ES2254380T3 - Fragmentos de ns2/3 del vhc y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido constituido por un fragmento de una proteasa NS2/3 del virus de la hepatitis C (VHC), proteasa que se produce de forma natural como un precursor de la proteasa NS2/3 del VHC, en el que el fragmento tiene como su resto N-terminal un aminoácido que está en una posición del resto 903 al 913 en el precursor de la proteasa NS2/3 del VHC y como su resto del extremo C-terminal un aminoácido que está en una posición del resto 1206 al 1657 en el precursor de la proteasa NS2/3 del VHC, polipéptido que, cuando está en un homodímero, tiene actividad autoproteolítica.

Description

Fragmentos de NS2/3 del VHC y usos de los mismos.

La presente invención se refiere a ensayos, procedimientos de selección, polipéptidos, miméticos y procedimientos de uso basados en un polipéptido derivado de la proteasa NS2/3 del virus de la hepatitis C (VHC).

El virus de la hepatitis C (VHC) es el principal agente causal de hepatitis no A, no B (H-NANB) esporádica y transmitida por vía parenteral. Se cree que aproximadamente el 1% de la población humana del planeta está infectada. La infección por el virus puede dar lugar a hepatitis crónica y cirrosis hepática y puede llevar a un carcinoma hepatocelular. Actualmente no existe vacuna ni una terapia establecida, aunque se ha conseguido un éxito parcial en una minoría de casos mediante el tratamiento con interferón-\alpha recombinante, solo o en combinación con ribavirina. Por tanto, existe una necesidad urgente de agentes terapéuticos nuevos y ampliamente eficaces.

Varias enzimas codificadas por virus son dianas posibles para una intervención terapéutica, incluyendo una autoproteasa (NS2-3), una serina proteasa (NS3), una helicasa (NS3) y una ARN polimerasa dependiente de ARN (NS5B).

El dominio proteasa NS3 se localiza en el extremo N-terminal de la proteína NS3 y es responsable de la escisión intramolecular en el sitio NS3/4A y del procesamiento intermolecular después del extremo 3' en las uniones NS4A/4B, NS4B/5A y NS5A/5B.

NS3 se forma por la escisión proteolítica de la molécula precursora NS2/3, que genera el extremo N-terminal maduro de NS3. Esta reacción está autocatalizada por la propia molécula precursora NS2/3.

Se cree que la actividad autocatalítica de la proteasa NS2/3 es esencial para la replicación del VHC (Kolykhalov, A. y col. (2000) J. Virol. 74 2046-2051) y, por tanto, representa una diana terapéutica potencialmente importante en el tratamiento de la infección por VHC.

Se desconoce el mecanismo exacto de la escisión de NS2/3, pero se sabe que es una reacción intramolecular, posiblemente cotransduccional, que está catalizada por la actividad proteolítica de NS2/3 (Wu y col., TIBS 23, 92-94, 1998). Puesto que la actividad se estimula mediante la adición de iones metálicos tales como Zn o Cd en ensayos de traducción in vitro, la enzima se ha clasificado provisionalmente como una metaloproteasa. El estudio del precursor NS2/3 ha sido complicado debido a su actividad autoproteolítica, su insolubilidad y su inestabilidad.

Aún no se ha informado de ensayos in vitro que usen una proteasa NS2/3 purificada. La insolubilidad e inestabilidad de la proteasa y su actividad autocatalítica han impedido el desarrollo de estos ensayos.

La actividad proteasa de NS2/3 en sistemas de traducción libres de células y en células transfectadas ha sido descrita por Grakoui y col. (1993) PNAS 90, 10583-10587 y Hijikata y col. (1993) J. Virol 67, 4665-4675. Estos grupos encontraron que el sitio de escisión de la proteasa NS2/3 está entre los restos 1026 y 1027 del polipéptido del VHC y se demostró que la escisión era dependiente de Zn. Se determinó que la Cys993 y la His952 eran esenciales para la escisión y también se requerían para la actividad las secuencias entre los restos 827 y 1186-1207. También se identificó una actividad de escisión en trans. Todos los estudios realizados por estos grupos fueron en células o en extractos celulares.

Reed y col. (1995) J. Virol. 69, 4127-4136 informaron de la actividdad de escisión en trans y la inhibición en trans de la escisión de la proteasa NS2/3 en sistemas basado en células y también describieron la secuencia específica de la reacción de escisión.

Pieroni y col. (1997) J. Virol 71, 6373-6380 describieron la producción del precursor de NS2/NS3 en forma latente en un sistema de traducción libre de células y también su reactivación mediante la adición de detergente. Sin embargo, el sistema descrito no implicaba a la enzima purificada.

La escisión en el sitio NS2/3 requiere tanto el dominio NS3 de la proteasa (pero no su actividad serina proteasa) como la proteína NS2 que empieza en el resto 810 del precursor NS2/3 del VHC. Los primeros \sim100 restos de NS2 son altamente hidrófobos y pueden asociarse con la membrana del RE en las células infectadas. Esta porción hidrófoba puede ser responsable de la escasa solubilidad de la proteína. Se ha demostrado que las deleciones de la región N-terminal hasta el resto 923 suprime la actividad.

En base al trabajo experimental y a la descripción de este documento, en diversos aspectos la presente invención se basa en la obtención de polipéptidos de la proteasa NS2/3 que se inician en uno de los resto del 903 al 913, es decir 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, 910, 911, 912 ó 913 y termina en el resto 1206, resto 1657 ó un resto entre el 1206 y el 1657.

Sorprendentemente, estos polipéptidos truncados mantienen la actividad autoproteolítica de la proteasa de longitud completa, pero se pueden purificar en la forma de precursor sin que sufran autoescisión. Además, ésta es una forma dimérica del polipéptido que se demuestra que es responsable de la actividad autoproteolítica. Por tanto, el polipéptido activo es capaz de dimerizarse para generar la actividad autoproteolítica.

La provisión de una molécula precursora activa permite en definitiva la provisión de ensayos y procedimientos de selección de agentes que pueden modular, especialmente inhibir, la actividad autoproteolítica del precursor NS2/3 y que, por tanto, tienen potencial terapéutico en el tratamiento del VHC.

Diversos aspectos de la presente invención proporcionan un polipéptido que tiene actividad autoproteolítica y que es capaz de expresarse en una forma inactiva sin autoescindirse y posteriormente, activarse. La forma autoproteolítica del polipéptido puede ser un homodímero.

La presente invención proporciona un polipéptido o un fragmento del polipéptido que tiene una unión N-terminal entre los restos 903 y 913 y una unión C-terminal en o entre los restos 1206 y 1657. El polipéptido o fragmento del polipéptido puede, por tanto, estar truncado en su extremo C-terminal y puede comprender la secuencia NS3 completa. Preferiblemente, el polipéptido o fragmento del polipéptido incluye el dominio proteasa completo de NS3. En realizaciones preferidas, la unión C-terminal está en el resto 1206.

Las referencias de este documento a la secuencia poliproteica del VHC y a los restos de ésta se refieren a una o más de las secuencias poliproteicas del VHC de las bases de datos siguientes: poliproteína de la cepa J del VHC, Nº de acceso de Swissprot P26662; poliproteína de la cepa H del VHC, Nº de acceso de Swissprot: P27958; poliproteína de la cepa H77, Nº de acceso de Translated-Genbank AAB66324 o Nº de acceso de TREMBL 036579. Sin embargo, también pueden emplearse aislados de otras cepas y genotipos del VHC de acuerdo con la presente invención.

Los aislados del VHC pueden derivar del VHC de genotipo 1a, 1b, 1c, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 4a, 4b, 4c, 4d, 5a, 6a, 6b, 7a, 7b, 8a, 8b, 9a, 9b, 9c, 10a u 11a, como se describe en Tokita, M. y col. J. Gen. Virol. (1996) 77, 293-301 y Myakawa, Y. y col. Molecular Med. Today (1995) 1, 20-25, o derivar del HVC de las cepas H-FDA, H-AP, VHC-1, VHC-J, VHC-BK, HC-J6, VHC-T, HC-J8 o VHC-JT descritas en Grakoui y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 10583-10587.

La presente invención también proporciona un polipéptido o un fragmento de polipéptido compuesto esencialmente por una secuencia de aminoácidos que se inicia en el resto 903, 913 o en un resto localizado entre estos restos y que termina en el resto 1206, 1657 o en un resto localizado entre estos restos. Por tanto, el polipéptido o fragmento del polipéptido puede estar truncado en su extremo C-terminal o puede comprender la secuencia completa de NS3. Preferiblemente, el polipéptido o fragmento de polipéptido incluye el dominio completo de la proteasa NS3.

El polipéptido o fragmento de polipéptido, por ejemplo, puede tener una unión N-terminal en el resto 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, 910, 911, 912 ó 913 de la poliproteína del VHC y una C-terminal en o entre los restos 1206 y 1657, por ejemplo, resto 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600 ó 1650.

Un polipéptido puede estar en forma aislada y/o purificada, libre o sustancialmente libre de material con el que puede estar asociada, tal como otros polipéptidos, o (por ejemplo, si se produce mediante expresión en una célula procariótica) carente de glicosilación nativa, por ejemplo, sin glicosilar.

La presente invención también proporciona polipéptidos que son variantes, derivados o mutantes de la secuencia de aminoácidos. Un polipéptido que es una variante, derivado o mutante puede tener una secuencia de aminoácidos que difiera de la secuencia correspondiente de la poliproteína del VHC (por ejemplo, la Nº de acceso de Swissprot: P26662 descrita anteriormente) mediante una o más adiciones, sustituciones, deleciones e inserciones de uno o más aminoácidos pero que, en forma dimérica, tiene una actividad autoproteolítica y puede expresarse en una forma inactiva y activarse posteriormente.

Las secuencias de aminoácidos pueden estar compuestas de entre 293 y 754 restos, y se corresponden con la secuencia de inicio en o entre los restos 903 y 913, extendiéndose hasta una secuencia en o entre los restos 1206 y 1657 de la proteasa nativa del VHC. Más preferiblemente, las secuencias pueden estar compuestas de entre 293 y 303 restos, que se corresponden con la secuencia de inicio en o entre los restos 903 y 913 y se extiende hasta el resto 1206 de la proteasa del VHC nativo.

Un polipéptido que es una variante, derivado o mutante de la secuencia de aminoácidos de la región correspondiente de la secuencia de la poliproteína del VHC puede comprender una secuencia de aminoácidos que comparta más de aproximadamente el 60% de similitud, más de aproximadamente el 70% de similitud, más de aproximadamente el 80% de similitud, más de aproximadamente el 90% de similitud, más de aproximadamente el 95% de similitud o sea sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de la poliproteína NS2/3 del VHC. Generalmente, la similitud de aminoácidos se define con respecto al algoritmo GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI) como se ha señalado anteriormente, o al programa TBLASTN, de Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. La similitud permite la "variación conservativa", es decir, la sustitución de un resto hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitución de un resto polar por otro, tal como arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico o glutamina por asparragina. Las variantes de secuencia de aminoácidos en particular pueden diferir de una secuencia referida en este documento en la inserción, adición, sustitución o deleción de 1 aminoácido, 2, 3, 4, 5-10, 10-20, 20-30, 30-50, 50-100, 100-150 o más de 150 aminoácidos.

La comparación de secuencia puede hacerse a lo largo de la longitud completa de las secuencias relevantes mostradas en ese documento.

Generalmente, como bien se entenderá, la homología al nivel de aminoácidos es en cuanto a similitud o identidad de aminoácidos. La similitud permite la "variación conservativa", es decir, la sustitución de un resto hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitución de un resto polar por otro, tal como arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico o glutamina por asparragina. La homología puede tomarse sobre la longitud completa de una secuencia o sobre una parte, tal como 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200 nucleótidos o aminoácidos contiguos. Cuando se dice que estas dos secuencias de nucleótidos comparten "homología" o son "homólogos" se hace en base a la comparación de secuencias. Para esto es irrelevante cualquier relación filogenética. Los expertos en la materia se refieren de forma habitual a la homología entre secuencias de nucleótidos sin implicación del origen evolutivo. También puede decirse que dos secuencias de nucleótidos homólogas son "similares" o tienen un cierto porcentaje de similitud o un cierto porcentaje de identidad.

En general, no es crítico cual de los diversos algoritmos convencionales se use para determinar el grado de homología de dos secuencias de nucleótidos con otra. Un algoritmo preferido puede ser GAP, que usa el procedimiento de alineamiento de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (1970) 48, 443-453) y está incluido en el Manual de Programas o el Paquete de Wisconsin, Versión 8, septiembre 1994, (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE.UU.). En ausencia de instrucciones contrarias, el experto entenderá que se usen los parámetros por defecto con el objetivo de maximizar el alineamiento, con una penalización por creación de hueco = 12 y una penalización por extensión del hueco = 4.

La similitud u homología (los términos se usan indistintamente) o identidad puede ser como se define y determina en el programa TBLASTN de Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10, o BestFit, que es parte del Paquete de Wisconsin, Versión 8, septiembre de 1994 (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE.UU., Wisconsin 53711). Las comparaciones de secuencia preferiblemente se hacen usando FASTA y FASTP (véase Pearson y Lipman, 1988, Methods in Enzymology, 183: 63-98). Los parámetros preferiblemente se establecen usando la matriz por defecto, como sigue: Gapopen (penalización para el primer resto en un hueco): -12 para proteínas/-16 para ADN; Gapext (penalización para restos adicionales en un hueco): -2 para proteínas/-4 para ADN; longitud de palabra KTUP: 2 para proteínas/6 para ADN.

La homología de la secuencia de ácidos nucleicos puede determinarse mediante hibridación selectiva entre moléculas en condiciones rigurosas.

Los experimentos preliminares pueden realizarse por hibridación en condiciones poco rigurosas. Para la incubación con una sonda, las condiciones preferidas son aquellas que son suficientemente rigurosas como para ser un simple patrón con un pequeño número de hibridaciones identificadas como positivas que pueden ser investigadas adicionalmente.

