ES2637589T3 - Solución reguladora de lisis de aplicación universal y métodos de procedimiento para la lisis de muestras corporales - Google Patents

Abstract

Uso de una solución reguladora que comprende: (i) al menos un agente caotrópico, (ii) al menos un agente reductor, y (iii) al menos una enzima proteolítica para el procedimiento de una muestra respiratoria, en la que el procedimiento comprende la lisis y licuefacción de dicha muestra respiratoria, y en la que dicha muestra respiratoria se selecciona del grupo que consiste en esputo, pus de la cavidad paranasal, secreción bronquial, secreción traqueal, secreción endotraqueal, aspirado bronquial, aspirado traqueal, aspirado endotraqueal, lavado bronquial, lavado broncoalveolar, hisopado bronquial, hisopado nasofaríngeo, hisopado laríngeo y biopsia pulmonar.

Description

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DESCRIPCION

Solucion reguladora de lisis de aplicacion universal y metodos de procedimiento para la lisis de muestras corporales Campo tecnico de la invencion

La invencion se refiere al uso de una solucion reguladora de aplicacion universal para el procedimiento de una muestra respiratoria, en el que el procedimiento comprende lisis y licuefaccion de dicha muestra respiratoria y un metodo de procedimiento para la lisis y licuefaccion de una muestra respiratoria que es relevante para el diagnostico de enfermedades respiratorias. Dicha muestra respiratoria se selecciona del grupo consistente en esputo, pus de la cavidad paranasal, secrecion bronquial, secrecion traqueal, secrecion endotraqueal, aspirado bronquial, aspirado traqueal, aspirado endotraqueal, lavado bronquial, lavado broncoalveolar, hisopado bronquial, hisopado nasofarmgeo, hisopado larmgeo y biopsia pulmonar.

Antecedentes de la invencion

Las tecnicas moleculares, en particular los analisis de acidos nucleicos ganan cada vez mas importancia en el campo del diagnostico. En particular, los diagnosticos moleculares en el campo de las enfermedades respiratorias, tales como neumoma o tuberculosis, a menudo requieren el analisis de muestras corporales tales como fluidos corporales que son muy diversos en su apariencia, por ejemplo, secreciones de sangre, esputo y traqueal. Hasta la fecha, cada tipo de muestra requiere una solucion reguladora de lisis diferente, metodo de procedimiento y un procedimiento de lisis que a menudo no son transferibles a otros tipos de muestras. Hasta la fecha no se ha publicado ningun protocolo que abarque todos los tipos de muestras relevantes para el diagnostico molecular de enfermedades respiratorias, por ejemplo, neumoma. De este modo, actualmente no es posible utilizar un protocolo de rutina estandarizado y facil de usar para todos los tipos de muestras relevantes para el diagnostico de pacientes con neumoma. De este modo, se desean soluciones reguladoras de lisis y metodos de procedimiento que son de aplicacion universal a una amplia variedad de muestras corporales, en particular, muestras que son relevantes para el diagnostico de enfermedades respiratorias, tales como neumoma.

Es particularmente importante que los pacientes con infecciones agudas graves de las vfas respiratorias identifiquen rapidamente patogenos causantes y factores de riesgo concomitantes, tales como resistencias a farmacos, para permitir un cambio de la terapia antibiotica de banda ancha inicial a una terapia personalizada dirigida espedficamente a patogenos causantes con sus resistencias a los farmacos identificados. Las directrices internacionales para los subtipos de neumoma grave, tal como la neumoma adquirida en el hospital, adquirida por el ventilador o asociada al cuidado de la salud, se recomiendan fuertemente la identificacion de ciertos patogenos de riesgo (por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa) o factores de riesgo para las resistencias a multiples farmacos (por ejemplo, mecA) que tienen un impacto significativo en el diseno del regimen de antibioticos.

Los enfoques diagnosticos utilizados hasta la fecha para las enfermedades respiratorias, por ejemplo, radiograffa de torax, baciloscopia, examen ffsico, o pruebas de cultivo microbiano, por ejemplo, de cultivos de esputo, cultivos de muestras broncoscopicas, o hemocultivos, a menudo no son apropiados para identificar patogenos o factores de riesgo y/o tienen eficiencias muy bajas. De este modo, hasta la fecha, no existe un metodo de deteccion eficaz que este apoyado por estudios clmicos validados para el diagnostico de neumoma. Como consecuencia, las pautas de neumoma no recomiendan ningun metodo de diagnostico como un metodo de referencia. Mas bien, se utiliza una combinacion de diferentes metodos de diagnostico que cubren diferentes muestras, basandose en la experiencia y experiencia del medico que lo atiende. En este contexto, se utilizan varias muestras respiratorias, asf como no respiratorias para el diagnostico. Por ejemplo, los hemocultivos se utilizan como indicadores de bacteriemia o punciones pleurales como indicadores del empiema, lo que conduce a un alto riesgo de mortalidad para los pacientes con neumoma.

Por ejemplo, el documento US 2003/215845 A1 se refiere a la extraccion selectiva de ADN a partir de grupos de celulas. El documento WO 2005/010186 A1 describe un metodo para el diagnostico de la tuberculosis mediante baciloscopia, cultivo y reaccion en cadena de la polimerasa usando muestras clmicas procesada y un kit de los mismos. El documento KR 20090110969 A describe una solucion de soporte para el diagnostico de tuberculosis y cancer de pulmon.

Las muestras que son relevantes para el diagnostico de enfermedades respiratorias son generalmente diffciles de manejar. Estas muestras abarcan esputo, pus, lfquido pleural, aspirado gastrico, aspirado endotraqueal, aspirado transtraqueal, lavado broncoalveolar, hisopado larmgeo, hisopos nasofarmgeos y otros que son generalmente mezclas no homogeneas de muchos componentes diferentes de diferentes comportamientos qmmicos y ffsicos. Generalmente, tales muestras son altamente viscosas e incluso muestras del mismo tipo difieren enormemente en su composicion. Sin embargo, la accesibilidad y la lisis de patogenos inflamatorios pueden ser menos eficientes si estan atrapadas en un medio solido y viscoso.

Todos los metodos de diagnostico utilizados hasta ahora para detectar patogenos en muestras de las vfas respiratorias requieren un procedimiento de muestras laborioso para descontaminacion y licuefaccion usando una combinacion de enzimas tales como proteasas, lipasas, ADNasas o glicosidasas, detergentes, agentes caotropicos,

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agentes quelantes y agentes reductores, entre otros. Sin embargo, algunos de estos agentes tales como SDS son inhibidores conocidos de los metodos de amplificacion y analisis de acidos nucleicos. Ademas, debido al alto riesgo de infeccion, cualquier procedimiento de muestras sospechosas de tuberculosis requiere un ambiente S3 con flujo laminar certificado y medidas de proteccion extensivas para excluir cualquier exposicion del personal a bacterias vivas. De este modo, para pruebas moleculares sena ventajoso utilizar muestras corporales directamente para el diagnostico de acidos nucleicos y eludir los procedimientos de descontaminacion y licuefaccion intensivos de manipulacion.

De este modo, el diagnostico molecular en las enfermedades respiratorias es actualmente largo, laborioso, propenso a errores y asociado con un alto riesgo de contaminacion. Ademas, dado que cada tipo de muestra requiere un procedimiento de manipulacion diferente, no es posible el procedimiento en un entorno de alto rendimiento.

Por lo tanto, el objetivo de la presente invencion es proporcionar una solucion reguladora de lisis y un metodo de procedimiento simple que sean de aplicacion universal para la lisis de una variedad de diferentes tipos de muestras, tales como muestras corporales relevantes para el diagnostico de enfermedades respiratorias, y que reducen la necesidad de una manipulacion intensiva de las muestras y, de este modo, reducen el riesgo de contaminacion y permiten el diagnostico molecular en un entorno de alto rendimiento.

Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que una solucion reguladora de lisis que contiene como unico ingrediente activo un agente caotropico, un agente reductor y una proteasa es de aplicacion universal para la lisis de muestras corporales, en particular, de muestras corporales que son relevantes para el diagnostico de enfermedades respiratorias. De este modo, la solucion reguladora de lisis descrita en este documento es de aplicacion universal, por ejemplo, para la lisis de jugos gastricos y muestras de esputo o secrecion traqueal, que son muy diferentes en sus composiciones.

Ademas, los presentes inventores han desarrollado un metodo de procedimiento, que es facil y seguro de llevar a cabo, de aplicacion universal, automatizable, aplicable en un entorno de alto rendimiento, y que no requiere ningun pretratamiento de descontaminacion o licuefaccion demorado y laborioso de las muestras. En particular, el metodo de procedimiento de la presente invencion permite realizar el procedimiento completo de lisis de una muestra corporal en un solo tubo de reaccion, sin necesidad de centrifugacion y transferencia de muestras o etapas de pipeteado, reduciendo sustancialmente el trabajo requerido y el riesgo de contaminacion. El lisado resultante del metodo de procedimiento de acuerdo con la presente invencion se puede transferir directamente a procedimientos de aislamiento de acidos nucleicos, por ejemplo, basados en membranas de silica, perlas de silica o tecnologfa de perlas magneticas, sin necesidad de otros metodos de purificacion de acidos nucleicos tales como extraccion o precipitacion con fenol-cloroformo. De este modo, los lisados son, por ejemplo, apropiados para la transferencia directa a una columna de aislamiento de ADN QiaAmpTM sin obstruccion significativa de la columna, lo que no se esperaba, en particular, para las muestras altamente viscosas de las vfas respiratorias.

Resumen de la invencion

En un aspecto, la presente invencion proporciona el uso de una solucion reguladora que comprende (i) al menos un agente caotropico, (ii) al menos un agente reductor, y (iii) al menos una enzima proteolftica para el procedimiento de una muestra respiratoria, en la que el procedimiento comprende la lisis y licuefaccion de dicha muestra respiratoria, y en la que dicha muestra respiratoria se selecciona del grupo que consiste en esputo, pus de la cavidad paranasal, secrecion bronquial, secrecion traqueal, secrecion endotraqueal, aspirado bronquial, aspirado traqueal, aspirado endotraqueal, lavado bronquial, lavado broncoalveolar, hisopado bronquial, hisopado nasofarmgeo, hisopado larmgeo y biopsia pulmonar. Preferiblemente, la solucion reguladora comprende ademas perlas. Preferiblemente, la solucion reguladora es de aplicacion universal para el procedimiento de muestras respiratorias que son relevantes para el diagnostico de una enfermedad respiratoria.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo de procedimiento de una muestra respiratoria, en la que el procedimiento comprende la lisis y licuefaccion de dicha muestra respiratoria, dicho metodo que comprende la etapa de (i) poner en contacto la muestra respiratoria que se va a tratar con al menos un agente caotropico, al menos un agente reductor, y al menos una enzima proteolftica, y la mezcla de la muestra respiratoria, el al menos un agente caotropico, el al menos un agente reductor y la al menos una enzima proteolftica, en la que la muestra respiratoria se selecciona del grupo que consiste en esputo, pus de la cavidad paranasal, secrecion bronquial, secrecion traqueal, secrecion endotraqueal, aspirado bronquial, aspirado traqueal, aspirado endotraqueal, lavado bronquial, lavado broncoalveolar, hisopado bronquial, hisopado nasofarmgeo, hisopado larmgeo y biopsia pulmonar. Preferiblemente, el metodo comprende ademas la etapa de (ii) calentar la mezcla a una primera temperatura, preferiblemente a una temperatura a la que la enzima proteolftica es activa. Preferiblemente, el metodo comprende ademas la etapa de (iii) calentar la mezcla a una segunda temperatura, preferiblemente a al menos 80°C. Preferiblemente, el metodo comprende ademas la etapa de (iv) molienda con perlas de la mezcla. En una realizacion preferida, la molienda con perlas de la etapa (iv) se realiza en paralelo a la etapa de calentamiento (iii). En una realizacion preferida, las etapas (ii) a (iv), preferiblemente las etapas (i)(b) a (iv) del metodo de acuerdo con la presente invencion, se llevan a cabo en un procedimiento automatizado. En una realizacion preferida, el metodo comprende ademas la etapa de (v) aislar un acido nucleico de la mezcla.

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En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo de analisis de una muestra respiratoria que comprende el procedimiento de la muestra respiratoria de acuerdo con el metodo de la presente invencion para el procedimiento de una muestra respiratoria y (vi) aplicar la mezcla a un metodo de amplificacion/analisis de acido nucleico.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo de deteccion de la presencia de un patogeno en una muestra respiratoria que comprende el procedimiento de la muestra respiratoria de acuerdo con el metodo de la presente invencion para el procedimiento de una muestra respiratoria y (vi) aplicar la mezcla a un metodo de amplificacion/analisis de acido nucleico que es apropiado para la deteccion de dicho patogeno. Preferiblemente, dicho patogeno esta asociado con una enfermedad respiratoria.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona un metodo de diagnostico de una enfermedad respiratoria, tal como neumoma, tuberculosis, bronquitis, o infecciones patogenas durante la fibrosis qmstica o enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD), o un tumor del sistema respiratorio, en un sujeto que comprende el procedimiento de una muestra respiratoria de acuerdo con el metodo de la presente invencion para el procedimiento de una muestra respiratoria y (vi) aplicar la mezcla a un metodo que es apropiado para diagnosticar la enfermedad respiratoria.

Preferiblemente, los metodos de acuerdo con la presente invencion son de aplicacion universal a diferentes tipos de muestras respiratorias, preferiblemente a diferentes tipos de muestras respiratorias relevantes para el diagnostico de una enfermedad respiratoria, y de este modo, los metodos de acuerdo con la presente invencion preferiblemente son apropiados para ser aplicados en un entorno de alto rendimiento a una variedad de diferentes tipos de muestras.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo de procedimiento de al menos dos muestras respiratorias que comprenden el procedimiento de cada una de las al menos dos muestras respiratorias de acuerdo con el metodo de la presente invencion para el procedimiento de una muestra respiratoria, en la que las al menos dos muestras respiratorias son diferentes tipos de muestras respiratorias.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: Ejemplo de un metodo de lisis manual que utiliza la solucion reguladora de lisis de acuerdo con la invencion.

El ejemplo A del procedimiento es un procedimiento manual que utiliza un agitador tipo vortex estandar para mezclar a 2500 rpm (velocidad maxima estandar para un agitador tipo vortex IKA, los dispositivos de otros proveedores pueden variar) durante 30 segundos (otras veces podna funcionar tambien), bloques de calentamiento precalentados y un dispositivo de molienda capaz de alcanzar una velocidad de molienda de aprox. 100 g (otras velocidades pueden funcionar tambien, y la velocidad puede variar para otros dispositivos con geometna diferente). Observese que para todas las etapas de mezcla/molienda los tubos se retiran del bloque de calentamiento y se procesan a temperatura ambiente.

Figura 2: Ejemplo de un metodo de lisis automatizado que utiliza la solucion reguladora de lisis de acuerdo con la invencion.

El ejemplo B de procedimiento es un procedimiento automatizado que utiliza un dispositivo de molienda con perlas que realiza todas las etapas del procedimiento (mezcla, calentamiento, molienda). Las velocidades de molienda se relacionan con fuerzas entre 50-100 g dependiendo de las geometnas del dispositivo. A medida que los tubos se calientan junto con las camaras a las temperaturas objetivo, en este ejemplo se incluyen mayores velocidades de rampa, aun, los tiempos de rampa no son cnticos y tambien pueden ser considerablemente mas cortas.

Figura 3: Composicion de muestras de diferentes tipos de muestras corporales.

Se puntuaron 76 muestras de diferentes ongenes (muestras respiratorias y otras relevantes, como puntas y drenajes) para determinar la viscosidad, la sangre, y el contenido de sedimentos para describir las diferencias de los tipos de muestra basandose en una puntuacion promedio.

Figura 4: Realizacion de procedimientos de lisis con diferentes tipos de muestras corporales.

El numero de muestras procesadas para cada tipo de muestra se indica entre parentesis. De cada tipo de muestra, incluida la sangre, se seleccionaron muestras de referencia para cubrir toda la gama de muestras pertinentes para enfermedades respiratorias (total: 12 muestras). Cada una de estas muestras se sometio a tres protocolos de lisis diferentes: (a) protocolo de lisis completo manual como se muestra en la figura 1 y descrito en el ejemplo 1 (protocolo de lisis completo), (b) protocolo de lisis completo sin adicion de proteinasa K, (c) protocolo de lisis sin segunda etapa de calentamiento (96°C), en su lugar las muestras se incubaron a temperatura ambiente. Todas las muestras se han sometido a una etapa final de molienda con perlas de cinco minutos como se describe en el ejemplo 1 (protocolo de lisis completo), el lisado se transfirio entonces, se mezclo con etanol y se aplico a una columna de membrana de silica (QiaAmpTM, Qiagen). Las eficiencias de lisis se puntuaron tras la digestion con proteinasa K (primera etapa de calentamiento), la segunda etapa de calentamiento (96°C) y la molienda con perlas.

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Ademas, se controlo la turbidez de los sobrenadantes. El flujo directo despues de la aplicacion del lisado a las membranas de s^lica se controlo usando una centnfuga a velocidad reducida (4000 rpm en lugar de 8000 rpm recomendadas). Se examino la membrana de silica para detectar colorantes o componentes de muestra restantes que podnan indicar una lisis insuficiente.

Figura 5: Ejemplos tipicos de muestras de pacientes lisadas usando el metodo de lisis manual de acuerdo con la presente invencion.

Las muestras lisadas son tambien tfpicas para el protocolo automatizado.

A/B: esputos, C: secrecion traqueal.

Figura 6: Impacto de la molienda con perlas y el calentamiento en la lisis de las muestras de secrecion traqueal (sin digestion de proteinasa K).

En una primera etapa, las muestras se incubaron a 96°C durante 15 minutos directamente despues de la adicion de la solucion reguladora de lisis y de la mezcla corta. La molienda con perlas se realizo durante 5 minutos ya sea durante la etapa de calentamiento (96°C) o a temperatura ambiente despues de completar la etapa de incubacion a 96°C [M]. El progreso de la lisis se controlo a lo largo del tiempo basandose en la puntuacion de lisis (puntuacion de lisis 0: no o solo insuficientemente lisada, grupos de mucosas todavfa presentes, puntuacion de lisis 1: lisado parcial, agrupaciones menores todavfa presentes, puntuacion de lisis 2: casi completamente lisado, aun algunos trozos sin lisar presentes; puntuacion de lisis 3: lisado completo). Los sobrenadantes lisados se aplicaron a membranas de silica esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El flujo directo se controlo al aumentar las fuerzas centnfugas comenzando a 4000 rpm. Las figuras 6A y 6B muestran cada una dos ejemplos de muestras de secrecion traqueal que reflejan la variabilidad de muestras del mismo tipo.

Figura 7: Impacto de la digestion de proteinasa K en la lisis de muestras de secrecion traqueal.

El protocolo de lisis se realizo como se describe para la figura 6 con la adicion de una digestion de proteinasa K antes de la etapa de calentamiento (96°C) usando la misma muestra que en la figura 6. Para la digestion de proteinasa K, se adicionaron 20 |il de proteinasa K Qiagen (20 mg/ml) a las muestras con solucion reguladora de lisis y las muestras se incubaron a 56°C, durante 10 minutos. La eficacia de la lisis se puntuo como se describe para la figura 6. Las figuras 7A y 7B muestran cada una dos ejemplos de muestras de secrecion traqueal.

Figura 8: Calidad del ADN de los ADN purificados de diferentes tipos de muestras corporales.

Siete muestras de pacientes de diferentes ongenes se reforzaron con Pseudomonas aeruginosa (20000 patogenos/ml = 4400 patogenos/220 |il de muestra utilizada) y se lisaron usando el protocolo manual como se describe en la figura 1 y el ejemplo 1 (protocolo de lisis completo). El ADN se purifico con el Kit de sangre de ADN QuiaAmp usando una centnfuga y se eluyo en 200 |il de agua. La calidad del ADN aislado purificado a partir de muestras reforzadas se controlo mediante analisis espectral del eluido diluido 5 veces (220-320 nm). BAL: lavado broncoalveolar.

Figura 9: Prueba de inhibicion de PCR de muestras seleccionadas.

La copurificacion putativa de los inhibidores de PCR se probo mediante una prueba de inhibicion de PCR para los eluatos descritos en la figura 8. Para pruebas de inhibicion, se adicionan 3 |il de un eluato de ADN a una PCR de 30 |il que contiene una plantilla no relacionada con una mezcla de cebadores correspondiente. En ausencia de cualquier efecto inhibidor, estos cebadores generan varios amplicones de molaridades conocidas. Una disminucion significativa de molaridades de amplicon indicana inhibicion. Para los controles, se utilizaron eluatos generados a partir de solucion salina regulada con fosfato (PBS). Para evaluar la eficacia de PCR y determinar la presencia de inhibidores de PCR, se han comparado las molaridades de los amplicones generados en presencia del ADN aislado de los lisados con las molaridades de los amplicones generados por los PCR de control (control: n = 4).

Figura 10: Eficacia de PCR del ADN aislado (PCR de P. aeruginosa).

Las PCR espedficas para P. aeruginosa se han realizado usando ADN aislado de lisados de diferentes muestras corporales como se describe en la figura 8. La figura 10 muestra las molaridades de amplicon y los rendimientos de ADN de las diferentes PCR.

Figura 11: Resultados de PCR de muestras de pacientes procesadas de acuerdo con el metodo de la presente invencion.

Se han procesado 27 muestras de pacientes usando el protocolo de lisis manual como se describe en la figura 1 y el ejemplo 1 (protocolo de lisis completo). Se analizo el ADN purificado con membrana de silica con PCR multiple que detecta patogenos indicativos de enfermedades respiratorias Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, y especie

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Streptococcus como indicador de flora huesped). Las molaridades de amplicon se han determinado usando un bioanalizador Agilent.

Figura 12: Comparacion de los resultados de PCR con datos de pruebas de cultivo microbiologico.

Los resultados de la PCR mostrados en la figura 11 se han comparado con los datos derivados de las pruebas de cultivo microbiologico realizadas para las mismas muestras que se muestran en la figura 11. Para cinco muestras se identifico un genero patogeno mediante cultivo microbiologico, sin embargo, para la mayona de las muestras el cultivo microbiologico no dio lugar a la identificacion de los patogenos en un nivel de genero. Los resultados obtenidos por los ensayos de cultivo microbiologico han sido confirmados por la prueba de PCR. Los cebadores de Haemophilus utilizados en esta prueba no discriminan entre las especies influenzae y parainfluenzae. En general, la PCR permitio la deteccion e identificacion de patogenos en mas muestras que las pruebas de cultivo microbiologico.

Figura 13: Comparacion de lisis manual y automatizada con muestras clmicas.

Se ha desarrollado un dispositivo para la automatizacion completa del procedimiento de lisis y se probo el rendimiento de acuerdo con el "ejemplo B de procedimiento" (Figura 2 y Ejemplo 1, protocolo de lisis completo, procedimiento automatizado) y se comparo con el protocolo de lisis manual (Figura 1 y Ejemplo 1, protocolo de lisis completo, procedimiento manual) usando muestras clmicas que han sido probadas positivas mediante pruebas de cultivo microbiologico como se indica en el panel inferior. Se han seleccionado secreciones traqueales con altas viscosidades para esta prueba. El ADN aislado de los lisados usando membranas de silica, se ha aplicado a la PCR triple usando cebadores espedficos para Pseudomonas-, Staphylococcus-, y Candida-.

Figura 14: Comparacion de lisis manual y automatizada usando muestras clmicas reforzadas.

Para excluir cualquier efecto de congelacion y descongelacion de la muestra en la lisis de patogenos, se reforzo un segundo conjunto de muestras con Pseudomonas aeruginosa (gramnegativo) y Staphylococcus aureus (grampositivo) a 20000 patogenos/ml y se procesaron con el protocolo manual o automatizado. El aislamiento del ADN y la PCR se ha realizado como se describe en la figura 13.

Descripcion detallada de la invencion

Aunque la presente invencion se describe con detalle mas adelante, se debe entender que esta invencion no se limita a las metodologfas, protocolos y reactivos particulares descritos en este documento, ya que pueden variar. Tambien se debe entender que la terminologfa usada en este documento es con el proposito de describir unicamente realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invencion que estara limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en este documento tienen los mismos significados que comunmente entienden por un experto en el arte.

