JPH08502162A - ウイルス形態形成抑止法 - Google Patents

ウイルス形態形成抑止法

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Abstract

(57)【要約】 少なくとも１つのウイルス蛋白のプレニル化或はポストプレニル化反応の阻害を図ることにより、ウイルスの形態形成、生成、放出或は脱外被を抑止することが出来る。プレニル化及びポストプレニル化反応の阻害剤、例えば、メバロネートやプレニル化化合物（prenyl group）の合成経路の阻害剤、プレニル転移酵素の阻害剤やプレニル化標的CXXXボックスの擬態などを使用することが開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の名称］ ウイルス形態形成抑止法 この発明は、米国立衛生研究所の援助によりなされた。米国政府は、この発明 になんらかの権利を有する。 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ウイルス形態形成とウイルス感染の抑止に関する。特に、本発明は 、ウイルス蛋白のプレニル化或はポストプレニル化反応を抑止することより、そ のような抑止を行うことに関する。 ［従来の技術］ ある種の膜結合性蛋白は、適切に機能するためには親油性残基の付与を必要と することが示されてきている。疎水性残基はイソプレノイド前駆体から誘導され るので、そのような変異の一群は″プレニル化″と呼ばれる。プレニル残基は、 いくつかの膜結合性蛋白において基質蛋白のカルボキシ末端の″CXXX″ボックス に含まれていることが示されている、システインのスルフヒドリル基に付加する ことが、知られている。特に、そのような膜結合性蛋白の一つは、ラス（ras） −ガン遺伝子の蛋白生成物であることが示されている。膜蛋白の疎水性に関する これらの反応の概要は、プレ ニル化を含めて、M．Hoffman、Science（１９９１）２５４：６５０−６５１及 びJ．B．Gibbs、Cell（１９９１）６５：１−４によって明かにされた。 更に、プレニル化は、プレニル化蛋白のカルボキシ末端を変異させる一連の追 加反応の第一段階であることが多い。これらのプレニル化起動又はポストプレニ ル化の反応には、カルボキシメチル化とタンパク質加水分解を含む。 今日までのプレニル化基質蛋白における研究では、CXXXボックスは、２、３位 に脂肪族残基を、そして末端位にロイシン、セリン、メチオニン、システイン又 はアラニンを含んでいる。このように、これまで研究されたCXXXボックスは、ボ ックス自身が比較的疎水性である。 ウイルス蛋白のプレニル化は、肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）の形態形成に必 要であることが現在分かっている。これは、ウイルス蛋白がプレニル化されるこ とを最初に示したものである。更には、いくつかの機能上の結果はプレニル化に よるものとすることが出来る。プレニル化の標的であるウイルス蛋白は、驚いた ことには配列Cys-Arg-Pro-Glnの親水性CXXXボックスを含んでいる。他のヴィリ オン（virions）の蛋白のＣ−端の近傍にある、この比較的親水性のCXXXボック ス及び対応するCXXXボックス（親水性或は親油性）又 は他のシステイン含有配列のプレニル化又はプレニル化起動変異は、抗ウイルス 作戦の格好の標的である。 これらの標的としては、現在、Ａ型肝炎（HAV)ウイルス、Ｃ型肝炎（HCV）ウ イルス、ヘルペスシンプレックスウイルス（HSV）、サイトメガロウイルス（CMV ）、バリセラ−ゾスタ−ウイルス（VZV）、インフルエンザウイルス、タバコモ ザイクサテライトウイルス（TMSV）とオオムギストライプモザイクウイルス（BS MV）などの植物ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）の核抗原及びヒト免疫不全 ウイルス−１（HIV-1）のネフ（nef）遺伝子生成物などの蛋白などがあると見な すことが出来る−特に、ネフ（nef）がエイズの発現に重要な役割を演ずること が示されて以来−が、しかしこれらに限定されるものではない（H．W．