JPH11513252A

JPH11513252A - 宿主細胞タンパク質と複製に必要なウイルスタンパク質との相互作用を阻害する抗ウイルス化合物

Info

Publication number: JPH11513252A
Application number: JP9514221A
Authority: JP
Inventors: パリーズ，ピーター; オニール，ロバート
Original assignee: ザマウントシナイメディカルセンター
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1995-10-06
Publication date: 1999-11-16
Also published as: AU3953895A; EP0861322A4; EP0861322A1; WO1997012967A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ウイルスの複製に必要とされるウイルスタンパク質と相互作用する宿主細胞タンパク質の同定、およびウイルスタンパク質と宿主細胞タンパク質との特異的相互作用を妨げる化合物を同定するための高処理量アッセイに関する。本発明は、幾分かは、本出願人がインフルエンザウイルスのタンパク質とヒト宿主細胞タンパク質との新規な相互作用を見いだしたことに基づく。これら宿主細胞タンパク質のうちの一つ（ここではＮＰＩ−１と呼ぶ）はインフルエンザウイルスタンパク質ＮＰと相互に作用し、インフルエンザウイルスの複製に必要とされる補助タンパク質であり得る。別の宿主細胞タンパク質（ここではＮＳ１Ｉ−１と呼ぶ）はインフルエンザウイルスタンパク質ＮＳ₁と相互に作用する。宿主細胞タンパク質とウイルスタンパク質との結合を妨げ、そしてウイルスの複製を抑制する化合物はウイルス感染のin vivo治療に有用であり得る。

Description

【発明の詳細な説明】宿主細胞タンパク質と複製に必要なウイルスタンパク質との相互作用を阻害する抗ウイルス化合物１．序論本発明は、ウイルス介入のための新規な細胞標的の同定、新規な標的に作用する抗ウイルス化合物の同定、およびこのような抗ウイルス化合物の治療上の使用に関するものである。２．発明の背景インフルエンザＡ型ウイルスはオルトミクソウイルス科に属するネガティブ鎖ＲＮＡウイルスである。このウイルスのゲノムは８分節からなり、１０のポリペプチドをコードしている。Scholtissekの研究室で得られた実験的証拠は、核タンパク質（ＮＰ）がインフルエンザウイルスの種特異性の主要な決定因子であることを示している(Scholtissekら，1985，Virology 147: 287-294)。系統発生的分析によると、ＮＰ遺伝子は２つのファミリー、すなわち、主にトリ起源のＮＰを含むファミリーと、ヒト起源のＮＰを含むファミリーに大別される（Bean，19 84，Virology 133: 438-442; Buckler-White & Murphy，1986，Virology 155:34 5-355; Gammelinら，1989，Virology 170: 71-80; Scholtissekら，1985，前掲）。ヒトウイルス A/HK/1/68および遺伝的に関連したＮＰをもつウイルスは、４０℃でのニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）の二重感染後に、ＮＰ中にｔｓ欠損を有するトリウイルス A/FPV/Rostock/1/34の変異株を救済することができない(Sc holtissekら，1985，前掲; Scholtissekら，1978，Virology 91: 79-85)。ＣＥＦ細胞上のｔｓ変異株の救済に失敗したヒトウイルスは、Madin-Darbyイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞上では救済することができた（Scholtissekら，1978，前掲）。さらに、A/HK/1/68 ウイルスおよびA/HK/1/68 ウイルス由来のＮＰを含むA/FP V/Rostock/1/34ウイルス再集合株はＭＤＣＫ細胞内で複製するが、ＣＥＦ内では複製しなかった（Scholtissekら，1978，前掲）。FPV ts変異株の宿主特異的救済およびA/HK/1/68ウイルス再集合株の宿主制限は、哺乳動物細胞とトリ細胞とでは異なる宿主由来の因子がこの現象に関与しており、この因子はインフルエンザＡ型ウイルスのＮＰと相互に作用し得ることを示唆している。しかしながら、これまで、こうした宿主タンパク質が同定されたことはなかった。インフルエンザウイルスＲＮＡの複製および転写には、ウイルスによりコードされる４種類のタンパク質が必要である。すなわち、ＮＰとウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの３成分、ＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡである(Huangら，19 90，J．Virol．64: 5669-5673)。ＮＰはゲノムＲＮＡと相互作用するビリオン（ウイルス粒子）の主要構造成分であり、ＲＮＡ合成における抗転写終結に必要である（Beaton & Krug，1986，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:6282-6286）。また、ＮＰはＲＮＡ鎖の伸長にも必要である(Shapiro & Krug，1988，J．Virol.62 : 2285-2290)が、開始には必要でない（Hondaら，1988，J．Biochem．104:1021- 1026）。ＮＳ１は感染細胞においてインフルエンザＡ型ウイルスにより発現される主要な非構造タンパク質であるが、感染でのその役割は不明である。温度感受性ＮＳ１対立遺伝子を有するウイルスの研究は、ウイルスの遺伝子発現および／または複製におけるＮＳ１の調節的役割の方向を示し（Wolstenholmeら，1980，J．Vir ol．35:1-7; Koenneckeら，1981，Virol．110:16-25; Hatadaら，1990，J．Gen ．Virol．71: 1283-1292）、また、それはその優先的な核蓄積とも一致した(Gre enspanら，1988，J．Virol．62: 3020-3026)。その発現はさまざまな方法で細胞機能を妨害することが示された（Fortesら，1994，EMBO J．13: 704-712;Qiu & Krug，1994，J．Virol．68: 2425-2432; Luら，1994，Genes Dev．8:1817-1828) 。これらの作用は、一本鎖および二本鎖インフルエンザｖＲＮＡ(Hatada & Fuku da，1992，J．Gen．Virol．73: 3325-3329; Hatadaら，1992，J．Gen．Virol．7 3: 17-25）、ポリアデノシンＲＮＡ（Qiu & Krug，1994，前掲）、およびスプライセオソームU6 RNA（Luら，1994，前掲）を含めて種々のＲＮＡと、ＮＳ１との、観察された相互作用により仲介されることが示唆された。ＮＳ１と種々のＲＮＡとの相互作用を伴うこれらの研究にもかかわらず、感染中にＮＳ１と相互作用する宿主タンパク質はこれまで同定されたことも特性付けされたこともなかった。インフルエンザウイルスの細胞内複製に関与する宿主細胞機能についてはほとんど知られていない。さらに、ウイルスタンパク質と直接に相互作用する細胞因子も特性付けされておらず、治療的介入の標的として使用できる細胞因子／ウイルス相互作用などなおさらそうである。３．発明の概要本発明は、ウイルスの複製に必要とされるウイルスタンパク質と相互作用する宿主細胞タンパク質の同定、およびウイルスタンパク質と宿主細胞タンパク質との特異的相互作用を妨げる化合物を同定するための高処理量アッセイに関する。ウイルス複製を抑制する妨害性化合物はウイルス感染を治療するのに用いられる。本発明は、幾分かは、本出願人がインフルエンザウイルスタンパク質（例えば、ＮＰおよびＮＳ１）とヒト宿主細胞タンパク質（ここではそれぞれＮＰＩ−１、ＮＰＩ−２、ＮＰＩ−３、ＮＰＩ−４、ＮＰＩ−５、ＮＰＩ−６およびＮＳ１Ｉ−１と呼ばれる）との新規な相互作用を見いだしたことに基づくものである。ＮＰＩ−１やＮＳ１Ｉ−１のような宿主細胞タンパク質はインフルエンザウイルスの複製に必要とされる補助タンパク質であり得る。宿主細胞タンパク質とウイルスタンパク質の結合を妨害して、ウイルスの複製を抑制する化合物はウイルス感染のin vivo治療に有用であり得る。４．図面の説明図１Ａおよび１Ｂ： NP- 相互作用性タンパク質の同定に用いた相互作用トラップ系。図１Ａ： R100はリポーター遺伝子LexAop-LEU2および転写的に不活性のLexA-NP融合タンパク質を含む（左）。ライブラリータンパク質はガラクトース含有培地中でR100形質転換体により合成される。このライブラリータンパク質がLexA-NP融合タンパク質と相互作用しない場合は、LEU2遺伝子が転写されない（中央）。ライブラリータンパク質がLexA-NP融合タンパク質と相互作用する場合は、LEU2遺伝子が転写的に活性となり、細胞がleu^-培地上でコロニーを形成する（右）。図１Ｂ：相互作用トラップにおいて用いたpLexA-NP ベイト (bait)プラスミド。インフルエンザA/PR/8/34ウイルスの核タンパク質（NP）のコーディング領域を、pEG202のEcoRlおよびSalＩ制限部位にサブクローニングした。この構築物は、クローニングプロセスから誘導されたポリリンカー配列によりコードされる３アミノ酸によって分離された、LexAの202アミノ酸とNPの全コーディング領域（498アミノ酸）を含む融合タンパク質をコードする。図２． NPI-1 cDNAのヌクレオチド配列および推定タンパク質配列。コーディング配列はヌクレオチド１から出発して、ヌクレオチド1581で終わる。このライブラリークローンの5'末端は星印で示してある。ネステッド(nested)逆転写および5'RACEプライマーに相補的な領域には下線が引いてある。図３． NPI-1とSRP1との比較。垂直線は同一を示し、コロンおよびピリオドは保存的変化を示す（Deverauxら，1984，Nucl．Acids Res．12: 387-395）。42 アミノ酸ARMリピートは、Peiferら，1994，Cell 76: 789-791に従って垂直に並列化される。SRP1と他のARM リピート含有タンパク質との完全な比較については、Peiferら，1994，前掲を参照のこと。ARM コンセンサス配列は下に示してあり、“＋”はＫ、ＲまたはＨを、“−”はＤまたはＥを、そして“〜”はギャップを示す。他の残基はNPI-1とSRP1のリピート内で保存されているので、これら２つのタンパク質のみから誘導されるコンセンサス配列も示してある。図４． GST-NPI-1はin vitroでNPに結合する。GST(レーン1，5，6)およびGST -NPI-1(レーン2，3，7，8)を細菌内で発現させ、グルタチオンアガロースビーズ上に細胞溶解物から沈降させた。次に、複合体化ビーズを、表示した部分精製インフルエンザウイルスNPおよびポリメラーゼ調製物（Pol/NP）と共にインキュベートした。沈降したタンパク質は12.5% SDS ポリアクリルアミドゲル上で分画化し、クーマシーブルーで染色するか（レーン１〜３）、またはウイルス核タンパク質に対するモノクローナル抗体 HT103を用いてイムノブロットした（レーン４〜８）。沈降しなかったPol/NPがレーン４に分離された。Ｍはタンパク質分子量マーカー、＊はGST-NPI-1 融合タンパク質、矢印は融合タンパク質の主要分解産物を示す。図５． NPI-1に対するポリクローナルウサギ血清を用いた全細胞タンパク質のイムノブロット。HeLaおよびMDBK細胞株からの全細胞溶解物および細胞質細胞抽出物をSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロースに移行させ、抗-NPI-1血清でイムノブロットし、そして¹²⁵I-プロテインAで現像した。各レーンは１×10⁵細胞からのタンパク質を含む。図６． NPはNPI-1に対する抗血清によりインフルエンザＡ型ウイルス感染細胞から共免疫沈降される。感染HeLa細胞のタンパク質を³⁵S-メチオニンおよび³⁵ S-システインで標識し、全細胞溶解物を本文に記載のとおりに調製した。NPI-1 とNPの複合体は抗-NPI-1血清により沈降された。その後、沈降タンパク質をSDS- PAGEで分画化し、オートラジオグラフィーにより検出した。図７〜11．酵母において相互作用トラップ系を用いて検出された、インフルエンザＡ型のNPと相互作用する５つの異なるタンパク質の単離されたコーディング領域の部分ＤＮＡ配列。その配列が提示されるタンパク質は次のとおりである。図７： NPI-2の部分ヌクレオチド配列。図８： NPI-3の部分ヌクレオチド配列。図９： NPI-4の部分ヌクレオチド配列。図10： NPI-5の部分ヌクレオチド配列。図11： NPI-6の部分ヌクレオチド配列。図12． NS1I-1遺伝子のヌクレオチド配列およびNS1I-1タンパク質のコード化アミノ酸配列。2572 bpの配列は２つの重なりあうクローンのジデオキシ配列解析法により決定した。第１のクローンpK5は酵母ライブラリーから単離され、ヌクレオチド位置791から2572までのHeLa細胞cDNAを含む。第２のクローンpRACENS 1I-1は、NS1I-1 mRNAの5'末端から誘導されるcDNAを得るために用いた5'RACE法より得られたもので、ヌクレオチド位置１から944までを含む。図13． NS1I-1特異的プローブを用いたHeLa細胞ポリ(A)-RNAのノーザンブロット分析。図14． GST-NS1I-1およびグルタチオンセファロースによるA/WSN/33感染MDCK 細胞の抽出物からのNS1タンパク質の共沈降。MDCK細胞の単層にインフルエンザA /WSN/33ウイルスをm.o.i.（感染多重度）10で感染させるか、または偽感染させ、そして感染後５〜６時間³⁵S-メチオニンおよび³⁵S-システインで標識した。タンパク質を抽出して、GST-NS1I-1（レーン３および８）またはGST-タンパク質（レーン６）を被覆したグルタチオンセファロースに結合させるために使用した。