Por ejemplo, las hibridaciones pueden realizarse, según el procedimiento de Sambrook y col. (a continuación) usando una solución de hibridación que comprende: SSC x 5 (donde > SSC= = cloruro sódico 0,15 M; citrato sódico 0,15 M; pH 7), reactivo de Denhardt x 5, SDS al 0,5-1,0%, ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado a 100 \mug/ml, pirofosfato sódico al 0,05% y formamida hasta el 50%. La hibridación se realiza a 37-42ºC durante al menos seis horas. Tras la hibridación, los filtros se lavan como sigue: (1) 5 minutos a temperatura ambiente en SSC x 2 y SDS al 1%; (2) 15 minutos a temperatura ambiente en SSC x 2 y SDS al 0,1%; (3) 30 minutos - 1 hora a 37ºC en SSC x 1 y SDS al 1%; (4) 2 horas a 42-65ºC en SSC x 1 y SDS al 1%, cambiando la solución cada 30 minutos.

Una fórmula común para calcular las condiciones rigurosas requeridas para alcanzar la hibridación entre moléculas de ácido nucleico de una homología de secuencia especificada es (Sambrook y col., 1989): T_{m} = 81,5ºC + 16,6 Log [Na+] + 0,41 (% G+C) - 0.63 (% de formamida) - 600/ Nº de pb en doble cadena.

Como un ejemplo de la fórmula anterior, usando [Na^{+}] = [0,368] y formamida al 50%, con el contenido en GC del 42% y un tamaño medio de sonda de 200 bases, la T_{m} es 57ºC. La T_{m} de un ADN dúplex desciende en 1 -1,5ºC con cada descenso del 1% de la homología. De este modo, las dianas con más de aproximadamente el 75% de identidad de secuencias se observarían usando una temperatura de hibridación de 42ºC. Esta secuencia se consideraría sustancialmente homóloga a la secuencia del ácido nucleico de la presente invención.

Es bien conocido en la técnica que aumentando gradualmente la rigurosidad de la hibridación sólo permanezcan algunos clones positivos. Otras condiciones adecuadas incluyen, por ejemplo para la detección de secuencias que son aproximadamente el 80-90% idénticas, la hibridación durante la noche a 42ºC en Na_{2}HPO_{4} 0,25 M, pH 7,2 SDS al 6,5%, sulfato de dextrano al 10% y un lavado final a 55ºC en SSC x 0,1, SDS al 0,1%. Para la detección de secuencias que tienen una identidad mayor de aproximadamente el 90%, las condiciones adecuadas incluyen la hibridación durante la noche a 65ºC en Na_{2}HPO_{4} 0,25 M, pH 7,2, SDS al 6,5%, sulfato de dextrano al 10% y un lavado final a 60ºC en SSC x 0,1, SDS al 0,1%.

El experto puede usar las técnicas descritas en este documento y otras bien conocidas en la técnica para producir grandes cantidades de polipéptido, por ejemplo, mediante la expresión a partir del ácido nucleico codificador.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe anteriormente.

La secuencia codificadora puede ser la del gen NS2/3 del VHC (cepa J del VHC, Nº de acceso de Genbank D90208; cepa H del VHC, Nº de acceso de Genbank M67463; cepa H77 del VHC, Nº de acceso de Genbank AF009606) o puede ser un mutante, variante o derivado de esta secuencia. La secuencia puede diferir de la secuencia de nucleótidos de NS2/3 del VHC mediante un cambio que es una o más adiciones, inserciones, deleciones y sustituciones de uno o más nucleótidos de la secuencia. Los cambios en una secuencia de nucleótidos pueden dar lugar a un cambio de aminoácidos a nivel de la proteína, o no, según determine el código genético.

De este modo, el ácido nucleico según la presente invención puede incluir una secuencia diferente de la secuencia del ácido nucleido de NS2/3 del VHC que aún codifica un polipéptido con la misma secuencia de aminoácidos.

Generalmente, se proporciona un ácido nucleico según la presente invención como un aislado, en forma aislada y/o purificada o libre o sustancialmente libre de material con el que se asocia de forma natural, tal como libre o sustancialmente libre del ácido nucleico que flanquea el gen en el genoma viral, excepto posiblemente una o más secuencias reguladoras para la expresión. El ácido nucleico puede ser completa o parcialmente sintético y puede incluir ADN genómico, ADNc o ARN. La secuencia codificadora mostrada en este documento en una secuencia de ADN. Cuando el ácido nucleico según la invención incluye ARN, debería interpretarse que la referencia a la secuencia mostrada abarca la referencia al ARN equivalente con la T sustituida por U.

El ácido nucleico puede proporcionarse como parte de un vector que se puede replicar y la presente invención también proporciona un vector que incluye un ácido nucleico como se expone anteriormente, en particular cualquier vector de expresión a partir del cual puede expresarse el polipéptido codificado en las condiciones apropiadas, y una célula hospedadora que contiene cualquiera de estos vectores o ácidos nucleicos. En este contexto, un vector de expresión es una molécula de ácido nucleico que incluye un ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés y secuencias reguladoras apropiadas para la expresión del polipéptido, en un sistema de expresión in vitro, por ejemplo, lisado de reticulocitos, o in vivo, por ejemplo, en células eucarióticas tales como células COS o CHO, o en células procarióticos tales como E. coli. Las células que comprenden los vectores como se describe anteriormente son un aspecto adicional de la presente invención.

Generalmente, se proporciona un ácido nucleico según la presente invención como un aislado, en forma aislada y/o purificada, o libre o sustancialmente libre de material con el que se asocia de forma natural, tal como libre o sustancialmente libre del ácido nucleico que flanquea el gen en el genoma (por ejemplo, viral), excepto posiblemente una o más secuencias reguladoras para la expresión. El ácido nucleico puede ser completa o parcialmente sintético y puede incluir ADN genómico, ADNc o ARN.

Los expertos pueden preparar fácilmente secuencias de ácido nucleico que codifiquen los polipéptidos de la presente invención usando la información y las referencias contenidas en este documento y las técnicas conocidas en la materia (por ejemplo, véase Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, y Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992). Estas técnicas incluyen (i) el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar muestras de este ácido nucleico, por ejemplo a partir de fuentes genómicas, (ii) síntesis química o (iii) preparación de secuencias de ADNc. Puede generarse ADN que codifique los polipéptidos y usarse en cualquier forma adecuada conocida por los expertos en la materia, incluyendo tomar el ADN codificador, identificar los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados en cualquier lado de la porción que se va a expresar y cortar dicha porción del ADN. A continuación, la porción puede unirse de forma operativa a un promotor adecuado en un sistema de expresión convencional disponible en el mercado. Otra aproximación recombinante es amplificar la porción relevante del ADN con cebadores para PCR adecuados.

Las modificaciones de una secuencia de ácido nucleico pueden hacerse, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida a sitio que lleva a la producción de un polipéptido modificado, por ejemplo, teniendo en cuenta el codon de preferencia en las células hospedadoras usadas para expresar el ácido nucleico.

Para obtener la expresión de las secuencias de ácido nucleico de la invención, las secuencias pueden incorporarse a un vector que tenga una o más secuencias control unidas de forma operativa al ácido nucleico para controlar su expresión. Los vectores pueden elegirse o construirse. Pueden contener secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, fragmentos de terminación, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadotas, genes marcadores y otras secuencias según sea apropiado, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico de modo que el polipéptido o péptido se produce como una fusión y/o ácido nucleico que codifica señales de secreción, de modo que el polipéptido producido en la célula hospedadora se secreta a partir de la célula. Los vectores puede ser plasmídicos, virales, por ejemplo, fago o fagémido, según sea apropiado. Para detalles adicionales véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2ª edición, Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica y análisis de proteínas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col. eds., John Wiley & Sons, 1992.

A continuación, el polipéptido puede obtenerse transformando los vectores en células hospedadoras en las que el vector es funcional, cultivando las células hospedadoras de modo que se produzca el polipéptido y recuperando el polipéptido de las células hospedadoras o del medio circundante.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona una célula hospedadora que contiene un ácido nucleico heterólogo como se describe en este documento.

Son bien conocidos los sistemas para clonar y expresar polipéptido en una diversidad de células hospedadoras diferentes. Las células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias, células eucarióticas, tales como de mamíferos y levaduras y sistemas de baculovirus. Las líneas celulares de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino, células HeLa, células de riñón de cría de hámster, células COS y muchas otras. Una bacteria hospedadora común preferida es E. coli.

El ácido nucleico de la invención puede integrarse en el genoma (por ejemplo, el cromosoma) de la célula hospedadora. La integración puede promoverse mediante la inclusión de secuencias que promuevan la recombinación con el genoma, según técnicas convencionales. El ácido nucleico puede estar en un vector extracromosómico dentro de la célula o de cualquier otra forma identificable como heterólogo o extraño para la célula.

Un aspecto adicional proporciona un procedimiento que incluye introducir una molécula de ácido nucleico de la invención en una célula hospedadora. La introducción, que generalmente puede (especialmente para la introducción in vitro) denominarse sin limitación como "transformación", puede emplear cualquier técnica disponible. Para las células eucarióticas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato cálcico, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otros virus, por ejemplo, vaccinia o, para células de insectos, baculovirus. Para células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro cálcico, electroporación y transfección usando bacteriófago. Como alternativa, podría emplearse la inyección directa del ácido nucleico.

Pueden usarse genes marcadores, tales como genes de resistencia o sensibilidad a antibióticos, en la identificación de clones que contienen el ácido nucleico de interés, como es bien conocido en la técnica.

La introducción puede seguirse provocando o permitiendo la expresión a partir del ácido nucleico, por ejemplo, cultivando células hospedadoras (que realmente pueden incluir células transformadas aunque más probablemente las células serán descendientes de las células transformadas) en condiciones para la expresión del gen, de modo que se produzca el polipéptido codificado. Si el polipéptido se expresa unido a un péptido líder señal apropiado, éste puede secretarse de la célula al medio de cultivo. Tras la producción mediante expresión, puede aislarse y/o purificarse un polipéptido a partir de la célula hospedadora y/o del medio de cultivo, según sea el caso, y posteriormente, usarse como se desee, por ejemplo, en la formulación de una composición que puede incluir uno o más componentes adicionales, tal como una composición farmacéutica que incluye uno o más excipientes, vehículos o transportadores farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, véase a continuación).

En vista de lo anterior, la presente invención también proporciona un procedimiento para hacer un polipéptido truncado de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención, incluyendo el procedimiento la expresión a partir de un ácido nucleico que codifica el polipéptido. Esto puede conseguirse convenientemente cultivando una célula hospedadora que contenga el ácido nucleico en cultivo en las condiciones apropiadas que causen o permitan la expresión del polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC, mientras que se minimiza la autoproteolisis. Las condiciones preferidas incluyen un medio carente o bajo en Zn. Este impide el plegamiento de la porción NS3 de la molécula precursora, impidiendo así el autoprocesamiento y llevando a la formación de una proteína insoluble que se acumula en cuerpos de inclusión.

Los procedimientos para la purificación de proteínas insolubles expresadas en cuerpos de inclusión son bien conocidos por los expertos en la materia. Convenientemente, se emplea la filtración en gel en condiciones de desnaturalización seguida de cromatografía en fase inversa.

La proteína desnaturalizada purificada puede renaturalizarse tras la purificación mediante el ajuste de las condiciones que permiten el replegamiento. Preferiblemente, esto se consigue en un tampón de replegamiento en el que se reduce la concentración del agente caotrópico (guanidina) mediante diálisis hasta una concentración residual de 0,75 M, la fuerza iónica es mayor de 200 mM de NaCl y la concentración de proteína es menos de 100 \mug/ml. La proteína soluble replegada se puede medir mediante análisis del sobrenadante tras la ultracentrifugación de la muestra replegada.

La proteína soluble replegada puede activarse alterando las condiciones del tampón. Un tampón adecuado para la activación de la proteasa puede incluir los siguientes componentes:

Fuerza iónica equivalente a al menos 50 mM, preferiblemente a al menos 100 mM o al menos 150 mM de NaCl, por ejemplo, 200 mM, 250 mM o 300 mM de NaCl;

glicerol al 10-60%, preferiblemente glicerol al 20-50%, por ejemplo, glicerol al 30%, 40% o 50%;

CHAPS al 0,5%-3%, preferiblemente CHAPS al 1-2%, por ejemplo CHAPS al 1%, 1,5% o 2%;

pH 6,5-8,5, preferiblemente pH 7-8, por ejemplo pH 7, 7,5 u 8;

agente reductor 1-100 mM (por ejemplo, cisteína o DTT), preferiblemente agente reductor 1-10 mM, por ejemplo, 1 mM, 3 mM, 5 mM o 10 mM de agente reductor;

Zn^{++} 1-100 \muM, preferiblemente Zn^{++} 5-50 \muM, por ejemplo Zn^{++} 30 \muM, 40 \muM o 50 \muM.

Un procedimiento de activación es reducir la concentración de proteína a 2,5 \mug/ml o menos en un tampón que contiene TRIS 50 mM, pH 7,5, glicerol al 50%, CHAPS al 2%, NaCl 250 mM, DTT 3 mM, Zn^{++} 30 \muM (véase el Ejemplo 7).

Diversos aspectos de la presente invención proporcionan ensayos y procedimientos para la selección y/u obtención/identificación de una sustancia que modula, por ejemplo, inhibe, reduce o interfiere con la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC y para el uso de los polipéptidos de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención en estos procedimientos y ensayos de selección. La actividad de la proteasa puede modularse mediante la promoción o inhibición de la dimerización.

Un procedimiento de selección o ensayo para identificar un agente que pueda modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC puede incluir:

(a) poner en contacto un agente de ensayo con un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención; y

(b) determinar la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC.

El polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC, que se pone en contacto con el agente de ensayo, puede estar en la forma monomérica o en la dimérica. Cuando el polipéptido es monomérico, el agente de ensayo puede modular la formación de la forma dimérica, la actividad proteolítica del dímero o ambas. Cuando el polipéptido es dimérico, el agente de ensayo puede modular la formación de la forma monomérica, la actividad proteolítica del dímero o ambas.