Kesstler III等、Cell（１９９１）６５：６５１−６６２）。従って、これらの標的蛋白 のプレニル化或はそれらのポストプレニル化反応を阻害することは、これらの感 染の進行にとって抑止であると言える。 ［発明の開示］ 本発明は、インビトロ及びインビボ両方において、ウイルスの形態形成、生成 、放出或は脱外被を妨げる方法を提供する。少なくとも１つのウイルス蛋白のプ レニル化或はポストプレニル化反応を妨げる薬剤を感染細胞に与えて、ウイルス 感染を停止させる。そのよ うな細胞は培養基に含まれてもよいし、動物或は植物の被検体中に含まれていて もよい。 このように、一つの視点において、本発明は、ウイルスの形態形成、生成、放 出或は脱外被を抑止する方法に関するもので、その方法は、少なくとも１つのウ イルス蛋白のプレニル化或はポストプレニル化反応を効果的に妨げることから成 る。他の視点において、本発明は、候補薬剤をプレニル化阻害能力で選別する検 定法に関する。第三の視点において、本発明は、ウイルス蛋白のプレニル化或は ポストプレニル化反応を阻害するのに効果のある薬剤を投与することにより、ウ イルス感染を治療する方法に関する。好ましい実施態様においては、ウイルス蛋 白は、Ｄ型肝炎ウイルスの大（large）デルタ抗原、HBVの核抗原或はHIVのネフ （nef）蛋白である。 ［図面の簡単な説明］ 図１Ａと１Ｂは、ウイルス蛋白を表すウイルス感染細胞であって、トリチウム 化メバロネートで処理されたものの溶菌によって得られた蛋白のイムノブロット の写真である。 図２Ａと２Ｂは、野生型又は突然変異ウイルス蛋白を含み、トリチウム化（tr itiated）プロリン又はメバロネートで標識された細胞の溶解物から誘導された 蛋白のイムノブロットの写真である。 図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄは、ウイルス蛋白を含む種々の細胞上澄み液のイ ムノブロットの写真である。 図４は、HDV形態形成の進行を図示したものである。 ［発明の実施の態様］ 肝炎デルタウイルス（HDV）感染は、急性、慢性両方の肝臓疾患を引き起こし 、致命的になり得る（１、２）。このRNAウイルスは、１．７ｋｂの一本鎖環状 ゲノムとデルタ抗原−唯一知られているHDV−コード化蛋白−を含む。これらの 成分は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原が埋め込まれている脂質外被によって包み込 まれており（３）、それはなぜHBV感染が付随して起こる場合のみHDV感染が起こ る（４、５）のかを説明している。デルタ抗原の２つのイソ型は、感染した肝臓 と血清中に存在する（６、７）。この異質性は、デルタ抗原の末端コドンの一つ のヌクレオチドにおける一方向性の突然変異（コドン１９６：UAG→UGG）−それ は複製の間に生ずる（８）−から起こる。このように、小デルタ抗原は１９５個 のアミノ酸の長さであるが、大デルタ抗原は、そのCOOH末端に更に１９のアミノ 酸を含む以外は、同等の配列である。両形態のデルタ抗原とも、同一のRNAケノ ムバインディングドメインを含んでいるが（９）、それらは、ゲノム複製に対し て劇的に異なる効果を有する。大きな形態のものが強力なトランス優性の阻害剤 （potent trans-dominan t inhibitor）であるのに対し（１０、１１）、複製には小さな形態が必要であ る。 大デルタ抗原の最後の４つのアミノ酸は、Cys-Arg-Pro-Gln-COOHである。この COOH末端構造−CXXXボックスと称する（但しCはシステインで、Xは任意のアミノ 酸）−は、メバロン酸から誘導される、システイン・１５炭素部分（ファルネシ ル）又はシステイン・２０炭素部分（ゲラニルケラニル）（cystein 15 or 20 c arbon moieties）に付加するプレニル転移酵素の基質として関連付けられている （１２−１４）。生じた疎水性変異体は、ｐ２１ラス（Ras）（１５、１６）及 びラミンＢ（１２、１７）に対して提案されているように、誘導された蛋白（de rivatized protein）の膜結合性を助けうる。我々によって、大デルタ抗原が同 様に変異されていることが、今明示された。 他のヴィリオンも、プレニル化に適した標的配列を含んでいる。