対照として、抽出物をα-NS1（レーン２）、α-M1（レーン４）、または非免疫血清（レーン５）により免疫沈降させた。タンパク質をSDSゲル電気泳動およびフルオログラフィーで分析した。グルタチオンアガロース沈降のために使用したものの10%に相当する全抽出物のアリコートを示す（レーン１および７）。ウイルスタンパク質の位置および分子量マーカーを左側に示す。図15． GST-NS1I-1はインフルエンザＡ型およびＢ型ウイルス株のNS1タンパク質を共沈降させる。インフルエンザウイルスA/duck/Alberta/76（パネルＡ）、A/turkey/Oregon/71（パネルＢ）、A/Beijing/32/92（パネルＣ）、A/Berkele y/1/68（パネルＤ）、およびB/Lee/40（パネルＥ）を感染させた³⁵S-標識MDCK細胞の抽出物を調製し、図14に記載したGST-NS1I-1（レーン“GST-K5”）またはGS T-タンパク質（レーン“GST”）を被覆したグルタチオン−セファロースによるウイルスタンパク質の沈降において使用した。さらに、ウイルスタンパク質はα -NS1-、α-M1-または非免疫血清（それぞれレーン“α-NS1”、“α-M1”、“NI ”）を用いて免疫沈降させた。SDSゲル電気泳動およびフルオログラフィーで分析した。それぞれ10%（パネルＣおよびＥ）または6.7%（パネルＡ、ＢおよびＤ）に相当する全抽出物のアリコートも示す（レーン“T”）。ウイルスタンパク質の位置を右側に示してある。５．発明の詳細な説明本発明は、ウイルスの複製および感染にとって重要なウイルスタンパク質と相互に作用する宿主細胞タンパク質の同定、ウイルスタンパク質と宿主細胞タンパク質との特異的相互作用を妨害する化合物の同定、並びにヒトを含めた動物のウイルス感染を治療する際の抗ウイルス剤としての該化合物の評価および使用に関するものである。本発明は、本節および実施例において、ヒト宿主細胞タンパク質とインフルエンザウイルスタンパク質との相互作用の同定および阻害について記載する。説明の簡略化のため、２つの特定の宿主細胞タンパク質の単離を詳述する。第１の該タンパク質は、インフルエンザウイルスNPタンパク質と相互作用するヒト細胞タンパク質、核タンパク質相互作用因子１（nucleoprotein interactor 1：NPI-1 ）である。NPI-1遺伝子およびタンパク質、並びに該タンパク質とNPタンパク質との相互作用は以下の第６節の実施例において詳述する。NPタンパク質と相互作用する他の宿主細胞タンパク質としては、制限するものではないが、NPI-2、NPI -3、NPI-4、NPI-5およびNPI-6があり、これらについても以下に記載する。NPタンパク質とNPI-1ないしNPI-6宿主細胞タンパク質との相互作用は以前には決して同定されたことがなかったので、それらは抗ウイルス治療のための新規な標的を提供し、本発明の態様を詳述するための優れたモデルとして役に立つ。しかしながら、こうした原理は、ウイルスＲＮＡの複製に必要とされる４種のインフルエンザウイルスタンパク質(NPのほかにPA、PB1、PB2)のいずれかと相互作用する他の宿主細胞タンパク質の同定にも同様に応用できるだろう。また、非構造タンパク質１相互作用因子１（nonstructural protein 1interac tor 1：NS1I-1）の同定についても以下の第７節の実施例において詳述する。NS1 I-1はインフルエンザウイルスNS1タンパク質と相互作用するヒト細胞タンパク質である。この相互作用も以前に記載されたことがなく、それゆえ、抗ウイルス治療のためのもう一つの新規な標的を提供する。本発明はまた、宿主細胞タンパク質と、感染に必要とされる（NS₁のほかの）他のウイルスタンパク質、例えばインフルエンザウイルスの場合にはNS₂、HA、NA、M₁およびM₂タンパク質、との相互作用を同定することを包含する。こうした原理は、パラインフルエンザウイルスのようなパラミクソウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス、バンヤウイルス、アレナウイルス、Dhoriと呼ばれるオルトミクソ様昆虫ウイルスなどを含むがこれらに限らない、他のＲＮＡウイルスにも同様に応用できる。このようにして同定された宿主細胞タンパク質は完全に新規なタンパク質、またはウイルスタンパク質と相互に作用することがまだ知られていない既知のタンパク質を含み得る。タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに適した方法はどれも、新規なウイルス−宿主タンパク質相互作用を同定するために使用でき、本発明の範囲内にあると見なされる。例えば、いくつかの伝統的な方法は共免疫沈降、架橋、および勾配またはクロマトグラフカラムからの共精製である。より新しい方法は標的タンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子の同時同定を可能にする。これらの方法は、λgtllライブラリーの抗体探索と類似した方法で、標識標的タンパク質を用いて発現ライブラリーを探索することを含む。ここに記載される宿主細胞タンパク質、NPI-1ないしNPI-6、およびNS1I-1を同定するために、in vivoでタンパク質相互作用を検出する方法の一つである酵母相互作用トラップ系がここに記載するとおりに成功裏に使用され、制限ではなく単に例示のために詳述される。宿主細胞／ウイルスタンパク質相互作用は抗ウイルス介入の標的と考えられる。ここに記載するようなアッセイを用いて、かかる相互作用を妨害する化合物を同定することができる。このようにして同定された、ウイルスの感染、複製、組み立てまたは放出を抑制する化合物は抗ウイルス剤として使用される。本発明によれば、あるウイルスを抑制することが判明した所与の化合物は、宿主細胞タンパク質に対して同様の依存性を有する広範囲のさまざまなウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルスのようなパラミクソウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス、バンヤウイルス、アレナウイルス、Dhoriと呼ばれるオルトミクソ様昆虫ウイルスなどを含むがこれらに限らない）に対する抗ウイルス活性について試験される。相互作用性タンパク質の役割の解明は介入の標的として他のウイルスを同定することにつながるだろう。例えば、我々は、NPI-1がウイルス核酸−タンパク質複合体を宿主細胞の核内に運び入れるのに重要であることを見いだした。それゆえ、NPI-1の活性を妨害することによって、このプロセスを破壊する下記方法は、例えば、上に挙げたウイルスのほかに、核相を有するウイルスを治療するのに有効であるかもしれない。こうした追加のウイルスとして、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス科の仲間およびアデノウイルスがあるが、これらに限らない。本発明のさまざまな面は、特にNPおよびNS1と相互作用する宿主細胞タンパク質（NPI-1ないしNPI-6およびNS1I-1）に関して、とりわけNPI-1に重点をおいて以下の分節で説明されるが、本発明はNPI-1に限定されるものではなく、治療的介人の標的としてのあらゆるウイルス／宿主細胞タンパク質相互作用を包含するものである。５．１．複製に必要なウイルスタンパク質と相互作用する宿主細胞タンパク質の同定宿主細胞タンパク質ＮＰＩ−１に対する未確認の遺伝子を、インフルエンザＡウイルスＮＰとの相互作用能に基づいてクローン化した。ＮＰＩ−１は、酵母タンパク質ＳＲＰ１のヒト相同体である。ＮＰＩ−１とＮＰとの相互作用は、酵母では、相互作用トラップ系によって、ＮＰと細菌により発現したＮＰＩ−１タンパク質とのin vitro共沈により立証され、感染細胞抽出物では、抗−ＮＰＩ−１血清の使用によるＮＰとＮＰＩ−１との共沈により立証された。この未知の相互作用の立証は、実施例で示す（下記の第６節参照）。得られたデータは、ＮＰＩ −１がインフルエンザＡウイルスの複製において役割を果たすことを示している。ＮＰＩ−１は、インフルエンザウイルスによってコードされるタンパク質と相互作用することを特徴とする第一の細胞タンパク質である。従って、この役割は、ＮＰ−ＮＰＩ−１相互作用の抑制を抗ウイルス治療にとっての優れた標的とするものである。複製サイクルのどの段階でＮＰＩ−１が機能するのかは、まだ立証されていない。ＮＰＩ−１は、（１）ウイルスの侵入の間のリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の核への移動；（２）抗転写終結および延長を含むｖＲＮＡ合成；（３）延長、ポリアデニル化および細胞質への輸送を含むｍＲＮＡ合成；ならびに（４）ウイルス粒子の組み立ての間のＲＮＰの核からの退去を含むと考えられる多数のＮＰ機能のいずれかに影響を及ぼすと考えられる。ＮＰＩ−１およびＳＲＰ１が共に、ＲＮＡ合成に関与するタンパク質と相互作用するという事実は、細胞のＤＮＡ依存性転写とインフルエンザウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成とが基本的に類似しているかもしれないということを意味する。ＮＰＩ−１のような細胞性因子は、ウイルスおよび細胞のＲＮＡ合成機構によって共用され、類似の機能を果たすと考えられる。さらに、ＮＰＩ−１は、ウイルスＲＮＰを、ｍＲＮＡのスプライシングおよびポリアデニル化が起こる核マトリックス場につなぎ止めておくことができる。なお、ＮＰＩ−１はHeLa細胞から単離されたが、この細胞系は、インフルエンザＡウイルスによる生産的感染を受けないことに留意すべきである。しかし、HeLa細胞は、インフルエンザウイルスＲＮＡとタンパク質とを合成し（図６、レーン３参照）、ウイルスＲＮＡ合成を調べるためにすでに使用されてきた（Beaton & Krug，1986，前出）。ウイルスＮＰは、感染細胞において二つの形態で存在する。一方の形態は、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）と結合し、他方は、遊離形である（Shapiro & Krug，1988，前出）。ＮＰＩ−１との共沈実験に使用するＰｏｌ／ＮＰ標品は、ウイルス粒子タンパク質をｖＲＮＡから分離して精製する塩化セシウム／グリセロール勾配上で精製した（Hondaら、1988、前出）。この実験では、ポリメラーゼタンパク質ではなくＮＰがクーマシー染色ゲル上で検出された（図４、レーン３）。しかし、ウイルスのポリメラーゼタンパク質の共沈は、イムノブロット実験によって精密には試験しなかった。感染HeLa細胞抽出物からＮＰのみが共沈したことは、ＮＰが遊離ＮＰであり、ＮＰＩ−１によって結合されることを示唆するものである。一つの宿主因子のみに、マイナス鎖ＲＮＡウイルスの複製過程における決定的な機能が割り当てられている。細胞性カゼインキナーゼIIは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼのリンタンパク質Ｐをリン酸化することが分かっている。これは、ウイルスのポリメラーゼを活性化するために必要であると考えられる工程である（BarikおよびBanerjee，1992，Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 89: 6570-6574; Barik およびBanerjee，1992，J.Virol．6 6: 1109-1118）。ＮＰＩ−１およびＳＲＰ１は50%が同一であり、アミノ酸レベルでは81%が保存されている。これは、ヒトおよび酵母のようにかなりかけ離れた生物に属するタンパク質にあって、非常に保存の程度が高く、ＮＰＩ−１／ＳＲＰ１がその細胞において非常に基本的な機能を果たすことを示唆するものである。ＮＰＩ−１およびＳＲＰ１は８個の内部反復を有し、各々は約42アミノ酸である（図３）。この反復（ＡＲＭモチーフという）は、最初、ショウジョウバエの体節極性遺伝子 armadilloで同定され（Rigglemanら、1989，Genes Dev．3: 96-113）、β−カテニン、プラコグロビン、ｐ１２０、ＡＰＣおよびｓｍＧＤＳなどの他の多くのタンパク質で確認されている（Peiferら、1994，前出、およびその中の参考文献）。いくつかのＡＲＭタンパク質は、細胞接着構造と結合する。armadilloおよびその相同体は、カルシウム依存性群の細胞接着分子（ＣＡＭ）であるカドヘリンのＣ−末端細胞質尾部に結合し、ＣＡＭを下層にある細胞骨格に細胞 −細胞結合でつなぐ（McCreaら、1991，Science 254: 1359-1361）。armadillo タンパク質と対照的に、ＳＲＰ１およびＮＰＩ−１は、核に局在すると考えられる。ＮＰＩ−１がＳＲＰ１（Yanoら、1992，Mol．Cell．Biol．12: 5640-5651）のように核膜に結合するならば、ＮＰＩ−１は、ウイルスのＲＮＰを核膜にとどめるように機能することがあり得る（Jacksonら、1982，Nature 296: 366-368）。なお、ＮＰＩ−１は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに関与することが分かっている核タンパク質と関連する（または同一である）可能性がある（Cuomoら、1994，Meetin gabstract FO15，Keystone Symposium on Recombination）。ウイルスＮＰとの相互作用に対して十分であったＮＰＩ−１のカルボキシ末端の265個のアミノ酸は、4.5個のＡＲＭ反復を含む。個々の反復は一般に、ＡＲＭ共通配列と約30%が同一である。これは、他のタンパク質のＡＲＭ反復における保存度と一致する（Peiferら、1994，前出）。酵母で同じ相互作用トラップ系を使用して、さらに５個のＤＮＡ配列を単離した。これらは、部分的に、インフルエンザＡウイルスのＮＰと相互作用するタンパク質をコードする。また、この系を使用して、ＮＳ１Ｉ−１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ＮＳ１Ｉ−１とインフルエンザＡウイルスのＮＳ１−Ｉタンパク質との間の相互作用に基づいて同定した。このタンパク質は、ブタの１７ β−エストラジオールデヒドロゲナーゼのヒト相同体である。