SU1751209A1 - Рекомбинантна плазмидна ДНК pHIV 24-5, кодирующа слитый белок кор-антигена вируса гепатита В и белок оболочки вируса иммунодефицита человека, и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент слитого белка кор-антигена вируса гепатита В и белка оболочки вируса иммунодефицита человека - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к микробиологической и медицинской промышленности и биотехнологии. Целью изобретени   вл етс  получениебелка, обладающего иммуно- генной активностью кор-энтигенаи вируса гепатита В и белка оболочки вируса иммуноИзобретение относитс  к микробиологической и медицинской промышленности и биотехнологии. Целью изобретени   вл етс  получение белка, обладающего иммуногенной активностью кор-антигена вируса гепатита В и белка оболочки вируса иммунодефицита человека . Сконструирована рекомбинантна  плазмидна  ДНК, состо ща  из следующих элементов: дефицита человека. Изобретение позвол ет получить слитый белок НВсАд , состо щий из 114 N-концевых аминокислот кор-антигена вируса гепатита В (НВУ) и полной аминокислотной последовательности белка р24 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Такие белки обладают иммунологической активностью как НВсАд, так и белка р24 ВИЧ. Помимо 144 аминокислот НВсАд рекомбинантный белок НВсАд AHIVp24 содержит следующие последовательности гена gag ВИЧ: 13 аминокислот белка р17, 231 аминокислоту р24 и 74 аминокислоты р15. Синтез белка кодирует рекомбинантна  плазмида pHIV 24-5, котора  состоит из ДНК плазмиды рНВсб, несущей ген НВСАд с оптимизированным участком инициации трансл ции и с терминирующим кодоном по 144-й аминокислоте гена, и фрагмента генома ВИЧ, клонированного в плазмиде рВНЮ и соответствующего последовательности между сайтами рестрикции Pvull и Bglll в гене gag. Размер плазмиды 7900 п.о., мол.м. 5,06 МДа Ген Ыа обеспечивает устойчивость плазмиды к ампициллину. Ген НВсАд Д- HIVp24 находитс  под контролем тандема промоторов триптофанового оперона. 2 с п. ф-лы, 2 табл ДНК плазмиды рНВс5, котора   вл етс  производным плазмиды рНВсЗ, несущей ген НВсАд с оптимизированным участком инициации трансл ции, но с укороченным геном НАсАд, лишенным 39 N-концевых аминокислот и снабженным уникальным сайтом рестрикции EcoRI no 144-й аминокислоте гена, прот женностью 6700 п.о., фрагмента генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), клонированного в плазмиде рВНЮ, соответствующего послеXI сл пшД Ю о ю

Description

довательности между сайтами рестрикции Pvull и Bglll, кодирующего 13 аминокислот белка р17, 231 аминокислоту р24 и 74 аминокислоты р15 и снабженного терминирующим кодоном в фазе трансл ции белков ВИЧ, прот женностью 949 п.о.

фрагмента плазмиды рУС19, прот женностью 211 п.о.

Размер плазмиды 7900 п о , мол.м. 5,06 МДа.

В состав ДНК рекомбинантной плазмиды pHIV 24-5 вход т гены

ген НВСАд Д - HIV р24, обеспечивающий синтез конечного продукта;

ген Ыа, обеспечивающий устойчивость к ампициллину.

Ген HBcAg A - HIV р24 находитс  под контролем тандема промоторов Ptrp

Плазмида pHIV 24-5 амплифицируетс  при добавлении в среду хлорамфеникола, некоъюгативна.

Штамм-продуцент HBcAg А - HIV р24 получают трансформацией клеток Е. соИ К802 рекомбинантной плазмидной ДНК pHJV 24-5.

Штамм характеризуетс  следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки палочковидной формы, грамотрицательные.

Культуральные признаки: клетки растут на обычно используемых питательных средах , образуют колонии средней величины.

Физико-биохимические препараты, оптимальна  температура культивировани  - 37°С, оптимум рН 7,0-7,4. В качестве источника углерода используют углеводы, в качестве источника азота - минеральные соли, а также органические соединени  в виде пептона , триптона, аминокислот.

Устойчивость к антибиотикам, устойчив к ампициллину, что обусловлено наличием плазмиды. Присутствие в штамме плазмидной ДНК подтверждают путем проверки устойчивости к ампициллину, а также путем выделени  и анализа плазмидных ДНК,

Продуктивность штамма 1% химерного белка HBcAg A - HIV р24 от суммарного клеточного белка (по результатам сканировани  электрофореграмм белков, окрашенных серебром).

Штамм депонирован в коллекции Центрального музе  промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-4970.

Пример 1. 1. Конструирование ре- комбинзнтной плазмидной ДНК pHIV 24-5.