A continuacion, se describiran los elementos de la presente invencion. Estos elementos se enumeran con realizaciones espedficas, sin embargo, se debe entender que se pueden combinar de cualquier manera y en cualquier numero para crear realizaciones adicionales. Los ejemplos descritos de manera diferente y las realizaciones preferidas no deben ser interpretados como limitando la presente invencion solamente a las realizaciones explfcitamente descritas. Esta descripcion se debe entender como soporte y abarca realizaciones que combinan las realizaciones explfcitamente descritas con cualquier numero de los elementos divulgados y/o preferidos. Ademas, cualquier permutacion y combinacion de todos los elementos descritos en esta solicitud se debe considerar divulgada por la descripcion de la presente solicitud a menos que el contexto indique lo contrario. Por ejemplo, si en una realizacion preferida el agente caotropico de la solucion reguladora de lisis descrita en este documento es clorhidrato de guanidinio y en otra realizacion preferida el agente reductor de la solucion reguladora de lisis descrita en este documento es ditiotreitol, es una realizacion preferida que el clorhidrato de guanidinio y el ditiotreitol estan presentes en la solucion reguladora de lisis descrita en este documento.

Preferiblemente, los terminos usados en este documento se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza, (1995).

La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique lo contrario, metodos convencionales de qmmica, bioqmmica y tecnicas de ADN recombinante que se explican en la bibliograffa en el campo (vease, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

A lo largo de esta memoria descriptiva y de las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo exija de otro modo, la palabra "comprenden" y las variaciones, tales como "comprende" y "que comprende", se entendera que implica la inclusion de un miembro, un numero entero o un escalon o grupo de miembros, enteros o etapas, pero no la exclusion de ningun otro miembro indicado, numero entero o etapa o grupo de miembros, numeros enteros o etapas. El termino "comprender" tambien abarca los terminos "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Como se usa en esta memoria descriptiva y en las

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reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Definiciones

Un "solucion reguladora de lisis" en el contexto de la presente invencion es apropiado para la lisis de celulas con el fin de analizar el contenido de las celulas, tal como el analisis de los acidos nucleicos contenidos en las celulas. Preferiblemente, la solucion reguladora de lisis descrita en este documento es apropiada para la lisis de celulas de mamftero y/o celulas microbianas, tales como celulas bacterianas y de levadura. De este modo, la solucion reguladora de lisis descrita en este documento es preferiblemente apropiada para la lisis de bacterias de una familia seleccionada del grupo que consiste en Mycobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Mycoplasmataceae, Chlamydiaceae, Enterobacteriaceae, Staphylococcaceae, Streptococcaceae, Xantomonadaceae, Moraxellaceae, Legionellaceae, Burkholderiaceae, Corynebacteriaceae, Neisseriaceae, Bacteroides, y Pasteurellaceae, y para la lisis de levaduras de una familia seleccionada del grupo que consiste en Saccharomycetaceae, Sporidiobolaceae, Trichocomaceae, y Pneumocystidaceae.. Las propiedades lfticas de la solucion reguladora de lisis descrita en este documento pueden requerir etapas de procedimiento tales como calentamiento de la muestra que se va a lisar en dicha solucion reguladora de lisis o molienda con perlas. Las etapas de procedimiento pueden depender del tipo de celulas que se va a lisar y del tipo de muestra en las que estan contenidas. Preferiblemente, la solucion reguladora de lisis descrita en este documento es una solucion reguladora de lisis acuosa, esto es, una solucion reguladora de lisis basada en agua. De este modo, una solucion reguladora de lisis que, por ejemplo, consiste en (i) al menos un agente caotropico, (ii) al menos un agente reductor, y (iii) al menos una enzima proteolftica significa que dicha solucion reguladora de lisis tambien puede contener agua y opcionalmente componentes de la solucion reguladora, por ejemplo, para ajustar el pH de la solucion reguladora de lisis.

El termino "agente caotropico" se refiere a un agente que altera la estructura tridimensional de macromoleculas tales como protemas, ADN o ARN y las desnaturaliza. Los agentes caotropicos interfieren con la estabilizacion de interacciones intramoleculares mediadas por fuerzas no covalentes tales como enlaces de hidrogeno, fuerzas de van der Waals, y efectos hidrofobos. Los iones caotropicos son, por ejemplo, guanidinio, bario, tiocianato, yoduro y perclorato, segun la denominada serie de Hofmeister (cationes: NH4+ > Rb+ > K+ > Na+ > Cs+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ > Ba2+ > guanidinio; aniones: PO43- > SO42- > HPO42- > acetato > citrato> tartrato> Cl-> Br-> NO3-> ClO3-> ClO4-> I-> SCN-). En la serie de Hofmeister, los cationes y aniones de la izquierda se dice que son "kosmotropicos" (o anticaotropico) y aumentar la fuerza de las interacciones hiodrofobas. Los iones de la derecha son "caotropicos" y tienden a debilitar las interacciones hiodrofobas. Para todos los aspectos de la invencion, el agente caotropico contiene al menos un cation de la serie de Hofmeister que esta mas a la derecha en la serie que el calcio o al menos un anion de la serie de Hofmeister que esta mas a la derecha en la serie que el anion clorato (CO3-). Por ejemplo, el agente caotropico en el contexto de la presente invencion puede contener uno de los siguientes: bario, guanidinio, perclorato, yoduro, tiocianato o isotiocianato. Por ejemplo, el agente caotropico en el contexto de todos los aspectos de la presente invencion puede ser tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, clorhidrato de guanidinio, cloruro de guanidinio, tiocianato de alcali, isotiocianato de alcali, yoduro de alcali, o perclorato de alcali. En este contexto, el ion alcali es preferiblemente potasio o sodio.

Un "agente reductor" en el contexto de la presente invencion es cualquier agente que sea capaz de romper un enlace disulfuro en o dentro de macromoleculas tales como protemas. Para todos los aspectos de la presente invencion, el agente reductor puede ser ditiotreitol (DTT), N-acetilcistema (NALC), beta-mercaptoetanol, Tris(2- Carboxietil) fosfina (TCEP) o tiorredoxina. Preferiblemente, el agente reductor es DTT.

El termino “enzima proteolftica” en el contexto de la presente invencion se refiere a cualquier entidad que posea actividad proteolftica, esto es, que sea capaz de catalizar la hidrolisis de una protema, preferiblemente la hidrolisis de un enlace peptfdico. Preferiblemente, el termino "enzima proteolftica" se refiere a una enzima que pertenece al grupo de enzimas con el numero de la Comision de Enzimas (numero CE) EC 3.4, preferiblemente EC 3.4.21 o EC 3.4.22. Preferiblemente, la enzima proteolftica es una proteasa, preferiblemente una serina proteasa o una cistema proteasa. Los terminos "proteasa", "peptidasa" y "proteinasa" se usan indistintamente. Preferiblemente, la enzima proteolftica usada en la presente invencion posee una amplia especificidad de sustrato. Preferiblemente, la enzima proteolftica es activa en presencia de uno o mas agentes caotropicos. Por ejemplo, se prefiere que la enzima proteolftica utilizada en la presente invencion sea activa en presencia de tiocianato de guanidinio 400 mM, preferiblemente, 600 mM, preferiblemente 800 mM, preferiblemente 1 M, y/o en presencia de urea 2 M, preferiblemente 3 M, preferiblemente 4 M, preferiblemente 5 M, y/o en presencia de clorhidrato de guanidinio 1.5 M, preferiblemente 2 M, preferiblemente 4 M, preferiblemente 5 M. Preferiblemente, la enzima proteolftica usada en la presente invencion es activa en presencia de uno o mas agentes reductores. De este modo, se prefiere que la enzima proteolftica sea activa en presencia de DTT 10 mM, preferiblemente 20 mM, preferiblemente DTT 50 mM, preferiblemente DTT 80 mM, mas preferiblemente DTT 100 mM. En una realizacion preferida particular, la enzima proteolftica es activa en presencia de aproximadamente DTT 20 mM. En el contexto de la presente invencion, se considera que una enzima, tal como una enzima proteolftica, por ejemplo, una proteasa, esta activa si la velocidad de reaccion de la reaccion catalizada por la enzima es al menos 10%, preferiblemente al menos 20%, preferiblemente al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, preferiblemente al menos 50%, mas preferiblemente

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al menos 60%, mas preferiblemente al menos 70%, e incluso mas preferiblemente al menos 80% de la velocidad de reaccion maxima de dicha enzima usando condiciones optimas tales como condiciones de regulacion y temperature.

Ejemplos particularmente preferidos de enzimas proteolfticas usadas en la presente invencion son proteinasa K (preferiblemente EC 3.4.21.64), subtilisina (preferiblemente EC 3.4.21.62), elastasa (preferiblemente EC 3.4.21.11, Ec 3.4.21.36, EC 3.4.21.37, o EC 3.4.21.71), caspasa (preferiblemente EC 3.4.22.36). En una realizacion preferida particular, la enzima proteolftica es la proteinasa K, tal como la proteinasa K que se puede obtener de Qiagen (por ejemplo, 20 mg/ml, >600 mAU/ml, numero de pedido 19131) o subtilisina. Una definicion de unidad preferida de proteinasa K en el contexto de la presente invencion es: 1 unidad es la actividad que es necesaria para liberar aminoacidos y peptidos folin-positivos que corresponden a 1 |imol de tirosina por minuto. Otra definicion de unidad preferida de proteinasa K en el contexto de la presente invencion es: 1 unidad hidrolizara hemoglobina desnaturalizada con urea para producir un equivalente en color de 1 |imol de tirosina por minuto a pH 7.5 a 37°C. Las unidades "unidad" y "mAU" (AU = unidad Anson) se usan indistintamente en este documento. El experto en la materia sabe muy bien como elegir diferentes enzimas proteolfticas para obtener una actividad similar.

En el contexto de la presente invencion, el termino "perlas" se refiere a partfculas, que son preferiblemente de un tamano en el intervalo de 200 |im a 2 mm, preferiblemente de 300 |im a 800 |im. Las perlas pueden presentar cualquier forma, por ejemplo, pueden tener forma de bola, forma de cubo, forma triangular, o pueden presentar cualquier forma irregular. Preferiblemente, las perlas estan hechas de un material inerte solido. De este modo, las perlas presentan preferiblemente una consistencia firme y preferiblemente no reaccionan qmmicamente con sustancias biologicas tales como protemas o acidos nucleicos en una extension significativa. En realizaciones particularmente preferidas, las perlas no se unen a acidos nucleicos en una extension significativa. Preferiblemente, las perlas estan hechas de vidrio, ceramica, plastico o metal tal como acero. El material de las perlas es mas preferiblemente vidrio. Preferiblemente, el termino "perlas", como se usa en la presente invencion, no se refiere a perlas de silica ni a ninguna perla utilizada para el aislamiento de acido nucleico.

El termino "lisis" o "reaccion de lisis" se refiere a un procedimiento de lisis y se refiere preferiblemente a la lisis de una muestra corporal como se describe en este documento. En el contexto de todos los aspectos de la presente invencion, una reaccion de lisis comprende preferiblemente la provision de una mezcla de reaccion de lisis. Una "mezcla de reaccion de lisis" en el contexto de la presente invencion comprende preferiblemente una muestra, preferiblemente una muestra corporal, al menos un agente caotropico, al menos un agente reductor y al menos una enzima proteolftica. Preferiblemente, la mezcla de reaccion de lisis comprende ademas perlas como se describe en este documento. Por ejemplo, la mezcla de reaccion de lisis puede ser una mezcla de la solucion reguladora de lisis descrita en este documento y una muestra corporal o la mezcla de reaccion de lisis puede ser una mezcla de la "composicion de lisis premezclada" como se describe en este documento, una muestra corporal y al menos Una enzima proteolftica. Preferiblemente, la naturaleza y la concentracion del al menos un agente caotropico y el al menos un agente reductor se eligen de tal manera que la al menos una enzima proteolftica sea activa en la mezcla de reaccion de lisis. Preferiblemente, la naturaleza y concentracion del agente caotropico y/o la naturaleza y concentracion del agente reductor y/o la naturaleza y concentracion de la enzima proteolftica es tal que la licuefaccion, preferiblemente la lisis, de la muestra corporal en la mezcla de reaccion de lisis se logra. Preferiblemente, el al menos un agente caotropico es como se describe en este documento, por ejemplo, en las definiciones y el primer aspecto de la presente invencion, y preferiblemente esta presente en la mezcla de reaccion de lisis en una concentracion en el intervalo de 0.1 M a 4 M, preferiblemente en el intervalo de 0.5 M a 3.5 M, mas preferiblemente en el intervalo de 1.0 M a 3.0 M, mas preferiblemente en el intervalo de 1.2 M a 2.6 M. Por ejemplo, el al menos un agente caotropico, preferiblemente clorhidrato de guanidinio, puede estar presente en la mezcla de reaccion de lisis en una concentracion de 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 2.25, 2.5, 2.75, 3.0, 3.25, 3.5, 3.75, o 4.0 M, mas preferiblemente en una concentracion de aproximadamente 2.0 ± 0.75 M. El experto en la materia reconocera que la concentracion optima del agente caotropico puede variar para variar los agentes caotropicos, por ejemplo, dependiendo del tipo de muestra y/o de la enzima proteolftica. Por ejemplo, la concentracion preferida de clorhidrato de guanidinio en la mezcla de reaccion de lisis esta en el intervalo de 1.0 a 3.0 M, preferiblemente 2.0 ± 0.75 M, mientras que la concentracion preferida para el tiocianato de guanidinio esta en el intervalo de 0.1 a 1.0 M, preferiblemente 0.5 ± 0.4 M, por ejemplo, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, o 0.9 M. En algunas realizaciones, el al menos un agente caotropico en el sentido de la presente invencion es una solucion reguladora de lisis comercialmente disponible que contiene como componente un agente caotropico, preferiblemente como un componente principal, por ejemplo, la solucion reguladora de lisis Qiagen AL, como se describe con respecto al primer aspecto de la presente invencion. En estas realizaciones, la mezcla de reaccion de lisis preferiblemente comprende la solucion reguladora de lisis comercialmente disponible, preferiblemente la solucion reguladora de lisis Qiagen AL, en una concentracion en el intervalo de 20% (vol/vol) a 80% (vol/vol), preferiblemente en el intervalo de 30% (vol/vol) a 70% (vol/vol), mas preferiblemente en el intervalo de 40% (vol/vol) a 60% (vol/vol). Por ejemplo, Por ejemplo, la solucion reguladora de lisis comercialmente disponible, preferiblemente la solucion reguladora de lisis Qiagen AL, puede estar presente en la mezcla de reaccion de lisis en una concentracion de 20% (vol/vol), 30% (vol/vol), 40% (vol/vol), 50% (vol/vol), 60% (vol/vol), 70% (vol/vol), u 80% (vol/vol), preferiblemente en una concentracion de 50 ± 10% (vol/vol), mas preferiblemente 50 ± 5% (vol/vol). El experto en la materia comprendera que el % en volumen de solucion reguladora de lisis disponible comercialmente presente en la mezcla de reaccion de lisis depende del tipo y/o de la concentracion del agente caotropico en dicha solucion reguladora de lisis comercialmente disponible y sera capaz de adaptar facilmente el % en volumen de solucion reguladora de lisis

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comercialmente disponible en la mezcla de reaccion de lisis basada en el tipo y/o la concentracion del agente caotropico en la solucion reguladora de lisis comercialmente disponible. Preferiblemente, el al menos un agente reductor es como se describe en este documento y preferiblemente esta presente en la mezcla de reaccion de lisis en una concentracion en el intervalo de 0.5 mM a 100 mM, preferiblemente en el intervalo de 2.5 mM a 50 mM, mas preferiblemente en el intervalo de 10 mM a 30 mM. Por ejemplo, el al menos un agente reductor, preferiblemente DTT, puede estar presente en la mezcla de reaccion de lisis en una concentracion de 0.5 mM, 1.0 mM, 5.0 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, o 100 mM, preferiblemente la concentracion es superior a 10 mM, preferiblemente aproximadamente 20 ± 5 mM, mas preferiblemente aproximadamente 20 mM. Preferiblemente, la al menos una enzima proteolftica es como se describe en este documento y preferiblemente esta presente en la mezcla de reaccion de lisis en una concentracion en el intervalo de 5 a 200 unidades/ml, preferiblemente entre 10 a 100 unidades/ml, mas preferiblemente entre 20 a 50 unidades/ml. Por ejemplo, la enzima proteolftica, preferiblemente proteinasa K, puede estar presente en la mezcla de reaccion de lisis en una concentracion de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 unidades/ml, preferiblemente en una concentracion de 25 ± 10 unidades/ml, mas preferiblemente en una concentracion de 25 ± 5 unidades/ml, en la que preferiblemente las definiciones de unidad son como se describe para proteinasa K. Preferiblemente, las perlas opcionales son como se describen en este documento y estan preferiblemente presentes en la mezcla de reaccion de lisis en una concentracion en el intervalo de 50 a 500 mg/ml, preferiblemente en el intervalo de 100 a 400 mg/ml, mas preferiblemente en el intervalo de 150 a 350 mg/ml, mas preferiblemente en el intervalo de 250 a 350 mg/ml. Por ejemplo, las perlas opcionales pueden estar presentes en la mezcla de reaccion de lisis en una concentracion de 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, o 500 mg/ml, preferiblemente en una concentracion de 300 ± 100 mg/ml, mas preferiblemente en una concentracion de 300 ± 50 mg/ml. Se debe entender que las concentraciones y porcentajes (por ejemplo, % en volumen) proporcionados en este documento no consideran el volumen de las perlas opcionales. En algunas realizaciones, la mezcla de reaccion de lisis no contiene detergentes y/o agentes quelantes como se describe en este documento, por ejemplo, en las definiciones y para la solucion reguladora de lisis. En algunas realizaciones, la mezcla de reaccion de lisis comprende ademas uno o mas detergentes y/o uno o mas agentes quelantes como se describe en este documento. Preferiblemente, la mezcla de reaccion de lisis se basa en agua y preferiblemente contiene componentes de la solucion reguladora, tales como los descritos para la solucion reguladora de lisis. Preferiblemente, el pH de la mezcla de reaccion de lisis es aproximadamente neutro a alcalino. Preferiblemente, el pH de la mezcla de reaccion de lisis esta en el intervalo de 5.5 a 8.0, esto es, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, u 8.0, preferiblemente alrededor de 7. Preferiblemente, la mezcla de reaccion de lisis no contiene ninguna otra enzima que la al menos una enzima proteolftica. Por ejemplo, la mezcla de reaccion de lisis puede comprender, preferiblemente consistir esencialmente en, preferiblemente consistir en una muestra corporal como se describe en este documento, 1.2 a 2.6 M de agente caotropico, preferiblemente clorhidrato de guanidinio, agente reductor 21 ± 5 mM, preferiblemente DTT, 25 ± 5 unidades de enzima proteolftica, preferiblemente proteinasa K, y preferiblemente 300 ± 50 mg/ml de perlas. Por ejemplo, la mezcla de reaccion de lisis puede consistir en aproximadamente 48 ± 3% (vol/vol) de solucion reguladora de lisis Qiagen AL, por ejemplo, 230 |il ± 10 |il, aproximadamente 2% (vol/vol) DTT 1 M, por ejemplo, 10 |il ± 3 |il, aproximadamente 4% (vol/vol) proteinasa K (>600 mAU/ml), por ejemplo, 20 |il ± 6 |il, aproximadamente 46 ± 5% (vol/vol) de muestra corporal, y preferiblemente aproximadamente 300 mg/ml ± 50 mg/ml de perlas, por ejemplo, 140 ± 30 mg de perlas de vidrio. La proteinasa K tambien se puede adicionar a la mezcla de reaccion de lisis en forma seca.

El termino "composicion de lisis premezclada" se refiere a una composicion que comprende al menos un agente caotropico y al menos un agente reductor. Preferiblemente, la composicion de lisis premezclada comprende ademas perlas como se describe en este documento. Preferiblemente, la composicion de lisis premezclada es la solucion reguladora de lisis descrita en este documento carente de la al menos una enzima proteolftica. Preferiblemente, la naturaleza y concentracion del agente caotropico y/o la naturaleza y concentracion del agente reductor en la composicion de lisis premezclada es tal que la licuefaccion, preferiblemente la lisis, de una muestra corporal se logra si dicha muestra corporal se mezcla con la composicion de lisis premezclada, preferiblemente si dicha muestra corporal se mezcla con la composicion de lisis premezclada en una proporcion en volumen de aproximadamente 1:1. Preferiblemente, la naturaleza y concentracion del agente caotropico y/o la naturaleza y concentracion del agente reductor en la composicion de lisis premezclada es tal que una enzima proteolftica es activa en una mezcla de la composicion de lisis premezclada y una muestra corporal, preferiblemente si la composicion de lisis premezclada se mezcla con una muestra corporal en una proporcion en volumen de aproximadamente 1:1. Preferiblemente, la concentracion del al menos un agente caotropico y el al menos un agente reductor en la composicion de lisis premezclada es tal que despues de mezclarla con una muestra corporal y la adicion de una enzima proteolftica, las concentraciones del al menos un agente caotropico y el al menos un agente reductor es como se ha definido para la mezcla de reaccion de lisis. Preferiblemente, el al menos un agente caotropico es como se describe en este documento, por ejemplo, en las definiciones y el primer aspecto de la presente invencion, y preferiblemente esta presente en la composicion de lisis premezclada en una concentracion en el intervalo de 0.2 M a 8.0 M, preferiblemente en el intervalo de 1.0 M a 7.0 M, mas preferiblemente en el intervalo de 2.0 M a 6.0 M, mas preferiblemente en el intervalo de 2.5 M a 5.2 M. Por ejemplo, el al menos un agente caotropico, preferiblemente clorhidrato de guanidinio, puede estar presente en la composicion de lisis premezclada en una concentracion de aproximadamente 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, u 8.0 M, mas preferiblemente en una concentracion de aproximadamente 4.0 ± 1.5 M. El experto en la materia reconocera que la concentracion optima

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del agente caotropico puede variar para variar los agentes caotropicos, por ejemplo, dependiendo del tipo de muestra y/o de la enzima proteolftica. Por ejemplo, la concentracion preferida declorhidrato de guanidinio en la composicion de lisis premezclada esta en el intervalo de 2.0 a 6.0 M, preferiblemente 4.0 ± 1.5 M, mientras que la concentracion preferida para tiocianato de guanidinio esta en el intervalo de 0.2 a 2.0 M, preferiblemente 1.0 ± 0.8 M, por ejemplo, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, o 1.8 M. En algunas realizaciones, el al menos un agente caotropico en el sentido de la presente invencion es una solucion reguladora de lisis comercialmente disponible que contiene como componente un agente caotropico, preferiblemente como un componente principal, por ejemplo, la solucion reguladora de lisis Qiagen AL, como se describe con respecto al primer aspecto de la presente invencion. En estas realizaciones, la composicion de lisis premezclada comprende preferiblemente la solucion reguladora de lisis disponible comercialmente, preferiblemente la solucion reguladora de lisis comercialmente disponible, preferiblemente la solucion reguladora de lisis Qiagen AL, en una concentracion en el intervalo de 40% (vol/vol) a 99% (vol/vol), preferiblemente en el intervalo de 60% (vol/vol) a 98% (vol/vol), mas preferiblemente en el intervalo de 80% (vol/vol) a 96% (vol/vol). Por ejemplo, la solucion reguladora de lisis comercialmente disponible, preferiblemente la solucion reguladora de lisis Qiagen AL, puede estar presente en la composicion de lisis premezclada en una concentracion de 50% (vol/vol), 60% (vol/vol), 70% (vol/vol), 80% (vol/vol), 90% (vol/vol), 95% (vol/vol), o 98% (vol/vol), preferiblemente en una concentracion de 90% ± 9% (vol/vol), mas preferiblemente 96 ± 3% (vol/vol). El experto en la materia comprendera que el % en volumen de solucion reguladora de lisis disponible comercialmente presente en la composicion de lisis premezclada depende del tipo y/o de la concentracion de agente caotropico en dicha solucion reguladora de lisis comercialmente disponible y sera capaz de adaptar facilmente el % en volumen de la solucion reguladora de lisis comercialmente disponible en la composicion de lisis premezclada basada en el tipo y/o la concentracion del agente caotropico en la solucion reguladora de lisis comercialmente disponible. Preferiblemente, el al menos un agente reductor es como se describe en este documento, por ejemplo, en las definiciones y el primer aspecto de la presente invencion, y preferiblemente esta presente en la composicion de lisis premezclada en una concentracion en el intervalo de 1.0 mM a 200 mM, preferiblemente en el intervalo de 5.0 mM a 100 mM, mas preferiblemente en el intervalo de 20 mM a 60 mM. Por ejemplo, el al menos un agente reductor, preferiblemente DTT, puede estar presente en la composicion de lisis premezclada en una concentracion de 1.0 mM, 5.0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, o 200 mM, preferiblemente la concentracion es superior a 20 mM, preferiblemente la concentracion es aproximadamente 40 ± 10 mM, mas preferiblemente aproximadamente 40 mM. Preferiblemente, las perlas opcionales son como se describen en este documento y preferiblemente estan presentes en la composicion de lisis premezclada en una concentracion en el intervalo de 100 a 1000 mg/ml, preferiblemente en el intervalo de 200 a 800 mg/ml, mas preferiblemente en el intervalo de 300 a 700 mg/ml, mas preferiblemente en el intervalo de 500 a 700 mg/ml. Por ejemplo, las perlas opcionales pueden estar presentes en la composicion de lisis premezclada en una concentracion de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, o 1000 mg/ml, preferiblemente en una concentracion de 600 ± 200 mg/ml, mas preferiblemente en una concentracion de 600 ± 100 mg/ml. Se debe entender que las concentraciones proporcionadas en este documento se calculan sin el volumen de las perlas opcionales. En algunas realizaciones, la composicion de lisis premezclada no contiene detergentes y/o agentes quelantes como se describe en este documento, por ejemplo, en las definiciones o para la solucion reguladora de lisis. En algunas realizaciones, la composicion de lisis premezclada comprende ademas uno o mas detergentes y/o uno o mas agentes quelantes como se describe en este documento. Preferiblemente, la composicion de lisis premezclada se basa en agua y contiene preferiblemente componentes de la solucion reguladora, tales como los descritos para la solucion reguladora de lisis. Preferiblemente, el pH de la composicion de lisis premezclada es aproximadamente neutro a alcalino. Preferiblemente, el pH de la composicion de lisis premezclada esta en el intervalo de 5.5 a 8.0, esto es, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, u 8.0, preferiblemente alrededor de 7. Preferiblemente, la composicion de lisis premezclada no contiene una enzima proteolftica, preferiblemente, la composicion de lisis premezclada no contiene ninguna enzima. Por ejemplo, la composicion de lisis premezclada puede comprender, preferiblemente esencialmente consistir en, preferiblemente consistir en un agente caotropico, preferiblemente clorhidrato de guanidinio, en una concentracion en el intervalo de 2 a 6 M, preferiblemente, 2.5 a 5.5 M, mas preferiblemente 2.5 a 5.1 M, un agente reductor, preferiblemente DTT, en una concentracion en el intervalo de 20 a 60 mM, preferiblemente 40 ± 10 mM, y preferiblemente perlas, preferiblemente en una concentracion en el intervalo de 600 ± 100 mg/ml. Por ejemplo, la composicion de lisis premezclada puede comprender, preferiblemente esencialmente consistir en, preferiblemente consistir en 96 ± 3% (vol/vol) de solucion reguladora de lisis Qiagen AL, por ejemplo, 230 |il ± 10 |il, 4 ± 1% (vol/vol) de DTT 1 M, por ejemplo, 10 ± 3 |il, y preferiblemente perlas, preferiblemente en una concentracion de 600 ± 100 mg/ml, por ejemplo, 140 ± 30 mg de perlas de vidrio.

