JP2013526284A - 身体試料を溶解するための汎用溶解バッファーおよび加工方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、身体試料、特に呼吸器疾患の診断に関係する身体試料を溶解するための、汎用溶解バッファーおよび加工方法に関する。
分子技法、特に核酸の分析は、診断分野における重要度が、ますます高まりつつある。特に、肺炎や結核などの呼吸器疾患の分野における分子診断では、極めて多様な外観を有する体液などの身体試料、例えば血液、喀痰、および気管分泌物の分析が、しばしば必要になる。今までのところ、各試料タイプは、異なる溶解バッファー、加工方法および溶解手順を必要とし、それらは他の試料タイプには転用できないことが多い。呼吸器疾患、例えば肺炎の分子診断に関係する全ての試料タイプを対象とするプロトコールは、まだ公表されていない。したがって、肺炎患者の診断に関係する全ての試料タイプに、標準化された使い勝手のよいルーチンプロトコールを使用することは、今のところできない。したがって、多種多様な身体試料、特に肺炎などの呼吸器疾患の診断に関係する試料に汎用することができる溶解バッファーおよび加工方法が望まれている。
ある態様において、本発明は、(i)少なくとも1つのカオトロピック剤、(ii)少なくとも1つの還元剤、および(iii)少なくとも1つのタンパク質分解酵素を含む、溶解バッファーを提供する。好ましくは、本発明の溶解バッファーは、さらにビーズを含む。好ましくは、本発明の溶解バッファーは、身体試料の溶解、好ましくは呼吸器疾患の診断に関係するような身体試料の溶解に、汎用することができる。
以下に本発明を詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載する特定の方法論、プロトコールおよび試薬類に(これらはさまざまでありうるので)限定されないことを理解すべきである。本明細書において使用する専門用語には特定の実施形態を説明するという目的しかなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定しようとするものではないことも理解すべきである。別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。
本発明に関して、「溶解バッファー」は、細胞の内容物を分析する目的で、例えば細胞に含まれている核酸を分析するなどの目的で、細胞を溶解するのに適している。好ましくは、本発明の溶解バッファーは、哺乳動物細胞および/または微生物細胞、例えば細菌細胞や酵母細胞の溶解に適している。したがって本発明の溶解バッファーは、好ましくは、マイコバクテリウム科(Mycobacteriaceae)、シュードモナス科(Pseudomonadaceae)、マイコプラズマ科(Mycoplasmataceae)、クラミジア科(Chlamydiaceae)、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、スタフィロコッカス科(Staphylococcaceae)、レンサ球菌科(Streptococcaceae)、キサントモナス科(Xantomonadaceae)、モラクセラ科(Moraxellaceae)、レジオネラ科(Legionellaceae)、バークホルデリア科(Burkholderiaceae)、コリネバクテリア科(Corynebacteriaceae)、ナイセリア科(Neisseriaceae)、バクテロイデス(Bacteroides)、およびパスツレラ科(Pasteurellaceae)からなる群より選択される科の細菌の溶解、およびサッカロミセス科(Saccharomycetaceae)、スポリジオボラス科(Sporidiobolaceae)、トリココマ科(Trichocomaceae)、およびニューモキスチス科(Pneumocystidaceae)からなる群より選択される科の酵母の溶解に適している。本発明の溶解バッファーの溶解特性は、該溶解バッファーにおける溶解すべき試料の加熱またはビーズ粉砕などといった加工ステップを必要としうる。加工ステップは、溶解すべき細胞のタイプおよびその細胞を含んでいる試料のタイプに依存しうる。好ましくは、本発明の溶解バッファーは水性溶解バッファー、すなわち水系の溶解バッファーである。したがって、本発明に関して、例えば(i)少なくとも1つのカオトロピック剤、(ii)少なくとも1つの還元剤、および(iii)少なくとも1つのタンパク質分解酵素からなる溶解バッファーとは、そのような溶解バッファーが、水および場合によってはバッファー構成要素(例えば溶解バッファーのpHを調節するためのもの)をも含有しうることを意味する。