La modulación de la formación de la forma dimérica o monomérica puede conseguirse influenciando sobre el equilibrio dinámico entre las dos formas.

Adicionalmente, un procedimiento de selección o ensayo puede incluir la etapa de activación de la proteasa NS2/3 del VHC. Esta activación puede conseguirse cambiando las condiciones del tampón.

Los polipéptidos de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención pueden formar homodímeros, de modo que un agente que afecta a la dimerización del polipéptido puede modular la actividad autoproteolítica.

La actividad de un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención puede determinarse evaluando la proporción del polipéptido en la forma dimérica activa.

Por lo tanto, un procedimiento de selección o ensayo para identificar un agente que pueda modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC puede incluir:

(a) poner en contacto un agente de ensayo con un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención; y

(b) determinar la dimerización del polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC.

La dimerización puede determinarse mediante procedimientos convencionales bien conocidos para un experto, por ejemplo, mediante el uso de cromatografía de filtración en gel, anticuerpos o la dependencia de las cinéticas de escisión sobre la concentración de proteína.

Un aspecto relacionado de la presente invención proporciona el uso de un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención para determinar la presencia en una muestra de ensayo de un agente que tiene la capacidad de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del HVC nativa.

Un procedimiento para determinar la presencia en una muestra de ensayo de un agente que tiene la capacidad para modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC puede incluir:

(a) poner en contacto un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención con el agente de ensayo; y

(b) determinar la actividad del polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC.

Adicionalmente, el procedimiento puede incluir la etapa de activación del polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC. Esta activación puede conseguirse cambiando las condiciones del tampón.

La activación del polipéptido puede comprender la promoción de la formación de homodímeros del polipéptido.

Un agente que puede modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC puede afectar a la formación de la forma dimérica activa.

Un procedimiento para determinar la presencia en una muestra de ensayo de un agente que tiene la capacidad de modular la dimerización de la proteasa NS2/3 del VHC puede incluir:

(a) poner en contacto un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención con el agente de ensayo; y

(b) determinar la actividad proteasa de NS2/3 del VHC.

La actividad en presencia de una sustancia de ensayo puede compararse con la actividad del polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC en medios y condiciones de reacción comparables, en ausencia de la sustancia de ensayo. De ese modo puede identificarse una sustancia de ensayo capaz de modular la actividad. Una diferencia en la actividad del polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC entre las condiciones tratada y no tratada es indicativa de un efecto modulador de la sustancia o sustancias de ensayo relevantes. La actividad puede relacionarse con el grado de dimerización del polipéptido.

La sustancia de ensayo relevante puede alcanzar un efecto modulador afectando (es decir, reduciendo o aumentando) la dimerización de un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención. La presencia de un efecto modulador puede determinarse evaluando la dimerización del polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC.

Un procedimiento para determinar la presencia en una muestra de ensayo de un agente que tiene la capacidad de modular la dimerización de la proteasa NS2/3 del VHC puede incluir:

(a) poner en contacto un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención con el agente de ensayo; y

(b) determinar la dimerización del polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC.

La actividad puede determinarse mediante cualquier procedimiento adecuado. Los ejemplos de estos procedimientos incluyen una aproximación basada en HPLC en la que una enzima activada se incuba durante un tiempo fijo y se separa el precursor sin escindir de los productos en una columna de HPLC, relacionándose la cantidad de producto medida mediante fluorescencia con la actividad. Otra aproximación implica separar el producto NS3 escindido del precursor NS2/3 y del producto NS2 mediante etiquetas 5' y cuantificar la cantidad de NS3 mediante un ensayo convencional fluorimétrico o radiométrico.

Un procedimiento para determinar la presencia en una muestra de ensayo de un agente que tiene la capacidad de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC, puede incluir cuantificar la actividad de un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención y/o la cantidad de dicho agente en la muestre y/o la cantidad de dimerización del polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC.

En el caso apropiado, pueden incluirse uno o más controles en los ensayos y procedimientos descritos en este documento. Un experto podría fácilmente emplear los controles adecuados.

Los agentes que modulan, por ejemplo, aumentan o potencian la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC, pueden identificarse usando condiciones que, en ausencia de un agente positivo en el ensayo, destruye o reduce la actividad.

Los procedimientos para determinar la presencia, y opcionalmente cuantificar su cantidad, de un agente en una muestra de ensayo que tiene la capacidad de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC pueden tener fines diagnósticos, por ejemplo, en la evaluación de una terapia para tratar una afección asociada con la infección por el VHC.

Un procedimiento de selección o ensayo puede incluir purificar y/o aislar una sustancia de ensayo (por ejemplo, un agente del que se va a ensayar la capacidad para modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC) a partir de una mezcla o extracto, es decir, reducir el contenido de al menos un componente de la mezcla y del extracto, por ejemplo, un componente con el que la sustancia ensayado se asocia de forma natural. El procedimiento de selección o ensayo puede incluir determinar la capacidad de una o más fracciones de una mezcla o extracto de ensayo para modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC. La purificación y/o aislamiento puede emplear cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia.

Los expertos en la materia pueden variar el formato preciso de cualquiera de los procedimientos de selección o ensayo de la presente invención usando técnicas y conocimientos habituales. El experto conoce bien la necesidad de emplear experimentos de control apropiados.

En cualquier procedimiento de ensayo según la invención, la cantidad de sustancia o compuesto de ensayo que puede añadirse a un ensayo de la invención normalmente se determinará mediante ensayo y error dependiendo del tipo de compuesto usado. Típicamente, pueden usarse concentraciones de aproximadamente 0,001 nM a 1 mM o concentraciones mayores del posible compuesto modulador/inhibidor, por ejemplo, de 0,01 nM a 100 \muM, por ejemplo, de 0,1 a 50 \muM, tales como aproximadamente 10 \muM. Pueden usarse concentraciones mayores cuando la sustancia de ensayo es un péptido. Incluso una molécula que tiene un efecto débil puede ser un compuesto cabeza de serie útil para investigación y desarrollo adicional.

Puede aislarse y/o purificarse y/o investigarse de forma adicional y/o producirse un compuesto o agente identificado por cualquiera de los procedimientos proporcionados por la presente invención. En otra parte de este documento se describen diversos procedimientos y usos de estos compuestos. De este modo, la presente invención proporciona procedimientos de identificación de agentes que tienen la capacidad de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC.

Un agente o sustancia empleada en un procedimiento según la presente invención puede ser un compuesto químico natural o sintético y puede ser una molécula orgánica, inorgánica, péptido, ácido nucleico u otras. Los compuestos adecuados que puede seleccionarse incluyen compuestos químicos naturales o sintéticos usados en programas de selección de fármacos. También pueden usarse extractos de plantas, microbios u otros organismos que contienen diversos componentes caracterizados o sin caracterizar.

Es digno de mencionar que la tecnología de bibliotecas combinatorias proporciona una manera eficaz de probar la capacidad de un número potencialmente extenso de sustancias diferentes para modular una interacción. Estas bibliotecas y sus usos son conocidos en la técnica para todas las formas de productos naturales, pequeñas moléculas y péptidos, entre otros. En ciertas circunstancias, puede preferirse el uso de bibliotecas peptídicas.

Una clase de probables moduladores comprende fragmentos peptídicos derivados de polipéptidos de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención, o alelos, mutantes o derivados de estos fragmentos. Puede probarse la capacidad para inhibir la autoproteolisis de fragmentos peptídicos de 5 a 40 aminoácidos, por ejemplo de 6 a 10 aminoácidos a partir de las regiones del polipéptido donde tiene lugar la escisión o que son responsables de la actividad.

Otros péptidos adecuados son los que modulan la actividad de un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención y que tienen una longitud de 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75, 75-80, 80-85, 85-90, 90-95, 95-100 o más de 100 aminoácidos.

Otros péptidos adecuados son los que inhiben la dimerización de un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención y que tienen una longitud de 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75, 75-80, 80-85, 85-90, 90-95, 95-100 o más de 100 aminoácidos.

El ácido nucleico que codifica estos fragmentos, vectores y células hospedadoras que contienen estos ácidos nucleicos y procedimientos de expresión del ácido nucleico que codifica estos fragmentos son aspectos adicionales de la presente invención.

Otros compuestos candidatos inhibidores pueden basarse en el modelado de la estructura tridimensional del polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC y el uso racional del diseño de fármacos para proporcionar compuesto potenciales inhibidores con características particulares de la forma molecular, tamaño y carga.

Tras la identificación de una sustancia que modula o afecta a la actividad proteasa, la sustancia puede investigarse más en profundidad. Además, puede fabricarse y/o usarse en la preparación, es decir, fabricación o formulación, de una composición tal como un medicamento, composición farmacéutica o fármaco. Éstas pueden administrarse a individuos.

En diversos aspectos, la presente invención proporciona un modulador identificado mediante un procedimiento de selección de la invención, por ejemplo, una sustancia que inhibe o disminuye, aumenta o potencia la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC.

Tras la identificación, el modulador puede purificarse y/o investigarse más en profundidad y/o fabricarse. Puede usarse un modulador para obtener miméticos peptídicos o no peptídicos, por ejemplo, mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia y descritos en este documento. Puede usarse en un contexto terapéutico como se describe a continuación.

Los anticuerpos dirigidos frente a un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención forman una clase adicional de probables compuestos inhibidores. Los anticuerpos inhibidores candidatos pueden caracterizarse y puede determinarse sus regiones de unión para proporcionar anticuerpos de cadena única y fragmentos de los mismos que sean responsables de afectar a la actividad proteasa.

Los anticuerpos pueden obtenerse usando técnicas que son convencionales en la materia. Los procedimientos de producción de anticuerpos incluyen inmunizar a un mamífero (por ejemplo, ratón, rata, conejo, caballo, cabra, oveja o mono) con un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención. Los anticuerpos pueden obtenerse a partir de animales inmunizados usando cualquiera de una diversidad de técnicas conocidas en la materia y seleccionarse para modular la actividad de la NS2/3 del VHC usando un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de inmunotransferencia o inmunoprecipitación (Armitage y col., 1992, Nature 357: 80-82). El aislamiento de anticuerpos y/o de células que producen anticuerpo a partir de un animal puede ir acompañado de una etapa de sacrificio del animal.

Como alternativa o suplemento para inmunizar a un mamífero con un péptido, puede obtenerse un anticuerpo específico de un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención a partir de una biblioteca producida por tecnología de recombinación de dominios variables de inmunoglobulina expresados, por ejemplo, usando bacteriófago lambda o bacteriófago filamentoso que expresan dominios de unión de inmunoglobulina funcional a sus superficies; por ejemplo, véase el documento WO92/01047. La biblioteca puede ser virgen, construida a partir de secuencias obtenidas de un organismo que no ha sido inmunizado con un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención (o fragmentos del mismo) o puede ser una construida usando secuencias obtenidas a partir de un organismo que ha estado expuesto al antígeno de interés. Los anticuerpos candidatos pueden seleccionarse por modular la actividad de NS2/3 del VHC usando el polipéptido de la proteasa NS2/3.

Los anticuerpos según la presente invención pueden modificarse de varias formas. De hecho, debe interpretarse que el término "anticuerpo" abarca cualquier sustancia de unión que tenga un dominio de unión con la especificidad requerida. De este modo, la invención abarca fragmentos de anticuerpo, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, incluyendo moléculas sintéticas y moléculas cuya forma mimetiza la de un anticuerpo, que permite a éste unirse a un antígeno o a un epítope.

Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo, capaces de unirse a un antígeno u otra pareja de unión son el fragmento Fab compuesto por los dominios VL, VH, C1 y CH1; el fragmento Fd compuesto por los dominios VH y CH1; el fragmento Fv compuesto por los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, el fragmento dAb compuesto por un dominio VH; regiones CDR aisladas y fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra. También están incluidos fragmentos Fv de cadena única.

Un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal según la presente invención puede estar sometido a mutación genética o a otros cambios. Adicionalmente, los expertos en la materia entenderán que un anticuerpo monoclonal puede someterse a las técnicas de la tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que retienen la especificidad del anticuerpo original. Estas técnicas pueden implicar la introducción del ADN que codifica la región variable de la inmunoglobulina o las regiones determinantes de complementariedad (CDR), de un anticuerpo en las regiones constantes, o regiones constantes más las regiones del armazón, de una inmunoglobulina diferente. Véase, por ejemplo, los documentos EP184187A, GB2188638A o EP-A-0239400. La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describen en los documentos EP-A-0120694 y EP-A-0125023.

Los hibridomas capaces de producir anticuerpos con las características de unión deseadas están dentro del alcance de la presente invención, así como lo están las células hospedadoras, eucarióticas o procarióticas, que contiene ácidos nucleicos que codifican anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpos) y capaces de su expresión. También se describen procedimientos de producción de los anticuerpos que incluyen cultivar una célula capaz de producir el anticuerpo en condiciones en las que se produce el anticuerpo y, preferiblemente, se secreta.

Los anticuerpos también pueden usarse para purificar y/o aislar polipéptidos de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención, por ejemplo, siguiendo la producción del polipéptido mediante la expresión del ácido nucleico del mismo. Los anticuerpos puede ser útiles en un contexto terapéutico (que puede incluir profilaxis) para interrumpir la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC con miras a inhibir la replicación del VHC y, por tanto, reducir o prevenir la infección por VHC. Por ejemplo, los anticuerpos puede microinyectarse en células o tejidos, o administrarse por vía sistémica. Los anticuerpos pueden emplearse según la presente invención para otros fines terapéuticos y no terapéuticos que se discuten en otra parte de este documento.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona en uso de un agente que es capaz de modular la actividad de un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención, en un procedimiento de diseño de un mimético peptídico o no peptídico del compuesto, cuyo mimético es capaz de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC. El agente usando en este procedimiento puede ser un agente identificado usando procedimiento según la presente invención.

De forma similar, la presente invención proporciona el uso de un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención en un procedimiento de diseño de un mimético peptídico o no peptídico de una proteasa NS2/3 del VHC, cuyo mimético es capaz de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC.