En el contexto de la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada y la mezcla de reaccion de lisis, en algunas realizaciones, el agente caotropico no es tiocianato de guanidinio si el agente reductor es DTT. En algunas realizaciones, el agente reductor no es DTT si el agente caotropico es tiocianato de guanidinio o urea. En algunas realizaciones, el agente reductor no es DTT. En algunas realizaciones, el agente reductor no es beta- mercaptoetanol. En alguna realizacion, el agente caotropico no es tiocianato de guanidinio. En algunas realizaciones, el agente caotropico no es urea.

Los terminos "en el que la naturaleza y concentracion del agente caotropico es tal que se logra la licuefaccion, preferiblemente lisis, de una muestra corporal", "en el que la naturaleza y concentracion del agente reductor es tal que se logra la licuefaccion, preferiblemente lisis, de una muestra corporal”, y "en el que la naturaleza y

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concentracion de la enzima proteolftica es tal que se logra la licuefaccion, preferiblemente lisis, de una muestra corporal" significan que el agente caotropico y/o el agente reductor y/o la enzima proteolftica y sus concentraciones se eligen en base a su capacidad para la licuefaccion, preferiblemente lisan una muestra corporal, preferiblemente una muestra corporal viscosa. En particular, esto significa preferiblemente que la muestra corporal presenta una viscosidad mas alta antes del procedimiento con el agente caotropico y/o el agente reductor y/o la enzima proteolftica en comparacion con la viscosidad despues de dicho procedimiento. Preferiblemente, la viscosidad antes del procedimiento es al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces mayor que despues del procedimiento, mas preferiblemente la viscosidad antes del procedimiento es 10 veces mayor que despues del procedimiento. De este modo, con el fin de determinar la naturaleza del agente caotropico y/o el agente reductor y/o la enzima proteolftica, asf como las concentraciones apropiadas de los mismos, el experto en la materia puede incubar una muestra corporal, preferiblemente una muestra corporal viscosa, tal como esputo o secrecion traqueal, con el agente caotropico candidato y/o agente reductor y/o enzima proteolftica a diversas concentraciones, por ejemplo, a 0.2 M, 0.5 M, 1 M, 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, y 6 M para el agente caotropico y/o a 1 mM, 5 mM, 10 mM, 25 mM, 50 mM, y 100 mM para el agente reductor y/o a 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 unidades/ml para la enzima proteolftica,, durante un cierto penodo de tiempo, tal como durante 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos o 30 minutos, en el caso de la enzima proteolftica, preferiblemente a una temperatura a la que la enzima proteolftica es activa, y determinar la viscosidad de la muestra antes y despues del procedimiento. Con respecto a las propiedades de lisis, las expresiones anteriores significan que la muestra corporal contiene un mayor numero de celulas intactas antes del procedimiento con el agente caotropico y/o el agente reductor y/o la enzima proteolftica en comparacion con el numero de celulas despues de dicho procedimiento. Preferiblemente, el numero de celulas intactas antes del procedimiento es al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces mayor que despues del procedimiento, mas preferiblemente el numero de celulas intactas antes del procedimiento 10 veces mayor que despues del procedimiento. De este modo, con el fin de determinar la naturaleza del agente caotropico y/o el agente reductor y/o la enzima proteolftica, asf como las concentraciones apropiadas de los mismos, el experto en la materia puede incubar una muestra corporal, como se describe anteriormente, y el numero de celulas intactas en la muestra se determina antes y despues del procedimiento, por ejemplo, mediante analisis microscopicos. A continuacion, el agente caotropico y/o el agente reductor y/o la enzima proteolftica se eligen en concentraciones apropiadas para la licuefaccion, preferiblemente lisar la muestra corporal como se ha especificado anteriormente.

El termino "muestra corporal" como se usa en la presente invencion se refiere a cualquier muestra que se derive del cuerpo de un individuo. En este contexto, el termino "individuo" se refiere preferiblemente a un animal, preferiblemente un animal de mamfero incluyendo un ser humano. Por ejemplo, un individuo en el contexto de la presente invencion puede ser un raton, rata, cobaya, conejo, gato, perro, cabra, oveja, cerdo, vaca, caballo u humano, preferiblemente un ser humano. El individuo puede ser un paciente, en el que el termino "paciente" se refiere a un individuo que sufre de una enfermedad o que se sospecha que padece una enfermedad. En el contexto de la presente invencion, la enfermedad es preferiblemente una enfermedad respiratoria. Preferiblemente, una muestra corporal es un fluido corporal o tejido corporal, preferiblemente tomado con el proposito de una prueba cientffica, tal como para diagnosticar una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad respiratoria, por ejemplo, detectando y/o identificando un patogeno o la presencia de un marcador tumoral en una muestra corporal que es preferiblemente relevante para el diagnostico de una enfermedad respiratoria. Preferiblemente, una muestra corporal en el contexto de la presente invencion comprende celulas, por ejemplo, patogenos o celulas del individuo, la muestra corporal procede, por ejemplo, de celulas tumorales.

En el contexto de la presente invencion, las muestras corporales preferidas son muestras que son relevantes para el diagnostico de una enfermedad respiratoria. Tales muestras corporales pueden ser muestras respiratorias, esto es, muestras corporales derivadas de las vfas respiratorias, y muestras no respiratorias, esto es, muestras corporales que no se derivan de las vfas respiratorias. El tracto respiratorio en el contexto de la presente invencion comprende preferiblemente la nariz, los conductos nasales, los senos paranasales, la garganta, la faringe, la caja vocal, la laringe, la traquea, los bronquios, los bronquiolos y los pulmones, incluyendo bronquiolos respiratorios, conductos alveolares, sacos alveolares, alveolos. Ejemplos de muestras respiratorias en el contexto de la presente invencion son esputo, pus (por ejemplo, pus de la cavidad paranasal), secrecion bronquial, secrecion traqueal, secrecion endotraqueal, aspirados bronquiales, aspirados traqueales, aspirados endotraqueales, lavado bronquial, lavado broncoalveolar (BAL), hisopado bronquial, hisopado nasofarmgeo, hisopado larmgeo y biopsias pulmonares. Las muestras no respiratorias preferidas utilizadas en la presente invencion son relevantes para el diagnostico de enfermedades respiratorias. Ejemplos preferidos de muestras no respiratorias en el contexto de la presente invencion son sangre, pus, fluido pleural, punciones pleurales, jugo gastrico, aspirados gastricos y drenajes o fluidos punteados de otras localizaciones del cuerpo.

La expresion "diferentes tipos de muestras corporales" se refiere a dos o mas muestras corporales que son de naturaleza diferente. Por ejemplo, los diferentes tipos de muestras corporales pueden diferir en su consistencia, por ejemplo, ftquido, viscoso, grueso, solido, etc. y/o su composicion, por ejemplo, estructura y naturaleza de los componentes (protemas, ftpidos, mucinas, matriz extracelular, tejido, membranas, sales, polisacaridos, agua, etc.) pH, etc., o su origen. El grado de diferencia entre las muestras puede ser diferente para diferentes tipos de muestras. De este modo, cuanto mas caractensticas de dos muestras son diferentes, mas difieren las muestras. Por ejemplo, la sangre y el esputo o el jugo gastrico y el esputo son muy diferentes, mientras que el esputo y la secrecion traqueal son menos diferentes, etc.

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El termino "de aplicacion universal" como se usa en la presente invencion significa "ampliamente utilizable". De este modo, una solucion reguladora de lisis de aplicacion universal es una solucion reguladora de lisis ampliamente utilizable. Por ejemplo, una solucion reguladora de lisis que es de aplicacion universal para la lisis de muestras, tales como muestras corporales, es preferiblemente aplicable para la lisis de varios diferentes tipos de muestras, por ejemplo, de al menos 2, preferiblemente al menos 3, preferiblemente al menos 4, preferiblemente al menos 5, mas preferiblemente al menos 6, mas preferiblemente al menos 7, mas preferiblemente al menos 8, incluso mas preferiblemente al menos 9, y mas preferiblemente al menos 10 diferentes tipos de muestras corporales. Preferiblemente, la solucion reguladora de lisis de aplicacion universal es eficaz en la lisis de varios diferentes tipos de muestras. Mas preferiblemente, una solucion reguladora de lisis que es de aplicacion universal es aplicable para la lisis de varios, preferiblemente al menos 2, tipos altamente diferentes de muestras corporales como se describe a continuacion. Preferiblemente, el termino "aplicable a" en el contexto de la presente invencion significa "efectivo en" o "apropiado para".

En el contexto de la presente invencion, las expresiones "eficaz en la lisis de varios diferentes tipos de muestras" y "apropiado para la lisis de dos o mas diferentes tipos de muestras corporales" significan preferiblemente que al menos 10%, preferiblemente al menos 20%, preferiblemente al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, mas preferiblemente al menos 50%, mas preferiblemente al menos 60%, mas preferiblemente al menos 70%, incluso mas preferiblemente al menos 80%, incluso mas preferiblemente al menos 90%, incluso mas preferiblemente al menos 95%, mas preferiblemente al menos 99% de las celulas contenidas en la muestra corporal se lisan en al menos 2, preferiblemente al menos 3, preferiblemente al menos 4, preferiblemente al menos 5, mas preferiblemente al menos 6, mas preferiblemente al menos 7, mas preferiblemente al menos 8, incluso mas preferiblemente al menos 9, y mas preferiblemente al menos 10 diferentes tipos de muestras corporales.

En el contexto de la presente invencion, "un amplio espectro de muestras corporales" significa al menos 2, preferiblemente al menos 3, preferiblemente al menos 4, preferiblemente al menos 5, mas preferiblemente al menos 6, mas preferiblemente al menos 7, Mas preferiblemente al menos 8, incluso mas preferiblemente al menos 9, y mas preferiblemente al menos 10 diferentes tipos de muestras corporales. En una realizacion preferida, "un amplio espectro de muestras corporales" se refiere a "un amplio espectro de muestras corporales relevantes para el diagnostico de una enfermedad respiratoria". Mas preferiblemente, "un amplio espectro de muestras corporales" se refiere a varios, preferiblemente al menos 2, tipos altamente diferentes de muestras corporales como se describe a continuacion. Una "solucion reguladora de lisis de aplicacion universal" en el contexto de la presente invencion es preferiblemente aplicable para la lisis de un "amplio espectro de muestras corporales". En este contexto, una solucion reguladora de lisis de aplicacion universal es una solucion reguladora de lisis de amplio espectro.

Preferiblemente, la solucion reguladora de lisis, el uso, los metodos, y/o el kit es/son de aplicacion universal, preferiblemente para la lisis de muestras corporales, preferiblemente para la lisis de muestras corporales pertinentes para el diagnostico de una enfermedad respiratoria, y/o son aplicables a la lisis de un amplio espectro de muestras corporales. Esto significa, por ejemplo, que la solucion reguladora de lisis, el uso, los metodos o el kit son aplicables, aplicados preferiblemente para la lisis de al menos 2, preferiblemente al menos 3, preferiblemente al menos 4, preferiblemente al menos 5, mas preferiblemente al menos 6, mas preferiblemente al menos 7, mas preferiblemente al menos 8, incluso mas preferiblemente al menos 9, y mas preferiblemente al menos 10 diferentes tipos de muestras corporales seleccionadas del grupo que consiste en sangre, esputo, pus (por ejemplo, pus de la cavidad paranasal), fluido pleural, punciones pleurales, secrecion bronquial, secrecion traqueal, secrecion endotraqueal, aspirados bronquiales, aspirados traqueales, aspirados endotraqueales, lavado bronquial, lavado broncoalveolar (BAL), hisopado bronquial, hisopado nasofarmgeo, hisopado larmgeo, gastrico jugo, aspirados gastricos, y biopsias de pulmon, o que la solucion reguladora de lisis, el uso, los metodos, o el kit es/son aplicables, aplicados preferiblemente a la lisis de al menos 2, preferiblemente al menos 3, mas preferiblemente al menos 4, mas preferiblemente al menos 5, mas preferiblemente al menos 6 tipos de muestras corporales seleccionadas del grupo que consiste en sangre, esputo, secrecion traqueal, secrecion bronquial, lavado broncoalveolar, jugo gastrico, y puncion pleural, o que la solucion reguladora de lisis, el uso, la metodos, o el kit es/son aplicables, aplicados preferiblemente a la lisis de al menos 2, preferiblemente al menos 3 tipos de muestras corporales seleccionados del grupo que consiste en sangre, secreciones (tales como secreciones traqueales, secreciones bronquiales etc.), esputo, y lavados (tales como lavados bronquiales, lavados broncoalveolares, etc.), por ejemplo, sangre y secreciones; sangre y esputo; sangre y lavados; secreciones y esputo; secreciones y lavados; esputo y lavados; sangre, secreciones y lavados; sangre, secreciones y esputo, sangre, esputo y lavados; secreciones, esputo y lavados; y sangre, secreciones, esputo y lavados.

En realizaciones particularmente preferidas, la solucion reguladora de lisis, el uso, los metodos, o el kit es/son aplicables, aplicados preferiblemente a la lisis de muestras que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consiste en sangre, esputo, secrecion traqueal, secrecion bronquial, lavado broncoalveolar, jugo gastrico y puncion pleural.

Preferiblemente, la solucion reguladora de lisis, el uso, los metodos, o el kit es/son aplicables, preferiblemente aplicados a la lisis de al menos 2 tipos muy diferentes de muestras corporales, tales como sangre y esputo; sangre y secrecion traqueal; sangre y secrecion bronquial; sangre y lavado broncoalveolar; sangre y jugo gastrico; sangre y puncion pleural; esputo y jugo gastrico; esputo y puncion pleural; lavado broncoalveolar y puncion pleural; lavado

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broncoalveolar y jugo gastrico; lavado broncoalveolar y esputo; y puncion pleural y jugo gastrico. Mas preferiblemente, la solucion reguladora de lisis, el uso, los metodos, o el kit es/son aplicables, preferiblemente aplicados a la lisis de al menos 3 muestras muy diferentes, tales como sangre, esputo, y jugo gastrico; sangre, esputo y puncion pleural; sangre, secrecion traqueal y jugo gastrico; sangre, secrecion traqueal y puncion pleural; sangre, secrecion bronquial y jugo gastrico; sangre, secrecion bronquial y puncion pleural; sangre, lavado broncoalveolar y jugo gastrico; sangre, lavado broncoalveolar y puncion pleural; esputo, jugo gastrico y puncion pleural; secrecion traqueal, jugo gastrico y puncion pleural; secrecion bronquial, jugo gastrico y puncion pleural; y lavado broncoalveolar, jugo gastrico y puncion pleural.

Una "enfermedad respiratoria" en el contexto de la presente invencion es cualquier enfermedad que afecte al sistema respiratorio. Por ejemplo, las enfermedades respiratorias tal como se usan en este documento incluyen (i) enfermedades pulmonares obstructivas, (ii) enfermedades pulmonares restrictivas, (iii) infecciones de las vfas respiratorias, tales como infecciones de las vfas respiratorias superiores, por ejemplo, resfriado comun, sinusitis, amigdalitis, otitis media, faringitis o laringitis e infecciones de las vfas respiratorias inferior, por ejemplo, neumoma, (iv) tumores del sistema respiratorio, por ejemplo, cancer de pulmon de celulas pequenas, cancer de pulmon de celulas no pequenas (por ejemplo, adenocarcinoma, carcinoma no diferenciado de celulas grandes), otros canceres de pulmon tales como carcinoides, sarcoma de Kaposi o melanoma, linfoma, cancer de cabeza y cuello, mesotelioma y metastasis de cancer en el pulmon, tales como cancer de mama, cancer de colon, cancer de prostata, cancer de celulas germinales, y carcinoma de celulas renales, (v) enfermedades de cavidad pleural, por ejemplo, empiema y mesotelioma, y (vi) enfermedades vasculares pulmonares. Las enfermedades respiratorias particularmente preferidas en el contexto de la presente invencion son enfermedades respiratorias que pueden ser diagnosticadas usando diagnostico molecular, preferiblemente usando metodos de amplificacion y analisis de acido nucleico. Por ejemplo, las infecciones respiratorias, tales como infecciones con patogenos, por ejemplo, bacterias, virus, levaduras u hongos, preferiblemente levaduras o bacterias, y tumores del sistema respiratorio son enfermedades respiratorias preferidas en el contexto de la presente invencion. Las enfermedades respiratorias particularmente preferidas en el contexto de la presente invencion son neumomas, en particular neumomas causadas por infecciones con patogenos, tales como neumoma bacteriana, viral, fungica, parasitaria, atfpica, adquirida en el hospital, adquirida en el ventilador, asociada con la asistencia sanitaria, adquirida en la comunidad, o smdrome respiratorio agudo severo, tuberculosis, bronquitis, infecciones patogenas durante la fibrosis qrnstica o enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD) y un tumor del sistema respiratorio.

El termino "detergente" tal como se usa en este documento significa "surfactante". Ejemplos de detergentes son las sales alquilsulfato, tales como dodecilsulfato de sodio (SDS) o laurilsulfato de amonio, surfactantes no ionicos, tales como Triton X-100, octilglucosido, Genapol X-100 o polisorbatos, por ejemplo, Tween 20 o Tween 80, y sarkosyl (N- lauroil-sarcosina). En algunas realizaciones, la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada y/o la mezcla de reaccion de lisis no contienen un detergente. Preferiblemente, la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada y/o la mezcla de reaccion de lisis no contienen SDS. Preferiblemente, la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada y/o la mezcla de reaccion de lisis no contienen Triton X-100. Preferiblemente, la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada y/o la mezcla de reaccion de lisis no contienen Tween 20 o Tween 80. Preferiblemente, la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada y/o la mezcla de reaccion de lisis no contienen N-lauroilsarcosina. Preferiblemente, la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada y/o la mezcla de reaccion de lisis no contienen ninguno de los detergentes anteriores, mas preferiblemente la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada y/o la mezcla de reaccion de lisis no contienen ningun detergente. En algunas realizaciones, la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada y/o la mezcla de reaccion de lisis contienen uno o mas detergentes, por ejemplo, uno o mas de los detergentes anteriores. Por ejemplo, la mezcla de reaccion de lisis puede contener uno o mas detergentes en una concentracion en el intervalo de 0.1 a 10% (p/v), preferiblemente 0.25 a 5% (p/v), tal como 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 2.5, o 3% (p/v). Por ejemplo, la solucion reguladora de lisis o la composicion de lisis premezclada puede contener uno o mas detergentes en una concentracion en el intervalo de 0.2 a 20% (p/v), preferiblemente 0.5 a 10% (p/v), tal como 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, o 10% (p/v). Por ejemplo, si la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada o la mezcla de reaccion de lisis comprende la solucion reguladora de lisis Qiagen AL como agente caotropico, la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada o la mezcla de reaccion de lisis puede contener un detergente si la solucion reguladora de lisis Qiagen AL contiene un detergente. En este caso, la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada, y/o la mezcla de reaccion de lisis puede contener el detergente espedfico que esta presente en la solucion reguladora de lisis Qiagen AL y/o cualquier detergente adicional. Por ejemplo, la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada, y/o la mezcla de reaccion de lisis puede contener Triton X-100, Tween 20 y/o Tween 80, por ejemplo, en una concentracion como se describe anteriormente. Preferiblemente, la naturaleza y concentracion del uno o mas detergentes se elige de tal manera que la enzima proteolftica usada en la presente invencion sea activa.

El termino "agente quelante" como se usa en la presente invencion se refiere a un "ligando polidentado". Los terminos "agente quelante", "quelante", "quelante" y "agente secuestrante" se usan indistintamente. Preferiblemente, el agente quelante es capaz de formar multiples enlaces a un solo atomo tal como un ion metalico, por ejemplo, Mg2+ o Ca2+. Ejemplos de agentes quelantes son acetilacetona, etilendiamina, dietilentriamina, iminodiacetato, trietilentetramina, triaminotrietilamina, nitrilotriacetato, etilendiaminotriacetato, acido etilendiaminotetraacetico

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(EDTA), acido etilenglicol tetraacetico (EGTA), acido dietilentriamina pentaacetico (DTPA), y 1,4,7,10- tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacetico (DOTA). En algunas realizaciones, la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada, y/o la mezcla de reaccion de lisis no contienen EDTA y/o EGTA. Mas preferiblemente, la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada, y/o la mezcla de reaccion de lisis no contienen ninguno de los agentes quelantes anteriores, mas preferiblemente, la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada, y/o la mezcla de reaccion de lisis no contienen ningun agente quelante. En algunas realizaciones, la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada, y/o la mezcla de reaccion de lisis contienen uno o mas agentes quelantes, por ejemplo, uno o mas de los agentes quelantes anteriores. Por ejemplo, la mezcla de reaccion de lisis puede contener uno o mas agentes quelantes en una concentracion en el intervalo de 0.5 a 100 mM, preferiblemente 1 a 50 mM, tales como en una concentracion de aproximadamente 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 mM. Por ejemplo, la composicion de lisis premezclada o la solucion reguladora de lisis puede contener uno o mas agentes quelantes en una concentracion en el intervalo de 1 a 200 mM, preferiblemente 5 a 100 mM, tales como en una concentracion de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, o 100 mM. Por ejemplo, si la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada, o la mezcla de reaccion de lisis comprende la solucion reguladora de lisis Qiagen AL como agente caotropico, la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada, o la mezcla de reaccion de lisis puede contener un agente quelante si la solucion reguladora de lisis Qiagen AL contienen un agente quelante. En este caso, la solucion reguladora de lisis puede contener el agente quelante espedfico que esta presente en la solucion reguladora de lisis Qiagen AL o cualquier agente quelante adicional. Por ejemplo, la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada, o la mezcla de reaccion de lisis puede contener EDTA o EGTA en una concentracion como se describe anteriormente. Preferiblemente, la concentracion del agente quelante se elige de tal manera que la enzima proteofftica utilizada en la presente invencion sea activa.

