JP4286764B2 - ウイルス形態形成抑止法 - Google Patents

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Description

本発明は、ウイルス形態形成とウイルス感染の抑止に関する。特に、本発明は、ウイルス蛋白のプレニル化或はポストプレニル化反応を抑止することより、そのような抑止を行うことに関する。
ある種の膜結合性蛋白は、適切に機能するためには親油性残基の付与を必要とすることが示されてきている。疎水性残基はイソプレノイド前駆体から誘導されるので、そのような変異の一群は″プレニル化″と呼ばれる。プレニル残基は、いくつかの膜結合性蛋白において基質蛋白のカルボキシ末端の″ＣＸＸＸ″（配列番号１）ボックスに含まれていることが示されている、システインのスルフヒドリル基に付加することが、知られている。特に、そのような膜結合性蛋白の一つは、ラス（ras）−ガン遺伝子の蛋白生成物であることが示されている。膜蛋白の疎水性に関するこれらの反応の概要は、プレニル化を含めて、M．Hoffmanによって明かにされた（例えば、非特許文献１参照）。
更に、プレニル化は、プレニル化蛋白のカルボキシ末端を変異させる一連の追加反応の第一段階であることが多い。これらのプレニル化起動又はポストプレニル化の反応には、カルボキシメチル化とタンパク質加水分解を含む。
今日までのプレニル化基質蛋白における研究では、ＣＸＸＸボックスは、２、３位に脂肪族残基を、そして末端位にロイシン、セリン、メチオニン、システイン又はアラニンを含んでいる。このように、これまで研究されたＣＸＸＸボックスは、ボックス自身が比較的疎水性である。
ウイルス蛋白のプレニル化は、肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）の形態形成に必要であることが現在分かっている。これは、ウイルス蛋白がプレニル化されることを最初に示したものである。更には、いくつかの機能上の結果はプレニル化によるものとすることが出来る。プレニル化の標的であるウイルス蛋白は、驚いたことには配列Cys-Arg-Pro-Gln（配列番号２）の親水性ＣＸＸＸボックスを含んでいる。他のヴィリオン（virions）の蛋白のＣ−端の近傍にある、この比較的親水性のＣＸＸＸボックス及び対応するＣＸＸＸボックス（親水性或は親油性）又は他のシステイン含有配列のプレニル化又はプレニル化起動変異は、抗ウイルス作戦の格好の標的である。
これらの標的としては、現在、Ａ型肝炎（ＨＡＶ）ウイルス、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）ウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、バリセラ−ゾスタ−ウイルス（ＶＺＶ）、インフルエンザウイルス、タバコモザイクサテライトウイルス（ＴＭＳＶ）とオオムギストライプモザイクウイルス（ＢＳＭＶ）などの植物ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の核抗原及びヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）のネフ（ｎｅｆ）遺伝子生成物などの蛋白などがあると見なすことが出来る−特に、ネフ（ｎｅｆ）がエイズの発現に重要な役割を演ずることが示されて以来−が、しかしこれらに限定されるものではない（例えば、非特許文献２参照）。従って、これらの標的蛋白のプレニル化或はそれらのポストプレニル化反応を阻害することは、これらの感染の進行にとって抑止であると言える。
M．Hoffman、Science（１９９１）２５４：６５０−６５１及びJ．B．Gibbs、Cell（１９９１）６５：１−４ H．W．Kesstler III等、Cell（１９９１）６５：６５１−６６２
