JPH08510918A - 単純ヘルペスウィルス２型プロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）２型に関連するプロテアーゼ活性が確認された。該プロテアーゼの完全な核酸およびアミノ酸配列が決定された。プロテアーゼ基質ＩＣＰ３５をコードするＨＳＶ−２核酸セグメントの配列も決定された。プロテアーゼを発現する組換えベクターおよび宿主細胞も記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 単純ヘルペスウィルス２型プロテアーゼ 発明の詳細な説明 本発明は、本出願と同じ出願人による米国特許出願Ｎｏ．０８／０７３，８１ ９（１９９３年６月８日出願）（参考文献として本明細書に取込む。）の一部継 続出願である。技術分野 本発明は、単純ヘルペスウィルス学分野における新規酵素の同定に関する。特 に、本発明は、単純ヘルペスウィルス２型（ＨＳＶ−２）プロテアーゼに関連す るプロテアーゼの同定、該プロテアーゼをコードする核酸配列、および宿主細胞 による該プロテアーゼの発現に関する。本発明はまた、蛋白分解活性の抗ウィル ス治療標的としての使用に関する。背景 ヒトの単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）による感染は世界中の至るところで見 られる。ＨＳＶ感染の臨床上の経過は極めて変わりやすく、一次感染は無症状で あるか充分に穏和であり、大部分の場合、認識できない。ＨＳＶ感染に関係する 主な症状は、口内炎、角膜炎、結膜炎、皮膚の小疱出現、髄膜炎、脳炎、 生殖管感染および新生児疱疹である。 ＨＳＶは２種類の血清型に分けられ、１型および２型（各々、ＨＳＶ−１およ びＨＳＶ−２）と命名されている。ＨＳＶ−１ゲノムは、多くのキャプシド蛋白 を特定するが（Gibson et al.，J．Virol．13:155-165(1974)）、遺伝子的およ び免疫的に関連する１組のウィルスキャプシド蛋白が同定され、感染細胞蛋白３ ５（ＩＣＰ３５）と命名された（Braun et al.，J．Virol．49:142-153(1984)） 。 ＨＳＶ−２はヘルペスウィルス科のα−ヘルペスウィルス亜科の一つであり、 宿主範囲が変わりやすく、生殖サイクルが短く、仙骨神経節に潜在性感染を生じ させる可能性がある（Roizman et al,，Virology，2nd Ed．New York：Raven Pr ess 65:1795-1841(1990)）。ＨＳＶ−２ビリオンは、キャプシドによって囲まれ た核蛋白コア、外被および脂質膜で構成される。これらの構造上の特徴は、全て のヘルペスウィルスの特性である。ＨＳＶ−２ゲノムは、約１５０ｋｂの大きさ であり、二つの成分、すなわちユニークな長領域（Ｕ_L）およびユニークな短領 域（Ｕ_s）から成る（Braun et al.，J．Virol 49:142-153(1984)）。そのゲノム は、増殖的感染中に発現される少なくと も７０個の蛋白をコードするが、２、３個のみが生物学的に理解されている（Ro izman et a1.，前出）。ＨＳＶ−２感染の獲得は、通常、生殖器経由による伝染 の結果である。これらの場合、ウィルスは、膣管中または陰茎皮膚上で複製する とともに仙骨神経節に潜伏する（Whitley，Virology，2nd Ed．New York：Raven Press 66：1843-1887(1990)）。ＨＳＶ−１により誘発される口の病巣の場合と 同様に、再発性の生殖器感染が単純ヘルペスウィルス２型の最大の貯蔵庫である 。 ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対する効果的な治療の開発における主な障害は 、抗ウィルス剤によって阻害することができるウィルスに特異的な複製機構を見 出すことができないことである。理想的な抗ウィルス剤は、宿主細胞の代謝をあ まり変化させることなくライフサイクルの重要工程でウィルスの複製を阻害すべ きである。