最近、デヒドロゲナーゼ機能を有するいくつかのタンパク質が、遺伝子発現の転写後の事象と関係することが分かった（Hentze，1994，Trends Biochem．Sci．19: 101-103）。このことは、ウイルスの生活環中のＮＳ１Ｉ−１相互作用に対する機能上重要な役割を支持するものである。そのようにして同定した種々のタンパク質を表Ｉに示す。注：最近行なわれたジーンバンク(Genebank)の調査によると、本出願人が同定したＮＰＩ−３、ＮＰＩ−４およびＮＰＩ−５の後に、これらの配列が他のグループによって記載され、各々、Ｒｃｈ１、ＰＣ４およびＢＡＴ１と命名されたことが分かった。ＮＰＩ−２をコードする配列は、以前に同定されたｈｎＲＮＰＣタンパク質をコードする配列と同一である（LahiriおよびThomas，1986，前出）。ＮＰＩ− ３、ＮＰＩ−４、ＮＰＩ− およびＮＰＩ−６をコードする配列は、本出願人が同定する前は未知であった。ＮＳ１Ｉ−１遺伝子もまた、下記実施例の第７節に詳しく説明するように、新規である。本発明は、ここに開示するＤＮＡ配列の他に、１）図２および７〜１２に示されるＤＮＡ配列によってコードされるのと同じアミノ酸配列をコードするいずれかのＤＮＡ配列；２）本明細書に開示するコード配列（図２および７〜１２参照）の相補体と高度にストリンジェント条件下（例えば、68℃で、0.1 x ＳＳＣ／ 0.1%ＳＤＳで洗浄（Ausubel，F.M．ら編、1989，Current Protocols in Molecul ar Biology，Vol．I，Green Publishing Associates，Inc.，and John Wiley & Sons，Inc.，New York，p．2.10.3））でハイブリダイズさせ、機能的に等価な遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列；および／または３）本明細書に開示するコード配列（図２および７〜１２参照）の相補体と、ややストリンジェントな条件（例えば、42℃で、0.2 x ＳＳＣ／0.1%ＳＤＳで洗浄（Ausubelら、1989、前出））下でハイブリダイズさせ、さらに、機能的に等価な遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列を含むものである。本発明はまた、１）本明細書に開示するコード配列（図２および７〜１２参照）および／またはそれらの相補体（すなわち、アンチセンス）のいずれかを含むＤＮＡベクター；２）本明細書に開示するコード配列（図２および７〜１２参照）および／またはそれらの相補体（すなわち、アンチセンス）のいずれかを含み、コード配列および／またはアンチセンス配列の発現を支配する制御因子と機能的に作用するように結合したＤＮＡ発現ベクター；ならびに３）本明細書に開示するコード配列（図２および７〜１２参照）および／またはそれらの補体（すなわち、アンチセンス）のいずれかを含み、コード配列および／またはアンチセンス配列の宿主細胞での発現を支配する制御因子と作動的に結合した、遺伝子操作された宿主細胞も包含する。制御因子としては、それらに限定されないが、誘導および非誘導プロモーター、エンハンサー、オペレーターならびに当業者には公知の、発現を推進し、制御する他の因子が挙げられる。本発明は、ここで開示するＤＮＡ配列のいずれかの断片を含む。宿主細胞タンパク質が得られると、それらは、本発明に従って、他のウイルス由来のタンパク質との相互作用の検出に使用することができる。以下の記載は、この方法を説明するためのものであるが、これに限定されるものではない。インフルエンザＢウイルスのリボ核タンパク質複合体を単離し、ウェスタンイムノブロットアッセイを使用して、細胞性ＮＰＩ−１がこの複合体と結合していることを見いだした。この結果は、インフルエンザＡウイルスのＮＰとの相互作用に基づいて単離されたＮＰＩ−１が、インフルエンザＢウイルスのＮＰとも相互作用することを示す。かくして、インフルエンザＡウイルスでのＮＰ−ＮＰＩ−１相互作用を抑制し、それによってインフルエンザＡウイルス感染を抑制する化合物は、インフルエンザＢウイルスに対する抗ウイルス化合物として同様に有効なはずである。ここで同定されたものと相同性のある宿主細胞遺伝子は、いくつかの方法によって得ることができる。いくつかの場合、同じウイルスタンパク質、例えばインフルエンザＡウイルスのＮＰと相互作用するという性質を共有する種々の宿主細胞タンパク質は、遺伝的相同性をも共有すると考えられる。かくして、相互作用トラップ選択によって同定された遺伝子は、互いに相同性がある可能性がある。宿主細胞遺伝子が本発明に従って同定されると、相同遺伝子はいずれも、当業者に周知のクローニング法を使用して得ることができる。クローニング法としては、それに限定されないが、適切なプローブを使用して適切なｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）ライブラリー内で相同遺伝子を検出する方法が挙げられる。（例えば、Sambrookら、1989，Molecular Cloning: A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratories（参考文献として本明細書に取り込まれている。）参照）。この方法は、特に、同じウイルスタンパク質に結合する性質は共有していないが、遺伝的に相同性があるかもしれないタンパク質を得るのに有用である。そのような相同タンパク質は、相互作用トラップで使用されるウイルス以外のウイルスのタンパク質と相互作用すると考えられる。例えば、その産物がインフルエンザＡウイルスのタンパク質との相互作用によって検出された宿主細胞遺伝子は、産物がインフルエンザＡウイルスとは相互作用しないが、インフルエンザＢウイルスのタンパク質とは相互作用する別の遺伝子と相同性があると考えられる。そのような相同遺伝子の検出を最適化するために、問題のウイルスを感染させた細胞からｃＤＮＡライブラリーを作製してもよい。インフルエンザＢウイルスの他に、この方法は、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス、ブニアウイルス、アレナウイルス、ドーリ(Dhori)と呼ばれるオルトミクソ様の昆虫ウイルスなどのパラミクソウイルスならびにヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス科に属するメンバー、およびアデノウイルスなど、これらに限定されないが、他のウイルスにも同様に十分適用させることができる。５．２．ウイルスの複製に必要なウイルスタンパク質と宿主細胞との相互作用を妨げる化合物のスクリーニングアッセイ相互作用し、結合する宿主細胞タンパク質およびウイルスタンパク質は、ここで、しばしば、「結合相手」と言う。この用語は、以下のサブセクションの記載に従って作られ、各々のタンパク質の結合ドメインを含むペプチド断片をも含む。多数のアッセイ系のいずれも、化合物をテストして、その結合相手の相互作用を妨げる能力を調べるために使用することができる。しかし、リガンド（天然または合成）、ペプチド、または小さい有機分子など、それらに限定されないが、多数の化合物をスクリーニングするための迅速な高処理量アッセイが好ましい。結合相手の相互作用を妨げるために同定された化合物は、さらに、細胞をベースとするアッセイ、動物モデル系、およびここで記載した患者における、抗ウイルス活性の評価を行なうべきである。ウイルスタンパク質と宿主細胞タンパク質との間の相互作用を妨げる化合物を同定するために使用するアッセイ系の基本的原理は、ウイルスタンパク質および宿主細胞タンパク質を含む反応混合物をある条件下で調製し、十分な時間にわたり二つのタンパク質を相互作用させて結合させ、こうして複合体を形成させる工程を含む。化合物の抑制活性をテストするために、反応は、被験化合物の存在下および非存在下で行なう。すなわち、被験化合物は、最初から含まれていてもよいし、ウイルスタンパク質および宿主細胞タンパク質の添加後に添加してもよい。対照は、被験化合物を含まないか、プラシーボとともにインキュベートする。次いで、ウイルスタンパク質と宿主細胞タンパク質との間の複合体の形成を検出する。被験化合物を含む反応混合物中ではなく、対照反応中における複合体の形成は、その化合物がウイルスタンパク質と宿主細胞タンパク質との相互作用を妨げることを示す。使用することができるアッセイ要素および種々の方式を、以下のサブセクションに記載する。５．２．１．アッセイ要素アッセイにおける要素として使用する宿主細胞タンパク質およびウイルスタンパク質結合パートナーは、天然源から得ることができ、例えば、当業界で周知のタンパク質分離法を使用して、各々、細胞およびウイルスから精製する；当業界で周知の方法を使用する組換えＤＮＡ技術により産生する（例えば、Sambrookら、1989，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labor atories Press，Cold Spring Harbor，N.Y．参照）；および／または当業界で知られている方法を使用して全体または一部を化学的に合成することができる。例えば、ペプチドは、固相法により合成し、樹脂から切り離し、分離用高速液体クロマトグラフィーによって精製することができる（例えば、Creighton，1983，P roteins: Structures and Molecular Principles，W.H．Freeman & Co.，N.Y.， pp．50-60参照）。合成ペプチドの組成物は、例えばエドマン分解法を使用して、アミノ酸分析または配列決定により確認することができる（例えば、Creighto n，1983、前出、pp．34-49参照）。ペプチド断片は、各々のタンパク質の結合ドメインに対応するように作るべきである。当業界で普通に行なわれている多くの方法を使用して、タンパク質の結合部位を同定し、単離することができる。これら方法としては、それらに限定されないが、タンパク質をコードする遺伝子の一つを突然変異誘発し、共免疫沈降アッセイで結合の破壊をスクリーニングするか、または、宿主細胞遺伝子を突然変異誘発し、ウイルス感染に対する耐性を選択する方法が挙げられる。ウイルス遺伝子の補償突然変異を選択すると、この突然変異体宿主でのウイルスの増殖が可能となる。各々のタンパク質をコードする遺伝子の配列分析により、相互作用的結合に関与するタンパク質の領域に対応する突然変異が示される。あるいは、一つのタンパク質を、下記の5.2.2．節に記載した方法を使用して固体表面に固定し、トリプシンなどのタンパク質分解酵素で処理した標識結合パートナーと相互作用させて結合させることができる。洗浄した後、結合ドメインを含む短い標識ペプチドは、固体物質と結合したままであり、それは、単離してアミノ酸配列分析により同定することができる。また、タンパク質の遺伝子が得られると、短い遺伝子部分を遺伝子操作してタンパク質のペプチド断片を発現させることができ、それは、次いで、結合活性を試験して、精製または合成することができる。分子クローニング法または化学合成法のいずれで作製しても、本発明のアッセイで使用することができる結合パートナーのアミノ酸配列は、それらをコードする遺伝子の報告された配列と同一である必要はない。結合パートナーは、アミノ酸残基が欠失、付加または置換されて機能的に等価な物質を与える、変化した配列を含むことができる。例えば、機能的に等価なアミノ酸残基がその配列内の残基と置き変わって、配列が変化してもよい。そのような置換は、そのアミノ酸が属する種類の他のアミノ酸から選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含み、極性の中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含み、正に帯電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンを含み、負に帯電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。アッセイ系で使用す結合パートナーの一つを直接または間接的に標識して、ウイルスタンパク質と宿主細胞タンパク質との間に形成される複合体の検出を容易にする。種々の適する標識系を使用することができ、それらに限定されないが、¹²⁵ Ｉなどの放射性同位体；基質にさらすと検出可能な比色シグナルまたは光を発生する酵素標識系；および蛍光標識が挙げられる。組換えＤＮＡ法を使用してアッセイのウイルスおよび宿主細胞結合パートナーを作製する場合、融合タンパク質を処理して標識、固定化および／または検出を容易ならしめ得るようにすると有利であると考えられる。例えば、標識および検出を容易にするために、ウイルスまたは宿主細胞タンパク質のコード配列を、酵素活性を有する、または酵素基質として作用する異種タンパク質のコード配列に融合させることができる。融合構築物は、融合物質の異種成分が宿主細胞およびウイルスタンパク質の結合を妨げないように設計すべきである。間接的な標識は、結合パートナーの一方、すなわち、使用した宿主細胞タンパク質またはウイルスタンパク質のいずれかに特異的に結合する、標識抗体などの第三のタンパク質の使用を含む。そのような抗体としては、それらに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂ断片およびＦａｂ発現ライブラリーによって作られる断片が挙げられる。抗体の産生に対しては、種々の宿主動物に宿主細胞タンパク質もしくはウイルスタンパク質またはそれらの一部を注入することにより免疫感作することができる。そのような宿主動物は、２、３挙げると、ウサギ、マウスおよびラットがあるが、それらに限定されない。免疫反応を高めるために、宿主の種に応じて、種々のアジュバントを使用することができ、例えば、それらに限定されないが、フロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性剤、pluronicポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、keyhole limpetヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（bacille Calmette-Guerin）およびCorynebacterium parvum などの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられる。モノクローナル抗体は、細胞系を連続培養することによる抗体分子の産生に対する方法を使用して作ることができる。これらの方法としては、それらに限定されないが、KohlerおよびMilsteinによって最初に記載されたハイブリドーマ法（ Natrue，1975，256: 495-497）；ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Kosborら、19 83，Immunology Today，4:72; Coteら、1983，Proc．Natl．Acad．Sci.，80:202 6-2030）；およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Coleら、1985，Monoclonal Antib odies and Cancer Therapy，Alan R．Liss，Inc.，pp.77-96）が挙げられる。さらに、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子から得た遺伝子を適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子から得た遺伝子とともにスプライシングすることによる「キメラ抗体」の産生に対して開発された方法（Morrisonら、1984，Proc． Natl．Acad．Sci.，81: 6851-6855; Neubergerら、1984，Nature，312: 604-608 ; Takedaら、1985，Nature，314:452-454）を使用することができる。あるいは、一本鎖抗体の作製に対して記載された方法（米国特許No．4,946,778）を採用して、結合パートナーの一つに対して特異的な一本鎖抗体を作製することができる。特定のエピトープを認識する抗体断片は、公知の方法によって作ることができる。例えば、そのような断片は、それらに限定されないが、抗体分子のペプシン消化によって作ることができるＦ（ａｂ’）₂断片およびＦ（ａｂ’）₂断片のジスルフィド架橋を還元することにより得られるＦａｂ断片が挙げられる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを作製して（Huseら、1989，Science，246: 1275 -1281）、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を迅速かつ容易に同定することができる。５．２．２．アッセイ様式アッセイは、不均一または均一様式で行なうことができる。不均一アッセイは、結合パートナーの一方を固相に固定し、反応の終わりに固相上に固定された複合体を検出することを含む。均一アッセイでは、反応全体を液相で行なう。どちらの方法でも、反応物の添加順序は、試験される化合物に関して種々の情報が得られるよう変えることができる。例えば、結合パートナー間の相互作用を、例えば競合によって妨げる被験化合物は、試験物質の存在下で、すなわち、ウイルスタンパク質および宿主細胞タンパク質より前に、または同時に試験物質を反応混合物に添加することにより反応を行なって同定することができる。他方、先に形成された複合体を破壊する被験化合物、例えば、結合定数がより高く、複合体から結合パートナーの一方を追い出すような化合物は、複合体が形成された後に被験化合物を反応混合物に添加することにより試験することができる。種々の様式について、以下に簡単に記載する。不均一なアッセイ系では、一方の結合パートナー、例えばウイルスタンパク質または宿主細胞タンパク質のどちらかを固体表面上に固定し、固定していないその結合パートナーは、直接または間接的に標識する。実際には、マイクロタイタープレートを使用するのが便利である。固定される物質は、非共有または共有結合によって固定化することができる。非共有結合は、固体表面をそのタンパク質の水溶液で被覆し、脱水乾燥することにより簡単に行なうことができる。あるいは、そのタンパク質に対して特異的な固定化抗体を使用して、そのタンパク質を固体表面に固定することができる。表面は、予め調製して保存することができる。アッセイを行なうために、固定化した物質の結合パートナーを、被験化合物とともに、または被験化合物なしで被覆表面に添加する。反応完了後、未反応成分を除去（例えば、洗浄により）すると、形成された複合体は、固体表面上に固定されて残る。固体表面上に固定された複合体の検出は、多くの方法で行なうことができる。結合パートナーが予め標識してある場合は、表面上に固定された標識の検出が複合体の形成を示す。結合パートナーが予め標識していない場合は、表面上に固定された複合体を検出するために、間接的な標識を使用することができ、例えば、結合パートナーに対して特異的な標識抗体（抗体は、直接標識してもよいし、標識した抗−Ｉｇ抗体で間接的に標識してもよい。）を使用する。反応成分の添加順序に応じて、複合体の形成を抑制する被験化合物、または先に形成した複合体を破壊する被験化合物を検出することができる。あるいは、反応を、被験化合物の存在下、または不存在下、液相で行ない、反応物質を未反応成分から分離し、例えば、形成された複合体を溶液中で固定するための一方の結合パートナーに対して特異的な固定化抗体、および固定された複合体を検出するための他方の結合パートナーに対して特異的な標識抗体を使用して複合体を検出することができる。ここでも、反応物の液相への添加順序に応じて、複合体を抑制する被験化合物、または先に形成した複合体を破壊する被験化合物を同定することができる。本発明のもう一つの態様として、均一系アッセイが用いられる。この方法において、宿主細胞とウイルスのタンパク質の予備形成複合体を調製しておくが、この際、結合相手のタンパク質のうち一方を標識し、この標識により発生するシグナルが複合体形成により消失するようにしておく（たとえば、Rubensteinによる米国特許第4,109,496号には、この方法をイムノアッセイに利用することが記載されている）。予備形成複合体の一方の結合相手と競合して置き換わるような被験物質を加えるとバックグラウンド上にシグナルが発生する。このようにして、ウイルスタンパク質 - 宿主細胞タンパク質相互作用を分断するような被験物質を同定することができる。たとえば、NPI-1についての具体例において、NPI-1は、上記の5.2.1節に記載された組換えDNAの技術を用いる固定用に調製され得る。そのコーディング領域を、融合ベクターpGEX-5X-1を用いて、生じる融合タンパク質においても結合活性が維持されるような方法で、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）の遺伝子に融合させることができる。NPは、上に記載された当業者が通常行う方法を用いて、精製し、NPに特異的なモノクローナル抗体を生じさせるのに用いられる。この抗体は、たとえば当業者が通常実施する方法を用いて、放射性同位元素¹²⁵Ｉで標識することができる。不均一アッセイにおいては、たとえば、GST-N PI-1融合タンパク質をグルタチオン−アガロースビーズに固定することができる。次いで、被験化合物の存在下あるいは不存在下で融合タンパク質のNPI-1部分にNPが相互作用して結合し得るような方法で、NPを加える。被験化合物を加えた後、結合していない物質を洗浄除去し、NP特異性の標識された単クローン抗体を系に加え、複合体を形成した結合相手と結合させる。NPとNPI-1との間の相互作用は、グルタチオン−アガロースビーズと結合して残っている放射能の量を測定することにより検出される。被験化合物により相互作用が効果的に抑制されると、測定される放射能の減少が見られる。別の方法では、固体のグルタチオン−アガロースビーズを用いずに、GST-NPI- 1融合タンパク質とNPを液体中で混合することもできる。被験化合物は、結合相手の相互作用の進行中あるいは終了後に加えることができる。次いで、この混合物をグルタチオン−アガロースビーズに加え、結合していない物質を洗浄除去する。この場合にも、結合相手間での相互作用を抑制する程度はビーズに結合した放射能を測定することにより検出することができる。本発明の他の態様として、NPとNPI-1のそれぞれの結合ドメインに対応するペプチド断片を、それらの一方または両方のタンパク質全体を用いる代わりに用いて、上記の方法を行うことができる。これらの結合ドメインは、上記の5.2.1節に記載される方法により同定される。たとえば、限定するものではないが、NPI- 1は、この節で上記したように、GST-NPI-1融合タンパク質を作ってこれをグルタチオン−アガロースビーズに結合させることによって、固体材料に固定することができる。NPは、35Sのような放射性同位体で標識され、トリプシンのようなタンパク質分解酵素により分解される。次いで、分解生成物を、固定されたGST-NP I-1融合タンパク質に加えて、結合させる。結合していないペプチドを洗浄除去した後、標識された結合した物質、すなわちNPの結合ドメインを、溶出、精製し、上記5.2.1節に記載される方法でアミノ酸配列を分析する。このようにして同定されたペプチドは、合成的に製造されるか、上記5.2.1節に記載されたような、組換えDNA技術を使ってこれに適するタンパク質に融合される。本発明によれば、一つのウイルスを抑制することが発見された所与の化合物について、宿主細胞タンパク質に類似した依存関係を有する広い範囲の異なるウイルスに対して一般的な抗ウイルス活性があるかどうかを試験できる。たとえば、限定するものではないが、インフルエンザウイルスNPとNPI-1との相互作用を、N P結合部位に結合することによって抑制するような化合物について、下記5.3節に記載するアッセイにより、他のウイルス、特に、類似したタンパク質を有する、たとえば、パラインフルエンザウイルスのようなウイルスに対して試験を行うことができる。５．３．抗ウイルス活性のアッセイ前述のアッセイ系において同定された抑制効果のある化合物はすべて抗ウイルス活性について試験し得る。５．３．１．ウイルス成長アッセイ前述のアッセイ系で同定された抑制物質の、ウイルスの成長を妨げる能力は、プラーク形成または他のウイルス成長の指標、たとえば、TCID50またはニワトリ胚の尿膜中での成長等によって検定することができる。これらのアッセイにおいては、これに適した細胞株または胚含有卵にいろいろな型のインフルエンザウイルスを感染させ、感染と同時または感染後に組織培養液に被験化合物を加える。被験化合物の効果は、感染した細胞の上清または感染した胚含有卵の尿膜液において測定される血球凝集素(HA)力価により示されるウイルス粒子形成の定量によって、または、ウイルスのプラークの存在によって評価され、あるいは、プラーク表現型が存在しない場合には、TCID₅₀あるいはニワトリ胚の尿膜中での成長のような指標、または血球凝集アッセイによって評価される。抑制物質は、被験化合物のHA力価またはプラーク形成を低下させる能力、あるいは、ウイルスに感染した細胞またはニワトリ胚の尿膜における細胞変性効果を減少させる能力により、または血球凝集アッセイにより測定されるようなウイルスの粒子形成を減少させる能力により評価することができる。５．３．２．動物モデルアッセイ抑制物質がインフルエンザウイルスの複製を妨げる能力について、インフルエンザに対する天然の、または適応した宿主である動物モデルにおいてアッセイを行うことができる。このような動物として、ブタ、フェレット、マウス、サル、ウマおよび霊長目のような哺乳類または鳥類が挙げられる。下記の5.5節で詳述するように、このような動物モデルは被験動物におけるLD₅₀およびED₅₀を決定するのに利用することができ、このようなデータは、ウイルス／宿主細胞タンパク質相互作用の抑制物質に関する治療上の指標を得るために利用できる。５．４．抑制効果のある化合物下記のスクリーニングアッセイにおいて同定され、本発明に利用することのできる抑制効果のある化合物は、低分子の有機化合物、ペプチドおよび抗体を含むが、これらに限定されるものではない。たとえば、宿主細胞タンパク質のウイルスタンパク質への結合ドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチドは、天然のウイルスタンパク質と競合するように使用できるので、本発明による抑制物質として有用である。同様に、ウイルスタンパク質の宿主細胞タンパク質への結合ドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチドも利用できる。このようなペプチドは、化学的に合成するか、当業者に公知の方法を用いて組換えDNA技術により製造することができる（たとえば、上記のCreighton,1983,；および、上記のSambrookら、1989,参照）。ペプチドを細胞に運ぶためにリポフェクチンまたはリポソームを使用することができる。また、宿主細胞またはウイルスタンパク質のどちらかの結合ドメインに対して特異性があり、それらの相互作用を妨げるような抗体が利用できる。そのような抗体は、上記5.2.1.節に記載した標準的な技術を用いて、タンパク質そのものに対して、またはタンパク質の結合ドメインに対応するペプチドに対して産生され得る。このような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、Fabフラグメント、単鎖抗体、キメラ抗体等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。抗体全体を使用する場合には、細胞の中に入る抗体が好ましい。しかしながら、リポフェクチンを用いて、抗体、または、ウイルスあるいは宿主細胞タンパク質のエピトープに結合するFab領域のフラグメントを細胞内に運ぶことができる。抗体のフラグメントを用いる場合、標的タンパク質の結合ドメインに結合するような、抑制効果を有する最小のフラグメントを用いることが好ましい。５．５．薬剤の調製および投与の方法ウイルスの複製を抑制することが同定された化合物はウイルス感染の治療のために、治療上有効な用量を患者に投与することができる。治療上有効な用量とはウイルス感染による症状が回復するのに十分な化合物の量のことをいう。このような化合物の毒性および治療上の効力、たとえば、LD₅₀(母集団の50%が死に至る投与量)や、ED₅₀（母集団の50%に治療上の効果がある投与量）は、培養細胞または実験動物を用いた標準的な薬学的な方法により決定できる。