2 мкг плазмиды рНВсб расщепл ют 5 ед. рестриктазы EcoPI в 25 мкл раствора А, содержащего 0,1 М трис-HCI, рН 7,5, 0,05 М NaCt и 10 мМ MgCIa, в течение 1 ч при 37°С

Рестриктазу инактивируют 15-минутным прогреванием при 65°С. Заполнение липких концов провод т в 100 мкл раствора Б, содержащего 50 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ

MgCl2,10мМдитиотрейтол,25мМ№С1.100 мкМ dATP, dCTP, dTTP и dGTP и 5 ед. ДНК- полимеразы Е. coll (фрагмент Кленова), в течение 1 ч при 12°С. После очистки на ага- розном геле ДНК раствор ют в 20 мкл Н20

0 (ДНК1).

20 мкг плазмиды pIN G3 расщепл ют 50 ед рестриктазы Pvull в 100 мкл раствора В, содержащего 10 мМ трис-HCI, рН 7,5, 50 мМ NaCI и 10 мМ MgCl2, в течение 2 ч при 37°С,

5 нанос т инкубационную смесь на 1,5%-ный агарозный гель, фрагмент размером 1159 п о (мол.м. 0,74 МДа), несущий полную последовательность р24 с фланкирующими участками, выдел ют из агарозного гел 

0 (ДНК 2).

0,25 мкг ДНК 1 и 0,1 мкг ДНК 2 сшивают Т4 ДНК-лигазой в 10 мкл раствора Г, содержащего 50 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 10 мМ дитиотрейтол, 50 мкМ АТР и

5 10 ед. Т4 ДНК-лигазы, в течение 12 ч при 12°С. Дл  трансформации клеток к реакционной смеси добавл ют 100 мкл клеток Ё. coll RR1, обработанных 0,1 М CaCl2 (конечна  концентраци  - 5 х 109 клеток/мл),

0 Отбор клонов осуществл ют путем ре- стрикционного анализа плазмидной ДНК, выделенной экспресс-методом. Плазмида с ожидаемой рестрикционной картой получает наименование pHIV 24-5.

5 2. Штамм-продуцент Е. coll K802 (рН1 24-5)

Штамм-продуцент получают трансфор мацией клеток Е. coll K802 рекомбинантной

плазмидной pHIV24-5. Клетки выращивают

0 до оптической плотности ОПево 4-5 в солевой среде М9 с добавкой, г/л: каээминовые кислоты 10; глюкоза 2; ампициллин 0,02. Клетки собирают центрифугированием и ли- зируют в четырехкратном объеме буфера,

5 содержащего 0,05 М трис-HCI, рН 8,0; 0,15 М NaCI, 0,1% тритон X 100, 0,005 М ЭДТА, 2 мг/мл лизоцима. После инкубации в течение 30 мин при 4°С клетки подвергают трехкратному замораживанию - оттаиванию, добав0 л ют дезоксирибонуклеазу и MgCJ2 до конечной концентрации 20 мкг/мл и 10 мМ соответственно и инкубируют 30 мин при 4°С. Лизат после центрифугировани  (10 000 д, 4°С, центрифуга Т24) удал ют,

5 осадок суспендируют в растворе, содержащем 62,5 мМ трис-НСМ, рН°6,8; 2% додецилсульфат натри  (ДСН), 2% / -мер- каптоэтанол. Иммунологическую активность белка определ ют с помощью иммуноблотинга.

Пример 2. Дл  иммуноблотинга клетки (6 мг) суспендируют в 100 мл буфера дл  нанесени  образцов на полиакри- ламидный гель, содержащий 2%-ный додецилсульфат натри  (ДСН) и 2%-ный - / -меркаптоэтанол и лизируют 2 мин прогреванием на кип щей вод ной бане. Полученные лизаты (2-4 мг/мл белка) нанос т на полиакриламидный градиентный гель (12-23%) размером 150x150x0,75 мм. Элек- трофорез провод т в течение 15ч при силе тока 7 мА. После электрофореза белки перенос т на нитроцеллюлозные фильтры. Фильтры инкубируют с моноклональными анти-р24 антителами МАК 4/4/1 в разведе- нии 1:500 на буфере TBS, содержащем 50 мМ трис-HCI, рН 7,8; 0,15 М NaCI, 0,1% тритон X 100, с 1% БСА в течение 15 ч при 20°С. После трехкратной отмывки буфером TBS фильтры инкубируют 2 ч при 20°С с коньюгатом пероксидазы хрена с антителами против иммуноглобулинов человека в разведении 1:16 на буфере TBS с 1% БСА В параллельной постановке фильтры инкубируют с моноклональными антителами 14Е11 в разведении 1:50 на буфере TBS с 1% БСА течение 15 ч при 20°С, отмывают, как описано выше, и инкубируют в течение 2 ч при 20°С с конъюгатом иероксидэгзы хрена с белком A S. aureus. После инкуба- ции с пероксидазными конъюгатами фильтры в обоих случа х отмывают буфером TBS (3-5 раз) и про вл ют диаминобензидином, Лизаты клеток штамма - продуцента обнаруживают в обоих случа х специфические зоны окраски, соответствующие белку с мол.м. 49 кДа (Или длиной 462 аминокислот).