第1の態様において、本発明は、(i)少なくとも1つのカオトロピック剤、(ii)少なくとも1つの還元剤、および(iii)少なくとも1つのタンパク質分解酵素を含む、好ましくはそれらから本質的になる、好ましくはそれらからなる、溶解バッファーに関する。好ましくは、本発明の溶解バッファーはさらに、ビーズを含む。したがって好ましくは、本発明の溶解バッファーは、(i)少なくとも1つのカオトロピック剤、(ii)少なくとも1つの還元剤、(iii)少なくとも1つのタンパク質分解酵素、および(iv)ビーズを含み、好ましくはそれらから本質的になり、好ましくはそれらからなる。好ましくは、該ビーズは、約300μm〜800μmの範囲内の直径、例えば300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、または800μmの直径を有し、好ましくは約600μmの直径を有する。好ましくは、ビーズは、未処理ビーズ上に存在しうるあらゆる汚染物質を溶解または加水分解するために酸洗浄されている。例えば、ビーズ、好ましくはガラスビーズは、それらを2M HNO3に少なくとも1時間に浸漬し、それらをすすぎ水がもはや酸性でなくなるまで水ですすぐことによって、酸洗浄することができる。あるいは、市販の酸洗浄ガラスビーズを例えばSigma-Aldrich(注文番号G8772)から入手することもできる。好ましくは、ビーズ、好ましくはガラスビーズは、約200〜1000mg/ml、好ましくは300〜900mg/ml、好ましくは400〜800mg/mlの範囲内の量で存在する。例えば、ビーズ、好ましくはガラスビーズは、約200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml、600mg/ml、700mg/ml、800mg/ml、900mg/ml、または1000mg/mlの量で存在し、最も好ましくは約550mg/mlの量で存在する。例えば、140mgのガラスビーズを250μlの溶解バッファーに加えることで、溶解バッファー中に560mg/mlのガラスビーズ量とすることができる(このようにガラスビーズの体積は考慮されない)。好ましくは、ビーズ(好ましくはガラスビーズ)は、ビーズ粉砕に適している。
ウシ型結核菌、M.ブランデリ(M. branderi)、M.ブリスバネンス(M. brisbanense)、M.ブルマエ(M. brumae)、M.カナリアセンス(M. canariasense)、M.カプラエ(M. caprae)、M.セラータム(M. celatum)、M.ケロナエ(M. chelonae)、M.キメラ(M. chimaera)、M.チタエ(M. chitae)、M.クロロフェノリカム(M. chlorophenolicum)、M.チュブエンス(M. chubuense)、M.コンセプショネンス(M. conceptionense)、M.コンフルエンティス(M. confluentis)、M.コンスピキュウム(M. conspicuum)、M.クッキイ(M. cookii)、M.コスメティカム(M. cosmeticum)、M.ディエルンホフェリ(M. diernhoferi)、M.ドリカム(M. doricum)、M.ドゥバリイ(M. duvalii)、M.エレファンティス(M. elephantis)、M.ファラックス(M. fallax)、M.ファルシノゲネス(M. farcinogenes)、M.フラベッセンス(M. flavescens)、M.フロレンティナム(M. florentinum)、M.フルオロアンテニボランス(M. fluoroanthenivorans)、M.ホルツイタム(M. fortuitum)、M.ホルツイタム亜種アセトアミドリティカム(M. fortuitum subsp. acetamidolyticum)、M.フレデリクスバーゲンス(M. frederiksbergense)、M.ガディウム(M. gadium)、M.ガストリ(M. gastri)、M.ゲナベンス(M. genavense)、M.ギルバム(M. gilvum)、M.グッディイ(M. goodii)、M.ゴードナエ(M. gordonae)、M.ヘモフィルム(M. haemophilum)、M.ハシアカム(M. hassiacum)、M.ヘッケスホルネンス(M. heckeshornense)、M.ハイデルベルゲンス(M. heidelbergense)、M.ヒベルニアエ(M. hiberniae)、M.ホドレリ(M. hodleri)、M.ホルサティカム(M. holsaticum)、M.ヒューストネンス(M. houstonense)、M.イムノゲナム(M. immunogenum)、M.インタージェクタム(M. interjectum)、M.インターメディウム(M. intermedium)、M.イントラセルラー(M. intracellular)、M.カンサシイ(M. kansasii)、M.コモセンス(M. komossense)、M.クビカエ(M. kubicae)、M.クマモトネンス(M. kumamotonense)、M.ラクス(M. lacus)、M.レンティフラバム(M. lentiflavum)、ライ菌(M. leprae)(これはハンセン病を引き起こす)、M.レプラムリウム(M. lepraemurium)、M.