毒性を表す用量と治療上の有効性を示す用量の比は治療上の指標となるもので、LD₅₀/ED₅ ₀ の比により表される。この治療上の指標の大きい化合物が好ましい。有害な副作用を現す化合物を使用する際には、感染していない細胞の損傷を最小限に抑え、副作用を減らす為、このような化合物を感染した部分だけに集めて運ぶようなデリバリーシステムを設計するように注意を払わなければならない。細胞培養アッセイおよび動物を用いた研究から得られたデータをヒトに対する投与量の範囲を決定する際に利用することができる。このような化合物の投与量は、ED₅₀を含み、毒性がほとんどないか毒性がない循環濃度の範囲にあるのが好ましい。投与量は採用される投薬形態および利用される投与の経路によってこの範囲内で変化し得る。本発明で使用されるすべての化合物について、治療上有効な用量はまず細胞培養アッセイにより見積もることができる。投与量は、動物モデルにおいて、細胞培養により決定したのと同様にして、循環血漿濃度がIC50（すなわち、最大の感染の半分または最大の抑制の半分となるような被験化合物の濃度）を含む範囲となるように決定し得る。このような知見はヒトに対する有効な用量をさらに精密に決定するために利用できる。血漿中での濃度は、たとえば高速液体クロマトグラフィーにより測定される。本発明に使用する医薬組成物は、一つ以上の生理的に許容可能な担体または賦形剤を使用して通常の方法で処方することができる。以上のように、化合物およびその生理的に許容される塩および溶媒化合物を、吸入またはガス注入による投与（どちらも口または鼻を通して）、または、経口、口内、非経口、あるいは直腸から投与するように処方し得る。吸入により投与するためには、本発明に使用する化合物は、圧縮容器または噴霧器から出されるエーロゾルスプレーの形で提供されるのが便利である。その際、適当な噴射薬、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、カーボンジオキシドまたはその他の適したガスを一緒に使用することができる。加圧したエーロゾルを使う場合には、メーターで量った量を送出するバルブを備えることによって一定量の投薬ができる。吸入またはガス注入に用いるための、たとえばゼラチンでできたカプセルおよびカートリッジは、化合物と、ラクトースまたはデンプンのような好適な粉体基剤からなる粉体混合物を含む処方を行う。経口投与のためには、医薬組成物はたとえば、錠剤やカプセルのような形で提供される。これらは、通常の方法により、薬学的に許可し得る賦形剤、すなわち、結合剤（たとえば、あらかじめゼラチン化したコーンスターチ、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（たとえば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（たとえば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（たとえば、ラウリル琉酸ナトリウム）を用いて調製される。錠剤は当業者に公知の方法でコーティングされてもよい。経口投与のための剤は、たとえば、溶液、シロップまたは懸濁液のような形で提供されるか、または、乾燥した製品として提供され、使用の前に水または他の好ましい溶解剤と混合するようにしてもよい。このような液剤は通常の方法により薬剤に使用可能な添加剤、すなわち、懸濁剤（たとえば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素添加食用脂）；乳化剤（たとえば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性溶解剤（たとえば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコールまたは分留された植物性油）；および、防腐剤（たとえば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）を用いて調製される。製剤は緩衝剤(buffer salts)、香料、着色剤および甘味料を適宜含有してもよい。経口投与のための製剤は活性化合物の放出を制御するような処方が好適におこなわれる。口内投与のための組成物は通常の方法で調製された錠剤またはトローチの形で提供される。化合物は、注射、たとえば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために処方することができる。注射のための処方は単位投薬形態ごとに、たとえば、アンプルまたは多投与量容器にいれて、防腐剤を添加して提供される。化合物は油性または水性の溶解剤中で懸濁液、溶液、またはエマルジョンの形で提供され、懸濁剤、安定剤および／または分散剤のような処方剤を含んでいてもよい。または、粉体の活性成分を使用前に適宜の溶解剤、たとえば、無菌のバイオジェンフリーの水と混合するようにしてもよい。化合物は、たとえば、ココアバターや他のグリセリドのような通常の座薬基剤を含む座剤または貯留浣腸剤のような直腸投与のために処方することもできる。前述した処方に加えて、化合物はデポー調剤としても処方できる。このような長期間作用する製剤は移植（たとえば、皮下または筋内）または筋内注射により投与される。たとえば、化合物は適宜の高分子または疎水性物質（たとえば、許容可能な油中のエマルジョン）またはイオン交換樹脂と共に、または溶解性に乏しい塩のような溶解性に乏しい誘導体として処方することができる。組成物は必要ならば、活性成分を含む一回または多数回分の投与量をパックまたはディスペンサー装置に入れて供給されてもよい。パックは、ブリスターパックのように金属またはプラスチックの箔でできていてもよい。パックまたはディスペンサー装置に投与法の指示を添付してもよい。６．実施例： NPI-1 の同定とそのインフルエンザ核タンパク質との相互作用インフルエンザAウイルスのヌクレオプロテインと相互作用する細胞タンパク質を同定するために酵母相互作用トラップ系を使用した。このタンパク質、核タンパク質相互作用物質１(NPI-1)は酵母タンパク質SRP1のヒト同族体である。SRP 1は、先に温度感受性RNAポリメラーゼI変異株の抑制因子として同定されたものである(Yanoら、1992,Mol.Cell.Biol．12:5640-5651)。NPI-1の全長のcDNAクローンは、HeLa細胞のポリA+RNAよりとられた。インフルエンザA/PR/8/34ウイルスを感染させた胚含有卵から部分的に精製したウイルスNPは、細菌で発現させたグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)とNPI-1の融合タンパク質と複合体を形成しているグルタチオンアガロースビーズにより、溶液から共沈させることができた。これにより酵母遺伝子系の結果を確認した。NPI-1に対して作られた抗血清により、65 kDa ポリペプチドを、HeLaおよびMDBK細胞の両方の全細胞抽出物から同定した。これに加えて、ウイルス核タンパク質はインフルエンザA/WSN/33 ウイルス感染HeLa細胞から、NPI-1に対する抗血清により免疫的に共沈した。これは、感染細胞内でこれらの二つのタンパク質が相互作用することを示し、NPI- 1がインフルエンザウイルスの複製において役割を果たしていることを示唆している。６．１．材料および方法酵母株EGY48(Mata trp1 ura3 his3 LEU2::pLEXAop6-LEU2)(Zervosら,1993,Cel l 72: 222-232)および、プラスミドpEG202、pSH18-34、および、pRFHM1、および、pJG4-5で構築したHeLa細胞cDNAライブラリー（Gyurisら、1993，Cell 75: 791 -803)については先に述べた。類似した型のこれらのプラスミドおよびこの酵母宿主株は、二つのタンパク質の融合系の一部として、Clontechから購入可能である。インフルエンザA/PR/8/34 NPタンパク質をLexAの翻訳融合遺伝子として発現できるようにpEG202にサブクローニングすることによってpLexA-NPを構築した（図１）。これらの研究の一部として構成された酵母株は、表２に記載されている。大腸菌MH3株(trpC araD IacX hsdR galU galK)およびW31005については先に述べた通りである（Hallら、1984，Cell 36: 1057-1065）。６．１．２．ＮＰインターアクターの選択先に記述された方法(Gyurisら、1993、前出；Zervosら、1993、前出）に本質的にしたがって、相互作用トラップ(trap)選択を実施した。酢酸リチウム法(Ito ら，1983，J．Bacteriol．153:163-168)を用いて、HeLa ｃＤＮＡライブラリーによってＲ１００株を形質転換した。12枚の25 x 25cm²のhis^-trp^--グルコースプレートを用いて2 x 10⁶個の一次酵母形質転換細胞を選択し、プールし、-70℃ で保存した。his^-leu^--ガラクトースプレートを用いてleu+表現型のライブラリー形質転換体を選択した。プレーティングの効率は、ガラクトース+コロニー１個あたり約10^-4leu+コロニーであった。HoffmanおよびWinston（HoffmanおよびW inston，1987，Gene 57:267-272）の記述にしたがってleu+ライブラリー形質転換細胞からプラスミドＤＮＡを単離し、そしてエレクトロポレーションによりＭＨ３細胞に導入した。形質転換混合物をlxA+amp+グルコースプレートにプレーティングすることによりライブラリープラスミドを選択した(Miller，1972，Exper iments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。ＮＰとの相互作用の特異性をチェックすることによりｃＤＮＡを分析した。単離したプラスミドのそれぞれをＲ１０１株およびＲ１０２株に導入した。これらの株は、β-ガラクトシダーゼをコードし、上流ＬｅｘＡ結合部位から転写的に制御されているＧＡＬ１プロモーターを有するレポータープラスミドであるpSH1 8-34を有する。Ｒ１０２株は、クローン化ｃＤＮＡのＮＰ-特異性に関する陰性対照として使用した。この株はpRFHM1を含有し、これはキイロショウジョウバエのバイコイド(bicoid)タンパク質の転写的に不活性な断片と融合したＬｅｘＡをコードしている。コロニーのニトロセルロースレプリカを用いて、細胞を凍結割断し、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドーリル-β-D-ガラクトシド(X-gal)を含有する緩衝液中でインキュベートすることによりβ-ガラクトシダーゼ活性をアッセイした(Miller，1972，前出)。pLexA-NPの存在下でleu+およびβ-gal+の両方の表現型を付与するが、pRFHM1の存在下では付与しないプラスミドを、さらに試験するために取っておいた。６．１．３．ＮＰＩ−１の５’末端のクローニング Frohmanの方法によるｃＤＮＡ末端の急速増幅("RACE")によりＮＰＩ−１の5' 末端をクローン化した(Frohman，1990，PCR Protocols: A Guide to Methods an d Applications，Innisら編、Academic Press Inc.，San Diego，p．28-38; Fro hmanら，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．85: 8998-9002)。ＮＰＩ−１特異的オリゴヌクレオチド5'GCAAAGCAGGAGAAACCAC3'を用いて、１μgのポリA+ HeL a細胞ＲＮＡの逆転写を実施した。ターミナルトランスフェラーゼにより、ｃＤＮＡの第一鎖にｄＣＴＰの尾を付けた。ネステド(nested)ＮＰＩ−１プライマー 5'GGGTCCATCTGATAGATATGAGAG3および5'RACEアンカープライマー5'CUACUACUACUA GGCCACGCGTCGACTACTACGGGIIGGGIIGGGIIG3'(Gibco/BRL)を用いて、逆転写産物のＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲ産物をpGEM-T(Promega)中にサブクローン化し、標準的プロトコールにより配列決定した。ＰＣＲによってもたらされる誤りを避けるため、３つの独立した実験由来の5'RACE産物をクローン化し、配列決定した。６．１．４．ＧＳＴ−ＮＰＩ−１の細菌による発現および精製 HeLa ｃＤＮＡライブラリー由来のＮＰＩ−１ｃＤＮＡを、グルタチオン-S- トランスフェラーゼ融合ベクターpGEX-5X-1(Pharmacia)のEcoR1およびXhoI制限エンドヌクレアーゼ部位にサブクローン化し、プラスミドpGST-NPI-1を作成した。標準的プロトコールにしたがって、イソプロピル-β-D-ガラクトピラノシドを用いて、W31005細胞中の細菌発現プラスミドよりタンパク質を誘導した（Smith およびJohnson，1988，Gene 67: 31-40)。細菌をインキュベーションの４時間後にペレット化し、氷冷リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄し、そして1/10培養物容量のPBS+1%トリトンX-100に再懸濁した。１ampの出力に設定したRaytheon超音波処理機を用いて15秒のパルスを４回かけて氷上で細菌を溶解した。BeckmanT L-100.３ローターを用いて、不溶性物質を50,000xgで30分間ペレット化した。グルタチオン-アガロースビーズ(Sigma Chemical Crop.)を用いて、ＧＳＴ− ＮＰＩ−１およびＧＳＴを細菌溶解物より精製した。ビーズは製造者の指示に従って膨潤させ、PBSで平衡化させた。典型的な結合反応は、細菌溶解物50μlおよびグルタチオン-アガロースビーズの50%スラリー10μlを含む500μlのPBS/0.1% トリトンX-100を用いて行なわれた。回転ホイールを用いて結合反応を５分間室温でインキュベートした。微量遠心機で５秒間遠心してビーズを回収し、ＰＢＳで３回洗浄した。６．１．５．