El termino "procedimiento" se refiere en general a cada procedimiento que comprende un cambio en una o mas propiedades ffsicas de una muestra que se procesa cuando se determinan dichas propiedades/magnitudes ffsicas antes y despues del tratamiento/procedimiento. El "procedimiento" en el sentido de la presente invencion comprende lisis y licuefaccion de una muestra de tal manera que la viscosidad de la muestra se reduce mediante el proceso del procedimiento. “Lisis” significa la desintegracion de las celulas presentes en la muestra. Tales celulas pueden ser celulas procariotas o eucariotas, por ejemplo, celulas bacterianas, celulas de levadura, celulas fungicas, celulas animales, celulas de mairfffero, etc., en las que el procedimiento puede conducir a la lisis de todas las celulas en la muestra o solamente de un tipo espedfico de celulas o un subconjunto de bacterias. En el contexto de la presente invencion, es mas preferido que el procedimiento comprenda la lisis de un patogeno.

El termino "licuefaccion" en el contexto de la presente invencion significa que la viscosidad de una muestra viscosa antes de la licuefaccion es mas alta, preferiblemente al menos 2 veces mas alta en comparacion con la viscosidad despues de la licuefaccion. Preferiblemente, la viscosidad de la muestra es al menos 3 veces mayor antes de la licuefaccion comparada con la viscosidad despues de la licuefaccion. Mas preferiblemente, la viscosidad de la muestra es al menos 5 veces, mas preferiblemente al menos 10 veces mas alta antes de la licuefaccion comparada con la viscosidad despues de la licuefaccion.

La "viscosidad" en el contexto de la presente invencion significa viscosidad dinamica, esto es, q, que se mide en kgm'1s_1 = Pas. Otra unidad comun para la viscosidad dinamica es centipoise (cP), donde 1 cP es igual a 1 mPas. El agua a 20°C tiene una viscosidad de 1.0020 cP. Algunos ejemplos de materiales con viscosidades mas altas son: sangre a 37°C = 4-25 mPas, aceite de oliva = ~100 mPas, miel = 2000-10000 mPas, jarabe de chocolate = 1000025000 mPa s, chocolate fundido = 45000-130000 mPa s, y mantequilla de mam = -250000 mPa s. El experto en la materia sabe perfectamente como determinar la viscosidad de una muestra. Por ejemplo, los instrumentos para la medicion de viscosidad, esto es, viscosfmetros, estan disponibles comercialmente. Una "muestra viscosa" en el contexto de la presente invencion significa un material con una alta viscosidad, preferiblemente una viscosidad de al menos 1 x 104 mPa s, por ejemplo, secreciones traqueales o bronquiales, esputo, o muestras sangumeas y purulentas en general.

El termino "sin tratar" en el contexto de la presente invencion significa "no procesado" o "crudo". De este modo, la expresion "muestra corporal no tratada" significa que la muestra corporal no se trata mediante la aplicacion de uno o mas agentes qmmicos o fuerzas ffsicas tales como temperatura o fuerzas de cizallamiento, o cualquier otro procedimiento tal como centrifugacion, filtrado o tamizado. Para todos los aspectos de la presente invencion, se prefiere que la muestra corporal no sea tratada antes de ponerse en contacto con la solucion reguladora de lisis, la composicion de lisis premezclada o antes de que se lleve a cabo la primera etapa de los metodos de acuerdo con la presente invencion. Sin embargo, en el caso de que la muestra corporal se almacene durante un cierto penodo de tiempo, por ejemplo, durante mas de 8 horas, antes de realizar los metodos de la presente invencion o antes de ponerse en contacto la muestra corporal con la solucion reguladora de lisis o la composicion de lisis premezclada, se prefiere que la muestra corporal se almacene a una temperatura por debajo de 0°C, preferiblemente por debajo de - 5°C, mas preferiblemente por debajo de -10°C, y mas preferiblemente por debajo de -20°C. De este modo, se prefiere que el unico tratamiento de la muestra corporal antes de realizar los metodos de acuerdo con la presente invencion o antes de poner en contacto la muestra corporal con la solucion reguladora de lisis o la composicion de lisis premezclada sea la congelacion de la muestra.

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Un "procedimiento de aislamiento de acido nucleico" en el contexto de la presente invencion es un metodo que permite el aislamiento de acidos nucleicos a partir de una mezcla compleja de sustancias y/o moleculas tales como un lisado celular. Preferiblemente, el procedimiento de aislamiento de acido nucleico en el contexto de la presente invencion es una tecnologfa basada en silica o perla magnetica. Por ejemplo, un procedimiento de aislamiento de acidos nucleicos basado en silica se puede basar en una membrana de silica o en perlas de silica, preferiblemente sobre una membrana de silica. Los kits de aislamiento de acidos nucleicos estan comercialmente disponibles, por ejemplo, el kit de tejido de ADN EZ-1 (numero de pedido 953034) o el kit de sangre de ADN QiaAmp™ (numero de pedido 51104) de Qiagen. Dependiendo del procedimiento o kit de aislamiento de acido nucleico usado, puede ser necesario suplementar la muestra corporal procesada con otros reactivos antes de realizar el procedimiento de aislamiento de acido nucleico. Por ejemplo, para el aislamiento de acido nucleico usando purificaciones de membrana de silica, por ejemplo, usando el procedimiento de centrifugado QiaAmp™ de Qiagen, se requiere adicionar etanol (96-l0o%) a la muestra corporal lisada de acuerdo con las instrucciones del fabricante antes de transferir la mezcla sobre una columna de centrifugacion QiaAmp™. Dependiendo de los componentes utilizados para la lisis de la muestra corporal, puede ser preferible adicionar una mezcla de solucion reguladora de lisis Qiagen AL y etanol (96 a 100%) a la muestra corporal lisada, preferiblemente para conseguir una proporcion final en volumen de muestra corporal (incluyendo los componentes usados para la lisis de la muestra corporal distinta de la solucion reguladora de lisis Qiagen AL) con la solucion reguladora de lisis Qiagen AL con el etanol de aproximadamente 1: 1:1 antes de cargar la mezcla sobre la membrana de silica. Mas preferiblemente, el procedimiento de aislamiento de acido nucleico contemplado por la presente invencion no implica extraccion con solventes organicos tales como fenol y/o cloroformo o precipitacion con alcohol tal como etanol o isopropanol. El acido nucleico aislado es preferiblemente 90%, mas preferiblemente 95%, mas preferiblemente 99% libre de cualquier otra estructura macromolecular tal como protemas despues de realizar el procedimiento de aislamiento de acido nucleico.

El termino "calentamiento" en el contexto de la presente invencion significa "elevar la temperatura". De este modo, "calentar una mezcla a una primera temperatura" significa elevar la temperatura de una mezcla a una temperatura definida. Por ejemplo, una mezcla se puede calentar desde la temperatura ambiente a 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60°C, o a cualquier otra temperatura por encima de 60°C. Preferiblemente, "la primera temperatura" esta en el intervalo de 25 a 80°C, mas preferiblemente 30 a 60°C, mas preferiblemente la primera temperatura es 56 ± 5°C. Preferiblemente, la primera temperatura en el contexto de la presente invencion es una temperatura a la cual una enzima proteolftica, preferiblemente la enzima proteolftica usada en la presente invencion es activa. Preferiblemente, la primera temperatura es la temperatura de reaccion optima para la enzima proteolftica usada en la presente invencion. Preferiblemente, el calentamiento de una mezcla tambien incluye mantener la mezcla a la temperatura a la que se calento durante un cierto penodo de tiempo. Preferiblemente, la "segunda temperatura" es mayor que la primera temperatura. Preferiblemente, la segunda temperatura esta en el intervalo de 50 a 120°C, preferiblemente 60 a 100°C, mas preferiblemente 80 a 100°C. Por ejemplo, la segunda temperatura puede ser 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100°C, preferiblemente 96 ± 5°C. Preferiblemente, el termino "calentamiento a" una temperatura particular tambien abarca el termino "incubacion a" una temperatura particular.

El termino “molienda con perlas” significa agitacion en presencia de perlas. De este modo, si una muestra o mezcla, preferiblemente una muestra o mezcla ftquida, viscosa o semisolida, es molida con perlas, la muestra o mezcla contiene perlas y la muestra o mezcla y las perlas se agitan. La molienda con perlas conduce preferiblemente a la homogeneizacion de la muestra o mezcla y ruptura de las celulas debido a los gradientes de cizallamiento de alto ftquido y colision con las perlas. La velocidad y la eficacia de la homogeneizacion y la lisis celular pueden modificarse cambiando las velocidades de agitacion, el tipo de movimiento de agitacion y/o el tamano de las perlas, asf como las dimensiones del equipo. Preferiblemente, las condiciones de la etapa de molienda con perlas de los metodos de acuerdo con la presente invencion son tales que una o mas propiedades ffsicas de la mezcla son diferentes antes y despues de la etapa de molienda con perlas. Preferiblemente, la mezcla es mas homogenea despues de molienda con perlas, mas preferiblemente la mezcla es menos viscosa despues de la molienda con perlas, por ejemplo, al menos por un factor de 2, y mas preferiblemente la molienda con perlas comprende la lisis de celulas presentes en la mezcla, mas preferiblemente lisis de celulas bacterianas y/o de levaduras. El experto en la materia conoce bien los procedimientos de molienda con perlas. Por ejemplo, los molinos de perlas en varias dimensiones estan disponibles comercialmente.

Un "metodo de amplificacion de acido nucleico" en el contexto de la presente invencion es cualquier tecnica biologica molecular que sea apropiada para amplificar, esto es, multiplicar, un acido nucleico, en la que la amplificacion puede ser lineal o exponencial. Ejemplos de metodos de amplificacion de acidos nucleicos son la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), la amplificacion basada en secuencias de acidos nucleicos (NASBA), la reaccion en cadena de la ligasa (LCR), la amplificacion por desplazamiento de la cadena (SDA), la amplificacion de desplazamiento multiple (MDA), amplificacion de replicasa Q-beta, y amplificacion isotermica mediada por bucle. El metodo de amplificacion puede ser espedfico para un cierto acido nucleico tal como un gen espedfico o un fragmento del mismo, o puede ser universal de tal manera que todo o un tipo espedfico de un acido nucleico, tal como ARNm, se amplifique universalmente. Por ejemplo, el experto en la materia puede disenar cebadores de oligonucleotidos que se hibriden espedficamente con el acido nucleico de interes y usar estos cebadores en un experimento de pCr.

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Un "metodo de analisis de acidos nucleicos" en el contexto de la presente invencion es cualquier metodo que permita la deteccion y/o identificacion de un acido nucleico espedfico, en el que el termino "deteccion" tambien comprende la determinacion cuantitativa de un acido nucleico. La deteccion y/o identificacion puede estar basada en una amplificacion espedfica, por ejemplo, mediante la amplificacion de un fragmento de ADN espedfico usando cebadores de oligonucleotidos espedficos para dicho fragmento de ADN en la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). El experto en la materia conoce bien como disenar cebadores de oligonucleotidos que se hibridan espedficamente con el acido nucleico de interes. La deteccion y/o identificacion tambien se puede conseguir sin amplificacion, por ejemplo, secuenciando el acido nucleico que se va a analizar o por hibridacion espedfica de secuencia, por ejemplo, en el contexto de un experimento de micromatrices. Las tecnicas de secuenciacion y el analisis basado en micromatrices son procedimientos bien conocidos en el campo.

El acido nucleico que se va a aislar, amplificar o detectar y/o identificar puede ser ADN, tal como ADN genomico o ADNc, o ARN, tal como ARN mensajero (ARNm) o ARN ribosomico (ARNr). Preferiblemente, el acido nucleico es ADN. El experto en la materia conoce bien los metodos de aislamiento, amplificacion y analisis de acidos nucleicos teniendo en cuenta el conocimiento general y la bibliograffa en el campo.

El termino "tubo de reaccion listo para el uso" se refiere a tubos de reaccion repartidos en alfcuotas previamente que se pueden usar directamente para el procedimiento de la muestra. Esto tiene la ventaja de que la solucion reguladora de reaccion no se tiene que preparar ni repartir en alfcuotas antes de cada uso. En el contexto de la presente invencion, se prefiere particularmente que la composicion de lisis premezclada se proporcione en un tubo de reaccion listo para usar. Tambien se prefiere que la solucion reguladora de lisis se proporcione en un tubo de reaccion listo para usar. Preferiblemente, el tubo puede cerrarse bien, tal como un tubo de tapa de rosca. Preferiblemente, el tubo, preferiblemente el tubo de tapa de rosca tiene un volumen en el intervalo de 1 a 15 ml, preferiblemente 1 a 2 ml, preferiblemente 1.5 ml. Se prefiere un tubo de 1.5 ml, ya que se puede usar facilmente con bloques de calentamiento estandar. Sin embargo, dependiendo de la naturaleza y cantidad de muestra que se va a tratar/analizar, se puede ajustar el volumen del tubo. Preferiblemente, el tubo contiene una cantidad maxima de solucion reguladora de lisis o composicion de lisis premezclada de 1/4 del volumen del tubo, mas preferiblemente de 1/8 del volumen del tubo, en donde el volumen de la solucion reguladora de lisis y la composicion de lisis premezclada se determina sin el volumen de las perlas.

Los materiales y procedimientos descritos en este documento son apropiados para un procedimiento con un solo tubo de muestras biologicas tales como muestras corporales, en particular muestras corporales viscosas.

El termino "procedimiento de un tubo" significa que todas las etapas de procedimiento se llevan a cabo en un tubo, omitiendo la necesidad de otras etapas de manipulacion. La frase "en un tubo" significa de acuerdo con la invencion que la muestra procesada o una parte de la misma que contiene el material deseado tal como un material de acido nucleico no se transfiere de un recipiente a otro recipiente durante las etapas de procedimiento. Sin embargo, el termino "tubo" de acuerdo con la invencion pretende incluir todos los recipientes de reaccion de un tamano y forma apropiados. Preferiblemente, el "procedimiento en un solo tubo" en el contexto de la presente invencion significa "licuefaccion de un tubo", mas preferiblemente "lisis de un tubo", esto es, todas las etapas de procedimiento hasta la licuefaccion y/o lisis, respectivamente, se llevan a cabo en un recipiente. Mas preferiblemente, el material procesado de este modo se puede aplicar directamente a procedimientos posteriores tales como procedimientos de aislamiento, amplificacion, analisis y/o deteccion de acido nucleico.

Un "procedimiento automatizado" en el contexto de la presente invencion significa un procedimiento que es accionado y/o controlado por automatizacion. Preferiblemente, un "procedimiento automatizado" en el contexto de la presente invencion no requiere ni incluye ninguna etapa de manipulacion manual. De este modo, las etapas de metodo que se llevan a cabo en un procedimiento automatizado se realizan preferiblemente mediante un aparato o dispositivo que es preferiblemente programable para realizar dichas etapas de procedimiento en orden secuencial.

Un "patogeno" en el contexto de la presente invencion puede ser cualquier organismo que cause una enfermedad en otro organismo. Preferiblemente, un "patogeno" se refiere a un organismo infeccioso tal como un virus, una bacteria, protozoos, levaduras, hongos o un parasito. Preferiblemente, el patogeno en el contexto de la presente invencion es un microorganismo, tal como una bacteria, levadura, hongos o virus, mas preferiblemente una bacteria patogena humana, levadura, hongos o virus. Preferiblemente, el patogeno esta asociado con una enfermedad respiratoria. El termino "patogeno asociado con una enfermedad respiratoria" significa un patogeno que aparece habitualmente en el contexto de una enfermedad respiratoria. Por ejemplo, un patogeno asociado con una enfermedad respiratoria puede ser la causa de una enfermedad respiratoria, sin embargo, tambien puede ser un patogeno oportunista que es indicativo de una enfermedad respiratoria pero no es la causa de la misma. Preferiblemente, una bacteria en el contexto de la presente invencion es de la familia seleccionada del grupo que consiste en Mycobacteriaceae (por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium canetti, Mycobacterium caprae, Mycobacterium smegmatis, y Mycobacterium pinnipedii), Pseudomonadaceae (por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa), Mycoplasmataceae (por ejemplo, Mycoplasma pneumoniae), Chlamydiaceae (por ejemplo, Chlamydophila pneumoniae), Enterobacteriaceae (por ejemplo, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli), Staphylococcaceae (por ejemplo, Staphylococcus aureus), Streptococcaceae (por ejemplo, Streptococcus pneumoniae), Xantomonadaceae (por ejemplo, Stenotrophomonas maltophilia), Moraxellaceae (por ejemplo, Moraxella catarrhalis, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter lwoffii), Legionellaceae (por ejemplo, Legionella

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pneumophila), Burkholderiaceae (por ejemplo, Burkholderia cepacia), Corynebacteriaceae (por ejemplo, Corynebacterium diphtheria), Neisseriaceae (por ejemplo, Neisseria meningitis, Neisseria flavescens, Neisseria sicca), Bacteroides (por ejemplo, Bacteroides fragilis), y Pasteurellaceae (por ejemplo, Haemophilus influenzae), preferiblemente una levadura en el contexto de la presente invencion es de una familia seleccionada del grupo que consiste en Saccharomycetaceae (por ejemplo, Candida albicans), Sporidiobolaceae (por ejemplo, Cryptococcus neoformans), Trichocomaceae (por ejemplo, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus), y Pneumocystiaceae (por ejemplo, Pneumocystis jirovecii).

Descripcion

En un primer aspecto, la presente invencion se refiere al uso de una solucion reguladora que comprende, preferiblemente esencialmente que consiste en, preferiblemente que consiste en (i) al menos un agente caotropico,

(ii) al menos un agente reductor, y (iii) al menos una enzima proteolftica para el procedimiento de una muestra respiratoria, en la que el procedimiento comprende la lisis y licuefaccion de dicha muestra respiratoria, y en la que dicha muestra respiratoria se selecciona del grupo que consiste en esputo, pus de la cavidad paranasal, secrecion bronquial, secrecion traqueal, secrecion endotraqueal, aspirado bronquial, aspirado traqueal, aspirado endotraqueal, lavado bronquial, lavado broncoalveolar, hisopado bronquial, hisopado nasofarmgeo, hisopado larmgeo y biopsia pulmonar. Preferiblemente, la solucion reguladora comprende ademas perlas. De este modo, preferiblemente la solucion reguladora comprende, preferiblemente esencialmente consiste en, preferiblemente consiste en (i) al menos un agente caotropico, (ii) al menos un agente reductor, (iii) al menos una enzima proteolftica, y (iv) perlas. Preferiblemente, dichas perlas tienen un diametro en el intervalo de aproximadamente 300 |im a 800 |im, por ejemplo, un diametro de 300 |im, 400 |im, 500 |im, 600 |im, 700 |im, u 800 |im, y preferiblemente tienen un diametro de aproximadamente 600 |im. Preferiblemente, las perlas se lavan con acido para disolver o hidrolizar cualquier contaminante que pueda estar presente en las perlas no tratadas. Por ejemplo, las perlas, preferiblemente perlas de vidrio, pueden ser lavadas con acido por inmersion durante al menos una hora en HNO3 2 M y enjuagarlas con agua hasta que el agua de enjuague ya no sea acida. Alternativamente, las perlas de vidrio lavadas con acido se pueden obtener comercialmente, por ejemplo, de Sigma-Aldrich (numero de pedido G8772). Preferiblemente, las perlas, preferiblemente las perlas de vidrio estan presentes en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 200 a 1000 mg/ml, preferiblemente 300 a 900 mg/ml, preferiblemente 400 a 800 mg/ml. Por ejemplo, las perlas, preferiblemente de perlas de vidrio, estan presentes en una cantidad de aproximadamente 200 mg/ml, 300 mg/ml, 400 mg/ml, 500 mg/ml, 600 mg/ml, 700 mg/ml, 800 mg/ml, 900 mg/ml, o 1000 mg/ml, mas preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 550 mg/ml. Por ejemplo, se pueden adicionar 140 mg de perlas de vidrio a 250 ml de solucion reguladora para obtener una cantidad de perlas de vidrio de 560 mg/ml en la solucion reguladora (de este modo no se tiene en cuenta el volumen de las perlas de vidrio). Preferiblemente, las perlas, preferiblemente las perlas de vidrio son apropiadas para la molienda con perlas.

Preferiblemente, la naturaleza y concentracion del al menos un agente caotropico y el al menos un agente reductor se eligen de tal manera que la al menos una enzima proteolftica sea activa.

En una realizacion preferida, la naturaleza y concentracion del agente caotropico y/o la naturaleza y concentracion del agente reductor y/o la naturaleza y concentracion de la enzima proteolftica es tal que se consigue la licuefaccion y la lisis de una muestra respiratoria cuando la solucion reguladora se mezcla con la muestra, en la que la muestra es como se ha definido anteriormente. En una realizacion preferida, la naturaleza y concentracion del agente caotropico y/o la naturaleza y concentracion del agente reductor y/o la naturaleza y concentracion de la enzima proteolftica es tal que la solucion reguladora es apropiada para la lisis de al menos 2 diferentes tipos de muestras respiratorias, preferiblemente tales que la solucion reguladora es de aplicacion universal.

Se prefiere particularmente que la solucion reguladora sea de aplicacion universal para el procedimiento de muestras respiratorias que son relevantes para el diagnostico de una enfermedad respiratoria. La muestra respiratoria se selecciona del grupo que consiste en esputo, pus de la cavidad paranasal, secrecion bronquial, secrecion traqueal, secrecion endotraqueal, aspirados bronquiales, aspirados traqueales, aspirados endotraqueales, lavado bronquial, lavado broncoalveolar (BAL), hisopado bronquial, hisopado nasofarmgeo, hisopado larmgeo y biopsias pulmonares. Preferiblemente, la solucion reguladora es de aplicacion universal para el procedimiento de muestras respiratorias.

Preferiblemente, en la solucion reguladora, el agente caotropico es tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, clorhidrato de guanidinio, cloruro de guanidinio, tiocianato de alcali, isotiocianato de alcali, yoduro de alcali, o perclorato de alcali, en la que el ion alcali es preferiblemente potasio o sodio. Mas preferiblemente, el agente caotropico se selecciona del grupo que consiste en clorhidrato de guanidinio, tiocianato de guanidinio, y isotiocianato de guanidinio, en la que mas preferiblemente el agente caotropico es clorhidrato de guanidinio o tiocianato de guanidinio. El experto en la materia reconocera que pueden combinarse mas de un agente caotropico en la solucion reguladora. Por ejemplo, se pueden combinar clorhidrato de guanidinio y tiocianato de guanidinio. En una realizacion, el agente caotropico es una solucion reguladora disponible comercialmente que contiene como componente un agente caotropico, preferiblemente como un componente principal. En este contexto, "componente principal" significa que la solucion reguladora contiene, ademas del agua, principalmente el agente caotropico. Un

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ejemplo de dicha solucion reguladora comercialmente disponible que se considera un agente caotropico es la solucion reguladora de lisis Qiagen AL (Qiagen numero de pedido 19075) que contiene clorhidrato de guanidinio.

En una realizacion preferida, el agente caotropico o la combinacion de agentes caotropicos esta presente en una concentracion en el intervalo de 0.2 M a 8.0 M, preferiblemente en el intervalo de 1.0 M a 7.0 M, mas preferiblemente en el intervalo de 2.0 M a 6.0 M, mas preferiblemente en el intervalo de 2.5 M a 5.2 M. Por ejemplo, el al menos un agente caotropico, preferiblemente clorhidrato de guanidinio, puede estar presente en una concentracion de 0.2 M, 0.5 M, 0.8 M, 1.0 M, 1.5 M, 2.0 M, 2.5 M, 3.0 M, 3.5 M, 4.0 M, 4.5 M, 5.0 M, 5.5 M, 6.0 M, 6.5 M, 7.0 M, 7.5 M, u 8.0 M, preferiblemente en una concentracion de mas de 3.0 M, preferiblemente en una concentracion de mas de 4.0 M, incluso mas preferiblemente entre 5.0 M y 6.0 M, y mas preferiblemente en una concentracion de 5.5 M. El experto en la materia reconocera que la concentracion optima del agente caotropico en la solucion reguladora dependera de la naturaleza del agente caotropico, la muestra que se va a tratar, y/o la enzima proteolftica usada y se puede ajustar en base al agente caotropico o la combinacion de agente caotropicos usados. Por ejemplo, si el agente caotropico es tiocianato de guanidinio la concentracion del agente caotropico es preferiblemente en el intervalo de 0.2 M a 2.0 M, mas preferiblemente 0.2 M a 1.5 M, por ejemplo, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M, 1.0 M, 1.1 M, 1.2 M, 1.3 M, 1.4 M, o 1.5 M. Los agentes caotropicos mas preferidos son clorhidrato de guanidinio y tiocianato de guanidinio.