本発明は、インビトロ及びインビボ両方において、ウイルスの形態形成、生成、放出或は脱外被を妨げる方法を提供する。少なくとも１つのウイルス蛋白のプレニル化或はポストプレニル化反応を妨げる薬剤を感染細胞に与えて、ウイルス感染を停止させる。そのような細胞は培養基に含まれてもよいし、動物或は植物の被検体中に含まれていてもよい。
本発明の一視点において、候補薬剤をプレニル化阻害剤として選別する方法を提供する。該方法は、
（ａ）第１蛋白及び第２蛋白を分泌するか分泌するように変異された細胞に、又は、第１蛋白を分泌するか分泌するように変異された細胞及び第２蛋白を分泌するか分泌するように変異された細胞を組合せた細胞セットに、候補薬剤を接触させること、ここに、第１蛋白はＣＸＸＸボックスを含みかつプレニル化に依存して分泌される蛋白であり、第２蛋白はプレニル化に依存しないで分泌される蛋白である；
（ｂ）前記細胞又は細胞セットから分泌される第１蛋白の有無又は量を測定すること；及び
（ｃ）第２蛋白の分泌を阻害せずかつ第１蛋白の分泌量を減少させるか或は無くする候補薬剤を効力のあるプレニル化阻害剤として同定すること
を含むことを特徴とする（形態１・基本構成１）。
上記の方法において、前記第１蛋白は、大デルタ抗原であることが好ましい（形態２）。
上記の方法において、前記第２蛋白は、ＨＢｓＡｇであることが好ましい（形態３）。
上記の方法において、前記第１蛋白は、ＣＸＸＸボックスを含みかつプレニル化に依存して分泌される分泌蛋白が、そのＣＸＸＸボックスの代わりに、ＣＸＸＸボックスを含みかつプレニル化されても分泌されない非分泌蛋白のＣＸＸＸボックスを含むよう変異されたキメラであることが好ましい（形態４）。
更なる視点において、本発明は、ウイルスの形態形成、生成、放出或は脱外被を抑止する方法に関するもので、その方法は、少なくとも１つのウイルス蛋白のプレニル化或はポストプレニル化反応を効果的に妨げることから成る。他の視点において、本発明は、候補薬剤をプレニル化阻害能力で選別する検定法に関する。該方法は、（ａ）″ＣＸＸＸ″ボックスを含む第１の蛋白と第２のコントロール蛋白であって、前記第１の蛋白の分泌はプレニル化に依存し、第２のコントロール蛋白の分泌はプレニル化に依存しないものを分泌する細胞か、或は分泌するように変異された細胞を提供すること、ここで、第１の蛋白及び第２の蛋白をそれぞれ分泌する細胞は同一又は異なってもよく、（ｂ）第２のコントロール蛋白が分泌される条件下で前記細胞を候補薬剤と接触させること、及び
（ｃ）前記細胞から分泌される第１の蛋白の有無又は量を測定することを含み、分泌された第１の蛋白の量を減少させるか或は無くする候補薬剤が効力のある上記プレニル化阻害剤である。更に他の視点において、本発明は、ウイルス蛋白のプレニル化或はポストプレニル化反応を阻害するのに効果のある薬剤を投与することにより、ウイルス感染を治療する方法に関する。好ましい実施態様においては、ウイルス蛋白は、Ｄ型肝炎ウイルスの大（large）デルタ抗原、ＨＢＶの核抗原或はＨＩＶのネフ（ｎｅｆ）蛋白である。
肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）感染は、急性、慢性両方の肝臓疾患を引き起こし、致命的になり得る（１、２）。このＲＮＡウイルスは、１．７ｋｂの一本鎖環状ゲノムとデルタ抗原−唯一知られているＨＤＶ−コード化蛋白−を含む。これらの成分は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原が埋め込まれている脂質外被によって包み込まれており（３）、それはなぜＨＢＶ感染が付随して起こる場合のみＨＤＶ感染が起こる（４、５）のかを説明している。デルタ抗原の２つのイソ型は、感染した肝臓と血清中に存在する（６、７）。この異質性は、デルタ抗原の末端コドンの一つのヌクレオチドにおける一方向性の突然変異（コドン１９６：ＵＡＧ→ＵＧＧ）−それは複製の間に生ずる（８）−から起こる。このように、小デルタ抗原は１９５個のアミノ酸の長さであるが、大デルタ抗原は、そのCOOH末端に更に１９のアミノ酸を含む以外は、同等の配列である。両形態のデルタ抗原とも、同一のＲＮＡゲノムバインディングドメインを含んでいるが（９）、それらは、ゲノム複製に対して劇的に異なる効果を有する。大きな形態のものが強力なトランス優性の阻害剤（potent trans-dominant inhibitor）であるのに対し（１０、１１）、複製には小さな形態が必要である。