これらの配列 は、標的のウイルス蛋白のカルボキシ末端の近くにあり、CXXXボックスの形であ りうるが、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）の核抗原及びHIV-1のネフ（nef）遺伝子生 成物のように、システインはＣ−末端のアミノ酸としての位置を含めて、Ｃ−末 端のより近い位置（closer）でもありうる。 大デルタ抗原がプレニル化のための基質であるかどうかを決定するために、３ つの細胞系統、SAG、LAG、 GP4Fを［3H］メバロン酸で標識した。GP4F細胞はNIH3T3細胞の誘導体である（１ ８）。SAG（１９）とLAG（２０）細胞は、それそれ小及び大デルタ抗原を安定的 に発現する、GP4F細胞の誘導体である。 標識細胞溶解物をイムノブロット法（図１Ａ）で分析して、小及び大デルタ抗 原の定常状態量を検出した。溶解物は、デルタ抗原に対する抗体（抗−デルタ） 、SDSポリアクリルアミドケル電気泳動（SDS-PAGE）及び蛍光光度法（図１Ｂ） を使って、免疫沈降も行った。 更に詳しくは、図１を参照すると、大デルタ抗原が培養された細胞中でプレニ ル化されているのが示されている。細胞系統、SAG（１９）（レーン１）、LAG（ ２０）（レーン２）及びGP4F（１８）（レーン３）をロバスタチン（２５μM） 及び（R，S）-［5-3H］メバロネート（１４０mM）中で一晩培養し（３０）、RIP A緩衝液［50mMトリス（pH7.5）、150mM NaCl、1%NP-40、0.5%デオキシコール酸 ナトリウム、0.1%SDS］に細胞溶解した（２０）。（Ａ）アリコートをイムノブ ロット分析にかけた（１１）。ブロットを、デルタ抗原に対する抗体（α−δAg ）を含むHDV感染患者からとった血清とヒト免疫グロブリンG（IgG）（Promega） に対するセイヨウワサビパ−オキシダーゼ共役ウサギ抗体で処理し、続いて化学 ルミネセンス（アメルシャム）顕色 （Ｂ）を行った。細胞抽出液から得た（Ｂ）免疫沈降物（α−δAgによる）につ いて、SDS-PAGEと蛍光光度法を行った。図１においてＳは小デルタ抗原を、Ｌは 大デルタ抗原を示す。分子サイズマーカーが左に（キロダルトンで）示されてい る。 このように、小ではなく大抗原が［3H］メバロン酸で標識されたことは大デル タ抗原が培養細胞中でプレニル化を受けることを示唆するものである。 ［3H］プロリン又は［3H］メバロネートの存在下で行ったインビトロの翻訳反 応を用いた場合にも、同様の結果が得られた（図２）。図２には、大デルタ抗原 のCys211のSerへの突然変異及びプレニル化の欠損が示されている。インビトロ 翻訳反応を、（Ａ）L-［2、3、4、5-3H］プロリン（19μM）（94Ci/mmol、アメ ルシャム）か又は（Ｂ）、［3H］メバロネート（200μM）（３０）の存在下で、 ウサギ網状赤血球溶解物（Promega）を使って行った。（Ａ）と（Ｂ）について は、翻訳反応には小デルタ抗原mRNA（レーン１）；大デルタ抗原mRNA（レーン２ ）；水（レーン３）：又は大デルタ抗原（Cys211→Ser）（２０）mRNA（レーン ４）を用いた。各反応物の一部（20μl）を１mlのRIPA緩衝液に添加し、α−δA gで免疫沈降させ、上記のように分析した（図１）。 大イソ型のみが［3Ｈ］メバロネートで標識されたの に対し（図2B）、小及び大抗原両方が［3H］プロリンで標識された（図２Ａ）。 ［3H］メバロネートによる変異が、Cys211が末端のCXXXボックスに存在すること に依存しているかどうかを決定するために、この位置にセリンを含む突然変異体 を作った（２０）。Cys211は大デルタ抗原における唯一のシステインである。Cy s211をSerに突然変異させることは、大デルタ抗原の合成の妨げにはならなかっ たが（図2A）、［3H］メバロネートによるその変異は生じなかった（図2B）。 大デルタ抗原のメバロネート変異の特異型は、ファルネシルよりむしろゲラニ ルケラニルであるように見える（２１）。最初に述べたCXXXボックスは、Cysの 後の１番目及び２番目に脂肪族残基を含んでいたが、他の型のアミノ酸について はプレニル化部位に見い出すことが出来る（１３、１４）。