マダガスカリエンス(M. madagascariense)、M.マジェリテンス(M. mageritense)、M.マルモエンス(M. malmoense)、M.マリナム(M. marinum)、M.マッシリエンス(M. massiliense)、M.ミクロティ(M. microti)、M.モナセンス(M. monacense)、M.モンテフィオレンス(M. montefiorense)、M.モリオカエンス(M. moriokaense)、M.ムコゲニカム(M. mucogenicum)、M.ムラーレ(M. murale)、M.ネブラスケンス(M. nebraskense)、M.ネオアウラム(M. neoaurum)、M.ニューオルレアンセンス(M. neworleansense)、M.ノンクロモゲニカム(M. nonchromogenicum)、M.ノボカストレンス(M. novocastrense)、M.オブエンス(M. obuense)、M.パルストレ(M. palustre)、M.パラフォルトゥイタム(M. parafortuitum)、M.パラスクロフラセウム(M. parascrofulaceum)、M.パルメンス(M. parmense)、M.ペレグリナム(M. peregrinum)、M.フレイ(M. phlei)、M.フォカイクム(M. phocaicum)、M.ピンニペディイ(M. pinnipedii)、M.ポルシナム(M. porcinum)、M.ポリフェラエ(M. poriferae)、M.シュードショットシイ(M. pseudoshottsii)、M.プルベリス(M. pulveris)、M.サイクロトレランス(M. psychrotolerans)、M.ピレニボランス(M. pyrenivorans)、M.ローデシアエ(M. rhodesiae)、M.サスカチェワネンス(M. saskatchewanense)、M.スクロフラセウム(M. scrofulaceum)、M.セネガレンス(M. senegalense)、M.セオウレンス(M. seoulense)、M.セプティカム(M. septicum)、M.シモイデイ(M. shimoidei)、M.ショットシイ(M. shottsii)、M.シミアエ(M. simiae)、スメグマ菌(M. smegmatis)、M.スファグニ(M. sphagni)、M.スルガイ(M. szulgai)、M.テラエ(M. terrae)、M.サーモレジスティバイル(M. thermoresistibile)、M.トーカイエンス(M. tokaiense)、M.トリプレックス(M. triplex)、M.トリビアレ(M. triviale)、結核菌群(MTBC)(メンバーはヒトおよび動物の結核の原因因子である;この群の種には、ヒト結核の主要原因である結核菌、ウシ型結核菌、ウシ型結核菌BCG、M.アフリカヌム、M.カネッティ、M.カプラエ、M.ピンニペディイが含まれる)、M.ツシアエ(M. tusciae)、「ブルーリ(Buruli)」または「ベアンズデイル(Bairnsdale)」潰瘍を引き起こすM.ウルセランス(M. ulcerans)、M.ワクカエ(M. vaccae)、M.バンバアレニイ(M. vanbaalenii)、M.ウォリンスキイ(M. wolinskyi)、およびM.ゼノピ(M. xenopi)。
溶解チューブには140mg±20mgのガラスビーズ、230μl±5μlの溶解バッファーAL、10μl±2μlの1M DTTが入っている。チューブは15〜25℃の温度で貯蔵される。プロテイナーゼKはバッファーALとは接触させずに、別途、15〜25℃において、液状で、または(例えばスクリューキャップの内面上の)乾燥スポットとして貯蔵される。
本発明の方法は、混合機(ボルテックス)や加熱ブロックのような標準的実験機材を使って手作業で行うか、ビーズ粉砕機などの自動装置を使って自動化することができる。本発明の手動プロセスおよび自動プロセスの例を、それぞれ図1および2に示す。
試料投入
試料体積は220μl±10μlとした。試料およびプロテイナーゼKを溶解チューブに加えた後、試料と溶解バッファーの良好な均質化を保証するために、ボルテックスを使用するか、ビーズ粉砕機を高速(最大100g)で使用して、最大1分間、チューブを激しく混合した。試料の添加は層流下で行った。結核菌群による感染が疑われる場合は、96℃加熱ステップまでの全ての作業をS3実験室内で行った。一般に、試料の交差汚染を避けるために、フィルターチップも使用した。高粘度試料からのアリコートをピペッティングするには、開口部が広い、スラントカットされたフィルターチップの使用が推奨される。
プロテイナーゼK消化のために第1加熱ステップを56℃±1℃で10分間行った。第2加熱ステップは熱溶解のために96℃±1℃で15分間行った。完全な液状化を保証するために、このステップを、好ましくは、5分未満には短縮しない。感染リスクを低下させるためにこのステップを行うのであれば、最小の加熱継続時間については、さまざまな臨床状況において、法的要件が適用可能である場合がありうる。56℃インキュベーションステップと96℃インキュベーションステップの途中および間は、まだ液状化していない試料破片を分解するために、チューブを短時間混合するか、最大1分間、さまざまな速度で粉砕してもよい。