Como se ha descrito anteriormente, el agente caotropico contenido en la solucion reguladora se puede proporcionar mediante una solucion reguladora de lisis disponible comercialmente. En este contexto, la solucion reguladora de lisis comercialmente disponible, tal como se describe anteriormente, esta presente en la solucion reguladora preferiblemente al menos al 50% (vol/vol), preferiblemente al menos al 60% (vol/vol), preferiblemente al 70% (vol/vol), preferiblemente al menos al 80% (vol/vol), mas preferiblemente al menos al 85% (vol/vol), incluso mas preferiblemente al menos al 90% (vol/vol), y mas preferiblemente al menos al 95% (vol/vol), y es mas preferiblemente la solucion reguladora de lisis Qiagen AL.

Preferiblemente, el agente reductor se selecciona del grupo que consiste en ditiotreitol (DTT), N-acetilcistema (NALC), beta-mercaptoetanol, Tris (2-Carboximetil) fosfina (TCEP) y tiorredoxina. Preferiblemente, el agente reductor es NALC o DTT, mas preferiblemente DTT. Tambien se contempla una combinacion de mas de un agente reductor. El agente reductor o la combinacion de agentes reductores estan preferiblemente presentes en la solucion reguladora en una concentracion en el intervalo de 1.0 mM a 200 mM, preferiblemente en el intervalo de 5.0 mM a 100 mM, mas preferiblemente en el intervalo de 20 mM a 60 mM. Por ejemplo, el al menos un agente reductor, preferiblemente DTT, puede estar presente en la solucion reguladora en una concentracion de 1.0 mM, 5.0 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190mM, o 200 mM, preferiblemente la concentracion es superior a 20 mM, preferiblemente la concentracion es aproximadamente 40 ± 10 mM, mas preferiblemente aproximadamente 40 mM. Sin embargo, el experto en la materia reconocera que la concentracion del agente reductor en la solucion reguladora dependera de la naturaleza del agente reductor, de la muestra que se va a tratar, y/o la enzima proteolftica usada y se puede ajustar en base al agente reductor o combinacion de agentes reductores usados.

Preferiblemente, la enzima proteolftica en la solucion reguladora es como se describe anteriormente. Preferiblemente, la enzima proteolftica esta presente en una concentracion en el intervalo de 10 a 200 unidades/ml, preferiblemente en el intervalo de 20 a 100 unidades/ml, mas preferiblemente en el intervalo de 30 a 70 unidades/ml, mas preferiblemente en el intervalo de 40 a 60 unidades/ml. Por ejemplo, la enzima proteolftica, preferiblemente proteinasa K, puede estar presente in la solucion reguladora en una concentracion de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 unidades/ml, preferiblemente en una concentracion de 50 ± 20 unidades/ml, mas preferiblemente en una concentracion de 50 ± 5 unidades/ml, en la que preferiblemente la definicion de la unidad es como se describe anteriormente para la proteinasa K. La enzima proteolftica mas preferida es la proteinasa K. La proteinasa K es una proteasa estable con una amplia especificidad de sustrato que es muy activa incluso en presencia de agentes caotropicos y reductores, tolera una amplia gama de niveles de pH y condiciones de regulacion, y tiene una optima actividad a una temperatura de trabajo de 56°C.

Se prefiere particularmente que la solucion reguladora no contenga ninguna otra enzima que la al menos una enzima proteolftica.

En una realizacion, la solucion reguladora no contiene detergente, en particular, se prefiere que la solucion

reguladora no contenga ninguno de SDS, N-lauroil-sarcosina, Tween 20, Tween 80 y Triton-X-100. En una

realizacion, la solucion reguladora no contiene un agente quelante, en particular, se prefiere que la solucion

reguladora no contenga EDTA o EGTA. En una realizacion, la solucion reguladora no contiene (i) una enzima

distinta de la al menos una enzima proteolftica, (ii) un detergente, y (iii) un agente quelante.

En una realizacion preferida, la solucion reguladora tiene un pH que es aproximadamente neutro. En una realizacion preferida, la solucion reguladora tiene un pH en el intervalo de 5.5 a 8, esto es, un pH de 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, u 8, preferiblemente a pH de alrededor de 7. La solucion reguladora puede comprender componentes de la solucion reguladora que, por ejemplo, se pueden utilizar para ajustar el pH de la solucion reguladora. Ejemplos de tales componentes de la solucion reguladora incluyen, por ejemplo, acido 318

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{[tris(hidroximetil)metil]amino}propanosulfonico (TAPS), N,N-bis(2-hidroxi-etil)glicina (Bicina),

tris(hidroximetil)metilamina (TRIS), N-tris(hidroxilmetil)-metilglicina (Tricina), acido 4-2-hidroxietil-1- piperazinaetanosulfonico (HEPES), acido 2-{[tris(hidroximetil)metil]amino}etanosulfonico (TES), acido 3-(N- morfolino)propano-sulfonico (MOPS), piperazina-N,N'-bis(acido 2-etanosulfonico) (PIPES), acido dimetilarsmico (Cacodylate), citrato de sodio salino (SSC), y acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico (MES).

En una realizacion preferida, la solucion reguladora comprende, preferiblemente consiste esencialmente en, preferiblemente consiste en un agente caotropico en una concentracion en el intervalo de 2 a 6 M, preferiblemente 2 a 5 M, preferiblemente 2.3 a 4.7 M, a agente reductor en una concentracion en el intervalo de 25 a 75 mM, preferiblemente aproximadamente 50 mM, una enzima proteolftica en una concentracion en el intervalo de 20 a 100 unidades/ml, preferiblemente aproximadamente 50 unidades/ml, y opcionalmente perlas, preferiblemente de perlas de vidrio, de un diametro en el intervalo de 500 a 700 |iM, preferiblemente aproximadamente 600 |iM, en una concentracion en el intervalo de 500 a 700 mg/ml, preferiblemente aproximadamente 600 mg/ml. Preferiblemente, el agente caotropico es clorhidrato de guanidinio y/o el agente reductor es DTT y/o la enzima proteolftica es proteinasa K. Preferiblemente, las perlas, preferiblemente perlas de vidrio, estan presentes en la solucion reguladora.

En una realizacion particularmente preferida de la solucion reguladora, la solucion reguladora comprende, preferiblemente consiste esencialmente en, preferiblemente consiste en 80 a 95% (vol/vol) de solucion reguladora de lisis Qiagen AL, 3 a 7% (vol/vol) de DTT 1 M, 6 a 14% (vol/vol) 20 mg/ml (>600 mAu/ml) de proteinasa K, y opcionalmente perlas de vidrio, preferiblemente la solucion reguladora consiste en aproximadamente 88% (vol/(Vol/vol) de DTT 1 M, aproximadamente 4% (vol/vol) y aproximadamente 8% (vol/vol) 20 mg/ml (>600 mAU/ml) de proteinasa K a las que se pueden adicionar o no perlas de vidrio. Por ejemplo, se pueden mezclar 230 |il de ± 5 |il de solucion reguladora de lisis Qiagen AL, 10 |il ± 2 |il de DTT 1 M, 20 |il ± 4 |il y opcionalmente 140 mg ± 20 mg de perlas de vidrio de aproximadamente 600 |im de diametro para producir la solucion reguladora, en la que se adicionan preferiblemente las perlas de vidrio.

En una realizacion preferida, la solucion reguladora se proporciona en un tubo de reaccion listo para usar. En esta realizacion, la enzima proteolftica se separa preferiblemente del agente caotropico y el agente reductor. Por ejemplo, la enzima proteolftica puede estar presente en el tubo de reaccion listo para usar como mancha seca en el interior de la tapa o tapa del tubo, por ejemplo, en el interior de una tapa de rosca.

Tambien se describe en este documento, pero no se incluye en la presente invencion, el uso de (i) al menos un agente caotropico, (ii) al menos un agente reductor, y (iii) al menos una enzima proteolftica para la lisis de un ancho Espectro de muestras corporales. Preferiblemente, la lisis en este contexto abarca la provision de una mezcla de reaccion de lisis como se describe anteriormente en las definiciones. De este modo, se prefiere particularmente que el al menos un agente caotropico, el al menos un agente reductor y la al menos una enzima proteolftica se use para la lisis como se ha definido anteriormente para la mezcla de reaccion de lisis.

Preferiblemente, el al menos un agente caotropico, el al menos un agente reductor, y la al menos una enzima proteolftica son como se describen anteriormente, por ejemplo, en las definiciones y para la solucion reguladora usada en el primer aspecto de la presente invencion. Preferiblemente, las muestras corporales son como se describen anteriormente.

Dos o mas del al menos un agente caotropico, el al menos un agente reductor y la al menos una enzima proteolftica pueden estar presentes en una composicion, por ejemplo, en una composicion que comprende al menos un agente caotropico y el al menos un agente reductor, preferiblemente carente de la al menos una enzima proteolftica. En una realizacion preferida, dicha composicion es la composicion de lisis premezclada como se describe anteriormente en las definiciones. En otra realizacion, la composicion es la solucion reguladora usada en el primer aspecto de la presente invencion. Preferiblemente, la composicion esta presente en un tubo de reaccion listo para el uso. La muestra corporal y, si procede, tambien la enzima proteolftica, se adiciona preferiblemente al tubo de reaccion listo para el uso y la lisis se realiza preferiblemente en dicho tubo. Preferiblemente, toda la lisis ocurre en un solo tubo, de manera que se omite cualquiera otra etapa de manipulacion que pueda ir acompanado del riesgo de contaminacion.

En una realizacion, el al menos un agente caotropico, el al menos un agente reductor y la al menos una enzima proteolftica estan presentes en una composicion. Preferiblemente, dicha composicion es la solucion reguladora usada en el primer aspecto de la presente invencion. En esta realizacion, dicha composicion se usa preferiblemente como solucion reguladora de lisis de amplio espectro, esto es, como solucion reguladora de lisis de aplicacion universal, que es preferiblemente apropiada para, preferiblemente aplicada para, la lisis de dos o mas, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas diferentes tipos de muestras corporales, preferiblemente las muestras corporales son relevantes para el diagnostico de una enfermedad respiratoria, tal como sangre, esputo, pus, ftquido pleural, punciones pleurales, secrecion bronquial, secrecion traqueal, secrecion endotraqueal, aspirados bronquiales, aspirados traqueales, aspirados endotraqueales, lavado bronquial, lavado broncoalveolar (BAL), hisopado bronquial, hisopado nasofarmgeo, hisopado larmgeo, jugo gastrico, aspirados gastricos, y biopsias pulmonares. Preferiblemente, los diferentes tipos de muestras corporales son como se describen anteriormente.

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De este modo, la presente invencion describe el uso de una composicion que comprende (i) al menos un agente caotropico, (ii) al menos un agente reductor, y (iii) al menos una enzima proteolftica como solucion reguladora de lisis de amplio espectro, preferiblemente para muestras corporales.

Se prefiere particularmente que las muestras corporales no sean tratadas o solo se congelen antes de que se utilice la composicion como solucion reguladora de lisis de amplio espectro.

Se prefiere particularmente que, despues de la lisis, la muestra corporal sea apropiada para ser aplicada directamente a un procedimiento de aislamiento de acido nucleico, tal como procedimientos de aislamiento de acido nucleico basados en tecnologfa de perlas magneticas o de silica, sin la necesidad de procedimiento adicional tales como extraccion con solventes organicos o precipitacion antes de la aplicacion al procedimiento de aislamiento de acido nucleico. Sin embargo, dependiendo del procedimiento de aislamiento de acido nucleico, puede ser necesario complementar la muestra corporal lisada con reactivos adicionales como se describe anteriormente. Por ejemplo, en el contexto de la presente invencion se pueden usar kits de aislamiento de acidos nucleicos comercialmente disponibles, tales como el kit de tejido de ADN EZ-1 (tecnologfa de perlas magneticas) o el kit de sangre de ADN QiaAmp™ (basado en membrana de silica) de Qiagen. Para el aislamiento de acido nucleico EZ-1, la muestra corporal lisada se coloca preferiblemente directamente en la estacion de trabajo BioRobot® EZ-1 y el procedimiento adicional se realiza de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el aislamiento de acidos nucleicos QiaAmp™, se adiciona preferiblemente etanol (96-100%) a la muestra corporal lisada de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la mezcla se transfiere sobre una columna de centrifugacion QiaAmp™. Dependiendo de los componentes utilizados para la lisis de la muestra corporal, puede ser preferible adicionar una mezcla de solucion reguladora de lisis Qiagen AL y etanol (96 a 100%) a la muestra corporal lisada, preferiblemente para conseguir una proporcion final en volumen de muestra corporal (incluyendo los componentes usados para la lisis de la muestra corporal distinta de la solucion reguladora de lisis Qiagen AL) con la solucion reguladora de lisis Qiagen AL con el etanol de aproximadamente 1:1:1 antes de cargar la mezcla sobre la membrana de silica. A continuacion, se llevan a cabo las etapas adicionales del procedimiento segun lo recomendado por el fabricante. Alternativamente al aislamiento basado en membrana de silica usando una centnfuga, se puede usar una aplicacion basada en vado. Preferiblemente, se aplica una depresion de al menos 400 mbar, mas preferiblemente de al menos 600 mbar y mas preferiblemente de al menos 800 mbar para las etapas de union y de lavado en esta configuracion experimental.

La lisis de cada uno del amplio espectro de muestras corporales se realiza preferiblemente como se describe para el metodo del segundo aspecto de la presente invencion, preferiblemente, usando para cada uno del amplio espectro de muestras corporales una realizacion esencialmente identica del metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion.

En una realizacion particularmente preferida, el uso es para lisis de alto rendimiento de un amplio espectro de muestras corporales.

En un segundo aspecto, la presente invencion proporciona un metodo de procedimiento de una muestra respiratoria, en la que el procedimiento comprende la lisis y licuefaccion de dicha muestra respiratoria, dicho metodo que comprende la etapa de (i) poner en contacto la muestra respiratoria que se va a tratar con al menos un agente caotropico, al menos un agente reductor, y al menos una enzima proteolftica, y la mezcla de la muestra respiratoria, el al menos un agente caotropico, el al menos un agente reductor y la al menos una enzima proteolftica, en la que la muestra respiratoria se selecciona del grupo que consiste en esputo, pus de la cavidad paranasal, secrecion bronquial, secrecion traqueal, secrecion endotraqueal, aspirado bronquial, aspirado traqueal, aspirado endotraqueal, lavado bronquial, lavado broncoalveolar, hisopado bronquial, hisopado nasofarmgeo, hisopado larmgeo y biopsia pulmonar. Preferiblemente, los componentes de la mezcla son como se describen anteriormente, por ejemplo, en las definiciones y para el primer aspecto de la presente invencion. Preferiblemente, dicha mezcla es la mezcla de reaccion de lisis como se describe anteriormente en las definiciones.

Preferiblemente, el metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion comprende ademas la etapa de (ii) calentar la mezcla a una primera temperatura. Preferiblemente, el metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion comprende ademas la etapa de (iii) calentar la mezcla a una segunda temperatura. Preferiblemente, el metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion comprende ademas la etapa de (iv) molienda con perlas de la mezcla.

Preferiblemente, el metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion es de aplicacion universal a muestras respiratorias, preferiblemente a muestras respiratorias relevantes para el diagnostico de una enfermedad respiratoria. Preferiblemente, el metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion es aplicable a, preferiblemente, aplicado a un amplio espectro de muestras respiratorias. Preferiblemente, el metodo es para el procedimiento de un amplio espectro de muestras respiratorias.

Preferiblemente, el metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion comprende las etapas (i),

(ii) , (iii) y (iv), preferiblemente en este orden secuencial. Sin embargo, en el metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion, se puede omitir una o mas de las etapas (ii), (iii) y (iv). Por ejemplo, el metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion puede comprender las etapas (i), (ii) y (iv) o las etapas (i),

(iii) y (iv) o las etapas (i), (ii) y (iii), o las etapas (i) y (ii), o las etapas (i) y (iii), o las etapas (i) y iv). Ademas, las

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etapas individuales se pueden repetir. Por ejemplo, el metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion puede comprender las siguientes etapas en este orden secuencial: etapa (i), (iv), (ii), (iv), (iii), (iv), (iii), y

(iv), en la que dos o mas de las etapas se pueden realizar simultaneamente y/o se puede realizar una etapa durante otra etapa. Por ejemplo, se prefiere que la etapa (iv) se realice una o mas veces, por ejemplo, 1, 2, o 3 veces, durante la etapa (iii). Tambien se prefiere que se lleve a cabo la etapa (iv) para mezclar la muestra respiratoria con la solucion reguladora en la etapa (i). Ademas, se prefiere que la etapa (iv) se realice entre las etapas (ii) y (iii).

La etapa (i) comprende las etapas (a) poner en contacto (en el sentido de "que reune") los componentes de la mezcla y (b) mezclar los componentes de la mezcla, preferiblemente de tal manera que se consigue una mezcla uniforme. Los componentes pueden ponerse en contacto y mezclarse en cualquier combinacion posible de los componentes individuales.

Por ejemplo, esto incluye tambien la posibilidad de que un subconjunto de componentes de la mezcla sea (a-i) puesto en contacto y (bi) mezclado, y entonces uno o mas componentes restantes sean (a2) puestos en contacto con la mezcla de (bi) y luego (b2) mezclado hasta que todos los componentes de la mezcla se ponen en contacto y se mezclan, o que dos o mas componentes de la mezcla son (ai) puestos en contacto y (bi) mezclados y que otros dos o mas componentes son (a2) puestos en contacto y (b2) mezclados, y luego las mezclas de (bi) y (b2) son (a3) puestas en contacto y (b3) mezcladas hasta que todos los componentes de la mezcla se ponen en contacto y se mezclan, etc.

Por ejemplo, en la etapa (i), (i) todos los componentes de la mezcla pueden ponerse en contacto y mezclarse, por ejemplo, adicionando todos los componentes a un tubo de reaccion en cualquier orden secuencial posible y luego mezclando los componentes en el tubo de reaccion, o (2) todos los componentes de la mezcla, excepto la muestra respiratoria, pueden ponerse en contacto y mezclarse, y luego la muestra respiratoria se pone en contacto y se mezcla con los otros componentes puestos en contacto previamente y preferiblemente premezclados, o (3) todos los componentes de la mezcla excepto de la muestra respiratoria y la al menos una enzima proteolftica se ponen en contacto y se mezclan, y despues la muestra respiratoria se pone en contacto y se mezcla con los componentes previamente puestos en contacto y premezclados, y luego se pone en contacto la al menos una enzima proteolftica y se mezcla con los componentes previamente puestos en contacto y premezclados restantes, o (4) todos los componentes de la mezcla excepto de la muestra respiratoria y la al menos una enzima proteolftica se ponen en contacto y se mezclan, la muestra respiratoria y la enzima proteolftica se ponen en contacto y se mezclan, y despues se ponen en contacto y se mezclan los componentes previamente puestos en contacto y premezclados, etc.

En la variante (i) de ejemplo anterior, es posible que todos los componentes individuales se adicionen por separado, por ejemplo, a un tubo de reaccion, y se mezclen. Por ejemplo, los componentes individuales de la mezcla se pueden adicionar individualmente a la muestra respiratoria que se va a tratar.

En la variante (2) del ejemplo anterior, la mezcla de todos los componentes de la mezcla excepto de la muestra respiratoria es preferiblemente una composicion que comprende al menos un agente caotropico, al menos un agente reductor y al menos una enzima proteolftica, y es preferiblemente la solucion reguladora usada en el primer aspecto de la presente invencion.

En las variantes (3) y (4) del ejemplo anterior, la mezcla de todos los componentes de la mezcla excepto de la muestra respiratoria y la al menos una enzima proteolftica es preferiblemente una composicion que comprende al menos un agente caotropico y al menos un agente reductor, y es preferiblemente la composicion de lisis premezclada como se describe anteriormente en las definiciones.

La variante (3) del ejemplo anterior es una realizacion particularmente preferida del metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion.

En aquellas realizaciones, en las que algunos de los componentes de la mezcla se proporcionan como una composicion previamente contactada y preferiblemente premezclada, dicha composicion se proporciona preferiblemente en uno o mas tubos de reaccion, preferiblemente tubos de reaccion listos para usar. En estas realizaciones, la muestra respiratoria se puede adicionar directamente al tubo de reaccion, preferiblemente el tubo de reaccion listo para usar, sin tener que preparar y repartir en aftcuotas la solucion reguladora o tener que adicionar cada componente de solucion reguladora individualmente a la muestra. Los componentes que carecen opcionalmente, tales como la enzima proteolftica, se pueden adicionar, por ejemplo, junto con la muestra respiratoria o antes o posteriormente a la muestra respiratoria.

En una realizacion particularmente preferida del segundo aspecto de la presente invencion, en la etapa (i) la muestra respiratoria se pone en contacto y se mezcla con una composicion premezclada que comprende un subconjunto de componentes de la mezcla y luego los componentes restantes de la mezcla se ponen en contacto y se mezclan con la mezcla de la muestra respiratoria y la composicion premezclada. Se prefiere particularmente que la composicion premezclada que comprende un subconjunto de componentes de la mezcla comprende al menos un agente caotropico y al menos un agente reductor, pero que no contiene la al menos una enzima proteolftica. Preferiblemente, la composicion premezclada comprende todos los componentes de la mezcla, excepto la enzima

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proteolftica y la muestra respiratoria. Se prefiere particularmente que esta composicion premezclada sea la composicion de lisis premezclada como se describe anteriormente.

En esta realizacion, la muestra respiratoria que se va a tratar se pone preferiblemente en contacto con la composicion premezclada que comprende preferiblemente al menos un agente caotropico y al menos un agente reductor (sin enzima proteolftica), preferiblemente la composicion de lisis premezclada como se describe anteriormente, en la etapa (i), preferiblemente en una proporcion en volumen de muestra respiratoria con la composicion premezclada en el intervalo de 0.5:1 a 1:2, por ejemplo, en una proporcion de 0.5:1, 0.6:1, 0.7:1, 0.8:1, 0.9:1, 1:1, 1:1.2, 1:1.4, 1:1.6, 1:1.8, o 1:2, preferiblemente 1:1.1, en la que si la composicion premezclada contiene perlas el volumen de las perlas no se considera para el volumen de la composicion premezclada. Por ejemplo, se adicionan 220 |il ± 30 |il de una muestra respiratoria que se va a tratar, mas preferiblemente de una muestra respiratoria no tratada, a 240 |il ± 30 |il de la composicion de lisis premezclada (por ejemplo, que consiste en 230 |il ± 25 |il de solucion reguladora de lisis Qiagen AL y 10 |il ± 3 |il de DTT 1 M), conteniendo opcionalmente 140 mg ± 20 mg de perlas, preferiblemente perlas de vidrio, preferiblemente con un diametro de aproximadamente 600 |im. La composicion se mezcla. La al menos una enzima proteolftica se puede poner en contacto con la composicion antes, durante o despues de la mezcla. Por ejemplo, se puede adicionar la al menos una enzima proteolftica durante el mezclado si la al menos una enzima proteolftica se proporciona como una mancha seca en la tapa del tubo de reaccion y la composicion se pone en contacto con la tapa del tubo de reaccion durante el mezclado. La al menos una enzima proteolftica tambien se puede adicionar antes o despues del mezclado, por ejemplo, como una solucion. En el ejemplo anterior, por ejemplo, se pueden adicionar 20 |il de 20 mg/ml (>600 mAU/ml).