ＮＰ結合アッセイＧＳＴ−ＮＰＩ−１／ビーズ複合体へのＮＰの結合をアッセイするため、洗浄したＧＳＴ−ＮＰＩ−１／ビーズ複合体および10μgの部分精製インフルエンザウイルスポリメラーゼおよび核タンパク質調製物(Pol/NP)を含有する500μlの氷冷PBS+0.05% Nonidet P-40を用いて、典型的反応を実施した。インフルエンザウイルスA/PR/8/34に感染した孵化鶏卵よりウイルスを調製し、POL/NP調製物を以前に記述されたように精製した(Enamiら，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A ．87: 3802-3805; Parvinら，1989，J．Virol．63: 5142-5152)。回転ホイールを用いて、ＮＰを４℃で１時間結合させた。微量遠心機で５秒間遠心してビーズを回収し、PBS+0.05% NP-40を用いて３回洗浄した。洗浄したビーズを50μlのSD Sサンプル緩衝液(Sambrookら，1989，Molecular Cloning: A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratories Press，Cold Spring Harbor，NY)に再懸濁し、５分間煮沸し、微量遠心機でペレット化した。各上清の10μlを、12.5% SDS -ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により分離した。ゲルはクマシーブルーで染色するか、またはイムノブロット分析用に処理された。モノクローナル抗体ＨＴ１０３を用いたイムノブロッティングにより、ＮＰを検出した。６．１．６．抗血清およびイムノブロッティング雌ＮＹＺウサギ(Buckshire Farms)を完全フロイントアジュバントに溶解した2 00μgの精製ＧＳＴ−ＮＰＩ−１で免疫感作し、次いで不完全フロイントアジュバントに溶解した100μgの精製ＧＳＴ−ＮＰＩ−１を用いて３週間の間隔をおいて２回のブースター注射を行なうことにより、ＮＰＩ−１に対するポリクローナルウサギ抗血清を作成した。細菌溶解物中のＧＳＴ−ＮＰＩ−１のイムノブロット分析により、抗血清の特異性が示された。イムノブロットは標準的方法で実施した(HarlowおよびLane，1998，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spri ng Harbor Laboratories Press，Cold Spring Harbor，NY)。血清は1:1000に希釈して使用した。６．１．７．ウイルスおよび細胞 SDSサンプル緩衝液中で細胞を直接溶解し、次に21ga.のシリンジを通して染色体ＤＮＡを剪断することにより、HeLaおよびMDBK細胞由来の全細胞溶解物を作成した。氷冷NP-40溶解緩衝液［10mM Tris-HCl，pH 8.0; 100mM NaCl; 1mM EDTA; 1mM DTT; 1% Nonidet P-40; 1mM 4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド-ハイドロクロリド(Pefabloc)]中で細胞を溶解し、細胞質抽出物を作成した。氷上に10分間置いた後、遠心により核を除去した。SDS-PAGEによりタンパク質を分離し、ニトロセルロースに移し、イムノブロッティングにより可視化した。代謝的に標識されたタンパク質を含有する感染細胞溶解物を作成するため、4 x 10⁶個のHeLa細胞をインフルエンザウイルスA/WSN/33に多重度10で45分間37℃ で感染させた。感染をDMEM+0.1% BSA中で５時間進行させ、この時にMEM-cys-met に溶解した50μCi ³⁵S-メチオニン+50μCi ³⁵S-シスチンを用いて細胞を１時間標識した。感染細胞を650μlの氷冷NP-40溶解緩衝液に再懸濁し、次いでRaytheo n超音波処理機を用いて15秒のパルスを２回与えて核を破壊することにより、抽出物を調製した。TL-100.3 Beckmanローターを用いて、100,000xgで遠心して不溶性細胞破砕物を除去した。５μlの抗ＮＰＩ−１血清を100μlの感染細胞溶解物と共に氷上で１時間インキュベートした。Sepharose-4B結合プロテインＧビーズ(Sigma)と共に１時間インキュベートすることにより、免疫複合体を溶液から沈降させた。遠心によりビーズを回収し、NP-40溶解緩衝液で３回洗浄し、そしてSDS-サンプル緩衝液に再懸濁した。沈降したタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、オートラジオグラフィーにより可視化した。６．２．結果６．２．１．ＮＰＩ−１の単離Ａ型インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）と特異的に相互作用するタンパク質を同定するため、相互作用トラップ(trap)を用いた。相互作用トラップとは、タンパク質：タンパク質相互作用を検出する転写アクチベーターのモジュール的性質(modular nature)を利用した、最近開発された幾つかの遺伝子系のひとつである(Chienら，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．88 9578-9582; DaltonおよびTreisman，1992，Cell 68: 597-612; Durfeeら，1993，Genes Dev ．7: 555-569; Gyurisら，1993，前出; Vojtekら，1993，Cell 74: 205-214; Ze rvosら，1993，前出）。相互作用トラップは３つの構成要素から成る。すなわち、（１）基礎転写を全く有さないレポーター遺伝子；（２）転写的に不活性なＬｅｘＡＤＮＡ結合ドメインを含有する融合タンパク質；および（３）活性化ドメイン（図1A）を含有する融合タンパク質として発現される、発現ライブラリーによってコードされるタンパク質である。ＬｅｘＡ融合タンパク質と活性化ドメインを含有する融合タンパク質との相互作用は、この場合には、ロイシンを欠く培地で増殖する能力を付与する二分子転写アクチベーターを構成する(Gyurisら，1993，前出; Zervosら，1993，前出）。この相互作用が存在しない場合は、leu2遺伝子は転写されない。インフルエンザウイルスA/PR/8/34のＮＰ遺伝子を、ＬｅｘＡ遺伝子を有する翻訳融合遺伝子としてpEG202にサブクローン化し、pLexA-NPを作成した（図IB）。pJG4-5中に構築したHeLa細胞ｃＤＮＡライブラリーを用いて、pLexA-NPを含有するＲ１００株（表II）を形質転換した。pJG4-5は、GAL1プロモーターの制御下にある活性化ドメインを含有している(Gyurisら，1993，前出)。ライブラリープラスミドを100個のleu+コロニーから回収した。Ｒ１０１株にライブラリープラスミドを導入することにより、ＮＰとコードされたライブラリータンパク質との相互作用の再現性を試験した。得られた形質転換細胞を、ガラクトース依存性β-ガラクトシダーゼ活性およびロイシンを欠く培地での増殖についてスクリーニングした。異なるＬｅｘＡ融合プラスミドであってキイロショウジョウバエのバイコイドタンパク質の断片をコードするpRFHM1について、leu^- -培地での増殖を付与するライブラリープラスミドの能力をチェックすることにより、ＮＰへの特異性を分析した。23個のライブラリープラスミドがＮＰと相互作用するタンパク質をコードすることが確認された。12個の等しい2.1 kbpクローンが、核タンパク質インターアクター１（ＮＰＩ−１）と称するタンパク質のカルボキシ末端断片をコードしていた。部分的ＤＮＡ配列決定は、ＮＰＩ−１が酵母ＳＲＰ１遺伝子（後出）のヒト相同体であることを示した。６．２．２．ＮＰＩ−１ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定 pJG4-5中の2.1 kbpのＮＰＩ−１ｃＤＮＡを標準的プロトコールにより配列決定した。ＮＰＩ−１遺伝子の5'ｃＤＮＡ末端を、5'RACEによってクローン化した。３つの別個に誘導されたＮＰＩ−１ 5'RACE産物由来のｃＤＮＡをクローン化し、配列決定した。ＮＰＩ−１のヌクレオチド配列およびそこから引き出されるアミノ酸配列を図２に示す。配列は、計算される分子量が58,574 Daで等電点がp I=4.74である、527アミノ酸のタンパク質をコードする2.9 kbp ｃＤＮＡを示している。カルボキシル末端265アミノ酸は、相互作用トラップライブラリープラスミドによってコードされていて、ウイルスＮＰと相互作用をする。 FASTAおよびTFASTAプログラム(Deverauxら，1984，Nucleic Acids Res．12: 3 87-395)を用いた推定されるアミノ酸配列とGenBankおよびEMBLデータベースの比較は、ＮＰＩ−１がサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) タンパク質ＳＲＰ１(Yanoら，1992，Mol．and Cell．Biol．12: 5640-5651)のヒト相同体であることを示した。ＳＲＰＩは、ＲＮＡポリメラーゼＩのＡ１９０サブユニットの亜鉛結合ドメインにおける温度感受性突然変異の対立遺伝子特異的サプレッサーとしてクローン化された。アミノ酸配列はＮＰＩ−１とＳＲＰ１の間で高度に保存されている。すなわち、アミノ酸レベルで50%同一性および8 1%類似性である。ＮＰＩ−１のアミノ末端は潜在的核局在化(nuclear localizat ion)シグナルを有する(Chelskyら，1989，Mol．Cell．Biol．9: 2487-2492); アミノ酸25〜49はアルギニンに富み、アミノ酸28〜31には４個の連続するアルギニンを含有する。ＳＲＰ１と同様、ＮＰＩ−１は８個の連続するＡＲＭモチーフの一続きを含有し、これらは最初ショウジョウバエのアルマジロ(armadillo)タンパク質中に同定された42アミノ酸タンパク質サブ配列である(Peiferら，Cell 76 : 789-791，1994; Yanoら，1992，前出)（図３、後出）。６．２．３．ＮＰＩ−１はin vitroでＮＰと結合するＮＰＩ−１がウイルスＮＰと結合することを示すため、ＮＰＩ−１ｃＤＮＡ断片(アミノ酸262〜527)を、グルタチオンS-トランスフェラーエ融合遺伝子をもたらす細菌発現ベクターpGEX-5X-1にサブクローン化した。グルタチオンアガロースビーズを用いて、発現された融合タンパク質を細菌溶解物から精製した。インフルエンザウイルスA/PR/8/34由来のウイルスポリメラーゼであらかじめ部分精製したＮＰを、ＧＳＴ−ＮＰＩ−１と複合させたグルタチオンアガロースビーズにより、溶液より特異的に沈降させた（図４）。ＮＰのバンドはＧＳＴ−ＮＰＩ −１融合タンパク質のバンドよりも少し速く移動する。このタンパク質（ＮＰ）の同一性を、抗ＮＰモノクローナル抗体ＨＴ１０３を用いたイムノブロット分析により確認した（図４、レーン８）。６．２．４．細胞抽出物中のＮＰＩ−１の免疫検出ＧＳＴ−ＮＰＩ−１に対して作成したウサギ抗血清を用いて、HeLaおよびMDBK 両細胞の全細胞抽出物由来の、見かけ分子量65 kDaのポリペプチドを同定した（図５）。ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列より予測された分子量は少し小さかった(59 Da)。NP-40の存在下で細胞溶解により作成された細胞質画分においては、ＮＰＩ−１の量が全細胞抽出物に存在する量よりも少く、このことはＮＰＩ −１の殆どが核に存在することを示唆している（図５）。これは、ＮＰＩ−１相同体であるＳＲＰ１が、免疫蛍光法によると酵母細胞の核に局在するという結果 (Yanoら，1992，前出）に一致する。免疫蛍光法実験によるＮＰＩ−１の特定細胞内コンパートメントへの局在化は、使用した抗血清調製物の高いバックグラウンド蛍光のため、まだ可能となっていない。６．２．５．感染細胞中でＮＰＩ−１はＮＰと相互作用するＮＰはin vitroでＮＰＩ−１と複合体を形成したので、我々はＮＰとＮＰＩ− １が感染細胞中で複合体を形成するかどうかを調べた。ＮＰは、インフルエンザウイルスA/WSNに感染したHeLa細胞の抽出物から、ＮＰＩ−１に対する抗血清によって特異的に共免疫沈降した（図６）。このことは、Ａ型インフルエンザウイルスによる感染の際の、ウイルスＮＰと細胞ＮＰＩ−１との相互作用を示している。７．実施例：ＮＳ１Ｉ−１の同定およびインフルエンザ核タンパク質ＮＳ１との相互作用以下に記述する実施例では、酵母相互作用トラップ系を用いて、Ａ型インフルエンザウイルスのＮＳ１への結合に基づいて、HeLa細胞ｃＤＮＡライブラリー由来のヒトタンパク質ＮＳ１Ｉ−１（ＮＳ１−インターアクター-１）を同定した。ここにおいて、ＮＳ１Ｉ−１はヒトおよびトリの５つのインフルエンザウイルスＡ型株由来のＮＳ１タンパク質によって認識されるのみでなく、Ｂ型インフルエンザウイルスのＮＳ１によっても認識されることが示される。驚くべきことに、ＮＳ１Ｉ−１はブタから単離されたステロイドデヒドロゲナーゼに相同的である(Leendersら，1994，Eur．J．Biochem．222: 221-227)。デヒドロゲナーゼ機能を有する幾つかのタンパク質が、酵素活性を有するだけでなく、遺伝子発現における転写後の現象に関与していることが最近示された(Hentze，1994,前出)。この強い保存は、ウイルスのライフサイクルにおけるＮＳ１Ｉ−１相互作用の重要な機能的役割を支持する。７．１．材料および方法７．１．１．酵母株、大腸菌株およびプラスミド核酸、大腸菌および酵母の操作は、よそに記述されている標準的手順に本質的に従った(Ausubelら，1992，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates，Inc.およびJohn Wiley & sons，Inc.，NewYork)。酵母ＥＧＹ４０株(Mata trpl ura3 his3)およびＥＧＹ４８株(Mata trpl ura3 his3 LEU2::pLEX-Aop6-LEU2)、プラスミドpEG202、pRFHM1およびpSH18-34、およびpJG 4-5中に構築されたHeLa細胞ｃＤＮＡは、すでに記述されている(Gyurisら、1993 、前出; Zervosら、1993、前出)。