ビーズ粉砕は、粉砕と加熱を並行して行う能力を有するビーズ粉砕装置を使って行った。あるいは、ボルテックスを使って激しく混合することにより、試料を手作業で加工してもよい。短い粉砕ステップは、プロトコール全体を通して、ボルテックスを使って手作業で、またはビーズ粉砕装置を使って50〜100gで行うことができる。最終粉砕ステップは、96℃加熱ステップの完了後に室温で数分(5分)間行うか、好ましくは、溶解効率の改善とプロセス時間の短縮のために、ビーズ粉砕装置を使って、96℃加熱ステップ中に最大100gの力および数分(5分)の粉砕時間で行った。96℃でのインキュベーション時間が粉砕時間を超える場合は、プロセスの最後にもう一度短い粉砕ステップを行った。
チューブを溶解機から取り出す際に何らかの危険(火傷)がユーザーに及ぶことがないように、プロセスが終了した後に、溶解チューブを妥当な温度まで冷却した。
全てのピペッティングステップにフィルターチップを使用した。400μl±10μlの液状化上清を新しい1.5mlスクリューキャップチューブに移した。200μl±10μlの96%エタノールを上清に加え、チューブを短時間混合した。混合物(約600μl)をシリカメンブレンカラム(QiaAmp(商標))にローディングし、製造者の推奨に従って、遠心分離によって、または-800mbarまでの減圧によって加工した。
必要な試薬類を全て含有する調製済み溶解チューブとプロテイナーゼK(液状または乾燥のどちらか)は室温で貯蔵しておいた。新鮮患者試料を標準的臨床手順に従って集めた。試料のアリコート(220μl)を溶解チューブに移した。プロテイナーゼK(20μl)を加え、溶解チューブのスクリューキャップを硬く閉じた。粘液状試料のアリコートの移動には、スラントカットされた1000μlピペットチップを使用した。
試料タイプの相違を平均スコアに基づいて記述するために、起源の異なる76の試料(呼吸器試料および他の関連試料、例えば穿刺液およびドレナージ液)を、粘度、血液および沈渣含有量についてスコア化した(図3)。各タイプについて、含まれる試料の数を括弧内に示す。血液を含む各試料タイプから、呼吸器疾患用の関連試料の全てが網羅されるように、参考資料を選択した(合計12試料)。
二セット目の実験では、プロテイナーゼK、加熱、粉砕および並行加熱/粉砕の影響を、気管分泌物で調べた。特に、高い粘度および/または沈渣を有する試料を選択した。そのような試料は、溶解することが困難であると思われる。第1ステップでは、溶解バッファー(プロテイナーゼKなし)に添加して短時間混合した後、そのまま、試料を96℃で15分間インキュベートした。ビーズ粉砕は96℃インキュベーションステップの完了後に室温で5分間行うか[M]、または加熱ステップと並行して行った。溶解の進行を経時的にモニターした。次に、溶解上清をエタノールと混合し、上述のようにシリカメンブレンに適用した。4000rpmから出発して遠心力を増しながら、フロースルーをモニターした。図6Aおよび6Bは、異なる試料で観察されたばらつきを反映するそれぞれ2つの例を表す。
プロテイナーゼK消化ステップを含めて(56℃で10分)、実施例3で使用したものと同じ試料のアリコートを、実施例3について説明したように溶解し、モニターした。
起源が異なる7つの患者試料に緑膿菌(20000病原体/ml=4400病原体/220μl使用試料)をスパイクし、上記実施例1で説明し図1に示す手動プロトコールを使って溶解した。遠心分離機を使ってQiaAmp(商標)DNA血液キットでDNAを単離した。スパイクした患者試料から単離されたDNAの品質を、5倍希釈した溶出物のスペクトル分析(220〜320nm)でモニターした(図8)。
上記実施例1で説明し図1に記載する手動溶解プロトコールを使って、27の患者試料を加工した。一般的な呼吸器病原体(クレブシエラ・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ニューモニエ、インフルエンザ菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌、および宿主フローラの指標としてのストレプトコッカス属)を検出するために、シリカメンブレン精製DNAを、マルチプレックスPCRを使って分析した。簡単に述べると、3μlのDNA溶出物を、マルチプレックスプライマー(それぞれ最終濃度350nM)と共にマルチプレックスPCRキット(Qiagen)で、30μlの総液量中、35サイクルにわたって増幅した。Agilent Bioanalyzerを使ってアンプリコンモル濃度を決定した(図11)。