En la realizacion, en la que la muestra respiratoria se pone en contacto con la solucion reguladora usada en el primer aspecto de la presente invencion en la etapa (i), la muestra respiratoria se pone preferiblemente en contacto con la solucion reguladora en una proporcion en volumen de muestra respiratoria con la solucion reguladora en el intervalo de 0.5:1 a 1:2, por ejemplo, en una proporcion de 0.5:1, 0.6:1, 0.7:1, 0.8:1, 0.9:1, 1:1, 1:1.2, 1:1.4, 1:1.6, 1:1.8, o 1:2, preferiblemente 1:1.2, en la que el volumen de las perlas opcionales no se considera para el volumen de la solucion reguladora. Por ejemplo, se ponen en contacto 250 |il ± 30 |il de solucion reguladora, que contiene opcionalmente 140 mg ± 20 mg de perlas, preferiblemente perlas de vidrio, preferiblemente con un diametro de aproximadamente 600 |im, se ponen en contacto con 220 |il ± 30 |il de una muestra respiratoria, mas preferiblemente una muestra respiratoria no tratada.

El experto en la materia reconocera que las cantidades exactas de aftcuotas de una muestra respiratoria, tal como una muestra de esputo o una muestra de secrecion traqueal, pueden ser diffciles de conseguir si las muestras son muy mucosas, sin embargo, el sistema no es sensible a alguna variacion en la cantidad de entrada de la muestra, de este modo, la variacion en el volumen de la muestra puede ser mayor.

Preferiblemente, la muestra respiratoria se mezcla con los otros componentes de la mezcla en la etapa (i) de tal manera que se garantiza un buen contacto entre todos los componentes de la mezcla. El experto en la materia sabe perfectamente como conseguir una mezcla completa de una muestra respiratoria con los otros componentes de la mezcla. Por ejemplo, la muestra respiratoria puede ponerse en contacto con los otros componentes de la mezcla, por ejemplo, con una composicion premezclada de ciertos componentes de la mezcla como se describe anteriormente, y despues se mezcla mediante vortex o pipeteado hacia arriba y hacia abajo. Por ejemplo, la mezcla se puede mezclar mediante agitacion en vortex, preferiblemente vigorosamente, por ejemplo, durante varios segundos hasta uno a dos minutos. La mezcla tambien se puede mezclar aplicando la etapa (iv). Si se utiliza el pipeteado hacia arriba y hacia abajo, puede ser aconsejable utilizar puntas de pipeta que tengan una abertura ancha, por ejemplo, puntas de pipeta de las que se ha cortado la punta misma. En una realizacion preferida, la mezcla de la etapa (i) se incuba durante un penodo de tiempo en el intervalo de 1 minuto a 1 hora, por ejemplo, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, o 60 minutos, preferiblemente a aproximadamente la temperatura ambiente, por ejemplo, a 18, 20, 22, 24 o 26°C. El tiempo de incubacion depende de si se llevan a cabo las etapas (ii) y/o (iii) y/o (iv). El experto en la materia reconocera que al omitir la etapa (ii), (iii) y/o (iv) el tiempo de incubacion puede ser mas largo, por ejemplo, 60 minutos.

Preferiblemente, en la etapa (ii) la mezcla se calienta a una primera temperatura a la cual la enzima proteolftica es preferiblemente activa. Por ejemplo, si la enzima proteolftica es proteinasa K, la primera temperatura esta preferiblemente en el intervalo de 45 a 60°C, preferiblemente de 50 a 60°C, mas preferiblemente de 54 a 58°C, y mas preferiblemente la primera temperatura es aproximadamente 56 ± 1°C. Preferiblemente, la mezcla se mantiene a la primera temperatura, preferiblemente durante un penodo de tiempo que permite que la enzima proteolftica actue sobre las protemas en la muestra respiratoria, tal como durante un penodo de tiempo en el intervalo de 5 a 60 minutos, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, o 60 minutos, preferiblemente al menos 10 minutos. El experto en la materia sera consciente de que el tiempo de incubacion para conseguir un determinado resultado proteolftico puede tener que ajustarse a las condiciones de regulacion y temperatura. Por ejemplo, si se utiliza una temperatura suboptima y/o la solucion reguladora contiene componentes que inhiben la actividad de la enzima proteolftica, el tiempo de incubacion se extiende idealmente.

Preferiblemente, la mezcla se calienta en la etapa (iii) hasta una temperatura suficiente y/o durante un tiempo suficiente para causar la licuefaccion de la muestra, mas preferiblemente para provocar la lisis de la muestra, esto

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es, la lisis de las celulas presentes en la muestra. Preferiblemente, la mezcla se calienta en la etapa (iii) hasta una temperature suficiente y/o durante un tiempo suficiente para provocar la solubilizacion de componentes viscosos y solidos en la muestra. Preferiblemente, la etapa de calentamiento (iii) comprende la inactivacion de las celulas de la muestra, en particular, la inactivacion de microorganismos, tales como celulas bacterianas y/o de levadura. Preferiblemente, las micobacterias son inactivadas por calentamiento de la etapa (iii). El experto en la materia puede determinar facilmente una temperatura y una duracion apropiadas de calentamiento para producir licuefaccion y/o lisis mediante experimentos sencillos que determinan la viscosidad de las muestras y/o el numero de celulas intactas o viables antes y despues de tratamientos de calentamiento bajo condiciones variables, temperaturas variables y penodos de tiempo. Por ejemplo, las muestras se pueden calentar a 80°C durante 5 minutos, 85°C durante 5 minutos, 90°C durante 5 minutos, 95°C durante 5 minutos, 98°C durante 5 minutos, 80°C durante 10 minutos, 85°C durante 10 minutos, 90°C durante 10 minutos, 95°C durante 10 minutos, 98°C durante 10 minutos, 80°C durante 15 minutos, 85°C durante 15 minutos, 90°C durante 15 minutos, 95°C durante 15 minutos, o 98°C durante 15 minutos, y la viscosidad y/o el numero de celulas intactas o viables se pueden determinar antes y despues de la etapa de calentamiento. El experto en la materia reconocera que la temperatura de calentamiento optima y la duracion del calentamiento dependen de la naturaleza de la muestra usada. Se prefiere particularmente que la etapa de calentamiento (iii) comprenda la lisis de al menos parte de las celulas, preferiblemente de todas las celulas presentes en la muestra. Mas preferiblemente, despues de la etapa de calentamiento (iii), no estan presentes en la mezcla celulas viables, mas preferiblemente ninguna micobacteria viable, en particular ningun M. tuberculosis viable. El experto en la materia sabe muy bien como determinar si las bacterias viables estan presentes en la mezcla, por ejemplo, mediante pruebas de cultivo. Preferiblemente, la mezcla se calienta en la etapa (iii) hasta una temperatura en el intervalo de 80°C a 99°C, por ejemplo, a 80°C, 85°C, 90°C, 92°C, 94°C, 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, o 99°C, mas preferiblemente la mezcla se calienta al menos a 90°C, mas preferiblemente hasta aproximadamente 96°C. Preferiblemente, la mezcla se mantiene a la temperatura a la que se calienta, preferiblemente durante un penodo de tiempo en el intervalo de 5 a 30 minutos, por ejemplo, durante 5, 10, 15, 20, 25 o 30 minutos, mas preferiblemente durante al menos 10 minutos, mas preferiblemente durante al menos 15 minutos. En una realizacion particularmente preferida del segundo aspecto de la presente invencion, la mezcla se calienta a 96°C ± 5°C, preferiblemente a 96°C ± 1°C, y se mantiene a esta temperatura durante 15 minutos. El experto en la materia reconocera que cualquier combinacion de temperaturas y penodos de tiempo se contempla en la presente invencion siempre que se alcancen los efectos descritos anteriormente. Por ejemplo, las muestras se pueden calentar a 90°C durante 5 minutos, 90°C durante 10 minutos, 90°C durante 15 minutos, 90°C durante 20 minutos, 90°C durante 25 minutos, 90°C durante 30 minutos, 96°C durante 5 minutos, 96°C durante 10 minutos, 96°C durante 15 minutos, 96°C durante 20 minutos, 96°C durante 25 minutos, o 96°C durante 30 minutos etc.

Preferiblemente, las condiciones de la etapa de molienda con perlas (iv) del metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion son tales que una o mas propiedades ffsicas de la mezcla son diferentes antes y despues de la etapa de molienda con perlas. Preferiblemente, la mezcla es mas homogenea despues de molienda con perlas, mas preferiblemente la mezcla es menos viscosa despues de la molienda con perlas, por ejemplo, al menos por un factor de 2, y mas preferiblemente la molienda con perlas comprende la lisis de celulas presentes en la mezcla, mas preferiblemente lisis de celulas bacterianas y/o de levaduras. Preferiblemente, las perlas utilizadas para el procedimiento de molienda con perlas en la etapa (iv) del metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion tienen un diametro en el intervalo de aproximadamente 300 |im a 800 |im, por ejemplo, un diametro de 300 |im, 400 |im, 500 |im, 600 |im, 700 |im, u 800 |im, y preferiblemente tienen un diametro de aproximadamente 600 |im. Preferiblemente, las perlas, preferiblemente las perlas de vidrio se lavan con acido para disolver o hidrolizar cualquier contaminante como se describe para el primer aspecto de la presente invencion. Preferiblemente, la mezcla que contiene las perlas, preferiblemente las perlas de vidrio, se agita a una velocidad en el intervalo de 1500 a 3500 rpm, por ejemplo, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3250, 3500 rpm, mas preferiblemente a una velocidad de 2000 ± 100 rpm, preferiblemente durante un periodo de tiempo de al menos 2 minutos, preferiblemente de al menos 5 minutos, preferiblemente usando un agitador tipo vortex estandar tal como un agitador tipo vortex IKA. Alternativamente o ademas de un agitador tipo vortex, se puede usar un molino de perlas para la molienda con perlas. El molino de perlas se acciona preferiblemente a una velocidad de molienda relativa a una aceleracion en el intervalo de 50 a 200 g, preferiblemente de 50 a 100 g, preferiblemente de aproximadamente 100 g, preferiblemente de 2 a 10 minutos, preferiblemente de 3 a 8 minutos, preferiblemente de aproximadamente 5 minutos. Preferiblemente, la etapa de molienda con perlas se realiza a una temperatura elevada, por ejemplo, a una temperatura por encima de 40°C, preferiblemente por encima de 50°C, preferiblemente por encima de 60°C, preferiblemente por encima de 70°C, mas preferiblemente por encima de 80°C, mas preferiblemente por encima de 90°C, y mas preferiblemente la molienda con perlas de la etapa se lleva a cabo a aproximadamente 96°C.

En una realizacion preferida, la etapa de molienda con perlas (iv) se realiza en paralelo a la etapa de calentamiento (ii) o (iii), preferiblemente en paralelo a la etapa de calentamiento (iii). La expresion "una etapa se realiza en paralelo al otro", por ejemplo, puede significar que la etapa se realiza simultaneamente a la otra o que la etapa se realiza en la otra, en la que "simultaneamente" significa preferiblemente que se llevan a cabo ambas etapas durante el mismo periodo de tiempo y simultaneamente y en la que "durante" preferiblemente significa que se realiza una etapa mas corta al menos una vez, tal como una vez, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas veces durante una etapa mas larga. De este modo, se prefiere particularmente que la etapa (iv) se realice simultaneamente a, o al menos una vez, preferiblemente dos veces, durante la etapa (ii) o (iii). Por ejemplo, la etapa (iii) se puede llevar a cabo durante 15

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minutos, por ejemplo, la mezcla se puede calentar a 96°C ± 5°C, preferiblemente a 96°C ± 1°C, durante 15 minutes, y la etapa (iv) se puede una vez, preferiblemente dos veces, preferiblemente al menos 1 minuto, preferiblemente al menos 2 minutos, preferiblemente al menos 3 minutos, preferiblemente al menos 5 minutos, hasta 15 minutos durante la etapa (iii). Por ejemplo, la etapa mas corta se puede iniciar al comienzo de la etapa mas larga, la etapa mas corta se puede iniciar despues de que la etapa mas larga ha comenzado y puede terminar antes de que la etapa mas larga haya terminado o la etapa mas corta se puede iniciar de tal manera que se termina junto con la etapa mas larga. Preferiblemente, la etapa mas corta se inicia al comienzo de la etapa mas larga, preferiblemente cuando se ha alcanzado la temperatura objetivo de la etapa mas larga.

En una realizacion particularmente preferida del metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion, las etapas (i), opcionalmente (ii), opcionalmente (iii) y opcionalmente (iv), por ejemplo, en este orden secuencial, se llevan a cabo en un solo tubo sin la necesidad de transferir sobrenadantes u otras etapas de manipulacion que requieran la eliminacion de la muestra/mezcla del tubo de reaccion. De este modo, preferiblemente, el metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion es un metodo de "procedimiento de un tubo". Preferiblemente, estas etapas (i), opcionalmente (ii), opcionalmente (iii) y opcionalmente (iv) del metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion se llevan a cabo en un tubo de reaccion listo para usar.

En una realizacion preferida del metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion, las etapas (ii) a (iv), preferiblemente las etapas (i)(b), esto es, mezclar los componentes de la mezcla a (iv) se llevan a cabo en un procedimiento automatizado. De este modo, es particularmente preferido mezclar los componentes de la mezcla de la etapa (i), opcionalmente (ii) calentar la mezcla a una primera temperatura, opcionalmente (iii) calentar la mezcla a una segunda temperatura, y opcionalmente (iv) la molienda con perlas de la mezcla se realiza totalmente automatizada en un solo tubo mediante un dispositivo, haciendo de este modo, que cualquier etapa de manipulacion manual, aparte de la etapa (i)(a), poner en contacto los componentes de la mezcla, sea dispensable y, de este modo, reduzca el riesgo de contaminacion. Preferiblemente, el dispositivo es programable para realizar las etapas deseadas en cualquier orden secuencial y/o repetir una o mas de las etapas. Un ejemplo de un metodo automatizado de acuerdo con la presente invencion se muestra en la figura 2. Generalmente, todas las caractensticas de las etapas del metodo descritas anteriormente son tambien aplicables al procedimiento automatizado. La automatizacion del metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion es altamente ventajosa proporcionando las mejores eficiencias de lisis y tiempos de procedimiento reducidos y no sena posible sin la presente invencion, ya que solo la presente invencion proporciona la oportunidad de realizar una lisis completa de una muestra respiratoria en un solo tubo, esto es, en un procedimiento de un tubo. El procedimiento automatizado es particularmente preferido para las muestras que se sospecha que contienen organismos altamente patogenos tales como micobacterias, por ejemplo, M. tuberculosis.

En una realizacion preferida del segundo aspecto de la presente invencion, el metodo comprende la licuefaccion de la muestra respiratoria, tal como esputo o secrecion traqueal. Preferiblemente, el metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion comprende la lisis de las celulas presentes en la muestra, mas preferiblemente lisis e inactivacion de patogenos, en particular de micobacterias, presentes en la muestra. Preferiblemente, la muestra respiratoria, no se trata, en particular no se aclaro o descontamino, antes de la etapa (i). Esto significa que la muestra respiratoria no se trata con agentes tales como DTT o NALC o una combinacion de estos reactivos para clarificar/licuar la muestra o con SDS, NaOH, NALC, o una combinacion de estos reactivos para descontaminar la muestra antes de la etapa (i). La "descontaminacion" significa preferiblemente que cualquier organismo distinto de las micobacterias, en particular M. tuberculosis, tal como las bacterias, la levadura o la flora huesped, se inactive antes de cultivar la mezcla para detectar la presencia de micobacterias en la muestra. Sin embargo, aunque el metodo del segundo aspecto de la presente invencion se contempla para muestras respiratorias que no han sido descontaminadas antes de la etapa (i), preferiblemente que no han sido tratadas antes de la etapa (i), se hace hincapie en que el metodo es tambien apropiado para muestras respiratorias descontaminadas o previamente tratadas.

En una realizacion preferida, la muestra respiratoria no se trata antes de realizar la etapa (i) del metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion. En otra realizacion, la muestra respiratoria se congela antes de realizar la etapa (i) del metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion, sin embargo, preferiblemente el metodo no comprende ninguna etapa de procedimiento antes de la etapa (i) que no sea la congelacion de la muestra. De este modo, en una realizacion preferida, el unico procedimiento de la muestra respiratoria antes de realizar la etapa (i) es la congelacion de la muestra.

En una realizacion particularmente preferida del segundo aspecto de la presente invencion, la mezcla se calienta en las etapas (ii) y (iii) como se describe anteriormente y se muele con perlas en la etapa (iv) como se describe anteriormente. Por ejemplo, la mezcla se puede calentar a 56 ± 3°C durante 10 a 20 minutos, preferiblemente durante 10 minutos en la etapa (ii), a 96 ± 5°C durante 10 a 20 minutos, preferiblemente durante 15 minutos en la etapa (iii), y despues se muele con perlas a 2000 ± 100 rpm o 100 ± 10 g durante al menos 5 minutos en la etapa (iv). Tambien se contempla cualquier otra combinacion de las condiciones de molienda con perlas y calentamiento descritas anteriormente. Sin embargo, se hace hincapie en que el metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion puede omitir cualquiera de las etapas de calentamiento (ii) o (iii) y/o la etapa (iv) de molienda con

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perlas. El experto en la materia reconocera que si se omite una o mas de las etapas (ii), (iii) y (iv) la mezcla de la etapa (i) se incuba preferiblemente durante un tiempo suficiente para causar cambios en una o mas propiedades ffsicas de la muestra, preferiblemente disminucion de la viscosidad, por ejemplo, al menos en un factor de 2, y mas preferiblemente durante un tiempo suficiente para provocar la lisis y/o la inactivacion de patogenos presentes en la muestra. Como se ha descrito anteriormente, el experto en la materia conoce bien como determinar tales cambios en las propiedades ffsicas.

En una realizacion adicional del segundo aspecto de la presente invencion, el metodo comprende ademas la etapa de (v) aislar un acido nucleico de la mezcla. La etapa (v) se realiza preferiblemente despues de la ultima etapa del metodo como se describe anteriormente. De este modo, si el metodo comprende la etapa (i) y las etapas (ii), (iii) y (iv) se omiten, el acido nucleico se afsla de la mezcla despues de la etapa (i), si el metodo comprende las etapas (i) y (ii), el acido nucleico se afsla de la mezcla despues de la etapa (ii), etc. Mas preferiblemente, las perlas que estan opcionalmente presentes en la mezcla se eliminan antes de que la mezcla se aplique a un procedimiento de aislamiento de acido nucleico. Por ejemplo, las perlas pueden ser eliminadas dejando que las perlas se depositen por gravedad y transfiriendo el sobrenadante a un tubo de reaccion fresco. Mas preferiblemente, la mezcla obtenida despues de la ultima etapa del metodo, esto es, la etapa (i), (ii), (iii) o (iv) es apropiada para ser aplicada directamente a un procedimiento de aislamiento de acido nucleico sin la necesidad de procesamiento adicional tal como extraccion con solventes organicos o precipitacion antes de la aplicacion al procedimiento de aislamiento de acido nucleico. De este modo, en una realizacion particularmente preferida, la mezcla se aplica directamente a un procedimiento de aislamiento de acido nucleico sin ningun procedimiento adicional tal como extraccion usando solventes organicos o precipitacion antes de la aplicacion al procedimiento de aislamiento de acido nucleico. Sin embargo, dependiendo del procedimiento de aislamiento de acido nucleico usado puede ser necesario suplementar la mezcla con reactivos adicionales como se describe anteriormente, por ejemplo, en las definiciones y el segundo aspecto de la presente invencion. El procedimiento de aislamiento de acido nucleico se lleva a cabo preferiblemente tal como se describe anteriormente, por ejemplo, usando preferiblemente una tecnologfa de aislamiento de acido nucleico basada en perlas magneticas o basada en silica, tales como un procedimiento de aislamiento de acido nucleico basado en membranas de silica o perlas de silica, preferiblemente basado en membranas de silica.

El metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion puede comprender etapas adicionales, tales como ajustar el pH, preferiblemente neutralizar la mezcla, por ejemplo, antes de la etapa (ii) del metodo. Por ejemplo, el ajuste del pH, preferiblemente la neutralizacion de la mezcla se puede realizar usando uno o mas componentes de la solucion reguladora, por ejemplo, como se describe anteriormente para el primer aspecto de la presente invencion.

En una realizacion particularmente preferida del segundo aspecto de la presente invencion, el metodo comprende, preferiblemente consiste esencialmente en, preferiblemente consiste en las etapas, preferiblemente en este orden secuencial, (i) proporcionar una mezcla que comprende la muestra respiratoria que se va a tratar, al menos un agente caotropico, al menos un agente reductor, y al menos una enzima proteolttica, preferiblemente, proporcionando preferiblemente una mezcla de reaccion de lisis como se describe anteriormente, ajustando opcionalmente el pH preferiblemente a un pH aproximadamente neutro o alcalino, (iv) opcionalmente molienda con perlas de la mezcla durante 10 a 60 segundos, tales como 30 segundos, preferiblemente a aproximadamente temperatura ambiente, (ii) incubar la mezcla a 56 ± 4°C durante al menos 10 minutos, tal como durante 10, 12, 15, 20, o 25 minutos, opcionalmente realizar la etapa (iv) molienda con perlas durante 10 a 60 segundos, tal como durante 30 segundos, al menos una vez, preferiblemente dos veces durante la etapa previa (ii), opcionalmente (iv) molienda con perlas de la mezcla durante 10 a 60 segundos, tal como 30 segundos, (iii) incubar la mezcla a 96 ± 5°C durante preferiblemente 10 a 30 minutos, tal como 15 minutos, opcionalmente realizar la etapa (iv) molienda con perlas de durante 10 a 60 segundos, tal como durante 30 segundos, al menos una vez, preferiblemente dos veces durante la etapa previa (iii), y (iv) molienda con perlas de la mezcla, preferiblemente usando un molino de perlas, durante 2 a 10 minutos, tal como durante 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 minutos, preferiblemente durante 5 minutos, preferiblemente durante la etapa previa (iii), preferiblemente comenzando al principio de la etapa (iii), o aproximadamente a temperatura ambiente despues de la etapa previa (iii). Preferiblemente, las etapas se realizan en un procedimiento automatizado a partir de la etapa de mezcla de los componentes de la mezcla en la etapa (i).

En un tercer aspecto, la presente invencion proporciona un metodo de analisis de una muestra respiratoria que comprende el procedimiento de la muestra respiratoria de acuerdo con el metodo del segundo aspecto de la presente invencion y (vi) aplicar la mezcla a un metodo de amplificacion/analisis de acido nucleico. Preferiblemente, la mezcla en este contexto es la muestra respiratoria considerablemente lisada, preferiblemente completamente lisada, mas preferiblemente la mezcla en este contexto es el eluato obtenido a partir del procedimiento de aislamiento de acido nucleico (v). Preferiblemente, la mezcla se refiere a la mezcla obtenida en la ultima etapa del metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion.

En un cuarto aspecto, la presente invencion proporciona un metodo de deteccion de la presencia de un patogeno en una muestra respiratoria que comprende el procedimiento de la muestra respiratoria de acuerdo con el metodo del segundo aspecto de la presente invencion y (vi) aplicar la mezcla a un metodo de amplificacion/analisis de acido nucleico que es apropiado para la deteccion de dicho patogeno. Preferiblemente, la mezcla en este contexto es la muestra respiratoria considerablemente lisada, preferiblemente completamente lisada, mas preferiblemente la

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mezcla en este contexto es el eluato obtenido a partir del procedimiento de aislamiento de acido nucleico (v). Preferiblemente, la mezcla se refiere a la mezcla obtenida en la ultima etapa del metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion.