クローニングおよび発現に用いた大腸菌株は、MH3(trpC araD lacX hsdR ga1U ga1K)、DHF5α(FΦ80dlacZ △M15 △(lacZY-a rgF)U169 deoR recA1 endA1 hsdR17(r_K-m_K+)supE44 λ-thi- gyrA96 relA1)およびBL26(FompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm)であった。pLexA-NS1は、インフルエンザウイルスA/PR/8/34のNSセグメントのｃＤＮＡをpEG202中のＬｅｘＡ遺伝子の下流にサブクローン化することにより構築した。pGEX-NS1I-1は、ライブラリープラスミドpK5のHeLa ｃＤＮＡ-挿入配列をEcoRI/Xbol-断片としてpGEX-5X-1(Phar macia)にサブクローン化することにより構築した。使用したＤＮＡ-オリゴヌクレオチドは、GSP-I、5'-dTCCTGATGTTGCTGTAGACG-3'，GSP-II、GSP-II，5'-dGCAC GACTAGTATGATTTGC-3'，および5'RACEアンカープライマー(BRL)、5'-dCUACUACUAC UAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3'であった。７．１．２．ＮＳ１-インターアクターの同定上記の第6.1.2節でＮＰＩ−１について記述したのと本質的に同じ方法で、相互作用トラップ選択を実施した。ＥＧＹ４８をベイト(bait)プラスミドpLexA-NS 1およびlacZ-レポータープラスミドpSH18-34を用いて形質転換することにより選択株を構築した。pSH18-34由来のlacZの発現は、GAL1プロモーターおよびLexA依存性オペレーター部位により転写的に制御される。HeLa細胞ｃＤＮＡライブラリーを酢酸リチウム法により選択株に導入した(Itoら，1983，前出)。trp^-his^-ura^- グルコースプレートを用いて一次形質転換細胞を選択した。3.3 x 10⁵個の独立した形質転換細胞に相当する1 x 10⁶個の細胞を150 mmのtrp^-his^-ura^-leu^- ガラクトースプレートにプレートし、ＮＳ１と相互作用するタンパク質を発現するクローンを選択した。生存可能な細胞をニトロセルロースフィルターにレプリカ- トランスファーし、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドーリルβ-D-ガラクトシド(X-ga l)を用いて以前に記述されたようにβ-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした(Ausubelら，1992，前出)。選択の第２ラウンドで、陽性クローンをX-galtr p^-his^-ura^-ガラクトースプレートにレプリカプレーティングすることにより試験した。ガラクトースプレート上でのみβ-ガラクトシダーゼ活性を発現する酵母クローンからプラスミドＤＮＡを単離し、そして上記第6.1.2節に記述するようにライブラリープラスミドを大腸菌MH3株に導入することにより回収した。pSH18 -34を有するEGY40にpLexA-NS1またはpRFHM1と共に同時導入することにより、単離したプラスミドの特異性を試験した。pRFHM1は、これまでに述べていない(unr elated)LexA-バイコイド融合タンパク質を発現する。得られた株を、グルコースまたはカラクトースを含有するX-gal trp^-his^-ura^- プレートを用いてβ-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。ガラクトースの存在下でのみ、そしてpL exA-NS1と共にのみ、β-ガラクトシダーゼを誘導するプラスミドは真正の相互作用タンパク質をコードすると考えられた。７．１．３．ＮＳ１Ｉ−１５’末端ｃＤＮＡのクローニングＮＳ１Ｉ−１ｍＲＮＡの5'末端由来のｃＤＮＡのクローン化は、ＲＡＣＥ手順（ｃＤＮＡ末端の急速増幅）（Frohmanmら、1988、前出）にしたがって、5'ＲＡＣＥ-キット(BRL)を用いて行なった。逆転写酵素を用いて、2.5 pmolのＮＳ１Ｉ−１特異的オリゴヌクレオチドＧＳＰ−Ｉにハイブリダイズした1 μgのHeLa 細胞ポリ(A)-ＲＮＡからｃＤＮＡの第１鎖を合成した。ターミナルトランスフェラーゼにより、ｃＤＮＡの５’末端にｄＣの尾をつけた。この産物は、ネステドオリゴヌクレオチドＧＳＰ−ＩＩおよび上記キットにより提供されるアンカープライマーを用いるＰＣＲによる５’ＲＡＣＥ-産物の増幅のための鋳型として使われた。得られた断片をpGEM-T(Promega)にサブクローン化してpRACENS1I-1を形成し、そして標準的ジデオキシ法により配列決定した。FastaおよびTfataを用いて、ＮＣＢＩサーチを実施した。Bestfitを用いて配列比較を実施した。７．１．４．ノーザンブロット分析 1%アガロース-ホルムアルデヒドゲルを用いて1μgのHeLa細胞ポリ(A)-ＲＮＡを分離し、ナイロン膜(Nytran，Amersham)に移し、ＵＶ架橋した。このＲＮＡを³² Ｐで標識したＮＳ１Ｉ−１特異的プローブにハイブリダイズさせた。このプローブは、以前に記述された(Ausbelら、1992、前出）最初のpK5ライブラリー単離物の断片（第+791〜+1745位に相当する）から誘導したものである。７．１．５．ウイルス、細胞および抽出物インフルエンザウイルス株 A/WSN/33(H1N1)、A/Berkeley/1/68(H2N2)、A/Beij ing/32/92(H3N2)、A/duck/Alberta/76(N12N5)、A/turkey/Oregon/71（H7N5）およびB/Lee/40を、10日齢孵化鶏卵の尿膜腔で増殖させた。Madin Darbyイヌ腎臓- (MDCK)-細胞の集密的単層を、感染多重度10で１時間、35mmのディッシュを用いてインフルエンザウイルスに感染させた。感染は、0.1%ウシ血清アルブミンを含有するＭＥＭ培地を用いて、35℃(A型インフルエンザウイルス)または35℃(インフルエンザウイルスB/Lee/40)で５時間継続した。細胞をディッシュごとに100μ Ciの³⁵S-メチオニンおよび³⁵S-システインを用いてＭＥＭ-met^-cys^--培地中で１時間標識した。氷冷リン酸緩衝化生理食塩溶液(PBS)を用いて細胞を洗浄し、こすり取った。１枚のディッシュ由来の細胞を、500μlのNET-N緩衝液(10mM Tris/ HCl pH 8.0，1mM EDTA，150mM NaCl，0.05% Nonidet P40)を用いて、1Aに設定したRaytheon超音波処理機により30秒のパルスを２回かけて、溶解した。TL100.3 ローターを用いて、溶解物を10分間20,000rpmで遠心した。上清をタンパク質の沈降のために使用した。７．１．６．大腸菌におけるＧＳＴ−ＮＳ１Ｉ−１融合タンパク質の発現、および細胞抽出物からのウイルスタンパク質の沈降ＮＳ１Ｉ−１は、予測された分子量77kDaを有するＧＳＴ（グルタチオン-Ｓ- トランスフェラーゼ）−ＮＳ１Ｉ−１融合タンパク質として、pGEX-NS1I-1から大腸菌BL26中に発現された。記述されている方法(Smithら，1988，前出)に本質的にしたがって、イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを用いてＧＳＴ− ＮＳ１Ｉ−１の産生を誘導した。ＧＳＴ−ＮＳ１Ｉ−１を細菌溶解物からグルタチオンSepharose ビーズ(Pharmacia)に、製造者の指示にしたがって、吸着させた。ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、不純な混合タンパク質を除去した。ＧＳＴ− ＮＳ１Ｉ−１融合タンパク質を塗布したグルタチオンSepharose 10μlを、ウイルス感染MDCK細胞（上記参照）の抽出物100μlと共に、750μlのNET-100緩衝液( 20mM Hepes，pH8.0，100mM NaCl，0.5mM DTT)中で90分間４℃で回転させた。ビーズをPBS/0.05% NP-40で３回洗浄し、沈降したタンパク質をSDS-ゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより分析した。並発反応において、記述された方法(HarlowおよびLane，1988，前出)にしたがって、５μlの抗ＮＳ１または抗Ｍ１抗血清およびプロテインＡアガロースを用いて、50μlの感染細胞抽出物からウイルスタンパク質を免疫沈降させた。陰性対照として、pGEX-5X-1から大腸菌BL26中にＧＳＴタンパク質を発現させ、共沈降アッセイにおいて使用したのと同じ方法で用いた。７．２．結果７．２．１．ＮＳ１と相互作用する因子の単離酵母相互作用トラップ系(Gyurisら，1993，前出; Zervosら，1993，前出)を用いて、Ａ型インフルエンザウイルスの非構造タンパク質ＮＳ１と相互作用する細胞タンパク質を同定した。Ｌｅｘ−ＮＳ１融合タンパク質をベイト(baitえさ)として用いて、HeLa細胞ｃＤＮＡが酸性転写活性化ドメインを有する融合タンパク質として発現されているライブラリーをスクリーニングした(Gyuris，1993#159) 。２つのレポーター遺伝子LEU2およびlacZの両方がｃＤＮＡによってコードされたタンパク質により活性化されたコロニーを選択した。この二重選択法はストリンジェンシーを増大させるために使用された。なぜなら、最初のスクリーニングでは、候補の大部分が後の遺伝子試験で陰性と判明したからである。選択したクローンからライブラリープラスミドを単離した。コードされた融合タンパク質の結合特異性を、pSH18-34上にコードされている lacZレポーター遺伝子の活性化をアッセイすることにより試験した。このプラスミドからのβ-ガラクトシダーゼの発現は、LexA特異的オペレーター部位によって転写的に制御されている。単離したライブラリープラスミドを、EGY40を有するpSH18-34中にpLexA-NS1およびpRFHM1と共に同時導入した。pRFHM1はLexA-バイコイド融合タンパク質を発現するもので、非特異的オペレーター結合対照として用いられた。ガラクトースを含むがグルコースを含まないX-galプレートを用いて、得られた株をβ-ガラクトシダーゼ活性について特定的にアッセイした。3.3 x 10⁵個の独立したライブラリー形質転換細胞から、pLexA-NS1と共同してのみl acZレポーター遺伝子のガラクトース特異的活性化を誘導した３つのプラスミドを単離した。配列分析は、これら３つのプラスミドがそれぞれ異なる細胞ｃＤＮＡに由来することを示した。７．２．２．ＮＳ１Ｉ−１のクローニングおよび配列分析単離したプラスミドの１つであるpK5をさらに分析した。これは、1413ヌクレオチドのオープンリーディングフレームおよびそれに続く368ヌクレオチドよりなる潜在的非翻訳領域を有する、1781bpのｃＤＮＡ挿入配列を担持していた（図 12）。このｃＤＮＡはオリゴ（Ａ）領域で終わり、そして第2526〜2531位に共通ポリ（Ａ）部位を有していた。ＮＳ１Ｉ−１特異的プローブを用いたHeLa細胞ポリ(A)-ＲＮＡのノーザンブロット分析は、約3.0 kbの単一転写物を検出した。このことは、pK5の挿入配列が不完全なｃＤＮＡを表すことを示唆した（図１３）。残りのＮＳ１Ｉ−１ｃＤＮＡを５’ＲＡＣＥ手順(Frohmanら、1988、前出) によりクローン化した。５’末端の長さが異なるのみである４つの独立したクローンを配列決定した。pRACENS1I-1に含有される最長の５’ＲＡＣＥ産物は、ＮＳ１Ｉ−１配列を上流へ893ヌクレオチドだけ延ばし、合計で2674bpのｃＤＮＡとなった（図12）。この配列は、735アミノ酸からなる、予測される分子量が79. 5kDaで等電点が9.06であるタンパク質をコードする長いオープンリーディングフレームを有する。推定上のATG開始コドンは5'末端から103ヌクレオチド下流にあり、一連の事実の前後関係よりこれが翻訳開始点であろうと思われる(Kozak,1 989，J．Cell Biol．108: 229-241)。 FASTAおよびTFASTA分析プログラムを用いたEMBLおよびGenBankデータベースによる配列比較は、ＮＳ１Ｉ−１がブタ17β-エストラジオールデヒドロゲナーゼ( Leendersら，1994，前出)に高度に相同的であることを示した。両者のｃＤＮＡは核酸レベルで86%同一である。コードされたタンパク質は84%同一で、保存されたアミノ酸置換を考慮すると92%類似している。また、NCBIデータベースのBLAST 分析を行なうと、ＮＳ１Ｉ−１ｃＤＮＡは、発現された配列標識として単離された10個のヒトｃＤＮＡ断片に高い相同性を示す（断片の長さは134から556 bp である）。これらのｃＤＮＡは肝臓、脾臓、脳、脂肪組織および副腎組織を含む異なる組織から引き出されたもので、身体におけるＮＳ１Ｉ−１の広範な発現を示している。コードされたＮＳ１Ｉ−１タンパク質は、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリーの２個の保存された配列モチーフを特徴とする(Perssonら，1991，Eur. J．Biochem．200: 537-543)。具体的には、アミノ酸15から22(TGAGAGCG)は潜在的な補因子結合部位に類似しており、また残基163から167(YSAAK)は触媒作用に関与していると示唆された短い一続きに相当する(Chenら，1993，Biochemistry3 2: 3342-3346)。カルボキシ末端におけるトリペプチドAKLの存在も注目された。類似のトリペプチドモチーフが、ミクロボディーへの移入のための標的設定シグナルとして機能することが見いだされている（総論については、de HoopおよびA b，1992，Biochem．J．286: 657-669参照）。しかし、このシグナルの存在はタンパク質を自動的にこれらの細胞小器官に導くものではない（de HoopおよびAb ，1992，前出）。７．２．３．ＮＳ１Ｉ−１はインフルエンザウイルス感染細胞抽出物由来のＮＳ１タンパク質と結合するＮＳ１Ｉ−１タンパク質とインフルエンザウイルス感染細胞中に発現されるＮＳ１の間の物理的相互作用を確認するため、上記第6.2.3.節にＮＰＩ−１について記述したのと同様な方法で共沈降アッセイを実施した。