溶解プロセスの全自動化のための装置を開発し、微生物学的培養で結果が陽性であった臨床試料に「プロセス例B」(図2)を適用することによって、成績を調べた。結果を手動溶解プロトコール(図1)と比較した。この試験には粘度の高い気管分泌物を選択した。溶解物からのDNAの単離は上述のようにシリカメンブレンを使って行い、溶出物に対して、シュードモナス特異的プライマー、スタフィロコッカス特異的プライマー、およびカンジダ特異的プライマーでトリプレックスPCRを行った(図13)。
Claims (17)
- (i)少なくとも1つのカオトロピック剤、
(ii)少なくとも1つの還元剤、および
(iii)少なくとも1つのタンパク質分解酵素
を含む、溶解バッファー。 - さらにビーズ、好ましくは固形不活性材料、例えばガラス、セラミクス、プラスチック、または鋼などの金属でできているものを含む、請求項1に記載の溶解バッファー。
- 呼吸器疾患の診断に関係する身体試料の溶解に汎用することができる、請求項1または2に記載の溶解バッファー。
- 少なくとも1つのカオトロピック剤が、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、グアニジニウム塩酸塩、塩化グアニジニウム、チオシアン酸アルカリ、イソチオシアン酸アルカリ、ヨウ化アルカリ、およびアルカリ過塩素酸からなる群より選択され、かつ/または少なくとも1つの還元剤が、ジチオスレイトール(DTT)、N-アセチル-システイン(NALC)、β-メルカプトエタノール、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、およびチオレドキシンからなる群より選択され、かつ/または
、少なくとも1つのタンパク質分解酵素が、セリンプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼからなる群より選択され、好ましくは少なくとも1つのタンパク質分解酵素がプロテイナーゼK、エラスターゼ、サブチリシン、およびカスパーゼからなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の溶解バッファー。 - 前記少なくとも1つのタンパク質分解酵素以外に他の酵素を含有しない、請求項1〜4のいずれか一項に記載の溶解バッファー。
- 広範な身体試料を溶解するための
(i)少なくとも1つのカオトロピック剤、
(ii)少なくとも1つの還元剤、および
(iii)少なくとも1つのタンパク質分解酵素
の使用。 - 身体試料を加工するための方法であって、(i)加工すべき身体試料、少なくとも1つのカオトロピック剤、少なくとも1つの還元剤、少なくとも1つのタンパク質分解酵素を含む混合物を用意するステップを含み、好ましくはさらに(ii)混合物を第1温度まで加熱するステップを含み、かつ/または好ましくはさらに(iii)混合物を第2温度まで加熱するステップを含み、かつ/または好ましくはさらに(iv)混合物をビーズ粉砕するステップを含む方法。
- ステップ(iv)が、ステップ(iii)と同時に行われるか、ステップ(iii)中に行われる、請求項7に記載の方法。
- ステップ(ii)〜(iv)が自動プロセスで行われる、請求項7または8に記載の方法。
- さらに(v)混合物から核酸を、好ましくはシリカベースまたは磁気ビーズベースの核酸単離技術を使って、単離するステップを含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 身体試料を分析するための方法であって、請求項7〜10のいずれか一項に記載の方法に従って身体試料を加工すること、および(vi)混合物を核酸増幅/分析方法に適用することを含む方法。
- 身体試料中の病原体の存在を検出するための方法であって、請求項7〜10のいずれか一項に記載の方法に従って身体試料を加工すること、および(vi)混合物を該病原体の検出に適した核酸増幅/分析方法に適用することを含み、好ましくは病原体が呼吸器疾患に関連する方法。
- 対象における呼吸器疾患を診断するための方法であって、請求項7〜10のいずれか一項に記載の方法に従って身体試料を加工すること、および(vi)呼吸器疾患を診断するのに適した方法に混合物を適用することを含み、好ましくは呼吸器疾患が感染性呼吸器疾患または呼吸器腫瘍である方法。
- 異なるタイプの身体試料である少なくとも2つの身体試料を加工するための方法であって、前記少なくとも2つの身体試料のそれぞれを、請求項7〜10のいずれか一項に記載の方法に従って加工することを含む方法。
- 身体試料、少なくとも1つのカオトロピック剤、少なくとも1つの還元剤、および少なくとも1つのタンパク質分解酵素を含む、身体試料の溶解物。
- 請求項7〜10のいずれか一項に記載の方法に従って身体試料を加工することによって得ることができる溶解物。
- (i)カオトロピック剤、
(ii)還元剤、
(iii)タンパク質分解酵素、および
(iv)身体試料の加工に関する説明書
を含むキット。
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