Si el patogeno es una bacteria, la bacteria es preferiblemente de una familia seleccionada del grupo que consiste en Mycobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Mycoplasmataceae, Chlamydiaceae, Enterobacteriaceae, Staphylococcaceae, Streptococcaceae, Xantomonadaceae, Moraxellaceae, Legionellaceae, Burkholderiaceae, Corynebacteriaceae, Neisseriaceae, Bacteroides, y Pasteurellaceae. Si el patogeno es una levadura, la levadura es preferiblemente de una familia seleccionada del grupo que consiste en Saccharomycetaceae, Sporidiobolaceae, Trichocomaceae, y Pneumocystidaceae. Ademas, tambien se pueden detectar micobacterias que no estan asociadas con una enfermedad usando el metodo de acuerdo con el cuarto aspecto de la presente invencion. Las siguientes especies de la familia Mycobacteriaceae se pueden detectar usando el metodo de acuerdo con el cuarto aspecto de la presente invencion: M. abscessus, M. africanum, M. agr, M. aichiense, M. alvei, M. arosiense, M. arupense, M. asiaticum, M. aubagnense, M. aurum, M. austroafricanum, complejo Mycobacterium avium (MAC) (grupo de especies que son una causa significativa de muerte en pacientes con AIDS, las especies en este complejo incluyen: M. avium, M. avium paratuberculosis, que ha estado implicado en la enfermedad de Crohn en humanos y la enfermedad de Johne en ovejas, M. avium silvaticum, M. avium "hominissuis", M. colombiense), M. boenickei, M. bohemicum, M. bolletii, M. botniense, M. bovis, M. branderi, M. brisbanense, M. brumae, M. canariasense, M. caprae, M. celatum, M. chelonae, M. chimaera, M. chitae, M. chlorophenolicum, M. chubuense, M. conceptionense, M. confluentis, M. conspicuum, M. cookii, M. cosmeticum, M. diernhoferi, M. doricum, M. duvalii, M. elephantis, M. fallax, M. farcinogenes, M. flavescens, M. florentinum, M. fluoroanthenivorans, M. fortuitum, M. fortuitum subsp. acetamidolyticum, M. frederiksbergense, M. gadium, M. gastric, M. genavense, M. gilvum, M. goodii, M. gordonae, M. haemophilum, M. hassiacum, M. heckeshornense, M. heidelbergense, M. hiberniae, M. hodleri, M. holsaticum, M. houstonense, M. immunogenum, M. interjectum, M. intermedium, M. intracellular, M. kansasii, M. komossense, M. kubicae, M. kumamotonense, M. lacus, M. lentiflavum, M. leprae (que causa la lepra), M. lepraemurium, M. madagascariense, M. mageritense, M. malmoense, M. marinum, M. massiliense, M. microti, M. monacense, M. montefiorense, M. moriokaense, M. mucogenicum, M. murale, M. nebraskense, M. neoaurum, M. neworleansense, M. nonchromogenicum, M. novocastrense, M. obuense, M. palustre, M. parafortuitum, M. parascrofulaceum, M. parmense, M. peregrinum, M. phlei, M. phocaicum, M. pinnipedii, M. porcinum, M. poriferae, M. pseudoshottsii, M. pulveris, M. psychrotolerans, M. pyrenivorans, M. rhodesiae, M. saskatchewanense, M. scrofulaceum, M. senegalense, M. seoulense, M. septicum, M. shimoidei, M. shottsii, M. simiae, M. smegmatis, M. sphagni, M. szulgai, M. terrae, M. thermoresistibile, M. tokaiense, M. triplex, M. triviale, complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) (los miembros son agentes causantes de la tuberculosis humana y animal, las especies de este complejo incluyen: M. tuberculosis, la principal causa de la tuberculosis humana, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. canetti, M. caprae, M. pinnipedii), M. tusciae, M. ulcerans, que causa la "Buruli", o "ulcera Bairnsdale", M. vaccae, M. vanbaalenii, M. wolinskyi, y M. xenopi.

Preferiblemente, la bacteria de la familia de Mycobacteriaceae se selecciona del grupo que consiste en Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium canetti, Mycobacterium caprae, Mycobacterium smegmatis, y Mycobacterium pinnipedii, la bacteria de la familia de Pseudomonadaceae es Pseudomonas aeruginosa, la bacteria de la familia de Mycoplasmataceae es Mycoplasma pneumoniae, la bacteria de la familia de Chlamydiaceae es Chlamydophila pneumoniae, la bacteria de la familia de Enterobacteriaceae se selecciona del grupo que consiste en Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloaceae, Enterobacter sakazakii, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, Morganella morganii, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Salmonella enterica, Serratia marcescens, y Yersinia pseudotuberculosis, la bacteria de la familia de Pasteurellaceae se selecciona del grupo que consiste en Haemophilus influenzae y Haemophilus parainfluenzae, la bacteria de la familia de Staphylococcaceae se selecciona del grupo que consiste en Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis y otros estafilococos coagulasa negativos (flora huesped apatogena: Gemella haemolysans, Gemella morbillorum), la bacteria de la familia de Streptococcaceae se selecciona del grupo que consiste en Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, y Streptococcus agalactiae (flora huesped apatogena: Streptococcus salivarius, Streptococcus mitis, Streptococcus orals, y Streptococcus sanguinans), la bacteria de la familia Xanthomonadaceae es Stenotrophomonas maltophilia, la bacteria de la familia de Moraxellaceae se selecciona del grupo que consiste en Moraxella catarrhalis, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus (flora), y Acinetobacter lwoffii, la bacteria de la familia de Legionellaceae es Legionella pneumophila, la bacteria de la familia Burkholderiaceae es Burkholderia cepacia, la bacteria de la familia Corynebacteriaceae es Corynebacterium diphtheria, la bacteria de la familia Neisseriaceae se selecciona del grupo que consiste en Neisseria meningitis, Neisseria flavescens, y Neisseria sicca, y la bacteria de la familia de Bacteroides es Bacteroides fragilis.

Preferiblemente, la levadura de la familia Saccharomycetaceae se selecciona del grupo que consiste en Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida lusitania, Candida parapsilosis, y Candida tropicalis, la levadura de la familia Sporidiobolaceae es Cryptococcus neoformans, la levadura de la familia Trichocomaceae se selecciona del grupo que consiste en Aspergillus flavus y Aspergillus fumigatus, y la levadura de la familia Pneumocystidaceae es Pneumocystis jirovecii.

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En una realizacion preferida del tercer y cuarto aspecto de la presente invencion, el metodo de amplificacion/analisis de acido nucleico se selecciona del grupo que consiste en reaccion en cadena de polimerasa (PCR), amplificacion basada en secuencias de acidos nucleicos (NASBA), reaccion de cadena de ligasa (LCR), amplificacion de desplazamiento de cadena (SDA), amplificacion de replicasa Q-beta, amplificacion isotermica mediada por bucle, amplificacion de desplazamiento multiple (MDA) y analisis de micromatrices. Sin embargo, se observa que se puede aplicar cualquier otro metodo de amplificacion/analisis de acido nucleico en el contexto de la presente invencion. Basandose en el conocimiento general y en la bibliograffa en el campo, el experto en la materia conoce bien los metodos de amplificacion/analisis de acidos nucleicos y como llevar a cabo tales metodos. En una realizacion preferida particular, el metodo de amplificacion/analisis de acido nucleico es PCR.

Mas preferiblemente, el procedimiento de amplificacion de acido nucleico en el contexto de los aspectos tercero y cuarto de la presente invencion es apropiado para detectar, incluso mas preferiblemente para identificar, el patogeno, en el que el patogeno es preferiblemente una bacteria o levadura como se describe anteriormente. Por ejemplo, el acido nucleico contenido en la mezcla, lisado, o eluato obtenido por el metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion puede ser amplificado por PCR usando cebadores que son espedficos para el patogeno que se va a detectar, por ejemplo, la micobacteria. El experto en la materia conoce muy bien como disenar dichos cebadores espedficos basados en la secuencia del genoma del patogeno que generalmente esta disponible publicamente, por ejemplo, en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) pagina de inicio (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov)

Un quinto aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo de diagnostico de una enfermedad respiratoria en un sujeto que comprende el procedimiento de una muestra respiratoria de acuerdo con el metodo del segundo aspecto de la presente invencion y (vi) aplicar la mezcla a un metodo que es apropiado para diagnosticar la enfermedad respiratoria. Preferiblemente, la mezcla en este contexto es la muestra respiratoria considerablemente lisada, preferiblemente completamente lisada, mas preferiblemente la mezcla en este contexto es el eluato obtenido del procedimiento de aislamiento de acido nucleico. Preferiblemente, la mezcla se refiere a la mezcla obtenida en la ultima etapa del metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion. Preferiblemente, la muestra respiratoria es relevante para el diagnostico de una enfermedad respiratoria. Preferiblemente, la enfermedad respiratoria es una enfermedad respiratoria infecciosa o un tumor del sistema respiratorio. Preferiblemente, la enfermedad respiratoria se debe a una infeccion viral, bacteriana, fungica o de levadura, o es un tumor del sistema respiratorio. Preferiblemente, la enfermedad respiratoria es como se ha definido anteriormente, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en neumoma, tuberculosis, bronquitis, infecciones de patogenos durante la fibrosis qrnstica o enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD), y los tumores del sistema respiratorio.

Un metodo que es apropiado para diagnosticar la enfermedad respiratoria en este contexto es preferiblemente un metodo de diagnostico molecular, preferiblemente un metodo de amplificacion/analisis de acido nucleico, preferiblemente como se describe anteriormente. Por ejemplo, las infecciones de las vfas respiratorias se pueden detectar o diagnosticar detectando, preferiblemente identificando el patogeno infeccioso, y los tumores de las vfas respiratorias pueden ser detectados o diagnosticados detectando ciertos antfgenos asociados a tumores en las muestras respiratorias lisadas. Por ejemplo, el metodo de acuerdo con el quinto aspecto puede comprender el metodo de acuerdo con el tercer o cuarto aspecto de la presente invencion. De este modo, por ejemplo, el metodo de deteccion de la presencia de un patogeno en una muestra respiratoria de acuerdo con el cuarto aspecto de la presente invencion se puede utilizar para diagnosticar una enfermedad respiratoria, en particular una enfermedad respiratoria infecciosa, de acuerdo con el quinto aspecto de la presente invencion.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo de procedimiento de al menos dos muestras respiratorias, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 50, 60, 70, 80, 90 o mas de 100 muestras respiratorias, que comprende el procedimiento de cada una de las al menos dos respiratorias corporales de acuerdo con el metodo del segundo aspecto de la presente invencion, en la que las al menos dos muestras respiratorias son preferiblemente diferentes tipos de muestras respiratorias.

Se describe adicionalmente en este documento pero no se incluye en la presente invencion un metodo de analisis de al menos dos muestras respiratorias, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 50, 60, 70, 80, 90 o mas de 100 muestras respiratorias, que comprende analizar cada una de las al menos dos muestras respiratorias de acuerdo con el metodo del tercer aspecto de la presente invencion, en la que las al menos dos muestras respiratorias son preferiblemente diferentes tipos de muestras respiratorias y un metodo de deteccion de la presencia de un patogeno en al menos dos muestras respiratorias, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 50, 60, 70, 80, 90 o mas de 100 muestras respiratorias, que comprende detectar la presencia de un patogeno en cada una de las al menos dos muestras respiratorias de acuerdo con el metodo del cuarto aspecto de la presente invencion, en la que las al menos dos muestras respiratorias son preferiblemente diferentes tipos de muestras respiratorias. Preferiblemente, las al menos dos muestras respiratorias se procesan usando una realizacion similar, preferiblemente identica, del metodo de acuerdo con el segundo, tercer o cuarto aspecto de la presente invencion. Preferiblemente, los metodos segun estos aspectos se llevan a cabo en un entorno de alto rendimiento.

Se describe adicionalmente en este documento, pero no se abarca en la presente invencion un metodo para el procedimiento de un amplio espectro de muestras respiratorias que comprende el procedimiento de cada uno del amplio espectro de muestras respiratorias de acuerdo con el metodo del segundo aspecto de la presente invencion,

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un metodo de analisis de un amplio espectro de muestras respiratorias que comprende analizar cada uno del amplio espectro de muestras respiratorias de acuerdo con el metodo del tercer aspecto de la presente invencion, y un metodo de deteccion de la presencia de un patogeno en un amplio espectro de muestras respiratorias que comprende detectar la presencia de un patogeno en cada uno del amplio espectro de muestras respiratorias de acuerdo con el metodo del cuarto aspecto de la presente invencion. Preferiblemente, las muestras respiratorias del amplio espectro de muestras respiratorias se procesan usando una realizacion similar, preferiblemente identica del metodo de acuerdo con el segundo, tercer o cuarto aspecto de la presente invencion. Preferiblemente, los metodos segun estos aspectos se llevan a cabo en un entorno de alto rendimiento.

Se describe adicionalmente en este documento, pero no se incluye en la presente invencion un lisado de una muestra corporal que comprende una muestra corporal, preferiblemente una muestra corporal que es apropiada para el diagnostico de una enfermedad respiratoria, al menos un agente caotropico, al menos un agente reductor, y al menos una enzima proteolftica. Preferiblemente, los componentes del lisado son como se describen anteriormente, por ejemplo, en las definiciones y en el primer aspecto de la presente invencion. Preferiblemente, "muestra corporal" significa "los componentes de una muestra corporal". De este modo, "un lisado de una muestra corporal que comprende una muestra corporal" significa preferiblemente "un lisado de una muestra corporal que comprende los componentes de una muestra corporal".

En una realizacion, el lisado comprende una muestra corporal, preferiblemente como se describe anteriormente, y la solucion reguladora usada en el primer aspecto de la presente invencion. En una realizacion, el lisado es la mezcla de reaccion de lisis como se describe anteriormente, en la que preferiblemente, la muestra corporal se desintegra, por ejemplo, licuada, preferiblemente lisada.

La enfermedad respiratoria se debe preferiblemente a una infeccion viral, bacteriana, fungica o de levadura. Preferiblemente, la enfermedad respiratoria es como se describe anteriormente, y preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en neumoma, tuberculosis, bronquitis, infecciones patogenas durante la fibrosis qmstica o enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD) y tumores del sistema respiratorio. Preferiblemente, la muestra corporal no se trata antes de ponerse en contacto con los otros componentes del lisado.

En una realizacion, el lisado se prepara mediante o se puede obtener mezclando la muestra y la solucion reguladora de lisis descritas en este documento en una proporcion en volumen de la muestra con la solucion reguladora de lisis en el intervalo de 0.5:1 a 1:2, por ejemplo, en una proporcion de 0.5:1, 0.6:1, 0.7:1, 0.8:1, 0.9:1, 1:1, 1:1.2, 1:1.4, 1:1.6, 1:1.8, o 1:1.2, en el que, si la solucion reguladora de lisis contiene perlas, el volumen de la solucion reguladora de lisis se determina sin el volumen de las perlas. En una realizacion preferida, el lisado no tiene perlas, por ejemplo, porque la solucion reguladora de lisis no contiene perlas o las perlas se han eliminado del lisado. Preferiblemente, para producir el lisado, la mezcla de muestra corporal se calienta y/o se muele con perlas, preferiblemente se calienta y se muele con perlas como se describe anteriormente para el segundo aspecto de la presente invencion.

Ademas, el lisado tambien puede prepararse o puede obtenerse adicionando la muestra corporal a uno o mas componentes de la solucion reguladora de lisis y luego adicionando el componente(s) opcionalmente remanente de la solucion reguladora de lisis. Por ejemplo, el lisado se puede preparar o se puede obtener adicionando la muestra corporal a una composicion que comprende al menos un agente caotropico y al menos un agente reductor, preferiblemente a la composicion de lisis premezclada como se describe anteriormente, y a continuacion adicionar los componentes restantes del lisado, por ejemplo, la enzima proteolftica.

Se describe adicionalmente en este documento, pero no se incluye en la presente invencion un lisado que se puede obtener mediante el procedimiento de una muestra respiratoria de acuerdo con el metodo del segundo aspecto de la presente invencion.

Se describe adicionalmente en este documento, pero no se incluye en la presente invencion un kit que comprende (i) un agente caotropico, (ii) un agente reductor, (iii) una enzima proteolftica, y (iv) un folleto de instrucciones, preferiblemente un folleto de instrucciones para tratar una muestra corporal, preferiblemente un folleto de instrucciones para lisar una muestra corporal. Preferiblemente, los componentes del kit son como se describen anteriormente, por ejemplo, en las definiciones y en el primer aspecto de la presente invencion. Preferiblemente, la muestra corporal es relevante para el diagnostico de una enfermedad respiratoria, preferiblemente como se describe anteriormente. Preferiblemente, el kit comprende ademas perlas, preferiblemente hechas de un material solido inerte tal como vidrio, ceramica, plastico o metal tal como acero, preferiblemente como se describe anteriormente.

En una realizacion preferida del kit, se proporcionan dos o mas componentes del kit, por ejemplo, el agente caotropico y el agente reductor, en una composicion. Preferiblemente, la composicion se proporciona en uno o mas tubos de reaccion, preferiblemente tubos de reaccion listos para usar. Preferiblemente, dichos uno o mas tubos de reaccion comprenden una aftcuota de dicha composicion que es apropiada para la lisis de una muestra corporal. Preferiblemente, el volumen de dicha aftcuota esta entre 1/2 a 1/10, preferiblemente 1/4 a 1/10 del volumen del tubo de reaccion, tal como 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9 o 1/10 del volumen del tubo de reaccion. Dicha composicion puede comprender componentes distintos del agente reductor y el agente caotropico, tal como un componente de regulacion, por ejemplo, como se describe anteriormente para el primer aspecto de la presente invencion. Preferiblemente, dicha composicion no comprende la enzima proteolftica. Se prefiere que uno o mas tubos de

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reaccion comprendan tambien las perlas. Preferiblemente, dicha composicion es la composicion de lisis premezclada como se describe anteriormente en las definiciones.

Preferiblemente, el uno o mas tubos de reaccion son tubos de tapa de rosca, preferiblemente con un volumen en el intervalo de 0.2 a 50 ml, preferiblemente de 0.2 a 15 ml, preferiblemente de 0.5 a 10 ml, preferiblemente de 1 a 2 ml, preferiblemente de 1.5 ml. Los uno o mas tubos de reaccion pueden ser tambien recipientes de reaccion de formato de pozos multiples, tales como tiras de 8 o 12 recipientes de reaccion o placas de 24, 48 o 96 recipientes de reaccion, preferiblemente con una tapa que se puede cerrar con firmeza. La naturaleza y concentracion de los componentes del kit son preferiblemente como se ha definido anteriormente, por ejemplo, en las definiciones y para los componentes de la solucion reguladora usados en el primer aspecto de la presente invencion.

En una realizacion preferida del kit, la enzima proteolftica se proporciona por separado del agente caotropico y el agente reductor, por ejemplo, la enzima proteolftica se puede proporcionar en el kit en un tubo de almacenamiento separado. Alternativamente, la enzima proteolftica puede proporcionarse dentro de uno o mas tubos de reaccion que comprenden la composicion, preferiblemente la composicion de lisis premezclada, por ejemplo, en una mancha seca en la tapa del tubo, por ejemplo, en la tapa de la tapa de rosca.

En una realizacion preferida, el kit comprende ademas medios para aislar el ADN, preferiblemente una matriz de aislamiento de acido nucleico basada en una base de silica o base magnetica, preferiblemente como se describe anteriormente.

En una realizacion preferida, el kit es para la lisis de una muestra respiratoria corporal, preferiblemente como se describe anteriormente. En esta realizacion, el kit puede contener un folleto de instrucciones que describe el metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion. En otra realizacion preferida, el kit es para el analisis de una muestra respiratoria, preferiblemente como se describe anteriormente. En esta realizacion, el kit puede contener un folleto de instrucciones que describe el metodo de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invencion. En otra realizacion preferida, el kit es para detectar la presencia de un patogeno en una muestra respiratoria, preferiblemente como se describe anteriormente. En esta realizacion, el kit puede comprender ademas medios para la deteccion de un patogeno, por ejemplo, oligonucleotidos, tales como cebadores o sondas, espedficos para el acido nucleico derivado de dicho patogeno. En esta realizacion, el kit puede contener un folleto de instrucciones que describe el metodo de acuerdo con el cuarto aspecto de la presente invencion.

En otra realizacion preferida, el kit es para lisis de un amplio espectro de muestras corporales, preferiblemente para lisis de al menos 2, preferiblemente al menos 3, preferiblemente al menos 4, preferiblemente al menos 5, preferiblemente al menos 6, preferiblemente al menos 7 diferentes tipos de muestras corporales, preferiblemente como se describe anteriormente. En otra realizacion preferida, el kit es para analisis de un amplio espectro de muestras corporales, preferiblemente para analisis de al menos 2, preferiblemente al menos 3, preferiblemente al menos 4, preferiblemente al menos 5, preferiblemente al menos 6, preferiblemente al menos 7 diferentes tipos de muestras corporales, preferiblemente como se describe anteriormente. En otra realizacion preferida, el kit es para detectar la presencia de un patogeno en un amplio espectro de muestras corporales, preferiblemente para detectar la presencia de un patogeno en al menos 2, preferiblemente al menos 3, preferiblemente al menos 4, preferiblemente al menos 5, preferiblemente al menos 6, preferiblemente al menos 7 diferentes tipos de muestras corporales, preferiblemente como se describe anteriormente. En esta realizacion, el kit puede comprender ademas medios para la deteccion de un patogeno, por ejemplo, oligonucleotidos, tales como cebadores o sondas, espedficos para el acido nucleico derivado de dicho patogeno. Preferiblemente, las muestras corporales son relevantes para el diagnostico de una enfermedad respiratoria.

En otra realizacion, el kit es para el diagnostico de una enfermedad respiratoria, preferiblemente mediante diagnostico molecular, preferiblemente mediante analisis de acidos nucleicos, por ejemplo, detectando y/o identificando patogenos o un marcador de tumor del sistema respiratorio, como se describe anteriormente. En esta realizacion, el kit comprende ademas preferiblemente medios para la deteccion de un patogeno o un marcador de tumor del sistema respiratorio, por ejemplo, oligonucleotidos, tales como cebadores o sondas, espedficos para el acido nucleico derivado de dicho patogeno o para el marcador de tumor del sistema respiratorio. En esta realizacion, el kit comprende ademas preferiblemente un folleto de instrucciones que describe el metodo de acuerdo con el quinto aspecto de la presente invencion.

Preferiblemente, el kit es de aplicacion universal para la lisis de muestras corporales, preferiblemente muestras corporales relevantes para el diagnostico de una enfermedad respiratoria.

En las realizaciones preferidas, el kit es para realizar el metodo de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invencion, el metodo de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invencion, el metodo de acuerdo con el cuarto aspecto de la presente invencion, o el metodo segun el quinto aspecto de la presente invencion.

La presente invencion proporciona describe por primera vez una solucion reguladora de lisis, un uso, un metodo de procedimiento y un kit que son de aplicacion universal para la lisis de muestras corporales. Esto permite por primera vez realizar la lisis de varios tipos de diferentes muestras corporales, tales como muestras corporales relevantes para el diagnostico de una enfermedad respiratoria, en paralelo usando la misma solucion reguladora de lisis y

protocolo de procedimiento, y de este modo tratar diferentes tipos de muestras corporales en un entorno de alto rendimiento. Ademas, la presente invencion proporciona una valiosa alternativa a los enfoques existentes para el procedimiento, en particular la lisis, de muestras respiratorias, en particular tales muestras respiratorias que son diffciles de manejar, por ejemplo, muestras respiratorias tales como esputo o secreciones traqueales, especialmente 5 si se requiere el aislamiento de acidos nucleicos y su posterior analisis. Algunas de las ventajas de la presente invencion son un riesgo de infeccion bajo, especialmente si se van a detectar organismos altamente patogenos, una solubilizacion/licuefaccion eficiente y/o lisis de muestras respiratorias, una manipulacion reducida, la posibilidad de automatizar el procedimiento y llevar a cabo el procedimiento en un entorno de alto rendimiento, incluso para diferentes tipos de muestras, y compatibilidad con diferentes metodos de aislamiento de ADN.

10 Ejemplos

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar realizaciones particularmente preferidas de la presente invencion y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invencion de ninguna manera. Los expertos en la materia reconoceran que se pueden hacer diversas modificaciones a la descripcion anterior y a los siguientes ejemplos sin apartarse del espmtu y alcance de la invencion.