Por lo tanto, se describe un procedimiento de diseño de un mimético de un compuesto que tiene la actividad biológica para modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC, como se determina por los procedimientos de la presente invención, o un procedimiento de diseño de un mimético de un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención que tiene la actividad biológica de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC, como se determina mediante los procedimientos de la presente invención, comprendiendo dicho procedimiento:

(i) analizar una sustancia que tiene la actividad biológica para determinar los restos de aminoácidos esenciales e importantes para la actividad que define un farmacóforo; y

(ii) modelar el farmacóforo para diseñar y/o seleccionar miméticos candidatos que tengan la actividad biológica.

En la materia se conocen técnicas adecuadas de modelado. Estas técnicas permiten el estudio de la interacción entre un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención y un compuesto modulador y diseñar compuestos que contenga grupos funcionales ordenador de modo que puedan reproducir esta interacción.

El diseñado de miméticos de un compuesto farmacéuticamente activo conocido es una aproximación conocida para el desarrollo de compuestos farmacéuticos basados en un compuesto "cabeza de serie". Esto podría ser deseable cuando el compuesto activo es difícil o caro de sintetizar o cuando no es adecuado para un procedimiento de administración en particular, por ejemplo, los compuestos de la presente invención que son péptidos pueden no ajustarse bien como agentes activos para composiciones orales ya que tienden a ser degradados rápidamente por las proteasas del canal alimenticio.

Hay varias etapas que normalmente se siguen en el diseño de un mimético a partir de un compuesto que tiene una determinada propiedad como diana. En primer lugar, se determinan las partes particulares del compuesto en particular que son críticas y/o importantes para determinar la propiedad como diana. En el caso de un péptido, esto puede hacerse variando sistemáticamente los restos de aminoácidos del péptido, por ejemplo, sustituyendo sucesivamente cada resto. Estas partes o restos que constituyen la región activa del compuesto se conocen como su "farmacóforo".

Una vez que se ha encontrado el farmacóforo, se modela su estructura según sus propiedades físicas, por ejemplo, estereoquímica, uniones, tamaño y/o carga, usando los datos de una gama de fuentes, por ejemplo, técnicas espectroscópicas, datos de difracción de rayos X y RMN. En este proceso puede usarse el análisis por ordenador, mapeo de similitud (que modela la carga y/o volumen de un farmacóforo, en lugar de la unión entre los átomos) y otras
técnicas.

En una variante de la aproximación anterior, se modela la estructura tridimensional de un ligando y su pareja de unión. Esto puede ser especialmente útil cuando el ligando y/o la pareja de unión cambian de conformación durante la unión, permitiendo al modelo tener en cuenta esto en el diseño del mimético.

A continuación, se selecciona una molécula molde en la cual pueden injertarse grupos químicos que mimetizan al farmacóforo. La molécula molde y los grupos químicos injertados en ésta pueden seleccionarse convenientemente de modo que el mimético se fácil de sintetizar, sea probablemente farmacológicamente aceptable y no se degrade in vivo, mientras que retiene la actividad biológica del compuesto cabeza de serie. A continuación, el mimético o miméticos encontrados por esta aproximación pueden analizarse para ver si tienen la propiedad diana o en qué extensión muestra ésta. A continuación puede realizarse una optimización o modificación adicional para llegar a uno o más miméticos finales para ensayo in vivo o clínico.

El mimético o miméticos encontrados por cualquiera de las aproximaciones descritas en este documento pueden usarse en los procedimientos de ensayo de la presente invención para determinar si tienen la capacidad de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC.

Los miméticos obtenidos por un procedimiento de la invención también se describen en este documento.

Como se usa en este documento, una variante de una secuencia de aminoácidos indicada puede diferir en uno o más restos de aminoácidos a partir de esa secuencia, mediante una o más adiciones, inserciones, deleciones y sustituciones de uno o más restos de aminoácidos. Este puede incluir alteraciones de 1, 2, 3, 4, 5 o más de 5 aminoácidos tales como sustituciones con respecto a la secuencia indicada.

Esta variante de un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención, que tiene una secuencia descrita en este documento, puede, en ciertas realizaciones, ser de la misma longitud o más corto que esa secuencia. En otras realizaciones, el polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención (o una variante del mismo) puede estar incluido en un polipéptido particularmente mayor cuando el polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC se fusiona con una secuencia heteróloga o extraña. Pueden incluirse, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 ó 5, 10, 20 o más restos de aminoácidos adicionales, heterólogos a una forma nativa del polipéptido específico de la proteasa NS2/3 del VHC, en uno o en ambos extremos del polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC.

Los derivados de polipéptidos incluyen el polipéptido unido a una pareja de unión, por ejemplo una molécula efectora, un marcador, un fármaco, una toxina y/o un vehículo o molécula transportadora y/o una molécula que dirige tal como un anticuerpo o fragmento de unión del mismo u otro ligando. Las técnicas para unión de las parejas de unión, tanto peptídicas como no peptídicas son bien conocidas en la técnica. En una realización, la molécula vehículo es una secuencia peptídica de 16 aminoácidos derivada del homeodominio de Antennapedia (por ejemplo, como el que se vende con el nombre de "Penetratina"), que puede unirse a un péptido mediante un resto Cys terminal. La molécula de "Penetratina" y sus propiedades se describen en el documento WO 91/18981.

Los polipéptidos de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención y/o los agentes que modulan el péptido pueden generarse completa o parcialmente mediante síntesis química, de acuerdo con técnicas bien establecidas, tales como procedimientos convencionales de síntesis de péptidos en fase líquida o, preferiblemente en fase sólida, de las que se dispone de amplias descripciones generales (véase, por ejemplo, en J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª Edición, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), en M. Bodanzsky y A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Nueva York (1984); y Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, California), o pueden prepararse en solución, mediante el procedimiento en fase sólida o mediante cualquier combinación de fase sólida, fase líquida y solución química.

También se describen diversos procedimientos terapéuticos y usos de una o más sustancias seleccionadas entre (i) un compuesto identificado según un procedimiento de la invención que es capaz de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC; (ii) un mimético de cualquiera de las sustancias anteriormente mencionadas que es capaz de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC.

El fin terapéutico/profiláctico de este procedimiento o uso puede ser la modulación, por ejemplo, interrupción o interferencia, de la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC, para interrumpir, de este modo, la replicación del VHC y por tanto, reducir o prevenir la infección por VHC.

En diversos aspectos adicionales también se describe una composición farmacéutica, medicamento, fármaco u otra composición para este fin, comprendiendo la composición una o más de esas sustancias, el uso de esta sustancia en un procedimiento de tratamiento médico, un procedimiento que comprende la administración de esta sustancia o composición a un paciente, por ejemplo, para el tratamiento (que puede incluir tratamiento preventivo) de una afección médica, por ejemplo, una afección asociada con la infección por VHC, el uso de esta sustancia en la fabricación de una composición, medicamento o fármaco para la administración para este fin, por ejemplo, para el tratamiento de una afección asociada con la infección por VHC y un procedimiento para fabricar una composición farmacéutica que comprende mezclar esta sustancia con un excipiente, vehículo o transportador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, otros ingredientes.

Las sustancias pueden usarse como agentes activos solos o en combinación con otro o con cualquier otra sustancia activa.

Cualquiera que sea la sustancia usada en un procedimiento de tratamiento médico de la presente invención, la administración preferiblemente es una "cantidad profilácticamente eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz" (si se da el caso, aunque la profilaxis puede considerarse terapia), siendo ésta suficiente para mostrar beneficios en el individuo. La cantidad real administrada y la proporción y transcurso de la administración dependerán de la naturaleza y gravedad de lo que se está tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, decisiones sobre la dosificación, etc., está dentro de la responsabilidad de médicos de familia y de otros doctores en medicina.

Una sustancia o composición puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, de forma simultánea o secuencial dependiendo de la afección que se va a tratar.

Las composiciones farmacéuticas como se describen en este documento y para su uso como se describe en este documento, pueden incluir, además del ingrediente activo, un excipiente, vehículo, tampón, estabilizados u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la materia. Estos materiales no deberían ser tóxicos y no deberían interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material dependerá de la vía de administración, que puede ser oral o por inyección, por ejemplo, cutánea, subcutánea o intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden estar en forma de comprimidos, cápsulas, polvo o líquido. Un comprimido puede incluir un vehículo sólido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente incluyen un vehículo líquido, tal como agua, vaselina, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Puede incluirse solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles, tales como etilénglicol, propilénglicol o polietilénglicol.

Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o inyección en el lugar de la enfermedad, el ingrediente activo estará en forma de una solución acuosa aceptable por vía parenteral que no tenga pirógenos y tenga pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la material están bien capacitados para preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos, tales como cloruro sódico para inyectables, inyección de solución de Ringer o inyección de solución de Ringer con lactato. Pueden incluirse, si se requieren, conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos.

En las formulaciones del vehículo pueden usarse liposomas, especialmente liposomas catiónicos.

Ejemplos de técnicas y protocolos mencionados anteriormente pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª Edición, Osol, A. (ed), 1980.

La sustancia o composición puede administrarse de forma localizada en un lugar deseado o puede suministrarse de forma que se dirija a células en particular.

Las terapias dirigidas pueden usarse para suministrar más específicamente la sustancia activa a ciertos tipos de células mediante el uso de sistemas de dirección tal como anticuerpos o ligandos específicos de célula. Los sistemas dirigidos pueden ser deseables por una diversidad de razones, por ejemplo, si el agente es inaceptablemente tóxico o, por otro lado, si necesitara una dosificación demasiado alta o si, por otro lado, no fuera capaz de entrar en la célula diana.

En lugar de administrar estas sustancias directamente, cuando las sustancias moduladoras son polipéptidos, se pueden producir en las células diana mediante la expresión de un ácido nucleico codificador introducido en las células, por ejemplo, a partir de un vector viral. El vector puede dirigirse a las células específicas que se van a tratar, o puede contener elementos reguladores que son activadas más o menos selectivamente por las células diana.

El ácido nucleico que codifica la sustancia, por ejemplo un polipéptido capaz de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC, puede usarse de este modo en procedimientos de terapia génica, por ejemplo en el tratamiento de individuos, por ejemplo, con el propósito de prevenir o curar (total o parcialmente) un trastorno asociado con la infección por VHC.

En la técnica anterior se han usado vectores, tales como vectores virales, para introducir ácido nucleico en una amplia variedad de células diana diferentes. Típicamente, los vectores se exponen a las células diana para que pueda tener lugar la transfección a una proporción de célula suficiente como para proporcionar un efecto terapéutico o profiláctico útil a partir de la expresión del polipéptido deseado. El ácido nucleico transfectado puede incorporarse permanentemente en el genoma de cada célula diana, proporcionando un efecto duradero o, alternativamente, el tratamiento puede tener que repetirse periódicamente.

Se conocen en la técnica diversos vectores, tanto vectores virales como vectores plasmídicos, véase la Patente de EE.UU. Nº 5.252.479 y el documento WO 93/07282. En especial, se han usado varios virus como vectores de transferencia génica, incluyendo papovavirus, tales como SV40, virus vaccinia, virus del herpes, incluyendo VHS y VEB, y retrovirus. Muchos protocolos de terapia génica en la técnica anterior han usado retrovirus murinos inactivados.

Como alternativa al uso de vectores virales en terapia génica, otros procedimientos conocidos para introducir ácido nucleico en las células incluye técnicas mecánicas, tales como microinyección, transferencia mediada por liposomas y transferencia de ADN mediada por receptor.

Un ejemplo de una técnica para dirigir específicamente un ácido nucleico a células específicas, es la transferencia génica mediada por receptor, en la que el ácido nucleico se une a un ligando proteico a través de polilisina, siendo el ligando específico para un receptor presente en la superficie de las células diana.

Se puede proporcionar en un kit un agente o sustancia con capacidad para modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC o una molécula de ácido nucleico que codifique un polipéptido con esa capacidad, por ejemplo, sellado en un recipiente adecuado que proteja su contenido del ambiente exterior. Dicho kit puede incluir instrucciones de uso.

También se describe la purificación de un polipéptido, proteína u otra sustancia que tenga la capacidad de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC. También se describe una proteína, polipéptido, u otra sustancia purificada que tiene la capacidad de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC. La proteína, polipéptido u otra sustancia purificada puede estar pura a aproximadamente el 10%, más preferiblemente pura a aproximadamente el 20%, más preferiblemente pura a aproximadamente el 30%, más preferiblemente pura a aproximadamente el 40%, más preferiblemente pura a aproximadamente el 50%, más preferiblemente pura a aproximadamente el 60%, más preferiblemente pura a aproximadamente el 70%, más preferiblemente pura a aproximadamente el 80%, más preferiblemente pura a aproximadamente el 90%, más preferiblemente pura a aproximadamente el 95% o sustancialmente pura.

También se describe un procedimiento de purificación de una proteína, polipéptido u otra sustancia que tiene la capacidad de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC, el cual incluye poner en contacto la proteína, polipéptido u otra sustancia con un polipéptido de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención.

Se puede poner en contacto una mezcla que incluya una proteína, polipéptido u otra sustancia que tenga la capacidad de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC con un polipéptido inmovilizado de la proteasa NS2/3 del VHC de la presente invención (por ejemplo, inmovilizado covalente o no covalentemente, tal como a través de una molécula de unión específica como estreptavidina o biotina) y las moléculas que no se unen al polipéptido se eliminan con el lavado.

La proteína, polipéptido u otra sustancia que tiene la capacidad de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC, en un procedimiento de purificación descrito en este documento, puede estar en una mezcla de moléculas, tal como un extracto celular, tal como una célula normal de un organismo tal como un humano o una célula hospedadora recombinante que exprese la proteína o polipéptido o su forma no fosforilada a partir del ADN codificador, tal como una célula bacteriana, eucariótica (por ejemplo, de mamífero o de levadura) o de insecto, tal como un sistema de expresión de baculovirus.

Después de la purificación, la proteína, polipéptido u otra sustancia que tiene la capacidad de modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC puede usarse como se desee, por ejemplo, en un contexto terapéutico.