大デルタ抗原の最後の４つのアミノ酸は、Cys-Arg-Pro-Gln-COOH（配列番号３）である。このCOOH末端構造−ＣＸＸＸボックスと称する（但しＣはシステインで、Ｘは任意のアミノ酸）−は、メバロン酸から誘導される、システイン・１５炭素部分（ファルネシル）又はシステイン・２０炭素部分（ゲラニルケラニル）（cystein 15 or 20 carbon moieties）に付加するプレニル転移酵素の基質として関連付けられている（１２−１４）。生じた疎水性変異体は、ｐ２１ラス（Ras）（１５、１６）及びラミンＢ（１２、１７）に対して提案されているように、誘導された蛋白（derivatized protein）の膜結合性を助けうる。我々によって、大デルタ抗原が同様に変異されていることが、今明示された。
他のヴィリオンも、プレニル化に適した標的配列を含んでいる。これらの配列は、標的のウイルス蛋白のカルボキシ末端の近くにあり、ＣＸＸＸボックスの形でありうるが、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の核抗原及びＨＩＶ−１のネフ（ｎｅｆ）遺伝子生成物のように、システインはＣ−末端のアミノ酸としての位置を含めて、Ｃ−末端のより近い位置（closer）でもありうる。
大デルタ抗原がプレニル化のための基質であるかどうかを決定するために、３つの細胞系統、ＳＡＧ、ＬＡＧ、ＧＰ４Ｆを［３Ｈ］メバロン酸で標識した。ＧＰ４Ｆ細胞はＮＩＨ３Ｔ３細胞の誘導体である（１８）。ＳＡＧ（１９）とＬＡＧ（２０）細胞は、それそれ小及び大デルタ抗原を安定的に発現する、ＧＰ４Ｆ細胞の誘導体である。
標識細胞溶解物をイムノブロット法（図１Ａ）で分析して、小及び大デルタ抗原の定常状態量を検出した。溶解物は、デルタ抗原に対する抗体（抗−デルタ）、ＳＤＳポリアクリルアミドケル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び蛍光光度法（図１Ｂ）を使って、免疫沈降も行った。
更に詳しくは、図１を参照すると、大デルタ抗原が培養された細胞中でプレニル化されているのが示されている。細胞系統、ＳＡＧ（１９）（レーン１）、ＬＡＧ（２０）（レーン２）及びＧＰ４Ｆ（１８）（レーン３）をロバスタチン（２５μＭ）及び（Ｒ，Ｓ）−［５−３Ｈ］メバロネート（１４０ｍＭ）中で一晩培養し（３０）、ＲＩＰＡ緩衝液［５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ］に細胞溶解した（２０）。（Ａ）アリコートをイムノブロット分析にかけた（１１）。ブロットを、デルタ抗原に対する抗体（α−δＡｇ）を含むＨＤＶ感染患者からとった血清とヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）に対するセイヨウワサビパーオキシダーゼ共役ウサギ抗体で処理し、続いて化学ルミネセンス（アメルシャム）顕色（Ｂ）を行った。細胞抽出液から得た（Ｂ）免疫沈降物（α−δＡｇによる）について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと蛍光光度法を行った。図１においてＳは小デルタ抗原を、Ｌは大デルタ抗原を示す。分子サイズマーカーが左に（キロダルトンで）示されている。
このように、小ではなく大抗原が［３Ｈ］メバロン酸で標識されたことは大デルタ抗原が培養細胞中でプレニル化を受けることを示唆するものである。