15 Ejemplo 1: Detalles del procedimiento y descripcion general

Materiales y equipos

Consumibles y productos qmmicos

artfculo

proveedor numero de pedido

Tubos de tapa de rosca (1.5 ml)

por ejemplo, neolab 1-6186

Tapa de rosca

por ejemplo, neolab 1-6193

Perlas de vidrio, 425 - 600 |im, lavadas con acido

Sigma-Aldrich G8772

Solucion reguladora de lisis AL

Qiagen 19075

Solucion de DL-ditiotreitol (DTT) 1 M

Sigma-Aldrich 43816

Proteinasa K (20 mg/ml, > 600 mAU/ml)

Qiagen (solucion lista para usar) 19131

alternativamente Sigma - Aldrich (solido) P2308

Etanol 96%

Carl Roth P075.3

Kit de Sangre QiaAmp™ Mini

Qiagen 51104

Eppendorf Dualfilter T.I.P.S. (50 - 1000 |il)

neolab E6513

Equipos

artfculo

proveedor comentario

Bloque de calentamiento (56 - 96°C)

por ejemplo, Eppendorf thermomixer o equivalente

Dispositivo de molino de perlas

Curetis

Mezclador tipo vortex

por ejemplo, IKA o equivalente

Centrifugadora (13000 rpm)

por ejemplo, Heraeus Biofuge fresco o equivalente

Composicion del tubo de lisis

artfculo

cantidad/concentracion

Perlas de vidrio, 600 |im, lavadas con acido

140 mg

Solucion reguladora de lisis AL

230 |il

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15

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25

30

35

40

45

Solucion de DTT 1 M

10 |il

Proteinasa K

20 |il (adicionada junto con la muestra)

Muestra del paciente

220 |il

Volumen total (reaccion final)

480 |il

Preparacion y almacenamiento de tubos de lisis (tubos de reaccion listos para el uso)

Los tubos de lisis contienen 140 mg +/- 20 mg de perlas de vidrio, 230 jl +/- 5 jl de solucion reguladora de lisis AL, 10 jl +/- 2 jl de DTT 1M. Los tubos se almacenan a una temperatura entre 15 y 25°C. La proteinasa K se almacena por separado sin contacto con solucion reguladora AL entre 15 y 25°C, ya sea en forma lfquida o como mancha seca (por ejemplo, en el interior de una tapa de rosca).

Vista general del procedimiento

El metodo de acuerdo con la presente invencion se puede llevar a cabo ya sea manualmente usando equipos de laboratorio estandar como mezcladores (agitador tipo vortex) y bloques de calentamiento o automatizados usando un dispositivo automatizado tal como un molino de perlas. Los ejemplos para un procedimiento manual y un procedimiento automatizado de acuerdo con la presente invencion se proporcionan en las figuras 1 y 2, respectivamente.

Mas preferiblemente, para mejores eficiencias y tiempos de procedimiento reducidos, el procedimiento se realiza usando un dispositivo de molienda con perlas, que es capaz de realizar agitacion, tal como rotacion alrededor de varios ejes, y etapas de calentamiento simultaneamente, lo que permite la automatizacion completa del metodo de procedimiento de acuerdo con la presente invencion.

El ejemplo A del procedimiento (Figura 1) es un procedimiento manual que utiliza un agitador tipo vortex estandar para mezclar a 2500 rpm (velocidad maxima estandar para un agitador tipo vortex IKA, los dispositivos de otros proveedores pueden variar) durante 30 segundos (otros tiempos podnan funcionar tambien), bloques de calentamiento precalentados y un dispositivo de molienda con perlas capaz de alcanzar una velocidad de molienda relativa de aprox. 100 g (otras velocidades pueden funcionar tambien, y la velocidad puede variar para otros dispositivos con geometna diferente). Observese que para todas las etapas de molienda/mezcla se retiraron los tubos del bloque de calentamiento y se procesaron a temperatura ambiente.

El ejemplo B del procedimiento (figura 2) es un procedimiento automatizado que utiliza un dispositivo de molienda con perlas que realiza todas las etapas del procedimiento. Las velocidades de molienda se relacionan con fuerzas entre 50-100 g dependiendo de las geometnas del dispositivo. A medida que los tubos se calientan junto con las camaras a las temperaturas objetivo se incluyen velocidades de rampa mas largas en este ejemplo, aun asf, los tiempos de rampa no son cnticos y tambien pueden ser considerablemente mas cortos.

Etapas del metodo

Entrada de muestra

El volumen de la muestra fue de 220 il +/- 10 il. Despues de adicionar la muestra y la proteinasa K al tubo de lisis, el tubo se mezclo vigorosamente usando un agitador tipo vortex o molino de perlas a alta velocidad (hasta 100 g) durante 1 minuto para asegurar una buena homogeneizacion de la muestra y de la solucion reguladora de lisis. La adicion de la muestra se realizo bajo un flujo laminar. Si se sospechaba de infeccion por el complejo de Mycobacterium tuberculosis, todos los trabajos se llevaron a cabo hasta que se realizo la etapa de calentamiento a 96°C en un laboratorio S3. En general, tambien se usaron puntas de filtro para la pipeteado para evitar la contaminacion cruzada de las muestras. Se recomienda el uso de puntas de filtro inclinadas con abertura ensanchada para pipetear alfcuotas de muestras altamente viscosas.

Etapas de calentamiento

La primera etapa de calentamiento se realizo a 56°C +/- 1°C durante 10 minutos para la digestion con proteinasa K. La segunda etapa de calentamiento se realizo a 96°C +/- 1°C durante 15 minutos para la lisis termica. Esta etapa preferiblemente no se reduce por debajo de 5 minutos para asegurar la licuefaccion completa. Si esta etapa se realiza para reducir el riesgo de infeccion, los requisitos legales pueden ser aplicables en diferentes entornos clmicos para la duracion minima del calentamiento. Durante y entre etapas de incubacion de 56°C y 96°C, los tubos se pueden mezclar o moler brevemente hasta 1 minuto a varias velocidades para resolver cualquier trozo de muestra no licuado.

Molienda con perlas

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La molienda con perlas se realizo con un dispositivo de molienda con perlas capaz de moler y calentar en paralelo. Alternativamente, la muestra puede ser procesada manualmente mediante mezcla vigorosa usando un agitador tipo vortex. Pueden realizarse etapas de molienda cortas a lo largo de todo el protocolo, ya sea manualmente usando un agitador tipo vortex o usando el dispositivo de molienda con perlas con 50-100 g. Una etapa de molienda final se realizo a temperatura ambiente durante varios minutos (5 minutos) despues de completar la etapa de calentamiento a 96°C o, preferiblemente, para mejorar las eficiencias de lisis y reducir los tiempos de procedimiento, durante la etapa de calentamiento a 96°C con una fuerza de hasta 100 g y un tiempo de molienda de varios minutos (5 minutos) usando el dispositivo de molienda con perlas. Si el tiempo de incubacion a 96°C excedfa el tiempo de molienda, se llevo a cabo otra etapa de molienda corta al final del procedimiento.

Finalizacion del procedimiento

Los tubos de lisis se enfriaron a una temperatura razonable despues de que el procedimiento haya terminado para evitar cualquier peligro (quemaduras) para el usuario cuando se retira el tubo del lisador.

Transferencia de sobrenadante y purificacion de ADN

Se han utilizado puntas de filtro para todas las etapas de pipeteo. Se transfirieron 400 |il +/- 10 |il de sobrenadante licuado a un nuevo tubo de tapa de rosca de 1.5 ml. Se adicionaron 200 |il +/- 10 |il de etanol al 96% al sobrenadante y el tubo se mezclo brevemente. La mezcla (aproximadamente 600 |il) se cargo en una columna de membrana de silica (QiaAmpTM) y se trato ya sea por centrifugacion o por vacfo de hasta -800 mbar de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Protocolo completo de lisis

Se han almacenado tubos de lisis listos para usar que contienen todos los reactivos necesarios y proteinasa K (ya sea lfquida o seca) a temperatura ambiente. Se recogieron muestras de pacientes frescas de acuerdo con los procedimientos clmicos estandar. Se transfirio una alfcuota de la muestra (220 |il) a un tubo de lisis. Se adiciono proteinasa K (20 pl) y la tapa de rosca del tubo de lisis se cerro hermeticamente. Para la transferencia de las partes alfcuotas de la muestra mucosa, se utilizaron puntas de pipeta de 1000 |il cortadas al sesgo.

Para el procedimiento manual, el tubo se mezclo brevemente por vortex para asegurar un contacto optimo de la solucion reguladora de lisis con la muestra, en particular, para espedmenes altamente viscosos. El tubo se coloco entonces en un bloque de calentamiento (56°C) durante 10 minutos para una digestion optima de proteinasa K. Despues de la digestion, el tubo se mezclo brevemente y se transfirio a un bloque de calentamiento (96°C) para una segunda etapa de calentamiento de 15 minutos. Una o dos veces durante las dos etapas de calentamiento, la muestra se puede extraer, se agita brevemente en agitador tipo vortex y se transfiere de nuevo al bloque de calentamiento. Despues de completarse la etapa de calentamiento a 96°C, la muestra se transfirio a un dispositivo de molienda con perlas (alternativamente, se pudo usar un agitador tipo vortex) y se realizo la molienda con perlas durante 5 minutos (hasta 100 g) para resolver cualquier partfcula de muestra no lisada. Despues de que se completaran todas las etapas de lisis, se transfirieron 400 |il del sobrenadante licuado a un nuevo tubo con tapa de rosca.

Para el procedimiento automatizado, el tubo de lisis se coloco en el dispositivo de molienda con perlas inmediatamente despues de la adicion de la muestra y de la proteinasa K, y se inicio el procedimiento de lisis sin ningun otro requisito de manipulacion o mezclado para el usuario (Figura 2). Una vez completado el procedimiento, los tubos que conteman las muestras lisadas se retiraron del dispositivo y los sobrenadantes se transfirieron como se ha descrito.

Para la purificacion del ADN QiaAmp™, se adicionaron 200 |il de etanol (96%) al sobrenadante transferido. Despues de mezclar brevemente, el lisado se transfirio a una columna de centrifugacion QiaAmp™ (Qiagen). Se llevaron a cabo otras etapas de purificacion de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El ADN se eluyo con 200 |il de agua pura.

Ejemplo 2: Variabilidad del tipo de muestra e impacto de las caractensticas de lisis

Se puntuaron 76 muestras de diferentes ongenes (respiratorias y otras muestras relevantes, como punciones y drenajes) para determinar la viscosidad, la sangre y el contenido de sedimentos para describir las diferencias de los tipos de muestra basandose en el puntaje promedio (Figura 3). El numero de muestras incluido para cada tipo se indica entre parentesis. De cada tipo de muestra, incluida la sangre, se seleccionaron muestras de referencia para cubrir toda la gama de muestras pertinentes para enfermedades respiratorias (total: 12 muestras).

Cada una de estas muestras se sometio a tres protocolos de lisis diferentes para determinar el impacto de caractensticas individuales de lisis: (a) protocolo completo manual como se describe anteriormente, (b) protocolo completo sin adicion de proteinasa K, (c) protocolo sin etapa de calentamiento a 96°C (en lugar de la muestra se coloco a temperatura ambiente). Todas las muestras han sido sometidas a una etapa final de molienda con perlas de 5 minutos, el lisado se transfirio entonces, se mezclo con etanol y se aplico a una columna de membrana de silica

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como se describe. Las eficiencias de lisis se puntuaron tras la digestion con proteinasa K (primera etapa de calentamiento), la etapa de calentamiento a 96°C, y la molienda con perlas, y se determinaron las eficiencias de lisis.

El flujo directo de las membranas de silica se controlo usando una centnfuga a velocidad reducida (4000 rpm en lugar de 8000 rpm recomendadas), despues de la aplicacion de todo el volumen de la muestra, se verificaron las membranas para el colorante o los componentes restantes de la muestra lo que podna indicar una lisis insuficiente (Figura 4). Dos muestras resultaron en membranas ligeramente coloreadas, sin embargo, esto no tuvo ningun impacto en el flujo directo. No se han detectado trozos de muestra no lisados en las membranas de silica. Para otra muestra se detecto una ligera coloracion y alguna restriccion de flujo, aunque la lisis se completo. La figura 5 muestra ejemplos tfpicos de muestras de pacientes lisadas con exito usando el metodo de procedimiento de la presente invencion (A/B: esputo, C: secrecion traqueal).

Ejemplo 3: Eficacia de la lisis y comportamiento del flujo directo de membranas de silica sin tratamiento con proteinasa K

En un segundo conjunto de experimentos, se examino el impacto de la digestion con proteinasa K, calentamiento, molienda y calentamiento/molienda paralelos con secreciones traqueales. En particular, se han seleccionado muestras con altas viscosidades y/o sedimentos. Es probable que tales muestras sean diffciles de lisar. En una primera etapa, las muestras se incubaron a 96 °C durante 15 minutos directamente despues de la adicion a la solucion reguladora de lisis (sin proteinasa K) y una mezcla de corta duracion. La molienda con perlas se realizo durante 5 minutos a temperatura ambiente despues de completar la etapa de incubacion a 96°C [M] o paralela a la etapa de calentamiento. El progreso de la lisis se controlo con el tiempo. Los sobrenadantes lisados se mezclaron entonces con etanol y se aplicaron a membranas de silica como se describe anteriormente. El flujo directo se controlo al aumentar las fuerzas centnfugas comenzando a 4000 rpm. Las figuras 6A y 6B muestran cada una dos ejemplos que reflejan la variabilidad observada para diferentes muestras.

Varias muestras mostraron restricciones de flujo, aunque la lisis parecfa ser suficiente mediante observacion visual. A veces se observaba una ligera turbidez que no se correlacionaba con flujos reducidos. Una muestra (secrecion traqueal 1) no se liso completamente cuando no se realizo una molienda paralela a 96°C.

La molienda paralela durante la etapa de incubacion a 96°C disminuyo el tiempo requerido para la lisis completa y tuvo un efecto significativo sobre la velocidad del procedimiento y el exito de la lisis.

Ejemplo 4: Eficacia de la lisis y comportamiento del flujo directo de membranas de silica con procedimiento con proteinasa K

Se incluyo una etapa de digestion con proteinasa K (56°C durante 10 minutos) y se lisaron y se monitorizaron alfcuotas de las mismas muestras que se usaron para el ejemplo 3 como se describe para el ejemplo 3.

Algunas muestras ya se lisaron durante la etapa de digestion de proteinasa K, mientras que otras no cambiaron por digestion con proteinasa K. Se redujo la turbidez y se mejoro mucho el flujo directo. Ciertas muestras que requirieron mayores fuerzas centnfugas cuando se lisaron sin la etapa de digestion con proteinasa K se realizaron ya muy bien ya a fuerzas centnfugas bajas. No se ha observado mas la muestra residual no lisada (Figura 7).

De este modo, la etapa de digestion con proteinasa K es ventajosa para la lisis de muestras corporales, por ejemplo, para esputos o secreciones, en particular, si se pretende un procedimiento de aislamiento de acido nucleico usando fuerzas centnfugas bajas o un sistema basado en vacfo. Como en el ejemplo 3, la molienda paralela durante el calentamiento mostro un claro aumento en la eficiencia de la lisis y la reduccion del tiempo de procedimiento.

Ejemplo 5: Calidad de ADN y rendimiento de PCR con diferentes tipos de muestras

Siete muestras de pacientes de diferentes ongenes se reforzaron con Pseudomonas aeruginosa (20000 patogenos/ml = 4400 patogenos/220 pl de muestra usada) y se lisaron usando el protocolo manual como se describe anteriormente en el ejemplo 1 y se muestra en la figura 1. El ADN se aislo con Kit de sangre de ADN Qia Amp usando una centnfuga. La calidad del ADN que se aislo de las muestras de pacientes reforzadas se controlo mediante analisis espectral del eluato diluido 5 veces (220-320 nm) (Figura 8).

La copurificacion putativa de los inhibidores de la PCR se comprobo mediante una prueba de inhibicion de la PCR. En resumen, se adicionaron 3 |il de 200 |il de eluato a los PCR, que producen, en ausencia de cualquier efecto inhibidor, 3 amplicones de tamano diferente con una molaridad promedio conocida. Para las pruebas de inhibicion, las molaridades generadas en presencia de los eluatos de ADN se compararon con 4 PCR de control (eluatos generados a partir de solucion salina regulada con fosfato)

Ademas, se realizo una PCR de P. aeruginosa y se compararon las molaridades de amplicon y los rendimientos de ADN de los eluatos (Figura 10).

Todos los espectros muestran la apariencia tfpica de ADN puro. Ademas, no se observo inhibicion frente a los controles. El rendimiento de ADN, sin embargo, vana fuertemente, reflejando el nivel de referencia de ADN de

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muestras individuales. Sin embargo, el nivel de amplificacion de P. aeruginosa se encontraba en un rango comparable, aunque hubo cierta variabilidad, en particular, para muestras viscosas que son diffciles de mezclar con las suspensiones de patogenos durante el refuerzo.

Ejemplo 6: Deteccion de patogenos en diferentes tipos de muestras de pacientes corporales

Se analizaron 27 muestras de pacientes usando el protocolo de lisis manual como se describe anteriormente en el ejemplo 1 y la figura 1. El ADN purificado con membrana de silica se analizo usando PCR multiples para detectar patogenos respiratorios comunes (Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, y especie Streptococcus como indicador de flora huesped). En resumen, se amplificaron 3 |il de eluato de ADN con el Kit Multiplex PCR (Qiagen) junto con cebadores multiplexados (concentracion final de cada uno 350 nM) en un volumen total de 30 |il durante 35 ciclos. Las molaridades de amplicon se determinaron usando un bioanalizador de Agilent (Figura 11).

Los resultados de PCR se compararon con los datos obtenidos de las pruebas de cultivo microbiologico para estas muestras (Figura 12). Para la mayona de las muestras, las pruebas de cultivo microbiologico no identificaron patogenos en un nivel de genero, sino que mas bien detectaron cocos, bastoncillos o flora respiratoria (huesped) en general. De hecho, las pruebas de cultivo microbiologico fueron capaces de identificar un genero patogeno en solo 5 muestras, y todos ellos fueron confirmados por un resultado positivo de PCR. Tener en cuenta que los cebadores de Haemophilus utilizados en esta prueba no discriminan entre las especies influenzae y parainfluenzae. Los resultados de estos experimentos demuestran claramente que la PCR permite un analisis y un diagnostico mucho mas sofisticados de las enfermedades respiratorias al proporcionar informacion mas diferenciada sobre los patogenos individuales que las pruebas de cultivo microbiologico.

Ejemplo 7: Realizacion del protocolo de lisis automatizado con muestras clmicas

Se ha desarrollado un dispositivo para la automatizacion completa del procedimiento de lisis y se probo el rendimiento aplicando el "ejemplo B de procedimiento" (Figura 2) en muestras clmicas que han sido probadas positivas con cultivo microbiologico. Los resultados se compararon con el protocolo de lisis manual (Figura 1). Se seleccionaron secreciones traqueales con viscosidades elevadas para esta prueba. El aislamiento de ADN de los lisados se realizo usando membranas de silica como se describe anteriormente y se realizo PCR triple en eluatos con cebadores espedficos de Pseudomonas-, Staphylococcus- y Candida (Figura 13).

Para excluir cualquier efecto de la congelacion y descongelacion de la muestra para la lisis de patogenos, se realizo un segundo conjunto de muestras reforzadas con Pseudomonas aeruginosa (gramnegativo) y Staphylococcus aureus (grampositivo) a 20000 patogenos/ml y se procesaron usando el protocolo manual o el automatizado (Figura 14).

Ambos protocolos, esto es, el protocolo manual y el automatizado, lograron reproducir los resultados obtenidos mediante pruebas de cultivo microbiologico. Ademas, se han detectado patogenos reforzados en niveles comparables en todas las pruebas. De este modo, el procedimiento automatizado es tan eficiente como el procedimiento manual.

Los datos experimentales sostienen fuertemente que la presente invencion facilitara el diagnostico molecular para muestras respiratorias para una amplia gama de todos los tipos de muestras relevantes mediante el uso de un protocolo estandarizado facil de usar. La lisis se puede combinar con procedimientos de aislamiento de acidos nucleicos, por ejemplo, usando membranas de silica, para obtener ADN de alta calidad para PCR posterior. Dicho ADN se puede usar para la deteccion rapida y simultanea de patogenos y factores de riesgo de una manera mucho mas rapida y eficiente en comparacion con el cultivo microbiologico estandar. Los tubos de lisis repartidos en almuotas previamente reducen la variacion de muestra a muestra, las etapas de manipulacion y el riesgo de infeccion. El procedimiento automatizado permite el procedimiento de muestras facil y uniforme sin la necesidad de personal entrenado y la interaccion del usuario.

Claims (13)

1. 5

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   40

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   REIVINDICACIONES

   1. Uso de una solucion reguladora que comprende:

   (i) al menos un agente caotropico,

   (ii) al menos un agente reductor, y

   (iii) al menos una enzima proteolttica

   para el procedimiento de una muestra respiratoria, en la que el procedimiento comprende la lisis y licuefaccion de dicha muestra respiratoria, y en la que dicha muestra respiratoria se selecciona del grupo que consiste en esputo, pus de la cavidad paranasal, secrecion bronquial, secrecion traqueal, secrecion endotraqueal, aspirado bronquial, aspirado traqueal, aspirado endotraqueal, lavado bronquial, lavado broncoalveolar, hisopado bronquial, hisopado nasofarmgeo, hisopado larmgeo y biopsia pulmonar.
2. 2. El uso segun la reivindicacion 1, en el que la solucion reguladora comprende ademas perlas, preferiblemente hechas de un material inerte solido tal como vidrio, ceramica, plastico o metal tal como acero.
3. 3. El uso segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la solucion reguladora es de aplicacion universal para el procedimiento de muestras respiratorias que son relevantes para el diagnostico de una enfermedad respiratoria.
4. 4. El uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el al menos un agente caotropico se selecciona del grupo que consiste en tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, clorhidrato de guanidinio, cloruro de guanidinio, tiocianato de alcali, isotiocianato de alcali, yoduro de alcali, y perclorato de alcali, y/o el al menos un agente reductor se selecciona del grupo que consiste en ditiotreitol (DTT), N-acetilcistema (NALC), beta- mercaptoetanol, Tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP), y tiorredoxina, y/o la al menos una enzima proteolftica se selecciona del grupo que consiste en una serina proteasa y una cistema proteasa, preferiblemente la al menos una enzima proteolftica se selecciona del grupo que consiste en proteinasa K, elastasa, subtilisina, y caspasa.
5. 5. El uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la solucion reguladora no contiene ninguna otra enzima que la al menos una enzima proteolftica.
6. 6. Un metodo de procedimiento de una muestra respiratoria, en el que el procedimiento comprende la lisis y licuefaccion de dicha muestra respiratoria, dicho metodo que comprende la etapa de (i) poner en contacto la muestra respiratoria que se va a tratar con al menos un agente caotropico, al menos un agente reductor y al menos una enzima proteolftica, y la mezcla de la muestra respiratoria, el al menos un agente caotropico, el al menos un agente reductor y la al menos una enzima proteolftica, preferiblemente que comprende ademas la etapa de (ii) calentar la mezcla a una primera temperatura, y/o preferiblemente que comprende ademas la etapa de (iii) calentar la mezcla a una segunda temperatura, y/o preferiblemente que comprende ademas la etapa de (iv) molienda con perlas de la mezcla,

   en la que la muestra respiratoria se selecciona del grupo que consiste en esputo, pus de la cavidad paranasal, secrecion bronquial, secrecion traqueal, secrecion endotraqueal, aspirado bronquial, aspirado traqueal, aspirado endotraqueal, lavado bronquial, lavado broncoalveolar, hisopado bronquial, hisopado nasofarmgeo, hisopado larmgeo y biopsia pulmonar.
7. 7. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que la etapa (iv) se realiza simultaneamente a o durante la etapa (iii).
8. 8. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 6 o 7, en el que las etapas (ii) a (iv) se realizan en un procedimiento automatizado.
9. 9. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, que comprende ademas la etapa de (v) aislar un acido nucleico de la mezcla, preferiblemente usando una tecnologfa de aislamiento de acido nucleico basada en perlas magneticas o basada en silica.
10. 10. Un metodo de analisis de una muestra respiratoria que comprende el procedimiento de la muestra respiratoria de acuerdo con el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 y (vi) aplicar la mezcla a un metodo de amplificacion/analisis de acido nucleico.
11. 11. Un metodo de deteccion de la presencia de un patogeno en una muestra respiratoria que comprende el procedimiento de la muestra respiratoria de acuerdo con el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 y (vi) aplicar la mezcla a un metodo de amplificacion/analisis de acido nucleico que es apropiado para la deteccion de dicho patogeno, en el que preferiblemente el patogeno esta asociado con una enfermedad respiratoria.
12. 12. Un metodo de diagnostico de una enfermedad respiratoria en un sujeto que comprende el procedimiento de una muestra respiratoria de acuerdo con el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 y (vi) aplicar la

    mezcla a un metodo que es apropiado para diagnosticar la enfermedad respiratoria, en el que preferiblemente la enfermedad respiratoria es una enfermedad respiratoria infecciosa o un tumor del sistema respiratorio.
13. 13. Un metodo de procedimiento de al menos dos muestras respiratorias que comprende el procedimiento de cada una de las al menos dos muestras respiratorias de acuerdo con el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 5 6 a 9, en el que al menos dos muestras respiratorias son diferentes tipos de muestras respiratorias.