La Figura 1 muestra un esquema de un ensayo de selección de alto rendimiento para inhibidores de la proteasa NS2/3 del VHC. En la etapa 1, la NS2/3 se repliega. A continuación, el precursor se activa en un tampón apropiado para que se produzca la escisión (etapa 2). El precursor sin escindir se captura a continuación (etapa 4) y se mide la cantidad de NS3 libre en solución (etapa 5).

La Figura 2 muestra el producto de la reacción de escisión de NS2/3 separado por HPLC, como sigue. Una solución de proteasa H_{6}-907-1206-ASK4 5 \muM en clorhidrato de guanidina 6 M, Tris 25 mM, pH 8,7, DTT 100 mM se diluyó 50 veces en un tampón que contenía Tris 50 mM, pH 7,5, DTT 3 mM, glicerol al 50%, CHAPS al 1%, ZnCl_{2} 50 \muM, NaCl 250 mM a una temperatura de 4ºC. Tras 5 minutos, la temperatura se elevó a 23ºC, iniciando de este modo la reacción de escisión. Las muestras se analizaron en una columna de cromatografía de perfusión Poros R1/H (4,6 mm x 50 mm) equilibrada con H_{2}O al 90%/TFA al 0,1% (tampón A) y acetonitrilo al 10%/TFA al 0,08% (tampón B). La columna se desarrolló a un caudal de 2,5 ml/min usando un cromatógrafo de líquidos de alta resolución de Merck-Hitachi equipado con un detector de fluorescencia. Se usó un gradiente del 10%-90% de tampón B durante 15 minutos para separar el precursor de sus fragmentos escindidos. Los picos de proteína se detectaron mediante el seguimiento de triptófano fluorescente (excitación a 280 nm, emisión a 350 nm) y se cuantificó por integración del pico. La parte superior contiene NS2/3 replegada, la parte media contiene NS2/3 D.N. activada y la parte inferior contiene NS3 purificada.

La Figura 3 muestra un análisis de la reacción de escisión de 300 nM de la proteasa H_{6}-907-1206-ASK4 por HPLC. Panel izquierdo: análisis de la curva de tiempo de la reacción de escisión de NS2/3. El área del pico de HPLC correspondiente al producto de escisión NS3 se determinó por integración del pico y se representó en función del tiempo de incubación. Los datos pueden ajustarse a una ecuación exponencial única de la que se deriva un valor de la constante de velocidad de la reacción de primer orden observada. Panel derecho: dependencia de la concentración de la autoescisión de NS2/3 a 23ºC. Las constantes de velocidad de la reacción de primer orden de escisión se determinaron en función de la concentración de proteína.

La Figura 4 muestra un diagrama de dos vectores plasmídicos de expresión, pT7.7 (plásmido superior) y pCITE 2b (+) (plásmido inferior) usados para la clonación de fragmentos de ADNc que codifica la región NS2/3 de la poliproteína del VHC.

Parte experimental Ejemplo 1 Subclonación de la proteasa NS2/3 en vectores de expresión Amplificación por PCR de las construcciones de NS2-3

Se han generado plásmidos adecuados para la expresión heteróloga de NS2/3 activa de tipo silvestre o mutantes inactivos mediante clonación de fragmentos de ADNc amplificados por PCR que codifica la región NS2/3 de la poliproteína del VHC en los sitios de restricción apropiados.

Se conocen en la técnica varios plásmidos de expresión para la expresión de proteínas heterólogas tanto eucarióticas como procarióticas. En este ejemplo, el esqueleto del vector pT7.7 se usa para la expresión heteróloga en células procarióticas (E. coli), mientras que pCITE 2b (+) se usa para la expresión heteróloga en células eucarióticas (Hep 3b) o en sistemas de transcripción/traducción in vitro. En principio se podrían usar otros sistemas de expresión con el mismo propósito.

Se usaron como moldes los ADNc que codifican la región no estructural de los aislados correspondientes a las cepas J o H del VHC para la amplificación por PCR (cepa J del VHC, Nº de Acceso del Genbank D90208; cepa H del VHC, Nº de Acceso del GenBank M67463; cepa H77 del VHC, Nº de Acceso del Genbank AF009606). El ADN se amplificó de forma habitual preparando una mezcla de reacción de amplificación compuesta de 20 U/ml de ADN polimerasa Taq mezclada en Tris-SO_{4} 60 mM (pH 9,1 a 25ºC), (NH_{4})_{2}SO_{4} 18 mM, MgSO_{4} 2 mM, dGTP 200 \muM, dATP 200 \muM, dCTP 200 \muM, dTTP 200 \muM y estabilizadores (PCR SuperMix High Fidelity, GibcoBRL, Nº Cat. 10790-020), denominado protocolo de PCR 1 en los ejemplos siguientes.

De forma alternativa, se amplificó el ADN preparando una mezcla de reacción de amplificación compuesta de Tris-HCl 10 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50 mM, pH 8,3 (20ºC), dGTP 200 \muM, dATP 200 \muM, dCTP 200 \muM, dTTP 200 \muM y 2,5 U de ADN polimerasa Taq (ADN polimerasa Taq, Boehringer Mannheim, Nº Cat. 1146 173), denominado protocolo de PCR 2 en los ejemplos siguientes.

En algunos casos, se usó una mezcla de reacción de amplificación diferente, compuesta de Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,001%, dGTP 200 \muM, dATP 200 \muM, dCTP 200 \muM, dTTP 200 \muM y 2,5 U de AmpliTaq Gold (tm) (Perkin Elmer, Nº Cat. N808-0241), denominado protocolo de PCR 3 en los ejemplos siguientes.

En todos los casos, el volumen de reacción fue de 25 \mul, los cebadores específicos estaban a 200-500 nM cada uno (concentración final) y el molde de ADN estaba de forma habitual entre 20 y 100 ng (cantidad total por reacción). Las reacciones se realizaron en hielo, se mezclaron vigorosamente y se cargaron en el termociclador a 95ºC. La amplificación por PCR se realizó durante 20-30 ciclos de 95ºC, 60 segundos. La hibridación se llevó a cabo en general durante 15 segundos a una temperatura de 5ºC por debajo de la temperatura de fusión más baja (valor de Tm) de los cebadores. Los procedimientos para calcular los valores de Tm de la secuencia oligonucleotídica son conocidos en la técnica y se pueden encontrar en Sambrook y col. (1989). Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

La extensión se realizó a 72ºC (ADN polimerasa Taq, Boehringer Mannheim) o a 68ºC (PCR SuperMix High Fidelity, GibcoBRL) durante 60 segundos/Kb de longitud de la diana.

Todas las reacciones de PCR estuvieron precedidas de un único ciclo de desnaturalización de 1-2 minutos realizado a 95ºC (o 7 minutos para las reacciones realizadas con Taq Gold) y se detuvo con un rápido descenso a 4ºC, de forma alternativa, el descenso a 4ºC estuvo precedido de un único ciclo realizado a 72ºC durante 7 minutos (para las condiciones específicas, véase a continuación). El termociclador era de Perkin Elmer (GeneAMP PCR System 9700).

A continuación figura una lista de los cebadores oligonucleotídicos usados para la amplificación:

1

Mutagénesis

Las mutaciones se introdujeron en general mediante amplificación por PCR de las secuencias de ADNc usando cebadores mutagénicos. Este procedimiento es bien conocido por los expertos en la materia y se describe en: Sambrook y col. (1989), Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ehrlich, H. A., (1989) PCR Technology Stockton Press, Nueva York. y Zhao y col. (1993) Methods in Enzymology 217, 218. Las condiciones de la PCR son las descritas anteriormente.

También pueden introducirse mutaciones usando el procedimiento de E.S.U. (Eliminación de Sitio Único) de Deng, W. P. y Nickoloff, J. A., (1992) Anal. Biochem. 200,81, con el kit de mutagénesis E.S.U. (Pharmacia Biotech, Nº Cat. 27-1699-01) o mediante subclonación por enzimas de restricción de fragmentos que contienen la mutación o mutaciones deseadas.

A continuación figura una lista de los cebadores usados para la mutagénesis:

2

Subclonación de NS2-3 en pT7.7

pT7.7 fue el vector elegido para la preparación de las construcciones que se iban a usar en la expresión de proteínas heterólogas en procariotas (Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J. y Dubendorff, J.W. 1989. Methods in Enzymology 185, 60). El ADN de calidad CsCl_{2} (preparado según Sambrook y col. 1989: Ref. anterior) se cortó con la enzima de restricción Nde I (Boehringer Mannheim) durante 3 h a 37ºC y se rellenó con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa (Boehringer Mannheim) siguiendo las instrucciones del fabricante, es decir, añadiendo 33 \muM de NTP y 1 U de enzima/\mug de plásmido durante quince minutos a 25ºC. El plásmido relleno se cargó en un gel de TAE agarosa al 1%, se tiñó con 5 \mug/ml de bromuro de etidio y se sometió a electroforesis.

Tras la electroforesis, se escindió la banda correspondiente al ADN del plásmido y se purificó del gel con el kit Quiaex II (Quiagen, Nº Cat. 20021). Tras la elución, el plásmido se desfosforiló con fosfatasa alcalina intestinal de ternera (Boehringer Mannheim) siguiendo las instrucciones del fabricante y la solución se purificó con el kit Quiaex II (Quiagen, Nº Cat. 20021).

Las inserciones derivadas del protocolo de PCR 1 se fosforilaron directamente en la mezcla de PCR añadiendo ATP 5 mM y 7,9 U de polinucleótido quinasa de T4 (Pharmacia, Nº Cat. 27-0736-02) durante 30 minutos a 37ºC. Después de la fosforilación, se cargaron los productos de PCR en un gel de TAE agarosa al 1%, se tiñó con 5 \mug/ml de bromuro de etidio y se sometió a electroforesis. Tras la electroforesis, las bandas de interés se escindieron del gel y se eluyeron con el kit Quiaex II.

Los ligamientos se realizaron mezclando el plásmido con la inserción a una relación molar de 1:3 en una mezcla de ligamiento compuesta de Tris-HCl 50 mM (pH 8,7), DTT 10 mM, ATP 1 mM y 25 \mug/ml de albúmina sérica bovina con 400 U de ADN ligasa de T4 (New England Biolabs, Nº Cat. 202S) a 16ºC durante al menos 1 hora; de forma alternativa, se usó el kit de Ligamiento Rápido de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante (Boehringer Mannheim, Nº Cat. 1635 379). Cuando fue posible, las mutaciones se transfirieron de una construcción a otra mediante enzimas de restricción.

A continuación figura una lista de las construcciones preparadas en pT7.7 y usadas a lo largo de estos ejemplos, [el sitio de clonación es Nde I para todas las construcciones pT7.7]:

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4

Subclonación de NS2-3 en pCITE 2b (+)

pCITE 2b (+) (Novagen, Nº Cat. 69291-1) fue el vector elegido para preparar las construcciones que se iban a usar en los experimentos de expresión eucariótica o en ensayos de traducción in vitro. El ADN de calidad CsCl_{2} se cortó con la enzima de restricción Nco I durante 3 h a 37ºC y se rellenó con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa siguiendo las instrucciones del fabricante, es decir, añadiendo 33 \muM de NTP y 1 U de enzima/\mug de plásmido durante quince minutos a 25ºC. El plásmido relleno se cargó en un gel de TAE agarosa al 1%, se tiñó con 5 \mug/ml de bromuro de etidio y se sometió a electroforesis. Tras la electroforesis, la banda correspondiente al ADN del plásmido se escindió y se purificó del gel con el kit Quiaex II. Tras la elución, el ADN del plásmido se desfosforiló con fosfatasa alcalina intestinal de ternera siguiendo las instrucciones del fabricante y se purificó la solución.

De forma alternativa, el plásmido se cortó con la enzima de restricción MluN I y se desfosforiló siguiendo el protocolo explicado anteriormente. En algunos casos, pCITE 2b (+) se cortó con las enzimas de restricción MluN I y EcoR I y se desfosforiló como anteriormente.

Las inserciones derivadas de los protocolos de PCR 1 y 2 se fosforilaron directamente en la mezcla de PCR añadiendo ATP 5 mM y 7,9 U de polinucleótido quinasa de T4 durante 30 minutos a 37ºC. Después de la fosforilación, los productos de PCR se cargaron en un gel de TAE agarosa al 1%, se tiñeron con 5 \mug/ml de bromuro de etidio y se sometieron a electroforesis.

Tras la electroforesis la banda de interés se escindió del gel y se eluyó con el kit Quiaex II. Cuando las inserciones derivaban del protocolo de PCR 3, la estrategia de clonación implicaba una primera etapa de clonación en pCRII.I (Invitrogen, Nº Cat. K2000-01), a continuación los fragmentes clonados se rescataron con las enzimas de restricción MluN I y EcoR I, y se subclonaron en pCITE 2b (+). Cuando la estrategia de clonación lo requería, las inserciones preparadas con el protocolo de PCR 2 ó 3 se pulieron con ADN polimerasa de T4 (New England Biolabs, Nº Cat. 203S) según las instrucciones del fabricante y se purificaron como se explicó previamente.

Los ligamientos se realizaron mezclando el plásmido con la inserción a una relación molar de 1:3 en una mezcla de ligamiento compuesta por Tris-HCl 50 mM (pH 8,7), DTT 10 mM, ATP 1 mM y 25 \mug/ml de albúmina sérica bovina con 400 U de ADN de T4 a 16ºC durante al menos 1 hora; de forma alternativa se usó el kit de Ligamiento Rápido de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante.

Cuando fue posible, las mutaciones se transfirieron de una construcción a otra mediante enzimas de restricción.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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A continuación figura una lista de construcciones preparadas en pCITE 2b (+):

5

6

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Transformación de células competentes

Con fines de clonación y de propagación de ADN, todas las construcciones se transformaron en células Top10 de E. coli; la transformación se efectuó según el procedimiento de CaCl_{2} de Sambrook y col. (Sambrook, J., Fritsch E.F., Maniatis, T., 1989, Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Todos los mutantes de deleción se generaron en el contexto de la cepa J del VHC y posteriormente, se clonaron en un vector pCITE y se analizaron en un sistema de transcripción y traducción acopladas in vitro (véase más adelante) Los mutantes de deleción que empezaban en los restos 903 y 907 mostraban una actividad de escisión completa en comparación con una construcción de tipo silvestre, que empezaba en el resto 810, mientras que NS2/3 913-1027 era inactivo.