［３Ｈ］プロリン又は［３Ｈ］メバロネートの存在下で行ったインビトロの翻訳反応を用いた場合にも、同様の結果が得られた（図２）。図２には、大デルタ抗原のＣｙｓ２１１のＳｅｒへの突然変異及びプレニル化の欠損が示されている。インビトロ翻訳反応を、（Ａ）Ｌ−［２、３、４、５−３Ｈ］プロリン（１９μＭ）（９４Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アメルシャム）か又は（Ｂ）、［３Ｈ］メバロネート（２００μＭ）（３０）の存在下で、ウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って行った。（Ａ）と（Ｂ）については、翻訳反応には小デルタ抗原ｍＲＮＡ（レーン１）；大デルタ抗原ｍＲＮＡ（レーン２）；水（レーン３）：又は大デルタ抗原（Ｃｙｓ２１１→Ｓｅｒ）（２０）ｍＲＮＡ（レーン４）を用いた。各反応物の一部（２０μｌ）を１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液に添加し、α−δＡｇで免疫沈降させ、上記のように分析した（図１）。
大イソ型のみが［３Ｈ］メバロネートで標識されたのに対し（図２Ｂ）、小及び大抗原両方が［３Ｈ］プロリンで標識された（図２Ａ）。
［３Ｈ］メバロネートによる変異が、Ｃｙｓ２１１が末端のＣＸＸＸボックスに存在することに依存しているかどうかを決定するために、この位置にセリンを含む突然変異体を作った（２０）。Ｃｙｓ２１１は大デルタ抗原における唯一のシステインである。Ｃｙｓ２１１をＳｅｒに突然変異させることは、大デルタ抗原の合成の妨げにはならなかったが（図２Ａ）、［３Ｈ］メバロネートによるその変異は生じなかった（図２Ｂ）。
大デルタ抗原のメバロネート変異の特異型は、ファルネシルよりむしろゲラニルケラニルであるように見える（２１）。最初に述べたＣＸＸＸボックスは、Ｃｙｓの後の１番目及び２番目に脂肪族残基を含んでいたが、他の型のアミノ酸についてはプレニル化部位に見い出すことが出来る（１３、１４）。COOH末端配列Cys-Arg-Pro-Gln-COOH−前述のＣＸＸＸボックスとは違う−が、新規のプレニル化酵素の存在を意味するものであるかどうか、或は又それが、既知のプレニル化転移酵素のより広い基質特異性を反映するものなのかどうかは明確でない。
ＨＤＶ粒子形成については、デルタ抗原及び関連するゲノムは、恐らくはＨＢＶエンベロープ蛋白を含んでいる細胞膜を標的としている。大デルタ抗原のプレニル化がこの工程に含まれ得ると仮定し、大デルタ抗原がＨＤＶ様粒子形成に充分かどうか最初に調べた。ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）が、小又は大デルタ抗原と共にＣＯＳ−７細胞に短時間現れた。ＨＢｓＡｇ−含有外被に包み込まれたデルタ抗原からなるウイルス様粒子を、ＨＢｓＡｇに対する抗体（抗ＨＢｓ）を使い、清澄化媒質（clarified media）上澄み液の免疫沈降法により分析した。
図３には、大デルタ抗原とＨＢｓＡｇ部分を用いた粒子形成が示されている。パネル（Ａ）及び（Ｂ）については、ＣＯＳ−７細胞は、下記プラスミドで短時間トランスフェクトされた：ＨＢＶ表面抗原を発現するＳＶ２４Ｈ（３１）及び小デルタ抗原を発現するＳＶＬＡｇ（１９）（レーン１）；大デルタ抗原を発現するＳＶ２４ＨとＳＶＬ−大（large)（２０）（レーン２）；及びＤＮＡ抜きの燐酸カルシウム沈澱物（レーン３）。（Ｃ）と（Ｄ）においては、ＣＯＳ−７細胞は、ＳＶ２４ＨとＳＶＬ−大（large）（レーン４）；ＳＶ２４ＨとＳＶＬ−大（large)(Ser211）（２０）（レーン５）；及びＤＮＡ抜きの燐酸カルシウム沈澱物（レーン６）でトランスフェクトされた。（Ａ）と（Ｃ）については、トランスフェクシヨン４８時間後に、ＨＢｓＡｇ含有粒子を抗ＨＢｓを使って清澄化媒質上澄み液の２−ｍｌアリコートから免疫沈降させ（３１）、上記のようにイムノブロット（α−δＡｇにより）及び化学ルミネセンス分析を行った（図１）。（Ｂ）と（Ｄ）については、トランスフェクトされた細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含む細胞溶解緩衝液［５０ｍＭトリス（ｐＨ８．８）、２％ＳＤＳ］に収集し（２０）、アリコートで蛋白イムノブロットと化学ルミネセンス分析を行った。分子サイズマーカーが左に（ｋＤで）示されている。