COOH末端配列Cys-Ar g-Pro-Gln-COOH−前述のCXXXボックスとは違う−が、新規のプレニル化酵素の存 在を意味するものであるかどうか、或は又それが、既知のプレニル化転移酵素の より広い基質特異性を反映するものなのかどうかは明確でない。 HDV粒子形成については、デルタ抗原及び関連するゲノムは、恐らくはHBVエン ベロープ蛋白を含んでいる細胞膜を標的としている。大デルタ抗原のプレニル化 がこの工程に含まれ得ると仮定し、大デルタ抗原が HDV様粒子形成に充分かどうか最初に調べた。HBV表面抗原（HBsAg）が、小又は 大デルタ抗原と共にCOS-7細胞に短時間現れた。HBsAg-含有外被に包み込まれた デルタ抗原からなるウイルス様粒子を、HBsAgに対する抗体（抗HBs）を使い、清 澄化媒質（clarified media）上澄み液の免疫沈降法により分析した。 図３には、大デルタ抗原とHBsAg部分を用いた粒子形成が示されている。パネ ル（A）及び（B）については、COS-7細胞は、下記プラスミドで短時間トランス フェクトされた：HBV表面抗原を発現するSV24H（３１）及び小デルタ抗原を発現 するSVLAg（１９）（レーン１）；大デルタ抗原を発現するSV24HとSVL−大（lar ge）（２０）（レーン２）；及びDNA抜きの燐酸カルシウム沈澱物（レーン３） 。（C）と（D）においては、COS-7細胞は、SV24HとSVL−大（large）（レーン４ ）；SV24HとSVL−大（large）（Ser211）（２０）（レーン５）；及びDNA抜きの 燐酸カルシウム沈澱物（レーン６）でトランスフェクトされた。（A）と（C）に ついては、トランスフェクシヨン４８時間後に、HBsAg含有粒子を抗HBsを使って 清澄化媒質上澄み液の2-mlアリコートから免疫沈降させ（３１）、上記のように イムノブロット（α−δAgにより）及び化学ルミネセンス分析を行った（図１） 。（B）と（D）については、トランスフェクトされた細胞を、プロテアーゼ阻害 剤を含む細胞溶 解緩衝液［50mMトリス（pH8.8）、2%SDS］に収集し（２０）、アリコートで蛋白 イムノブロットと化学ルミネセンス分析を行った。分子サイズマーカーが左に（ kDで）示されている。 免疫沈降物中に存在するデルタ抗原を、イムノブロット分析法で検定した（図 3A）。小及び大デルタ抗原共、トランスフェクトされた細胞中で合成されたが（ 図3B）、大イソ型のみを分泌HBsAg含有粒子内に内包した（図3A）。同様の選択 的な内包が観察されている。（２２）。 次に、この粒子形成におけるメバロネート変異の機能について調べた。大デル タ抗原の好ましい内包に対する一つの説明は、小抗原はCXXXボックスを欠いてお り、従って変異を受けることが出来ないというものである。大デルタ抗原のCys2 11→Ser突然変異体は、小デルタ抗原の様に振舞い、内包（package）もされない と考えられる。実際、これはその通りであることが分かった。野生型及びSer211 突然変異体大抗原とも、トランスフェクトされた細胞中で合成されたのに対し（ 図3D）、野生型のみは粒子内に内包された（図3C）。かくて、大デルタ抗原の突 然変異形はプレニル化されず、HBsAgと粒子を形成することができない。 我々の結果によれば、大デルタ抗原のプレニル化は、デルタ抗原とHBV表面抗 原を含有する粒子の形成と放 出に必要であることが示唆されている。生産的（productive）ウイルス感染にプ レニル化部位が必要だということは、CXXXボックスの他の突然変異によって（２ ３）、又すべてのHDV単離物配列（sequenced HDV isolates）の中のCys211とCXX Xボックスモチーフの保存によって（２４）、更に示唆されている。 小ではなく大デルタ抗原のプレニル化及びウイルス粒子内への内包能力により 、小デルタ抗原の終止コドンにおける突然変異誘導異質性の意義が、更に強調さ れる。HDV複製の間に、Ｓゲノム（小抗原をコード化）が突然変異して、Ｌゲノ ム（大抗原をコード化）になる。この突然変異による少なく共２つの効果を識別 することが出来る（図４参照）。図４には、ＳゲノムからＬゲノムへの制御転換 （regulatory switch）が示されている。複製の間に、小デルタ抗原をコード化 するＳゲノムが突然変異して、大デルタ抗原をコード化するＬゲノムになる。