Todas las construcciones rindieron niveles elevados (>5 mg/l) de expresión de proteína heteróloga en E. coli. Se observó un alto nivel de autoprocesamiento, que variaba del 50 al 80% después de 3 horas de inducción a 23ºC.

Ejemplo 2 Expresión de las construcciones de proteasa NS2/3 en sistemas de transcripción/traducción in vitro (TIV)

Los ensayos de traducción in vitro (TIV) se realizaron con el Sistema de Lisado de Reticulocitos de Conejo o con el Sistema Rápido de Transcripción y Traducción Acopladas TnT T7 (Promega, Nº Cat. L4151 y L1170) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se preparó el ADN adecuado para la TIV mediante CsCl_{2} o con el Sistema de Purificación de ADN Wizard Plus SV (Promega, Nº Cat. A1460). En general, el ADN se linearizó con la enzima de restricción apropiada durante 3 h y se precipitó con CH_{3}COONa/EtOH. En algunos casos, el ADN se extrajo con fenol a partir de la solución antes de la precipitación con EtOH. A continuación se resuspendió en agua el ADN precipitado y se cargó una pequeña alícuota en un gel de TAE agarosa al 1%, se tiñó con bromuro de etidio para comprobar la restricción y la concentración. El ADN lineal se usó como molde para la transcripción in vitro dirigida por la ARN polimerasa de T7 (Stratagene, Nº Cat. 600124).

El ARN transcrito se extrajo con fenol y se precipitó con CH_{3}COONa/EtOH. A continuación se separó el ARN del ADN molde mediante centrifugación a través de una columna para centrífuga G-50 (Pharmacia, Nº Cat. 17-0043-01) (Sambrook, J., Fritsch E.F., Maniatis, T., (1989). Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.) El ARN purificado se precipitó como anteriormente y se resuspendió en agua.

El ARN se tradujo de forma habitual preparando una mezcla de reacción compuesta de CH_{3}COOK 30 mM, MgCl_{2} 360 \muM, mezcla de aminoácidos excepto metionina 30 \muM, 1 \mug de ARN, 10 \mul de lisado de reticulocitos, DTT 90 mM, 2 \mul de metionina marcada radioactivamente (Amersham, Nº Cat. SJQ0079), 1 \mul de RNasin (Promega, Nº Cat. N2511) y agua hasta 33 \mul. Se usó el sistema TnT con ADN lineal en una mezcla de reacción compuesta de 10 \mul de lisado de reticulocitos TnT, CH_{3}COOK 30 mM, MgCl_{2} 360 \muM, mezcla de aminoácidos excepto metionina 30 \muM, 1 \mug de ADN, DTT 21 mM, 2 ml de metionina marcada radioactivamente, 1 \mul de RNasin y agua hasta 33 \mul.

Las proteínas marcadas radioactivamente se separaron en SDS-PAGE. (Sambrook, J., Fritsch E.F., Maniatis, T., (1989). Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Los geles se fijaron en una solución de desteñido durante 30 minutos, y a continuación se empaparon durante 30 minutos con Amplify (Amersham, Nº Cat. NAMP 100) con agitación suave, se secó en papel 3MM y se sometió a autorradiografía.

Usando la metodología TIV, las versiones truncadas en el extremo N-terminal de NS2/3 de la cepa J del VHC que empiezan en los aminoácidos 903, 907, 913 y 919, acabando todas en el aminoácido 1206 (Construcciones números 25, 28, 31 y 33 del Ejemplo 1) se compararon en TIV con la construcción número 19, que tiene el extremo N-terminal nativo.

Se obtuvo una autorradiograma de los productos marcados expresados a partir de las construcciones de NS2/3. El autorradiograma se preparó como sigue; las construcciones NS2/3 se produjeron mediante la traducción in vitro en presencia de metionina marcada con ^{35}S usando el Sistema Rápido de Transcripción y Traducción Acopladas TnT T7. Después de 1 hora de incubación a 23ºC, las reacciones se pararon mediante la adición de tampón de muestra con SDS y se analizaron mediante SDS PAGE al 12,5%. Los geles se empaparon en AmplifyTM y se analizaron por autorradiografía.

Los experimentos mostraban que las deleciones N-terminales hasta el resto 907 se toleran sin perjudicar la actividad catalítica de la proteasa NS2/3. Las construcciones truncadas ofrecen la ventaja de estar desprovistas de una gran porción N-terminal hidrófoba que podría causar la agregación de la proteína durante la expresión heteróloga.

Ejemplo 3 Expresión transitoria de la construcción de proteasa NS2/3 en células eucarióticas

Se investigó la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC y su inhibición usando la expresión transitoria en células eucarióticas.

Las células Hep3B o HeLa se adaptan bien a este fin. Las células HeLa se siembran a una densidad de 6 x 10^{5} células/placa y se infectan con el virus vaccinia vTF7-3 a una multiplicidad de 5 UFP por célula. Esta infección llevará a la expresión de la ARN polimerasa de T7 en las células y se puede usar para expresar proteínas bajo el control de un promotor de la ARN polimerasa de T7. El procedimiento se describe ampliamente en Tomei y col., (1993) J. Virol. 67, 4017 y Kohara y col., (1992) J. Gen. Vir. 73: 2313-2318.

Tras la adsorción durante 30 minutos a 37ºC, se añadieron 3 ml de MEM de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero de ternera fetal al 10%. Las células se incubaron durante un periodo adicional de 30 minutos a 37ºC. Se precipitaron en fosfato cálcico 20 \mug de plásmido recombinante que contenía las construcciones de la proteasa NS2/3 según las construcciones números 16-35, como se describe en Sambrook y col. (1989), y se añadieron directamente a cada placa en un volumen de 500 \mul.

A las 4 horas de la transfección se sustituyó el medio por MEM sin metionina (Gibco Nº Cat. 31900-020) y las células se dejaron sin alimento durante 1 hora a 37ºC. A continuación las células se marcaron radioactivamente durante 3 horas con 400 \muCi de marcaje Tran^{35}S (ICN, Cat Nº 51006) en 2 ml de MEM sin metionina y suplementado con suero de ternera fetal al 2% dializado. Se recogieron las células y se resuspendieron en Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, EDTA 1 mM y ditiotreitol 1 mM.

La expresión y actividad de la proteasa NS2/3 se puede determinar en los extractos celulares tras la inmunoprecipitación con antisueros específicos. Con este propósito, se añadieron dodecil sulfato sódico y ditiotreitol al extracto celular a una concentración final del 2% y 10 mM, respectivamente. A continuación se incubaron los lisados a temperatura ambiente durante 1 hora y se calentaron a 95ºC durante 10 minutos. Se preadsorbieron 10 \mul de antisueros durante 1 hora a 4ºC en un volumen de 400 \mul de Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1% con los extractos de células HeLa infectadas con vT7F3 distribuidos sobre filtros de nitrocelulosa.

Después, la suspensión de anticuerpo se incubó con 60 \mul de proteína A Sefarosa durante 1 hora a 4ºC. La resina se sedimentó por centrifugación, se lavó tres veces en Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1% y se resuspendió en 400 \mul del mismo tampón. Se añadieron 20 \mul de lisado celular a la resina y se incubó durante 1 hora a 4ºC.

La suspensión de proteína A Sefarosa se puso posteriormente sobre 0,9 ml de Tris 5 mM pH 7,4, EDTA 16,5 mM, deoxicolato sódico al 0,1%, Nonidet P-40 al 0,25%, sacarosa al 30% (p/v) y se sedimentó mediante centrifugación en una microcentrífuga a temperatura ambiente. El sedimento se lavó dos veces con el mismo tampón sin sacarosa y una vez con agua. Las muestras se analizaron mediante autorradiografía tras la separación por electroforesis en SDS-poliacrilamida.

Ejemplo 4 Expresión en E. coli en presencia o ausencia de iones de Zn

En la técnica se conocen varios sistemas para la expresión heteróloga de la proteasa NS2/3 activa. En el ejemplo presente, se usó E. coli para la expresión de la proteasa NS2/3. Estas células también se dirigieron a expresar la proteína NS2/3 en una forma sin escindir, según el procedimiento explicado a continuación. Se pueden usar otros sistemas de expresión bacterianos o eucarióticos para el mismo propósito.

Se usaron vectores pT7-7 que contenían secuencias de la proteasa NS2/3 truncadas según las construcciones números 1-15 para transformar E. coli BL21 (DE3). Las células se cultivaron en medio mínimo M9 suplementado con biotina 50 \muM, tiamina a 2,4 \mug/ml, FeSO_{4} a 3,4 \mug/ml y ZnCl_{2} 200 \muM a 37ºC hasta una densidad óptica a 500 nm de 0,8. La temperatura se bajó hasta los 23ºC y se inició la inducción de la proteína mediante la adición de 200 \mul de IPTG. Después de 3 horas, las células se recogieron mediante centrifugación.

Los extractos celulares pueden analizarse mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes. Este experimento proporcionó evidencia de la inducción eficaz de la proteína precursora NS2/3 además de dos proteínas que migraban con el peso molecular aparente de los productos de escisión NS3 y NS2 esperados.

Puesto que el precursor NS2/3 sufre un autoprocesamiento sustancial durante su inducción, claramente en estas condiciones no es posible obtener grandes cantidades de proteína precursora pura sin escindir. Se intentaron, por tanto, dos estrategias para disminuir o detener la reacción de autoprocesamiento durante la inducción de la proteína.

1. Inducción a baja temperatura

La inducción a 15ºC disminuía la cantidad total de proteína producida, pero afectaba sólo ligeramente el grado relativo de autoprocesamiento. Un descenso adicional de la temperatura conduce a una deficiencia grave en la producción de la proteína. Por tanto, parecía que la cantidad relativa de precursor que se podía purificar potencialmente no se incrementaba mediante de la modulación de la temperatura durante la inducción.

2. Inducción en medio mínimo con bajo contenido en cinc

Se sabe que la proteína NS3 contiene cantidades estequiométricas de cinc que son necesarias para su plegamiento y estabilidad (De Francesco y col., 1996). Si la proteína NS3 se induce en E. coli cultivada en medio mínimo sin cinc añadido, no se plegará apropiadamente y forma agregados conocidos como cuerpos de inclusión. Las construcciones de proteasa NS2/3 truncada dirigirán la formación de proteína insoluble si se expresan en E. coli cultivada en medio M9 mínimo sin suplementar con iones de cinc. En estas condiciones, la mayoría de la proteína NS2/3 se encuentra como un precursor no escindido y en un gel teñido con Coomassie, sólo se veían cantidades muy bajas del producto de escisión NS3. Por tanto, este procedimiento proporciona una forma de expresión de la proteasa NS2/3 en forma latente sin escindir.

En resumen, para obtener un precursor de NS2/3 catalíticamente competente en una forma inactiva latente que potencialmente sea susceptible de purificación, se realizó la inducción de la proteína en medio de crecimiento mínimo sin cinc.

Ejemplo 5 Purificación de la proteasa NS2/3 sin procesar a partir de cuerpos de inclusión

Para obtener la proteasa NS2/3 en forma pura a partir de las células bacterianas, se cultivó E. coli en medio mínimo sin iones de cinc añadidos y se indujo la producción de proteínas NS2/3 usando las construcciones números 1-15 (véase el Ejemplo 1), como se explica anteriormente.

Las células se recogieron por centrifugación y el sedimento de células se lavó con tampón PBS (fosfato sódico 25 mM, pH 7,5, NaCl 140 mM). A continuación el sedimento lavado se resuspendió en tampón de lisis (40 ml/l de medio de crecimiento) con fosfato sódico 25 mM, pH 6,5, DTT 3 mM, NaCl 500 mM, CHAPS al 0,5% y glicerol al 15%. Tras la rotura de las paredes celulares bacterianas usando una prensa francesa, se añadió MgCl_{2} 10 mM al homogeneizado que se incubó a continuación durante 30 minutos a 4ºC en presencia de 6 U/\mul de ADNasa. El homogeneizado se centrifugó durante 15 minutos a 12.000 xg.

El sedimento de la centrifugación contenía la proteína NS2/3 además de otras proteínas bacterianas contaminantes. Se lavó dos veces con tampón de lisis, una vez con tampón de lisis suplementado con NP-40 al 1% y una vez con fosfato sódico 20 mM, pH 7,5, DTT 3 mM. El sedimento final típicamente contenía una proteína NS2/3 pura al 80%.

La proteína puede purificarse adicionalmente usando el procedimiento siguiente. El sedimento se resuspendió en clorhidrato de guanidina 7 M, Tris 25 mM pH 8,7, DTT 100 mM y se cargó en una columna de filtración en gel Superdex 75 26/60 (Pharmacia) equilibrada con clorhidrato de guanidina 6 M, Tris 25 mM pH 7,5, DTT 3 mM, NaCl 150 mM y desarrollada a un caudal de 2 ml/min. Las fracciones que contenían NS2/3 se mezclaron y se cargaron en una columna de cromatografía de fase inversa Source 15RPC de 0,5 x 20 cm (Pharmacia) equilibrada en H_{2}O al 90%, TFA al 0,1% (disolvente A) y acetonitrilo al 10%, TFA al 0,08% (disolvente B).

Se usó un gradiente de 10% de disolvente B a 90% de disolvente B durante 1 hora a un caudal de 4 ml/min para eluir de la columna la proteína NS2/3 en una forma pura. Las fracciones que contenían NS2/3 se mezclaron, se liofilizaron y la proteína se resolubilizó en clorhidrato de guanidina 7 M, Tris 25 mM, pH 8,7, DTT 100 mM.

Típicamente, la proteína tenía una pureza >95% y se obtuvo con un rendimiento >2 mg/l de cultivo bacteriano. La proteína purificada se caracterizó mediante espectrometría de masas por electropulverización, verificando, de este modo, que no se producían modificaciones de la proteína durante el procedimiento de expresión o purificación.

