep4AK 20 \muM, con la secuencia
KKKGSVVIVGRIILSGR-NH2. Pep4AK es un cofactor de la
proteasa NS3 y se añadió para obtener la actividad máxima.
En este punto, se añadieron 5 \muM de un
sustrato NS3 fluorogénico internamente inactivado con la secuencia
Mca-DDIVPCSMSK[DNP]. La reacción se siguió
usando un lector de fluorescencia en microplacas (excitación a 325
nm, emisión a 393 nm).
Es posible el manejo automatizado de todas las
etapas necesarias para este ensayo, permitiendo la selección de un
gran número de compuestos en un periodo corto de tiempo. Además,
los falso positivos que podrían surgir debido a la inhibición de la
proteasa NS3 se minimizan debido a la dilución 10 veces de la
solución original durante el ensayo de la proteasa NS3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Instituto di Ricerche di Biología
Molecolare P. Angeletti
\hskip1cmSteinkuhler, Christian
\hskip1cmPallaoro, Michele
\hskip1cmLahm, Armin
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Fragmentos de NS2/3 del VHC y usos de
los mismos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> SMWFP5917950
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/IB01/00527
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
14-03-2001
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 0006537.5
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-03-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
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<211> 54
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
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\hskip-.1em\dddseqskipttggaattcc tacttcttct tcttgctagc tctcatggtt gtctctaggt tctc
\hfill54
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<210> 2
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
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artificial: Cebador
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artificial: Cebador
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artificial: Cebador
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artificial: Cebador
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artificial: Cebador
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artificial: Cebador
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artificial: Cebador
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artificial: Cebador
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artificial: Cebador
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artificial: Cebador
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artificial: Cebador
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artificial: Cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccgtgata ggcggaagga gccg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagacaccg cggccgctgg ggacatcatc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctcatctg gtggttacaa tattttatca ccagagccg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtgactgg tgacccgtca accaagtc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met His His His}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Extensión C-terminal
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ser Lys Lys Lys Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Pro Ile Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Pep4AK
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Lys Lys Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg
Ile Ile Leu Ser Gly}
\sac{Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Sustrato NS3 fluorogénico internamente inactivado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asp Ile Val Pro Cys Ser Met Ser
Lys}
Claims (30)
1. Un polipéptido constituido por un fragmento de
una proteasa NS2/3 del virus de la hepatitis C (VHC), proteasa que
se produce de forma natural como un precursor de la proteasa NS2/3
del VHC, en el que el fragmento tiene como su resto
N-terminal un aminoácido que está en una posición
del resto 903 al 913 en el precursor de la proteasa NS2/3 del VHC y
como su resto del extremo C-terminal un aminoácido
que está en una posición del resto 1206 al 1657 en el precursor de
la proteasa NS2/3 del VHC, polipéptido que, cuando está en un
homodímero, tiene actividad autoproteolítica.
2. Un polipéptido según la reivindicación 1, en
el que el resto C-terminal del fragmento es el
aminoácido que está en la posición 1206 del precursor de la
proteasa NS2/3 del VHC.
3. Un polipéptido según la reivindicación 2, en
el que el resto N-terminal del fragmento es el
aminoácido que está en la posición 903 del precursor de la
proteasa NS2/3 del VHC.
4. Un polipéptido según la reivindicación 2, en
el que el resto N-terminal del fragmento es el
aminoácido que está en la posición 907 del precursor de la
proteasa NS2/3 del VHC.
5. Un polipéptido constituido por una secuencia
de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos al
90% sobre su longitud comparado con un fragmento de una proteasa
NS2/3 del VHC, proteasa que se produce de forma natural como un
precursor de la proteasa NS2/3 del VHC, en el que el fragmento
tiene como su resto N-terminal un aminoácido que
está en una posición del resto 903 al 913 en el precursor de la
proteasa NS2/3 del VHC y como su resto C-terminal
un aminoácido que está en una posición del resto 1206 al 1657 en el
precursor de la proteasa NS2/3 del VHC, polipéptido que, cuando
está en un homodímero, tiene actividad autoproteolítica, y en el
que el precursor de la proteasa NS2/3 del VHC es como el codificado
por el ácido nucleico de la cepa J del VHC como se proporciona en
la Figura 7 que representa el Nº Acc. de Genbank D90208, versión
D90208\bullet1, la cepa H del VHC como se proporciona en la
Figura 6 que representa el Nº Acc. de Genbank M67463, versión
M67463\bullet1 o la cepa H77 del VHC como se proporciona en la
Figura 5 que representa el Nº Acc. de Genbank AF009606, versión
AF009606\bullet1.