こ の一つの塩基の突然変異は、デルタ抗原のCOOH末端に２つの効果を及ぼす。第１ の効果は、COOH末端アミノ酸の性質を変えることであり、即ち、Pro（P）−ゲノ ム複製を高める（２０）−がGln（Q）に置き換わり、その結果ケノム複製を抑止 する。第２の効果は、標的プレニル化部位（CRPQ）が作られることである（ここ にＣはシステイン；Ｒはアルギニン；Ｐはプロリン；Ｑはグルタミンである）。 このように、第１の効果は、ゲノム複製（小デルタ抗原）のエンハンサ−を、 強力なトランス優性抑止剤（大デルタ抗原）に転換せしめることである（１０、 １１）。機能に置けるこの劇的な差は、エンハンサー活性を付与するのに充分で あるプロリンとCOOH末端のアミノ酸の性質によってもっぱら決るように見える（ １１、２５）。第２の効果は、CXXXボックスをデルタ抗原に付加することであり 、それは蛋白をプレニル化し、恐らくはそれがHBsAg含有粒子に内包されるのを 促進する。小抗原の生成から大デルタ抗原への転換の併合効果は、２つの役割を 持っているように見える：即ち、ゲノムが更に複製されるのを抑制すること、及 び内包とヴィリオン形態形成の立上りを促進することである。 我々の結果によれば、プレニル化蛋白を使った抗HDV療法及び他のウイルスに 関する抗ウイルス療法のための新しい標的として、プレニル化が示唆されている 。そのような療法は、ヴィリオンの形態形成、生成、放出及び脱外被（機能的に は、ヴィリオン形態形成の逆反応）を抑止することを目指している。プレニル化 の基質として機能することが求められる４つのC-末端側アミノ酸の同義性（dege neracy）が、ますます明らかになることを考慮して、これらのC-末端位のいずれ かにあるシステインにより、抗プレニル化療法の潜在標 的が見極められると考えられる。 プレニル化経路で作用する酵素を阻害する薬剤とCXXXボックス類似物を含めて 、HDVライフサイクルのプレニル化段階を阻止するようないくつかの構想が考え られる。両療法とも、ラス（ras）媒介発ガン性形質転換を抑止するために考え られてきた（２６）。ｐ２１Ha-RasのCXXXボックスに相当するテトラペプチド類 は、インビトロにおけるｐ２１Ha-Rasのプレニル化を阻害する（２７）。結局、 HDVライフサイクルにおける大デルタ抗原の２元機能は、活発に複製するＳゲノ ムで感染した細胞を対象とした、提案された（１１）欠陥干渉粒子−（DIP）（ ２８）様療法（defective interfering particle-like therapy）を更に精緻化 することを示唆している。Ｌゲノムは小デルタ抗原の発現源（source）を複製の ために必要とするが（１９、２０）、一旦複製するとそれ以上の複製に対する強 力なトランス優性抑止剤を作り出すので、療法上投与されたＬゲノムDIPが固有 の遮断機構を有しうることは勿論のこと（１１）、感染細胞に対して特異的であ り得る。もし、ＬゲノムもまたCys211からSerへの突然変異を含んでいるのであ れば、複製を抑止するのみならず内包に影響を及ぼすデルタ抗原をコード化し得 るだろう。 従って、抗ウイルス療法とウイルス形態形成の抑止 に至る新しいアプローチは、少なくとも１つのウイルス蛋白のプレニル化又はポ ストプレニル化反応の阻害に焦点が絞られる。これは、標的ウイルスに感染した 細胞を、少なくとも１つのウイルス蛋白のプレニル化又はポストプレニル化反応 を阻害する薬剤の効果量と接触させることにより行いうる。そのような薬剤とし ては、メバロネート合成経路の誘導体である、プレニル化化合物（prenyl group s）の形成阻害剤がある。その他の薬剤としては、小ペプチド、テトラペプチド 及びプレニル化されるシステイン残基の状況に似たその他の化合物を含めて、プ レニル化の標的配列の近似物ないし誘因物（おとり decoys）がある。例えば、 Y．Reise等、Cell（1990）62：81-88は、C-A-A-Xテトラペプチドによるプレニル 化阻害を報告している。上記のように、プレニル化されるシステイン残基は一般 に、標的蛋白のカルボキシ末端にある；最も普通の標的配列はCXXXボックスを含 むが、C-末端に比較的近接する（closer）システインも標的となりうる；ゆえに 、関連ペプチドとしては、XCXX、XXCX及びXXXCの形のものがある。