La masa encontrada por esta técnica para NS2/3 H6-907-1206-ASK4 fue de 33.694 Da y se correspondía con su masa teórica calculada a partir de la composición de aminoácidos. Esto documenta que no se han producido modificaciones detectables de las proteínas durante este procedimiento de purificación. Esta noción además está corroborada por el análisis de la secuencia de aminoácidos N-terminales realizada usando la degradación de Edman en un secuenciador en fase gaseosa. Este análisis dio la secuencia N-terminal esperada M-H-H-H.

Los rendimientos de proteína pura que se obtuvieron variaban considerablemente entre las diferentes construcciones 1-15 enumeradas en el Ejemplo 1. Los niveles más altos de expresión de la proteína bacteriana se obtuvieron con las construcciones etiquetadas con His + Lys usando células BL-21 de E. coli. La expresión de las construcciones mutantes basadas en NS2/3 907-1206 ASK_{4} era muy baja y tuvo que ser optimizada. Para estas construcciones, los niveles más altos de expresión se obtuvieron usando células B834 de E. coli y medio mínimo.

Ejemplo 6 Replegamiento de la proteasa NS2/3 purificada

Se estableció una selección sistemática de las condiciones de replegamiento variando los parámetros siguientes: metodología de replegamiento (diálisis, dilución rápida, dilución seriada, concentración de proteína (10-100 \mug/ml), pH (6-9), fuerza iónica (25-275 mM), aditivos polares (arginina 0,5 M), aditivos no polares (glicerol al 20%, sacarosa al 1%), concentración caotrópica residual (guanidina 0-0,75 M), detergente (CHAPS al 2%), PEG 4000 (0,05%), temperatura (4-23ºC) y concentración de Zn^{++} (30-100 \muM). En todos los experimentos, se controló la recuperación del precursor soluble tras la ultracentrifugación.

Usando esta metodología, se identificaron los siguientes factores como importantes para la recuperación de la proteína soluble tras el replegamiento: eliminación del agente caotrópico mediante diálisis, concentración de proteína <100 \mug/ml, concentración de agente caotrópico residual de guanidina 0,75 M en el tampón de replegamiento, fuerza iónica >200 mM de NaCl. En condiciones de replegamiento adecuadas, puede encontrarse más del 80% de precursor replegado en el sobrenadante tras una ultracentrifugación a 120.000 xg.

A partir de esto se desarrollaron dos procedimientos que pueden usarse con fines diferentes. El procedimiento A permite generar una proteína replegada a concentraciones micromolares que no sufre escisión a menos que se transfiera a un tampón apropiado capaz de sostener la reacción de escisión. El procedimiento B permite el replegamiento de la proteína NS2/3 sin plegar en un tampón que sostiene simultáneamente la reacción de escisión.

Procedimiento A

200 \mul de una solución que contiene polipéptido de la proteasa NS2/3 3 \muM en clorhidrato de guanidina 6 M, Tris 25 mM, pH 8,7, DTT 100 mM se dializaron frente a 20 ml de Tris 50 mM, pH 7,5, ZnCl_{2} 50 \muM, DTT 3 mM, NaCl 250 mM, clorhidrato de guanidina 750 mM usando una membrana de diálisis SpectraPor con un punto de corte de 10 kDa. La diálisis se realiza a 4ºC. Después de dos horas, la solución de proteína se puede retirar, dividir en alícuota y congelar rápidamente en nitrógeno líquido. No se produce escisión durante esta diálisis y la proteína puede activarse para sufrir escisión tras la adición de un tampón que activa la reacción de escisión como se explica más adelante.

Procedimiento B

Una solución de polipéptido de proteasa NS2/3 5 mM en clorhidrato de guanidina 6 M, Tris 25 mM, pH 8,7, DTT 100 mM se diluye 50 veces en un tampón que contenía Tris 50 mM, pH 7,5, DTT 3 mM, glicerol al 50%, CHAPS al 1%, ZnCl_{2} 50 \muM, NaCl 250 mM a una temperatura de 4ºC. Tras 5 minutos la temperatura se eleva a 23ºC iniciando, de este modo, la reacción de escisión.

Para ambos procedimientos, A y B, son posibles variaciones en la composición de los tampones y en la concentración de proteína y sus consecuencias se explican con más detalle más adelante. El rendimiento de proteína activa replegada varía entre el 30% y el 80% y depende de la composición del tampón, la composición de aminoácidos de la proteína NS2/3 y su pureza.

Ejemplo 7 Detección de la actividad in vitro de la proteasa NS2/3 purificada

Las proteínas replegadas según el procedimiento A se diluyeron al menos 5 veces en un tampón que tenía la siguiente composición (tampón de actividad): Tris 50 mM, pH 7,5, DTT 3 mM, glicerol al 50%, CHAPS al 1%, ZnCl_{2} 50 \muM, NaCl 250 mM.

A intervalos calculados, se retiraron alícuotas del tampón de actividad que contenían la proteasa NS2/3 replegada, la reacción se detuvo mediante la adición de dodecil sulfato sódico al 0,1% y las muestras se cargaron en un gel de poliacrilamida al 12,5% con dodecil sulfato sódico y tras la electroforesis, se analizaron por tinción con plata o mediante inmunotransferencia.

Las proteínas replegadas según el Procedimiento B simplemente se incubaron a 23ºC hasta dos horas y se analizaron de la misma forma.

Después de dos horas de incubación en estas condiciones, se detectó una banda intensa que migraba con el peso molecular de NS3 truncada en inmunotransferencias teñidas con anticuerpos anti NS3.

En el SDS-PAGE teñido con plata se detectaron dos bandas correspondientes con el PM de las proteínas NS2 y NS3 truncadas, además del precursor sin escindir. Se estimó que aproximadamente el 30% de la proteína precursora había sido procesada en este experimento.

Un formato más conveniente y cuantitativo de un ensayo de proteasa NS2/3 implica la separación del precursor y de los productos mediante HPLC. Se desarrolló el siguiente procedimiento: las proteínas replegadas según el procedimiento A o B se incubaron en tampón de actividad a 23ºC. A intervalos calculados, se retiraron alícuotas de 200 \mul y se añadieron 20 \mul de TFA al 10% para detener la reacción. La solución se inyectó en una columna de cromatografía de perfusión Poros R1/H (4,6 mm x 50 mm, PerSeptive Biosystems, Nº Cat. 1-1014-24) equilibrada con H_{2}O al 90%/TFA al 0,1% (tampón A) y acetonitrilo al 10%/TFA al 0,08% (tampón B).

La columna se desarrolló a un caudal de 2,5 ml/min usando un cromatógrafo de líquidos de alta resolución de Merck-Hitachi equipado con un detector de fluorescencia. Se usó un gradiente del 10%-90% de tampón B durante 15 minutos para separar el precursor de sus fragmentos escindidos. Usando el control de triptófano fluorescente (excitación a 280 nm, emisión a 350 nm) de forma fiable, se pueden detectar y cuantificar mediante integración del pico menos de 5 nM.

La Figura 2 muestra dos cromatogramas típicos registrados a tiempo cero y tras la incubación durante una noche de NS2/3 H6-907-1206-ASK4 (construcción número 3) en el tampón de actividad. El pico marcado "NS3" migra junto con una proteína convencional que abarca los aminoácidos 1027-1206 y que lleva la extensión C- terminal ASKKKK. Para verificar adicionalmente que durante la reacción de autoescisión de la proteasa NS2/3 purificada el procesamiento se producía en el sitio de escisión auténtico, se aisló y caracterizó el producto de escisión NS3 usando el análisis de secuencia N-terminal mediante la degradación de Edman. La secuencia obtenida fue A-P-I-T, que corresponde a los restos 1027-1030 de la poliproteína del VHC e indicaba claramente que se había producido la escisión en el sitio de NS2/3 auténtico.

Estimamos una constante de velocidad de primer orden de 0,06 min^{-1} para la reacción de escisión y una t/2 de 11,5 minutos. Estos datos no son diferentes a los datos publicados sobre la reacción de escisión de las construcciones NS2/3 de longitud completa en un sistema de transcripción/traducción in vitro, en el que se encontró una t/2 de 10 - 15 minutos y una escisión máxima del 70%.

Usando varias preparaciones enzimáticas diferentes, obtuvimos entre el 15 y el 80% de escisión y velocidades de 0,03 min^{-1} - 0,07 min^{-1}. Los fragmentos de escisión se sometieron al análisis de secuencia N-terminal para verificar que la escisión se producía en el sitio de escisión auténtico.

También se investigó la actividad proteasa NS3 del precursor NS2/3 H_{6}-907-1206-ASK_{4} replegado. No se apreciaron cambios significativos en la actividad proteasa NS3 durante una reacción de autoescisión que llevaba al 30% de procesamiento después de dos horas de incubación. El grado de actividad proteasa NS3 era compatible con la presencia de aproximadamente el 25% de moléculas activas, asumiendo que la actividad específica de la proteasa NS3 no cambia en el precursor NS2/3 H_{6}-907-1206-ASK_{4}.

Estos experimentos demuestran que la cantidad de proteína catalíticamente competente que puede recuperarse tiene tanto la actividad proteasa NS2 como la NS3. El resto de la proteína probablemente está mal plegada.

Ejemplo 8 Caracterización de la actividad de la proteasa NS2/3

El procedimiento de HPLC para detección de productos de escisión que surgen tras la incubación de la proteasa NS2/3 purificada y replegada en tampón de actividad puede usarse para cuantificar los parámetros cinéticos de la reacción y para determinar la influencia de las diferentes condiciones fisicoquímicas sobre su velocidad.

La Figura 3 muestra el transcurso de una escisión típica. Se incubó la proteasa NS2/3 30 nM en Tris 50 mM, pH 7,5, DTT 3 mM, glicerol al 50%, CHAPS al 1%, ZnCl_{2} 50 \muM, NaCl 250 mM y la reacción de escisión se siguió midiendo la cantidad de producto de escisión NS3 formado con el tiempo. Esto se hizo integrando el área del pico de HPLC de NS3.

En la Figura 3, panel izquierdo, se muestra una representación del área del pico NS3 frente al tiempo. Los valores se pueden ajustar mejor a una ecuación exponencial simple, que permite la asignación de una constante de velocidad aparente. Se encontró que esta constante de velocidad está se ve afectada por la variación de diversos parámetros, tal como fuerza iónica, concentración de glicerol, pH, concentración de detergente.

Un hallazgo inesperado es el hecho de que la constante de velocidad también muestra dependencia de la concentración de proteína (Figura 3, panel derecho). Esto es indicativo de que las especies activas son un multímero. De hecho, la cromatografía de filtración en gel mostró evidencias de que se habían formado especies diméricas en solución. La dimerización es una nueva propiedad de la proteasa NS2/3 que podría usarse para desarrollar una estrategia dirigida a encontrar inhibidores de NS2/3 que interfieran con la formación de dímeros.

Ejemplo 9 Ensayos para inhibidores de la proteasa NS2/3

La invención también proporciona metodologías que se pueden usar para identificar inhibidores de la reacción de escisión. Estos inhibidores pueden encontrarse mediante selección de colecciones o bibliotecas combinatorias de compuestos para la actividad inhibidora de la proteasa NS2/3. De forma conveniente, las moléculas orgánicas pequeñas se solubilizan en DMSO y se añaden al ensayo. En todos los ensayos siguientes se tolera la adición de hasta el 10% de DMSO sin perjuicio sustancial de la actividad de escisión de la proteasa NS2/3.

Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de ensayo que se pueden usar:

A. Ensayo basado en células

En este documento se describen plásmidos de expresión adecuados para la expresión transitoria de la proteasa NS2/3 en células eucarióticas (construcciones pCITE números 16-35; Ejemplo1). Estos plásmidos contienen la proteasa NS2/3 bajo el control de un promotor de la ARN polimerasa de T7. El uso de este sistema para controlar la expresión de proteínas heterólogas en células eucarióticas y, más específicamente, para controlar la actividad de proteasas virales, es bien conocido en la técnica (Tomei, L. y col. (1993). J. Virol. 67, 4017) y se describe en el Ejemplo 3.

La inhibición de la actividad proteasa NS2/3 por moléculas añadidas externamente tiene como resultado la disminución de los niveles de productos de escisión que se pueden determinar tras el marcaje radioactivo de las proteínas y el aislamiento de la proteasa NS2/3 y su producto de escisión NS3 mediante inmunoprecipitación con antisueros anti NS3, usando procedimientos establecidos conocidos en la técnica.

B. Ensayo de traducción in vitro

La proteasa NS2/3 activa puede generarse usando un sistema de transcripción y traducción acopladas in vitro o mediante traducción in vitro de las moléculas de ARN apropiadas como se explica anteriormente (Ejemplo 2).

La invención proporciona plásmidos adecuados para la producción de la proteasa NS2/3 dirigida por la ARN polimerasa de T7 que codifica moléculas de ARN según procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Los inhibidores se añaden a la mezcla de reacción y su potencia se determina mediante experimentos de valoración.

El marcaje radioactivo de las proteínas por adición de aminoácidos marcados radioactivamente y el posterior análisis en SDS-PAGE y autorradiografía permite controlar la inhibición de la actividad de la proteasa N2/3 por una disminución en la cantidad de productos de escisión radioactivos.

C. Detección de la escisión en SDS-PAGE o HPLC

Las construcciones de proteasa NS2/3 proporcionadas por esta invención se purifican y repliegan según los procedimientos de esta invención y se incuban en 200 \mul de tampón de actividad (Tris 50 mM, pH 7,5, DTT 3 mM, glicerol al 50%, CHAPS al 1%, ZnCl_{2} 50 \muM, NaCl 250 mM) u otro tampón adecuado para mantener la actividad de escisión. Típicamente, en el ensayo se usan de 30 nM a 300 nM de proteasa NS2/3 y se incuba en el tampón apropiado en presencia o ausencia de hasta el 10% (v/v) de una solución de compuestos orgánicos en DMSO. A la concentración más baja de proteína, la proteasa NS2/3 está presente en la solución tanto como dímero activo como monómero inactivo. Esto conduce a una velocidad de reacción total más lenta.