免疫沈降物中に存在するデルタ抗原を、イムノブロット分析法で検定した（図３Ａ）。小及び大デルタ抗原共、トランスフェクトされた細胞中で合成されたが（図３Ｂ）、大イソ型のみを分泌ＨＢｓＡｇ含有粒子内に内包した（図３Ａ）。同様の選択的な内包が観察されている。（２２）。
次に、この粒子形成におけるメバロネート変異の機能について調べた。大デルタ抗原の好ましい内包に対する一つの説明は、小抗原はＣＸＸＸボックスを欠いており、従って変異を受けることが出来ないというものである。大デルタ抗原のCysZ11→Ser突然変異体は、小デルタ抗原の様に振舞い、内包（package）もされないと考えられる。実際、これはその通りであることが分かった。野生型及びSer211突然変異体大抗原とも、トランスフェクトされた細胞中で合成されたのに対し（図３Ｄ）、野生型のみは粒子内に内包された（図３Ｃ）。かくて、大デルタ抗原の突然変異形はプレニル化されず、ＨＢｓＡｇと粒子を形成することができない。
我々の結果によれば、大デルタ抗原のプレニル化は、デルタ抗原とＨＢＶ表面抗原を含有する粒子の形成と放出に必要であることが示唆されている。生産的（productive）ウイルス感染にプレニル化部位が必要だということは、ＣＸＸＸボックスの他の突然変異によって（２３）、又すべてのＨＤＶ単離物配列（sequenced HDV isolates）の中のCys211とＣＸＸＸボックスモチーフの保存によって（２４）、更に示唆されている。
小ではなく大デルタ抗原のプレニル化及びウイルス粒子内への内包能力により、小デルタ抗原の終止コドンにおける突然変異誘導異質性の意義が、更に強調される。HDV複製の間に、Ｓゲノム（小抗原をコード化）が突然変異して、Ｌゲノム（大抗原をコード化）になる。この突然変異による少なくとも２つの効果を識別することが出来る（図４参照）。図４には、ＳゲノムからＬゲノムへの制御転換（regulatory switch）が示されている。複製の間に、小デルタ抗原をコード化するＳゲノムが突然変異して、大デルタ抗原をコード化するＬゲノムになる。この一つの塩基の突然変異は、デルタ抗原のCOOH末端に２つの効果を及ぼす。第１の効果は、COOH末端アミノ酸の性質を変えることであり、即ち、Pro（Ｐ）−ゲノム複製を高める（２０）−がGln（Ｑ）に置き換わり、その結果ゲノム複製を抑止する。第２の効果は、標的プレニル化部位（ＣＲＰＱ）が作られることである（ここにＣはシステイン；Ｒはアルギニン；Ｐはプロリン；Ｑはグルタミンである）。
このように、第１の効果は、ゲノム複製（小デルタ抗原）のエンハンサ−を、強力なトランス優性抑止剤（大デルタ抗原）に転換せしめることである（１０、１１）。機能に置けるこの劇的な差は、エンハンサー活性を付与するのに充分であるプロリンとCOOH末端のアミノ酸の性質によってもっぱら決るように見える（１１、２５）。第２の効果は、ＣＸＸＸボックスをデルタ抗原に付加することであり、それは蛋白をプレニル化し、恐らくはそれがＨＢｓＡｇ含有粒子に内包されるのを促進する。小抗原の生成から大デルタ抗原への転換の併合効果は、２つの役割を持っているように見える：即ち、ゲノムが更に複製されるのを抑制すること、及び内包とヴィリオン形態形成の立上りを促進することである。
我々の結果によれば、プレニル化蛋白を使った抗ＨＤＶ療法及び他のウイルスに関する抗ウイルス療法のための新しい標的として、プレニル化が示唆されている。そのような療法は、ヴィリオンの形態形成、生成、放出及び脱外被（機能的には、ヴィリオン形態形成の逆反応）を抑止することを目指している。プレニル化の基質として機能することが求められる４つのＣ−末端側アミノ酸の同義性（degeneracy）が、ますます明らかになることを考慮して、これらのC-末端位のいずれかにあるシステインにより、抗プレニル化療法の潜在標的が見極められると考えられる。