他の薬剤とし ては、プレニル化化合物自身の誘導体及び類似物がある。その他の適当な薬剤と しては、プレニルトランスフェラーゼ酵素及びポストプレニル化反応を触媒する 酵素の阻害剤がある。候補阻害剤の検定 本発明はまた、あるプレニル化蛋白を分泌させるための、プレニル化の必要条 件を利用することにより、プレニル化阻害剤としての候補薬剤を選別する方法を 提供する。分泌のためにプレニル化が必要なそれらの蛋白に対して、直接かつ単 純な方法で検定を実施することが出来る。その分泌がプレニル化に依存している 第１の蛋白を分泌するか或は分泌するように変異させた細胞を、実験用絹胞とし て用いる。分泌がプレニル化に依存しない第２の蛋白を、コントロールとして用 いる。このコントロール蛋白は、第１蛋白と同一又は異なる宿主細胞により分泌 させてもよい。候補薬剤を、両方の蛋白を分泌する細胞か、又は各々を分泌する 細胞を組合せたセット（matched sets）に投与する。分泌は、第１及び第２の分 泌蛋白の有無について細胞上澄み液を検定することにより、例えば通常のELISA 検定法により容易に評価することが出来る。合格する候補薬剤は、コントロール 蛋白の分泌を抑止することはないが、分泌のためにはプレニル化が必要なテスト 試料では蛋白分泌を抑止する。 HDVの大デルタ抗原は、プレニル化が分泌の必要条件であるウイルス蛋白であ る。ゆえに、この蛋白は、検定のための有用な試験システムの中心部分を成すも のである。プレニル化が必要でない蛋白を分泌するように変異させた細胞を、コ ントロールとして用いるこ とが出来る。大デルタ抗原を試験用蛋白として用いる場合、同じ細胞でHBsAgを コントロール蛋白として用いるのが有利である。何故なら、HBsAgもデルタ抗原 の分泌に必要だからである。 勿論、上記の検定法では、阻害剤が、大デルタ抗原或は検定で用いられる他の プレニル化制御分泌蛋白のプレニル化機構を阻止することが必要である。一連の プレニルトランスフェラーゼとプレニル化化合物（Prenyl groups）が、プレニ ル化阻害剤が必要か又は求められる種々の蛋白に適用されることが知られている 。これらの蛋白は、プレニル化されていようとそうでなかろうと、分泌されない ものもある；そのような１つの例は、ラス（ras）−ガン遺伝子の蛋白生成物で ある。 それにもかかわらず、上記検定方式を取り入れることにより、分泌蛋白の相当 するCXXXボックスの代りに、非分泌蛋白の特徴を示すCXXXボックスを配すること によって、これらの非分泌蛋白におけるプレニル化の阻害剤を選別することが出 来る。生成するキメラ蛋白は、非分泌蛋白の特徴を示す移入″CXXX″ボックスの プレニル化特性を示すだろうが、上澄み液に移行して検定にかかる宿主分泌蛋白 の能力は保持するだろう。このように、検定を使用してプレニル化阻害剤を検索 する標的蛋白の範囲を、非分泌蛋白にまで広げることが出 来る。 プレニル化に依存しない分泌蛋白を与えるコントロールシステムの存在は不可 欠である。このコントロールにより、細胞にとって単に毒でしかないか或は分泌 一般を抑止する候補阻害剤が、取り除かれる。上記検定の変形の１つにより確認 されたプレニル化阻害剤は、ウイルスの抑制だけではなく、−ガンに限らず−プ レニル化蛋白が関係するのが分かっている他のプロセス或は病状にも使用される ことが期待される。 ウイルス蛋白のプレニル化は、蛋白質加水分解やカルボキシメチル化のような 、蛋白のそれ以上のポストプレニル化反応にとっては明かに必要条件である。各 ステップの本質的連鎖を、問題のウイルス蛋白に最も好都合な点で阻止すること が出来る。阻害剤の投与 アミノ酸配列データバンクを調べて、C-末端に″CXXX″ボックスを含むウイル ス蛋白を選別することによって、プレニル化を行うウイルス蛋白を更に得ること が出来る。そのような蛋白の実例リストとしては、例えば、前記のごとく、HAV 、HCV、HSV、CMV、VZV、インフルエンザウイルス、タバコモザイクサテライトウ イルス及びオオムギストライプモザイクウイルスなどの植物ウイルス、Ｂ型肝炎 ウイルスの核抗原及びHIVIのネフ（nef）遺伝子生成物などの特異蛋白がある。 