6. Un polipéptido según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 fusionado con uno o más restos de
aminoácidos heterólogos.
7. Un ácido nucleico aislado que codifica un
polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Un vector de expresión que comprende un ácido
nucleico según la reivindicación 7 unido de forma operativa a
secuencias reguladoras para la expresión de dicho polipéptido.
9. Una célula hospedadora transformada con un
vector de expresión según la reivindicación 8.
10. Un procedimiento de producción de un
polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,
comprendiendo el procedimiento provocar la expresión de un vector
de expresión según la reivindicación 8 para producir dicho
polipéptido.
11. Un procedimiento según la reivindicación 10
que comprende cultivar la célula hospedadora transformada con dicho
vector de expresión en condiciones para la producción de dicho
polipéptido.
12. Un procedimiento según la reivindicación 11
en el que las células hospedadoras se cultivan en condiciones
mediante las cuales el polipéptido producido se acumula en cuerpos
de inclusión insolubles.
13. Un procedimiento según la reivindicación 12
en el que las células hospedadoras se cultivan en medio carente de
cinc.
14. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13 que comprende aislar y/o purificar dicho
polipéptido.
15. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 14 que comprende renaturalizar o replegar el
polipéptido.
16. Un procedimiento según la reivindicación 15
que comprende integrar el polipéptido en un homodímero que tenga
actividad autoproteolítica.
17. Un homodímero que puede obtenerse mediante un
procedimiento según la reivindicación 16.
18. Un homodímero de dos polipéptidos según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
19. Un procedimiento para obtener un polipéptido
constituido por un fragmento de una proteasa NS2/3 del VHC,
proteasa que se produce de forma natural como un precursor de NS2/3
del VHC y polipéptido que, cuando está en un homodímero, tiene
actividad autoproteolítica, comprendiendo el procedimiento:
proporcionar uno o más fragmentos truncados de la
proteasa NS2/3 del VHC;
analizar la capacidad del fragmento truncado o
fragmentos truncados para formar un homodímero que tenga actividad
autoproteolítica para identificar un homodímero que tenga actividad
autoproteolítica;
por medio de lo cual se obtiene dicho
polipéptido.
20. Un procedimiento según la reivindicación 19
en el que el fragmento truncado o los fragmentos truncados tienen
como resto N-terminal un aminoácido que está en una
posición del resto 903 al 913 en el precursor de la proteasa NS2/3
del VHC y como resto C-terminal un aminoácido que
está en una posición del resto 1206 al 1657 en el precursor de la
proteasa NS2/3 del VHC.
21. Un procedimiento según la reivindicación 19 o
la reivindicación 20 que comprende producir dicho fragmento
truncado o fragmentos truncados mediante la expresión a partir del
ácido nucleico codificador.
22. Un procedimiento según la reivindicación 21
en el que dicho fragmento truncado o fragmentos truncados se
producen mediante la expresión provocada cultivando células
hospedadoras transformadas con dicho ácido nucleico codificador en
condiciones para la producción de dicho fragmento truncado o
fragmentos truncados.
23. Un procedimiento según la reivindicación 22
en el que las células hospedadoras se cultivan en condiciones en
las que el polipéptido producido se acumula en cuerpos de inclusión
insolubles.
24. Un procedimiento según la reivindicación 23
en el que las células hospedadoras se cultivan en medio carente de
cinc.
25. Un homodímero de dos polipéptidos que pueden
obtenerse mediante un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 24.
26. Un procedimiento de ensayo para analizar la
capacidad de un agente para modular la actividad de la proteasa
NS2/3 del VHC, que comprende:
(a) poner en contacto un agente de ensayo con los
polipéptidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o
con un homodímero de dos de dichos polipéptidos; y
(b) determinar la formación de homodímeros de dos
de dichos polipéptidos y/o la actividad de la proteasa NS2/3 del
VHC.
27. Un procedimiento según la reivindicación 26
que comprende determinar la dimerización de dichos
polipéptidos.
28. Un procedimiento según la reivindicación 26 o
la reivindicación 27 que comprende determinar la actividad de la
proteasa NS2/3 del VHC.
29. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 26 a 28 que comprende identificar un agente de
ensayo como una sustancia que modula la actividad de la proteasa
NS2/3 del VHC.
30. Uso de un polipéptido según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6 o de un homodímero de dos de dichos
polipéptidos en la identificación u obtención de una sustancia que
modula la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC.
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