プレニル化経路で作用する酵素を阻害する薬剤とＣＸＸＸボックス類似物を含めて、ＨＤＶライフサイクルのプレニル化段階を阻止するようないくつかの構想が考えられる。両療法とも、ラス（ｒａｓ）媒介発ガン性形質転換を抑止するために考えられてきた（２６）。ｐ２１Ｈａ−ＲａｓのＣＸＸＸボックスに相当するテトラペプチド類は、インビトロにおけるｐ２１Ｈａ−Ｒａｓのプレニル化を阻害する（２７）。結局、ＨＤＶライフサイクルにおける大デルタ抗原の２元機能は、活発に複製するＳゲノムで感染した細胞を対象とした、提案された（１１）欠陥干渉粒子−（ＤＩＰ）（２８）様療法（defective interfering particle-like therapy）を更に精緻化することを示唆している。Ｌゲノムは小デルタ抗原の発現源（source）を複製のために必要とするが（１９、２０）、一旦複製するとそれ以上の複製に対する強力なトランス優性抑止剤を作り出すので、療法上投与されたＬゲノムＤＩＰが固有の遮断機構を有しうることは勿論のこと（１１）、感染細胞に対して特異的であり得る。もし、ＬゲノムもまたCys211からSerへの突然変異を含んでいるのであれば、複製を抑止するのみならず内包に影響を及ぼすデルタ抗原をコード化し得るだろう。
従って、抗ウイルス療法とウイルス形態形成の抑止に至る新しいアプローチは、少なくとも１つのウイルス蛋白のプレニル化又はポストプレニル化反応の阻害に焦点が絞られる。これは、標的ウイルスに感染した細胞を、少なくとも１つのウイルス蛋白のプレニル化又はポストプレニル化反応を阻害する薬剤の効果量と接触させることにより行いうる。そのような薬剤としては、メバロネート合成経路の誘導体である、プレニル化化合物（prenyl groups）の形成阻害剤がある。その他の薬剤としては、小ペプチド、テトラペプチド及びプレニル化されるシステイン残基の状況に似たその他の化合物を含めて、プレニル化の標的配列の近似物ないし誘因物（おとり decoys）がある。例えば、Y．Reise等、Cell（1990）62：81-88は、Ｃ−Ａ−Ａ−Ｘテトラペプチドによるプレニル化阻害を報告している。上記のように、プレニル化されるシステイン残基は一般に、標的蛋白のカルボキシ末端にある；最も普通の標的配列はＣＸＸＸボックスを含むが、Ｃ−末端に比較的近接する（closer）システインも標的となりうる；ゆえに、関連ペプチドとしては、ＸＣＸＸ（配列番号４）、ＸＸＣＸ（配列番号５）及びＸＸＸＣ（配列番号６）の形のものがある。他の薬剤としては、プレニル化化合物自身の誘導体及び類似物がある。その他の適当な薬剤としては、プレニルトランスフェラーゼ酵素及びポストプレニル化反応を触媒する酵素の阻害剤がある。
候補阻害剤の検定
本発明はまた、あるプレニル化蛋白を分泌させるための、プレニル化の必要条件を利用することにより、プレニル化阻害剤としての候補薬剤を選別する方法を提供する。分泌のためにプレニル化が必要なそれらの蛋白に対して、直接かつ単純な方法で検定を実施することが出来る。その分泌がプレニル化に依存している第１の蛋白を分泌するか或は分泌するように変異させた細胞を、実験用細胞として用いる。分泌がプレニル化に依存しない第２の蛋白を、コントロールとして用いる。このコントロール蛋白は、第１蛋白と同一又は異なる宿主細胞により分泌させてもよい。候補薬剤を、両方の蛋白を分泌する細胞か、又は各々を分泌する細胞を組合せたセット（matched sets）に投与する。分泌は、第１及び第２の分泌蛋白の有無について細胞上澄み液を検定することにより、例えば通常のＥＬＩＳＡ検定法により容易に評価することが出来る。合格する候補薬剤は、コントロール蛋白の分泌を抑止することはないが、分泌のためにはプレニル化が必要なテスト試料では蛋白分泌を抑止する。
ＨＤＶの大デルタ抗原は、プレニル化が分泌の必要条件であるウイルス蛋白である。ゆえに、この蛋白は、検定のための有用な試験システムの中心部分を成すものである。プレニル化が必要でない蛋白を分泌するように変異させた細胞を、コントロールとして用いることが出来る。大デルタ抗原を試験用蛋白として用いる場合、同じ細胞でＨＢｓＡｇをコントロール蛋白として用いるのが有利である。何故なら、ＨＢｓＡｇもデルタ抗原の分泌に必要だからである。