適当なプレニル化標的のこれらの候補は、標識メバロン酸を適当なウイルス又は ウイルス遺伝子生成物に感染するか又はそれを含んでいる細胞に与え、基準とし て標識付けをして得られたウイルス蛋白のプレニル化状態を評価することにより 、上記類似の方法で有効と確認することが出来る。更に、各ヴィリオンの形態形 成におけるプレニル化の役割及び抗ウイルス療法の標的としての妥当性もまた、 上記類似の方法で有効と確認することが出来る。 ウイルス形態形成、生成、放出または脱外被を培養中に抑止する場合には、適 当な宿主細胞を使ってウイルスを培養し、プレニル化又はポストプレニル化反応 を阻害するのに使われる薬剤を培養基中に添加する。感染細胞が、哺乳類被検体 或は特にヒト又はその他の霊長類被検体などの動物被検体に含まれる場合、プレ ニル化阻害に使われる薬剤は、一般に薬物製剤として投与される。選ばれた薬剤 の性質に依存する適当な製剤については Reminton's Pharmaceutical Sciences 、最新版、Mack Publishing Co．、Easton、PAを見ればよい。投与経路としては 、注射投与、経口投与、及び粘膜経由と皮膚経由投与を含めて、標準経路がある 。製剤の形態は、選ばれる薬剤の外に投与経路によって選ばれる。薬剤の適当な 混合物も活性成分として用いることが出来る。植物に投与する場合、活性成分を 植 物細胞に導入できる製剤を担体として用いる。 下記の参照文献を、明細書本文中の参照番号に従って列挙する。参照文献及び注解 １．M．リツエット（Rizzetto）、Hepatology（1983）3:729． ２．J．H．ホフネーグル（Hoffnagle）、J．Am．Med．Assoc．（1989）261:13 21． ３．F．ボニノ（Bonino）等、Infect．Immn．（1984）43:1000． ４．M．リツェット（Rizzetto）等、J．Infect．Dis．（1980）141:590． ５．M．リツエット（Rizzetto）等，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．（198 0）77:6124． ６．K．F．バーグマン（Bergmann）等、J．Infect．Dis．（1986）154:702． ７．F．ボニノ（Bonino）等、J．Virol（1986）58:945． ８．G．ルオ（Luo）等、同上（1990）64:1021． ９．J．H．リン（Lin）等、同上、p．4051． １０．M．チャオ（Chao）等、同上、p．5066． １１．J．S．グレン（Glenn）等、同上（1991）65:2357． １２．J．A．グロムセット（Glomset）等、TrendsBiochem．Sci．（1990）15:13 9． １３．W．A．マルテーズ（Maltese）、FASEB J．（1990）4:3319． １４．S．L．ムーレス（Moores）等、J．Bio．Chem．（1991）266 :14603． １５．J．F．ハンコック（Hancock）等、Cell（1989）57:1167． １６．W．R．シェーファー（Schafer）等、Science（1989）245:379． １７．L．A．ベック（Beck）等、J．Cell Biol．（1988）107:1307． １８．H．エレンス（Ellens）等、Hethods Cell Biol．（1989）31:155． １９．J．S．グレン（Glenn）等、J．Virol．（1990）64:3104．SAG細胞はGAG細 胞と同等。 ２０．J．S．グレン（Glenn）、学位論文、カリフォルニア大学、サンフランシ スコ（1992）． ２１．J．S．グレン（Glenn）等、未発表データ． ２２．J．C．ワン（Wang）等、J．Virol．（1991）65:6630；W．-S．リュウ（Ry u）等、同上（印刷中）；C．スーロー（Sureau）、個人情報． ２３．W．-S．リュウ（Ryu）等、準備中． ２４．１４の独立ウイルス単離集団（配列）の内、大デルタ抗原の４つの末端ア ミノ酸として、Cys-Arg-Pro-Gln-COOHをコードする配列が13、Cys-Thr-Pro-Gln- COOHをコードする配列が１［K．S．ワン（Wang）等、Nature（1986）323:508；S ．牧野等、同上（1987）329:343； M．Y．P．クオ（Kuo）等、J．Virol．（1988）62:1855；J．A．