El uso de concentraciones de proteínas similares o por debajo de la constante de equilibrio de disociación del dímero puede ser ventajoso si se desea encontrar inhibidores de la formación de dímeros. Además, una concentración baja de proteína también puede ser necesaria para determinar la actividad de inhibidores muy potentes. A concentraciones de proteína por encima de 100 nM la mayoría de la proteína estará presente como dímero activo y la reacción de escisión será más rápida que a una concentración baja de proteína (véase también la Figura 3).

Dependiendo de la concentración de proteína usada en el ensayo, la reacción se deja desarrollar durante 10 a 30 minutos y se detiene bien por inactivación de la proteasa NS2/3 mediante de la adición de 20 ml de TFA al 10% (si la escisión se detecta por HPLC) o de tampón de muestra con SDS (si la escisión se detecta en SDS-PAGE). En cada caso, la reacción se detiene en el intervalo lineal de la curva de tiempo (Figura 3). Esto es importante puesto que la desviación de la linearidad puede conducir a un subestimación de la potencia de los inhibidores añadidos.

Posteriormente, la cantidad de producto de escisión formado en ausencia de inhibidor se compara con la cantidad del mismo producto de escisión formado en presencia de inhibidor añadido. El % de inhibición se calcula a partir de esta comparación y se determina a diferentes concentraciones de inhibidor, lo que conduce a una determinación exacta de la potencia del compuesto inhibidor. Ni la generación del fragmento de escisión NS3 ni del NS2 se puede controlar con este propósito.

Usando SDS-PAGE como procedimiento de detección, es conveniente realizar una inmunotransferencia con antisueros específicos de NS2 o de NS3 para mejorar la sensibilidad. La intensidad de las bandas puede estimarse mediante densitometría u otras técnicas de imagen conocidas en la técnica.

El procedimiento de detección preferible es HPLC que permite la detección cuantitativa de NS2/3 sin escindir y de ambos fragmentos de escisión, NS2 y NS3, en pocos minutos. El ensayo puede usarse para seleccionar colecciones de compuestos químicos usando ensamblaje y análisis automatizados de muestras. En la Figura 2 se muestra un ejemplo de ejecución de HPLC que documenta la separación y cuantificación de NS2/3, NS2 y NS3.

D. Ensayos de selección de alto rendimiento

Las grandes colecciones de compuestos o bibliotecas combinatorias que a menudo contienen >10^{5} entidades químicas distintas, son fuentes prometedoras para compuestos cabeza de serie en un programa de desarrollo de fármacos. El manejo de estas grandes cantidades de compuestos requiere tecnologías robóticas y un ensayo que pueda realizarse en un formato de microplaca. La invención, por tanto, también proporciona procedimientos para ensayar la actividad de la proteasa NS2/3 en un ensayo en microplaca.

El ensayo, que se explica en la Figura 1, se realizó como sigue: mediante manipulación genética se introdujo una etiqueta de seis histidina en el extremo N-terminal del polipéptido de la proteasa NS2/3. La proteína etiquetada se purificó como se especifica anteriormente y se replegó siguiendo los procedimientos de replegamiento A o B. Por cuestiones de simplicidad, se prefirió el procedimiento de replegamiento B, por lo que el polipéptido de la proteasa NS2/3 desnaturalizado con la etiqueta de histidina se diluyó en 100 \mul de tampón de actividad (Tris 50 mM, pH 7,5, 2-mercaptoetanol 3 mM, glicerol al 50%, CHAPS al 1%, ZnCl_{2} 50 \muM, NaCl 250 mM) a una concentración final de 50 nM.

La incubación durante 15 minutos a 23ºC da lugar a un procesamiento parcial de la proteasa NS2/3. El tiempo de incubación se eligió para obtener aproximadamente el 10% de procesamiento. Sólo el fragmento de escisión NS2 y el precursor NS2/3 sin escindir poseen etiquetas de histidina. Estas histidinas pueden captarse mediante la adición de una resina de afinidad por metales. Por lo tanto, tras el periodo de incubación, se añadieron 100 \mul de una suspensión al 50% (v/v) de una resina de afinidad por metales Talon (Clontech, Nº Cat. 8901-3) equilibrada en Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 250 mM. La resina secuestraba las especies con etiquetas de histidina y dejaban la molécula NS3 sin etiqueta en solución.

La molécula NS3 generada durante la reacción de procesamiento de la proteasa NS2/3 tiene una actividad serina proteasa. Esta actividad puede usarse como lectura de la reacción de procesamiento entre NS2 y NS3. De hecho, la actividad catalítica de NS3 amplificará cada suceso de procesamiento de NS2/3, por ejemplo, a través de la renovación de un sustrato NS3 fluorogénico.

Tras la sedimentación de la resina, se retiró una alícuota de 40 \mul del sobrenadante y se añadió a un pocillo de una segunda microplaca de 96 pocillos que contenía 200 \mul de Tris 50 mM pH 7,5, Triton X-100 al 0,1%, DTT 10 mM, glicerol al 15%, NaCl 150 mM y Pep4AK 20 \muM, con la secuencia KKKGSVVIVGRIILSGR-NH2. Pep4AK es un cofactor de la proteasa NS3 y se añadió para obtener la actividad máxima.

En este punto, se añadieron 5 \muM de un sustrato NS3 fluorogénico internamente inactivado con la secuencia Mca-DDIVPCSMSK[DNP]. La reacción se siguió usando un lector de fluorescencia en microplacas (excitación a 325 nm, emisión a 393 nm).

Es posible el manejo automatizado de todas las etapas necesarias para este ensayo, permitiendo la selección de un gran número de compuestos en un periodo corto de tiempo. Además, los falso positivos que podrían surgir debido a la inhibición de la proteasa NS3 se minimizan debido a la dilución 10 veces de la solución original durante el ensayo de la proteasa NS3.

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<110> Instituto di Ricerche di Biología Molecolare P. Angeletti

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Steinkuhler, Christian

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Pallaoro, Michele

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Lahm, Armin

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<120> Fragmentos de NS2/3 del VHC y usos de los mismos

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<130> SMWFP5917950

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<140> PCT/IB01/00527

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<141> 14-03-2001

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<150> GB 0006537.5

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<151> 17-03-2000

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<160> 32

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 54

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 1

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ttggaattcc tacttcttct tcttgctagc tctcatggtt gtctctaggt tctc

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54

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<210> 2

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<211> 49

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 2

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ggccacccac caccaccacc accacatgga ccgagagatg gctgcatcg

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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ctacttcttc ttcttgctag cccgcatggt agtttccata gactc

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 4

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accgagagat ggctgcatcg tgcgg

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<212> ADN

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atccgtgcat gcatgttagt gcgg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caccaccacc accaccacat ccgtgcatgc atgttagtgc gg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaaaggagc cgccacccct gtagacc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaccgcatg gtagtttcca tagactc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcatcatca tcatcatcat caggctggca tgactagagt gccg

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcaggctgg catgactaga gtgccg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcatcatca tcatcatcat actagagtgc cgtactttgt acgc

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactagagt gccgtacttt gtacgc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccacccacca ccaccaccac cacctggaca cggaggtggc cgcgtcg

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggttgctgc cgcccatcac ggcg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgccgtgatg ggcggcagca acct

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgtataacg ctctcacccc tctgc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagaggggt gagagcgtta tacac

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgtacgtat atgacgctct tactccactg cgg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgcagtgga gtaagagcgt catatacgta cgt

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggctccttc cgcctatcac ggcc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccgtgata ggcggaagga gccg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagacaccg cggccgctgg ggacatcatc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggctcatctg gtggttacaa tattttatca ccagagccg

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgtgactgg tgacccgtca accaagtc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la hepatitis C

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met His His His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Extensión C-terminal

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Lys Lys Lys Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la hepatitis C

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Pro Ile Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Pep4AK

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Lys Lys Gly Ser Val Val Ile Val Gly Arg Ile Ile Leu Ser Gly}

\sac{Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Sustrato NS3 fluorogénico internamente inactivado

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Asp Ile Val Pro Cys Ser Met Ser Lys}

Claims (30)

1. Un polipéptido constituido por un fragmento de una proteasa NS2/3 del virus de la hepatitis C (VHC), proteasa que se produce de forma natural como un precursor de la proteasa NS2/3 del VHC, en el que el fragmento tiene como su resto N-terminal un aminoácido que está en una posición del resto 903 al 913 en el precursor de la proteasa NS2/3 del VHC y como su resto del extremo C-terminal un aminoácido que está en una posición del resto 1206 al 1657 en el precursor de la proteasa NS2/3 del VHC, polipéptido que, cuando está en un homodímero, tiene actividad autoproteolítica.

2. Un polipéptido según la reivindicación 1, en el que el resto C-terminal del fragmento es el aminoácido que está en la posición 1206 del precursor de la proteasa NS2/3 del VHC.

3. Un polipéptido según la reivindicación 2, en el que el resto N-terminal del fragmento es el aminoácido que está en la posición 903 del precursor de la proteasa NS2/3 del VHC.

4. Un polipéptido según la reivindicación 2, en el que el resto N-terminal del fragmento es el aminoácido que está en la posición 907 del precursor de la proteasa NS2/3 del VHC.

5. Un polipéptido constituido por una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos al 90% sobre su longitud comparado con un fragmento de una proteasa NS2/3 del VHC, proteasa que se produce de forma natural como un precursor de la proteasa NS2/3 del VHC, en el que el fragmento tiene como su resto N-terminal un aminoácido que está en una posición del resto 903 al 913 en el precursor de la proteasa NS2/3 del VHC y como su resto C-terminal un aminoácido que está en una posición del resto 1206 al 1657 en el precursor de la proteasa NS2/3 del VHC, polipéptido que, cuando está en un homodímero, tiene actividad autoproteolítica, y en el que el precursor de la proteasa NS2/3 del VHC es como el codificado por el ácido nucleico de la cepa J del VHC como se proporciona en la Figura 7 que representa el Nº Acc. de Genbank D90208, versión D90208\bullet1, la cepa H del VHC como se proporciona en la Figura 6 que representa el Nº Acc. de Genbank M67463, versión M67463\bullet1 o la cepa H77 del VHC como se proporciona en la Figura 5 que representa el Nº Acc. de Genbank AF009606, versión AF009606\bullet1.

6. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 fusionado con uno o más restos de aminoácidos heterólogos.

7. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 7 unido de forma operativa a secuencias reguladoras para la expresión de dicho polipéptido.

9. Una célula hospedadora transformada con un vector de expresión según la reivindicación 8.

10. Un procedimiento de producción de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo el procedimiento provocar la expresión de un vector de expresión según la reivindicación 8 para producir dicho polipéptido.

11. Un procedimiento según la reivindicación 10 que comprende cultivar la célula hospedadora transformada con dicho vector de expresión en condiciones para la producción de dicho polipéptido.

12. Un procedimiento según la reivindicación 11 en el que las células hospedadoras se cultivan en condiciones mediante las cuales el polipéptido producido se acumula en cuerpos de inclusión insolubles.

13. Un procedimiento según la reivindicación 12 en el que las células hospedadoras se cultivan en medio carente de cinc.

14. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 que comprende aislar y/o purificar dicho polipéptido.

15. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 que comprende renaturalizar o replegar el polipéptido.

16. Un procedimiento según la reivindicación 15 que comprende integrar el polipéptido en un homodímero que tenga actividad autoproteolítica.

17. Un homodímero que puede obtenerse mediante un procedimiento según la reivindicación 16.

18. Un homodímero de dos polipéptidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

19. Un procedimiento para obtener un polipéptido constituido por un fragmento de una proteasa NS2/3 del VHC, proteasa que se produce de forma natural como un precursor de NS2/3 del VHC y polipéptido que, cuando está en un homodímero, tiene actividad autoproteolítica, comprendiendo el procedimiento:

proporcionar uno o más fragmentos truncados de la proteasa NS2/3 del VHC;

analizar la capacidad del fragmento truncado o fragmentos truncados para formar un homodímero que tenga actividad autoproteolítica para identificar un homodímero que tenga actividad autoproteolítica;

por medio de lo cual se obtiene dicho polipéptido.

20. Un procedimiento según la reivindicación 19 en el que el fragmento truncado o los fragmentos truncados tienen como resto N-terminal un aminoácido que está en una posición del resto 903 al 913 en el precursor de la proteasa NS2/3 del VHC y como resto C-terminal un aminoácido que está en una posición del resto 1206 al 1657 en el precursor de la proteasa NS2/3 del VHC.

21. Un procedimiento según la reivindicación 19 o la reivindicación 20 que comprende producir dicho fragmento truncado o fragmentos truncados mediante la expresión a partir del ácido nucleico codificador.

22. Un procedimiento según la reivindicación 21 en el que dicho fragmento truncado o fragmentos truncados se producen mediante la expresión provocada cultivando células hospedadoras transformadas con dicho ácido nucleico codificador en condiciones para la producción de dicho fragmento truncado o fragmentos truncados.

23. Un procedimiento según la reivindicación 22 en el que las células hospedadoras se cultivan en condiciones en las que el polipéptido producido se acumula en cuerpos de inclusión insolubles.

24. Un procedimiento según la reivindicación 23 en el que las células hospedadoras se cultivan en medio carente de cinc.

25. Un homodímero de dos polipéptidos que pueden obtenerse mediante un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24.

26. Un procedimiento de ensayo para analizar la capacidad de un agente para modular la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC, que comprende:

(a) poner en contacto un agente de ensayo con los polipéptidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o con un homodímero de dos de dichos polipéptidos; y

(b) determinar la formación de homodímeros de dos de dichos polipéptidos y/o la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC.

27. Un procedimiento según la reivindicación 26 que comprende determinar la dimerización de dichos polipéptidos.

28. Un procedimiento según la reivindicación 26 o la reivindicación 27 que comprende determinar la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC.

29. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28 que comprende identificar un agente de ensayo como una sustancia que modula la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC.

30. Uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o de un homodímero de dos de dichos polipéptidos en la identificación u obtención de una sustancia que modula la actividad de la proteasa NS2/3 del VHC.