勿論、上記の検定法では、阻害剤が、大デルタ抗原或は検定で用いられる他のプレニル化制御分泌蛋白のプレニル化機構を阻止することが必要である。一連のプレニルトランスフェラーゼとプレニル化化合物（Prenyl groups）が、プレニル化阻害剤が必要か又は求められる種々の蛋白に適用されることが知られている。これらの蛋白は、プレニル化されていようとそうでなかろうと、分泌されないものもある；そのような１つの例は、ラス（ras）−ガン遺伝子の蛋白生成物である。
それにもかかわらず、上記検定方式を取り入れることにより、分泌蛋白の相当するＣＸＸＸボックスの代りに、非分泌蛋白の特徴を示すＣＸＸＸボックスを配することによって、これらの非分泌蛋白におけるプレニル化の阻害剤を選別することが出来る。生成するキメラ蛋白は、非分泌蛋白の特徴を示す移入″ＣＸＸＸ″ボックスのプレニル化特性を示すだろうが、上澄み液に移行して検定にかかる宿主分泌蛋白の能力は保持するだろう。このように、検定を使用してプレニル化阻害剤を検索する標的蛋白の範囲を、非分泌蛋白にまで広げることが出来る。
プレニル化に依存しない分泌蛋白を与えるコントロールシステムの存在は不可欠である。このコントロールにより、細胞にとって単に毒でしかないか或は分泌一般を抑止する候補阻害剤が、取り除かれる。上記検定の変形の１つにより確認されたプレニル化阻害剤は、ウイルスの抑制だけではなく、−ガンに限らず−プレニル化蛋白が関係するのが分かっている他のプロセス或は病状にも使用されることが期待される。
ウイルス蛋白のプレニル化は、蛋白質加水分解やカルボキシメチル化のような、蛋白のそれ以上のポストプレニル化反応にとっては明かに必要条件である。各ステップの本質的連鎖を、問題のウイルス蛋白に最も好都合な点で阻止することが出来る。
阻害剤の投与
アミノ酸配列データバンクを調べて、Ｃ−末端に″ＣＸＸＸ″ボックスを含むウイルス蛋白を選別することによって、プレニル化を行うウイルス蛋白を更に得ることが出来る。そのような蛋白の実例リストとしては、例えば、前記のごとく、ＨＡＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＶＺＶ、インフルエンザウイルス、タバコモザイクサテライトウイルス及びオオムギストライプモザイクウイルスなどの植物ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスの核抗原及びＨＩＶ−１のネフ（ｎｅｆ）遺伝子生成物などの特異蛋白がある。
適当なプレニル化標的のこれらの候補は、標識メバロン酸を適当なウイルス又はウイルス遺伝子生成物に感染するか又はそれを含んでいる細胞に与え、基準として標識付けをして得られたウイルス蛋白のプレニル化状態を評価することにより、上記類似の方法で有効と確認することが出来る。更に、各ヴィリオンの形態形成におけるプレニル化の役割及び抗ウイルス療法の標的としての妥当性もまた、上記類似の方法で有効と確認することが出来る。
ウイルス形態形成、生成、放出または脱外被を培養中に抑止する場合には、適当な宿主細胞を使ってウイルスを培養し、プレニル化又はポストプレニル化反応を阻害するのに使われる薬剤を培養基中に添加する。感染細胞が、哺乳類被検体或は特にヒト又はその他の霊長類被検体などの動物被検体に含まれる場合、プレニル化阻害に使われる薬剤は、一般に薬物製剤として投与される。選ばれた薬剤の性質に依存する適当な製剤については Reminton's Pharmaceutical Sciences、最新版、Mack Publishing Co．、Easton、PAを見ればよい。投与経路としては、注射投与、経口投与、及び粘膜経由と皮膚経由投与を含めて、標準経路がある。製剤の形態は、選ばれる薬剤の外に投与経路によって選ばれる。薬剤の適当な混合物も活性成分として用いることが出来る。植物に投与する場合、活性成分を植物細胞に導入できる製剤を担体として用いる。
下記の参照文献を、明細書本文中の参照番号に従って列挙する。
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２３．W.-S.リュウ(Ryu)等、準備中.