サルダンハ（Sal danha）等、J．Gen．Virol．（1990）71:1603；Y．P．キシア（Xia）等、（1990 ）178:331；F．今関等、J．Virol．（1990）64:5594；Y．-C．チャオ（Chao）等 、Hepatology（1991）13:345；P．デニー（Deny）等、J．Gen．Virol．（1991）72 :735］． ２５．大デルタ抗原のCOOH末端GlnのProへの特異的突然変異は、蛋白質を抑止剤 からゲノム複製のエンハンサーへ転換させたことを、我々は最近発見した。 ２６．J．B．ギブス（Gibbs）、Cell（1991）65:1． ２７．Y．レイス（Reiss）等、同上（1990）62:81． ２８．R．F．レーミッヒ（Ramig）、Virology、B．N．フィールズ（Fields）等 編（レーべン（Raven）、ニューヨーク、1990）、pp.112-122． ２９．M．Y．P．クオ（Kuo）等、J．Virol．（1989）63:1945． ３０．R．K．ケラー（Keller）、J．Biol．Chem．（1986）261:12053の方法に従 って、（R，S）−［5-3H］メバロネート（4-18.8 Ci/mmol）が合成された。 ３１．V．ブルース（Bruce）等、J．Virol．（1991）65:3813．
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，Ｊ Ｐ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ， ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．ヴィリオン形態形成、生成、放出又は脱外被を抑止する方法であって、ウイ ルスに感染した細胞を、少なくとも１つのウイルス蛋白のプレニル化又はポスト プレニル化反応を阻害する薬剤の効果量と接触させることから成る方法。 ２．該薬剤がプレニル化化合物（prenyl group）合成の阻害剤であるか又はプレ ニル転移酵素の阻害剤であるか、或は該薬剤かプレニル化化合物に擬体する（mi mic）か又はウイルス蛋白のプレニル化配列（locus）に擬体する、請求項１に記 載の方法。 ３．該ウイルス蛋白が、式CXXX、XCXX、XXCX又はXXXCのC-末端アミノ酸配列を含 み、上記において、Cはシステインであり、各Xはそれそれ任意のアミノ酸である 、請求項１に記載の方法。 ４．該薬剤が、CXXX、XCXX、XXCX又はXXXCに擬体する、請求項２に記載の方法。 ５．該薬剤が、ポストプレニル化反応を阻害するものである、請求項１に記載の 方法。 ６．該ヴィリオンが、D型肝炎ウイルス（HDV）であり、該ウイルス蛋白が上記HD Vの大デルタ抗原である、請求項１に記載の方法。 ７．上記阻害が、プレニル化に抵抗するように変異された複製物のトランス優性 阻害剤によって行われる、 請求項６に記載の方法。 ８．該ヴィリオンが、ヒト免疫不全ウイルスであり、該ウイルス蛋白がネフ（ne f）蛋白である、請求項１に記載の方法。 ９．該細胞が動物又は植物被検体に含まれており、該接触が薬剤を上記被検体に 投与することから成る、請求項１に記載の方法。 １０．候補薬剤をプレニル化阻害剤として選別する方法であって、 該方法は、″CXXX″ボックスを含む第１の蛋白と第２のコントロール蛋白を分 泌する細胞か、或は分泌するように（上記において、第１の蛋白の分泌はプレニ ル化に依存し、第２のコントロール蛋白の分泌はプレニル化に依存しない）変異 された細胞を、第２のコントロール蛋白が分泌される条件下で候補薬剤と接触さ せること、及び 細胞から分泌される第１の蛋白の有無又は量を測定することを含み、 分泌された第１の蛋白の量を減少させるか或は無くする候補薬剤が効力のある 上記プレニル化阻害剤である、候補薬剤を選別する方法。 １１．上記第１の蛋白が、大デルタ抗原である、請求項１０に記載の方法。 １２．上記第１の蛋白が、その″CXXX″ボックスの代 わりに、異なった蛋白の″CXXX″ボックスを含むように変異されたネイティブに 分泌された蛋白から成るキメラである、請求項１０に記載の方法。
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