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＮＳ１Ｉ−１融合遺伝子を構築し、大腸菌中に発現させた。細菌溶解物由来のＧＳＴ−ＮＳ１Ｉ−１融合タンパク質をアフィニティーマトリックスであるグルタチオンアガロースに吸着させ、混入している細菌タンパク質から精製した。固定化融合タンパク質を用いて、ヒトインフルエンザウイルスA/WSN/33に感染したMDCK細胞抽出物由来の³⁵Ｓ標識化タンパク質を結合させ、沈降させた（図１４）。この株のＮＳ１タンパク質は、酵母相互作用スクリーニングに用いたA/PR/8/34株由来の対応するタンパク質と98%同一である。上記抽出物のアリコートを並発反応に用いて、インフルエンザウイルスタンパク質ＮＳ１およびＭ１を免疫沈降させた。沈降したタンパク質をSDS-ゲル電気泳動により分析し、フルオログラフィーにより可視化した。図１４は、ＧＳＴ−ＮＳ１Ｉ−１が感染細胞抽出物由来の免疫沈降したＮＳ１タンパク質と同時泳動するタンパク質バンドを効率的に沈降させたことを示している（レーン２と３を比較されたい）。この相互作用はＮＳ１Ｉ−１に特異的であった。なぜなら、ＧＳＴのみを使用した場合、沈降物にはタンパク質が検出されなかったからである（レーン６）。さらに、偽りの感染細胞由来のＧＳＴ−ＮＳ１Ｉ−１によっては、いかなるタンパク質も沈降しなかった（レーン８）。これは、ウイルスにより誘導されたタンパク質がＮＳ１Ｉ−１によって認識されることを示している。この実験は、ＮＳ１Ｉ−１がＡ型インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質と特異的に相互作用をすることを確認した。この相互作用がウイルスのライフサイクルにとって重要であるならば、これが保存されていることが予想されるであろう。従って、他のＡ型インフルエンザウイルス株由来のＮＳ１へのＮＳ１Ｉ−１の結合が、一次構造における相当な変異 (Baezら，1981，Virology 113: 397-402; Ludwigら，1991，Virology 183: 566- 577)にもかかわらず、検出可能であるに相違ない。それゆえ、上記と同じ共沈降アッセイを用いて、そして異なるＡ型およびＢ型インフルエンザウイルス株に感染した細胞の抽出物を用いて、ＮＳ１Ｉ−１とＮＳ１との相互作用を検討した。突然変異が一定の速度でＮＳ１遺伝子に蓄積している(Buonagurioら，1985，S cience 232: 980-982)。従って、２つの株を単離した時間の隔たりがそのＮＳ１タンパク質の配列変異に反映されている(Ludwigら，1991，前出; Buonagurioら，1985，前出）。２つの最近単離されたヒトＡ型インフルエンザウイルス株 A/B eijing/32/92およびA/Berkeley/1/68由来のＮＳ１へのＮＳ１Ｉ−１の結合を調べた。図１５のパネルＣおよびＤからそれぞれ明らかなように、上記２つの株由来のＮＳ１タンパク質は両方とも特異的に沈降した(図１５、パネルＣおよびＤ、レーン"GST-K5")。Beijing株由来のＮＳ１タンパク質の低い免疫沈降効率（パネルＣ参照）は、再現性をもって観察された。A/Berkeley/1/68およびA/WSN/33 のＮＳ１タンパク質は、相互に90.8%同一である。A/Beijing/32/92のＮＳ１配列は不明である。ＧＳＴ−ＮＳ１Ｉ−１がより多岐にわたるトリインフルエンザウイルス株 A/d uck/Alberta/76およびA/turkey/Oregon/71のＮＳ１タンパク質によっても認識されるかどうかを調べるため、以下の分析を実施した。これらの株のＮＳ１タンパク質は、A/WSN/33株のそれとそれぞれ66.5%および63.6% 同一である。重要なことに、A/turkey/Oregon/71のＮＳ１は長さが124アミノ酸しかなく、他のＮＳ１タンパク質のカルボキシ末端側の半分（これは207〜237アミノ酸よりなる）の殆どを欠いている(Nortonら，1987，Virology 156: 204-213)。しかし、上記の両方の株由来のＮＳ１と同時泳動するタンパク質バンドの沈降が観察された(図１５、パネルＡおよびＢ、レーン"GST-K5")。A/duck/Alberta/76のＮＳ１およびＭ１タンパク質は、使用したゲル系では分離できなかった。これらのトリインフルエンザウイルス株のＧＳＴ−ＮＳ１Ｉ−１沈降物中には相当量の核タンパク質が理由は分からないが再現性を持って検出された。最後に、ヒトＢ型インフルエンザウイルスB/Lee/40を試験するため、共沈降アッセイを用いた。驚くべきことに、このウイルスのＮＳ１タンパク質はA/WSN/33 由来のＮＳ１と20.6%しか同一でないが、ＧＳＴ−ＮＳ１Ｉ−１はこのＢ型インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質を特異的に沈降させた(図１５、パネルＦ、レーン"GST-K5")。総合すると、各株の一次構造の大きな相違にもかかわらず、幾つかのＡ型およびＢ型インフルエンザウイルス株によって発現されたＮＳ１タンパク質へのＧＳＴ−ＮＳ１Ｉ−１の結合が証明され得た。この結果は、ウイルスのライフサイクルにおけるこの相互作用の重要な機能を強く支持し、そして、ＮＳ１Ｉ−１相互作用は抗ウイルス介入のための優れた標的であることを示している。本発明の範囲は、発明の個々の側面の説明としてここに記述されている特定の態様によって限定されるものではない。そして、機能的に同等な方法および構成要素は本発明の範囲に含まれる。実際、本明細書に示され記述されたものに加えて、ここまでの記述および添付の図面から、当業者には種々の変法が明らかとなろう。そのような変法は、請求の範囲に含まれるものとする。国際出願番号：ＰＣＴ／ＦｏｒｍＰＣＴ／ＲＯ／１３４（続き）アメリカンタイプカルチャーコレクションアメリカ合衆国２０８５２メリーランド州，ロックビル，パークローンドライブ１２３０１受託番号寄託日７５９５1 １９９４年１１月３０日

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/70 1/70 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者オニール，ロバートアメリカ合衆国 10032 ニューヨーク州ニューヨーク，ナンバー２イー，ウエスト 169テイーエイチストリート 621番地

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞表面受容体タンパク質ではない宿主細胞タンパク質と、ウイルスの感染、複製、組み立てまたは放出に必要とされるウイルスタンパク質と、の特異的相互作用を抑制する物質を同定するためのアッセイであって、 (a) 被験物質の存在下で、宿主細胞タンパク質の結合部位に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドと、ウイルスタンパク質の結合部位に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドとを、結合および複合体の形成を可能とするのに十分な条件下に十分な時間にわたり接触させ、そして (b) 複合体の形成を検出する、ことを含んでなり、その際、宿主細胞タンパク質とウイルスタンパク質との相互作用を抑制する被験物質の能力が、被験物質の不在下で形成された複合体の量と比べたとき、複合体の形成の低下により示される、上記アッセイ。２．インフルエンザウイルスＮＰと宿主細胞タンパク質との相互作用を抑制する物質を同定するためのアッセイであって、 (a) 被験物質の存在下で、インフルエンザウイルスＮＰの結合部位に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドと、宿主細胞タンパク質の結合部位に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドとを、結合および複合体の形成を可能とするのに十分な条件下に十分な時間にわたり接触させ、そして (b) 複合体の形成を検出する、ことを含んでなり、その際、インフルエンザウイルスＮＰと宿主細胞タンパク質との相互作用を抑制する被験物質の能力が、被験物質の不在下で形成された複合体の量と比べたとき、複合体の形成の低下により示される、上記アッセイ。３．宿主細胞タンパク質がＮＰＩ−１である、請求項２に記載のアッセイ。４．宿主細胞タンパク質がＮＰＩ−２である、請求項３に記載のアッセイ。５．宿主細胞タンパク質がＮＰＩ−３である、請求項３に記載のアッセイ。６．宿主細胞タンパク質がＮＰＩ−４である、請求項３に記載のアッセイ。７．宿主細胞タンパク質がＮＰＩ−５である、請求項３に記載のアッセイ。８．宿主細胞タンパク質がＮＰＩ−６である、請求項３に記載のアッセイ。９．インフルエンザウイルスＮＳ１と宿主細胞タンパク質との相互作用を抑制する物質を同定するためのアッセイであって、 (a) 被験物質の存在下で、インフルエンザウイルスＮＳ１の結合部位に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドと、宿主細胞タンパク質の結合部位に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドとを、結合および複合体の形成を可能とするのに十分な条件下に十分な時間にわたり接触させ、そして (b) 複合体の形成を検出する、ことを含んでなり、その際、インフルエンザウイルスＮＳ１と宿主細胞タンパク質との相互作用を抑制する被験物質の能力が、被験物質の不在下で形成された複合体の量と比べたとき、複合体の形成の低下により示される、上記アッセイ。 10．宿主細胞タンパク質がＮＳ１Ｉ−１である、請求項９に記載のアッセイ。 11．複合体の一方のタンパク質またはペプチドが固定され、他方のタンパク質またはペプチドがシグナル発生化合物により標識される、請求項１、２または９に記載のアッセイ。 12．前記のタンパク質またはペプチドを固定するために固定化抗体を用いる、請求項11に記載のアッセイ。 13．前記のタンパク質またはペプチドをシグナル発生化合物により標識するために標識抗体を用いる、請求項11に記載のアッセイ。 14．反応前に前記のタンパク質またはペプチド基質を固定させて、前記反応を固 −液相中で行う、請求項11に記載のアッセイ。 15．前記のタンパク質またはペプチドを液相中で接触させて複合体を形成させ、該複合体を反応の終了時に液相から分離する、請求項１、２または９に記載のアッセイ。 16．形成された複合体が、該複合体を固相上に固定することにより液相から分離される、請求項15に記載のアッセイ。 17．複合体が前記のタンパク質またはペプチド結合相手の一方に特異的な固定化抗体により捕捉される、請求項16に記載のアッセイ。 18．インフルエンザウイルスに感染した個体に、宿主細胞タンパク質と、ウイルスの感染、複製、組み立てまたは放出に必要とされるウイルスタンパク質と、の特異的相互作用を抑制する物質を治療上有効な量で投与することを含んでなる、インフルエンザウイルス感染の治療方法。 19．ウイルスタンパク質がＮＰである、請求項18に記載の方法。 20．宿主細胞タンパク質がＮＰＩ−１である、請求項18に記載の方法。 21．宿主細胞タンパク質がＮＰＩ−２である、請求項18に記載の方法。 22．宿主細胞タンパク質がＮＰＩ−３である、請求項18に記載の方法。 23．宿主細胞タンパク質がＮＰＩ−４である、請求項18に記載の方法。 24．宿主細胞タンパク質がＮＰＩ−５である、請求項18に記載の方法。 25．宿主細胞タンパク質がＮＰＩ−６である、請求項18に記載の方法。 26．ウイルスタンパク質がＮＳ１である、請求項18に記載の方法。 27．宿主細胞タンパク質がＮＳ１Ｉ−１である、請求項18に記載の方法。 28．ＮＰＩ−１のアミノ酸配列をコードするか、またはＮＰＩ−１のコーディング配列の相補配列に選択的にハイブリダイズして、機能的に同等の遺伝子産物をコードする、単離されたＤＮＡ配列。 29．請求項28のＤＮＡ配列の相補配列をコードする、単離されたＤＮＡ配列。 30．請求項28のＤＮＡ配列を含むＤＮＡベクター。 31．請求項29のＤＮＡ配列を含むＤＮＡベクター。 32．請求項28のＤＮＡ配列の発現を支配する調節要素に機能的に結合された該ＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクター。 33．宿主細胞内での請求項28のＤＮＡ配列の発現を支配する調節要素に機能的に結合された該ＤＮＡ配列を含んでなる、遺伝子工学的に操作された宿主細胞。 34．ＮＰＩ−２、ＮＰＩ−３、ＮＰＩ−４、ＮＰＩ−５またはＮＰＩ−６のアミノ酸配列をコードするか、またはＮＰＩ−２、ＮＰＩ−３、ＮＰＩ−４、ＮＰＩ −５またはＮＰＩ−６のコーディング配列の相補配列に選択的にハイブリダイズして、機能的に同等の遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列。 35．請求項34のＤＮＡ配列の相補配列をコードするＤＮＡ配列。 36．請求項34のＤＮＡ配列を含むＤＮＡベクター。 37．請求項35のＤＮＡ配列を含むＤＮＡベクター。 38．請求項34のＤＮＡ配列の発現を支配する調節要素に機能的に結合された該ＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクター。 39．宿主細胞内での請求項34のＤＮＡ配列の発現を支配する調節要素に機能的に結合された該ＤＮＡ配列を含んでなる、遺伝子工学的に操作された宿主細胞。 40．ＮＳ１Ｉ−１のアミノ酸配列をコードするか、またはＮＳ１Ｉ−１のコーディング配列の相補配列に選択的にハイブリダイズして、機能的に同等の遺伝子産物をコードする、単離されたＤＮＡ配列。 41．請求項40のＤＮＡ配列の相補配列をコードする、単離されたＤＮＡ配列。 42．請求項40のＤＮＡ配列を含むＤＮＡベクター。 43．請求項41のＤＮＡ配列を含むＤＮＡベクター。 44．請求項40のＤＮＡ配列の発現を支配する調節要素に機能的に結合された該ＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクター。 45．宿主細胞内での請求項40のＤＮＡ配列の発現を支配する調節要素に機能的に結合された該ＤＮＡ配列を含んでなる、遺伝子工学的に操作された宿主細胞。