Примерз. В качестве твердой фазы используют полистироловые 96-луночные планшеты дл  иммунологических реакций. Слитый белок развод т до концентрации 10 мкг/мл в 50 мМ МаНСОз - №2СОз, рН 9,5, внос т в лунки планшетов по 100 мкл в каждую , инкубируют 16 ч при 37°С, после чего раствор удал ют из лунок, планшеты высу- шивают. В лунки внос т моноклональные анти-р24 МАК4/1/1 в разведении 1:5000 на буфере TBS. После инкубации в течение 2 ч при 37°С планшеты отмывают 5-6 раз дистиллированной водой и внос т по 100 мкл коньюгата пероксидазы хрена с антителами против иммуноглобулинов мыши 1:5000 на буфере TBS. После инкубации в течение 1 ч планшеты отмывают и провод т цветную реакцию. В лунки внос т по 100 мкл 0,25%- ного раствора ортофенилдиамина -2HCI в 0,1 М цитрате натри , рН 5,0, 0,02% Н202, инкубируют 30 мин при 20°С, реакцию останавливают добавлением 100 мкл 0,1 H.HCI. По вление коричневой окраски свидетельствует о наличии р24-активности, дл  количественной оценки активности измер ют оптическую плотность при 492 нм (табл 1) Отсутствие реакции в отрицательном контроле (НВсАд) свидетельствует о специфичности св зывани  анти-р24 антител рекомбинантным белком НВсАд Д- HIV р24 (табл. 1).

Приведенные данные свидетельствуют о бифункциональной антигенное™ белка НВсАд Л- HIV р24 и, следовательно, служат примером использовани  целевого белка дл  иммунодиагностических целей.

Иммуногенна  активность рекОмбинан- тного белка HBcAg A- HIV р24.

Дл  определени  иммуногенности рекомбинантным белком НВсАд Д- HIV р24 иммунизируют кроликов. Дл  этого смешивают 2 мг антигена, растворенного в 1 мл физиологического раствора PBS, с 1,25 мл полного адъюванта Фрейнда и получают гомогенную эмульсию. Антиген ввод т подкожно . Инъекции антигена повтор ют на 14-й и 21-й день и с 28-го дн  начинают брать кровь. Специфичность антител определ ют методом ИФА с использованием двух антигенов: НВсАд (дл  определени  анти-НВс антител), рекомбинантного белка / -галактозидаза-р24(дл  определени  анти- р24 антител). Титры антител на 28-й день иммунизации приведены в табл. 2.

Приведенные данные свидетельствуют о наличии бифункциональной иммуногенности у данного белка.

Таким образом, предлагаемое изобретение позвол ет получить слитный белок, обладающий бифункциональной активностью как по белку кор-антигена вируса гепатита В, так и по белку оболочки вируса иммунодефицита человека.

Claims (2)

1. Рекомбинантна  плазмидна  ДНК pHIV 24-5, кодирующа  слитый белок кор- антигена вируса гепатита В и белок оболочки вируса иммунодефицита человека, размером 7860 п.о., содержаща 

EcoRI-EcoRI - фрагмент ДНК плазмиды рНВсб, размером 6700 п.о.,

Pvull-Pvull - фрагмент дНК плазмиды plVG3 с частью генома вируса иммунодефицита человека, размером 1160 п.о.;

уникальные сайты рестрикции с координатами:

BamHI0 (начало координат)

Sail276

Norul599

Sngt1871

Afelll2098

Seal3471

Xba - Hlndlll

5176 6087

2 сайта рестрикции Sphl - 191 и 5832 ,2 сайта рестрикции Pstl - 3236 и 5794;

гены, генетические маркеры и регул - торны е участки: .1

ген HBcAg A- HIV р24, обёспейиваю- щий синтез рекомбинантного белка НВсАд А - HIV р24, - координаты 5087- 6471;

ген Ь|а, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, координаты 2918-3778;

точку начала репликации - координаты 2153-2159; .

ген HBcAg A- HIV р24, наход щийс  под контролем тандема промоторов Ptrp, - координаты 4905-4937 и 5015-5047.

2. Штамм бактерий -Escherlchla coll BKflM B-4970 - продуцент слитого белка кор-антигена вируса гепатита В и белка оболочки вируса иммунодефицита человека.

1S.Та б л и ц а 2

Иммуногённвсгь химерного белка HBcAg A-HIV р24;.

Та блица 1