２４．１４の独立ウイルス単離集団（配列）の内、大デルタ抗原の４つの末端アミノ酸として、Cys-Arg-Pro-Gln-COOH をコ−ドする配列が13、Cys-Thr-Pro-Gln-COOH をコ−ドする配列が１［K.S.ワン(Wang)等、Nature(1986)323:508; S.牧野等、同上(1987)329:343； M.Y.P.クオ(Kuo)等、J.Virol.(1988)62:1855； J.A.サルダンハ(Saldanha)等、J.Gen.Virol.(1990)71:1603；Y.P.キシア(Xia)等、(1990) 178:331；F.今関等、J.Virol.(1990)64:5594； Y.-C.チャオ(Chao)等、Hepatology(1991) 13:345；P.デニ−(Deny)等、J.Gen.Virol.(1991)72:735］.
２５．大デルタ抗原のCOOH末端GlnのProへの特異的突然変異は、蛋白質を抑止剤からゲノム複製のエンハンサ−へ転換させたことを、我々は最近発見した。
２６．J.B.ギブス(Gibbs)、Cell(1991)65:1.
２７．Y.レイス(Reiss)等、同上(1990)62:81.
２８．R.F.レ−ミッヒ(Ramig)、Virology、B.N. フィ−ルズ(Fields)等編（レ−ベン(Raven)、ニュ−ヨ−ク、1990）、pp.112-122.
２９．M.Y.P.クオ(Kuo)等、J.Virol.(1989)63:1945.
３０．R.K.ケラ−(Keller)、J.Biol.Chem.(1986) 261:12053の方法に従って、(R,S)−［5-3H］メバロネ−ト(4-18.8 Ci/mmol)が合成された。
３１．V.ブル−ス(Bruce)等、J.Virol.(1991) 65:3813.
本発明は、ウイルス形態形成とウイルス感染の抑止に関する。特に、本発明は、ウイルス蛋白のプレニル化或はポストプレニル化反応を抑止することより、そのような抑止を行うことに関する。
ウイルス蛋白を表すウイルス感染細胞であって、トリチウム化メバロネートで処理されたものの溶菌によって得られた蛋白のイムノブロットの写真である。 野生型又は突然変異ウイルス蛋白を含み、トリチウム化（tritiated）プロリン又はメバロネートで標識された細胞の溶解物から誘導された蛋白のイムノブロットの写真である。 ウイルス蛋白を含む種々の細胞上澄み液のイムノブロットの写真である。 ＨＤＶ形態形成の進行を図示したものである。

Claims (4)

  1. 候補薬剤をプレニル化阻害剤として選別する方法であって、該方法は、
    （ａ）第１蛋白及び第２蛋白を分泌するか分泌するように変異された細胞に、又は、第１蛋白を分泌するか分泌するように変異された細胞及び第２蛋白を分泌するか分泌するように変異された細胞を組合せた細胞セットに、候補薬剤を接触させること、ここに、第１蛋白はＣＸＸＸボックスを含みかつプレニル化に依存して分泌される蛋白であり、第２蛋白はプレニル化に依存しないで分泌される蛋白である；
    （ｂ）前記細胞又は細胞セットから分泌される第１蛋白の有無又は量を測定すること；及び
    （ｃ）第２蛋白の分泌を阻害せずかつ第１蛋白の分泌量を減少させるか或は無くする候補薬剤を効力のあるプレニル化阻害剤として同定すること
    を含む方法。
  2. 前記第１蛋白は、大デルタ抗原である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第２蛋白は、ＨＢｓＡｇである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記第１蛋白は、ＣＸＸＸボックスを含みかつプレニル化に依存して分泌される分泌蛋白が、そのＣＸＸＸボックスの代わりに、ＣＸＸＸボックスを含みかつプレニル化されても分泌されない非分泌蛋白のＣＸＸＸボックスを含むよう変異されたキメラである、請求項１に記載の方法。
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