５−フルオロデオキシウリジンおよびアシクロビルなどの薬物の使用 により、ＨＳＶ感染のコントロールにおいて何らかの発展があったが、ＨＳＶ感 染に対する充分な治療は見出されていない。従って、この分野において、抗ウィ ルス治療に対する改善が必要である。 ヘルペスウィルス粒子の成熟は、ＤＮＡおよびエンベロープ を獲得して感染性ビリオンになるプロキャプシド構造の形成により生じると考え られる（Whitley，前出，1990；Roizman，前出，1990）。プロテアーゼは、ウィ ルスのキャプシドの発生に不可欠であると考えられる。従って、プロテアーゼの 作用を阻害することは、ウィルスの細胞溶解サイクルを破壊することになる。す なわち、プロテアーゼ作用の阻害剤が抗ウィルス治療に望ましい標的である。 最近、ＨＳＶ−１に対するプロテアーゼがRoizman et al．によって確認され （ＥＰ５１４８３０、１９９２年１１月２５日公開；参考文献として本明細書に 取込む）、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）に対するプロテアーゼがGibson et al．（ＷＯ９３／０１２９１、１９９３年１月２１日公開；参考文献として本明 細書に取込む）によって確認された。これら二つのプロテアーゼの間にはいくら か相同性があるが、酵素においてたった１個のアミノ酸残基が変化しても、任意 の物質による阻害に対する感受性に大いに影響があることが確立されている。従 って、個々のヘルペスプロテアーゼの一次構造の確立は、特定のウィルスに対し て阻害活性を有する物質の発見において極めて重要な工程である。 今日まで、ＨＳＶ２型に対するプロテアーゼは確認されていなかった。発明の要旨 本発明は、ＨＳＶ２型プロテアーゼを提供する。該プロテアーゼのアミノ酸配 列および該プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列またはその縮退等価物を図１に 示す。 本発明はさらに、宿主細胞でＨＳＶ２型プロテアーゼを発現することができる 発現ベクターを提供する。特に、ＨＳＶ２型プロテアーゼまたはその一部をコー ドするＤＮＡセグメントは、ベクター中の適する調節領域に操作可能に連結され 、それによってベクターが宿主細胞により複製され、運搬される。該ベクターを 有する組換え宿主細胞も提供する。 図面の簡単な説明 図１は、プロテアーゼ遺伝子およびＩＣＰ３５蛋白質のコード配列を含むＨＳ Ｖ−２ゲノム領域のヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列を示す。ＨＳＶ −２遺伝子は、ヌクレオチド２１１で始まり、ヌクレオチド９５１〜１１２０ま で伸びるＤＮＡ配列を含む。この範囲は変わりうるものであり、プロテアーゼ活 性をコードする配列部分全部を示すものである。プロ テアーゼの基質であるＩＣＰ３５の読み取り枠は、図１のヌクレオチド１１２４ 〜２１１９に表されるアミノ酸配列を含む。 図２は、実施例で使用する発現カセットを示すＨＳＶ遺伝子を図式的に表した 図である。 図３は、ＨＳＶ−２プロテアーゼ−ＣＫＳ融合蛋白質の大腸菌における発現お よびセルフプロセッシングに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を示す写真である 。 図４は、ＣＫＳに翻訳的に結合したＨＳＶ−２プロテアーゼの大腸菌における 発現およびセルフプロセッシングに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を示す写真 である。 図５は、ＨＳＶ−２プロテアーゼの大腸菌における発現およびセルフプロセッ シングのウェスタンブロット電気泳動の写真である。 図６は、実施例１３に記載するプラスミドｐＳＳＰＩ１の構成を図式的に説明 した図である。 図７は、ＣＫＳに翻訳的に結合したＨＳＶ−２プロテアーゼ／ＩＣＰ３５の大 腸菌における発現およびセルフプロセッシングに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳 動を示す写真である。 図８は、ＨＳＶ−２プロテアーゼのＳ．cerevisiaeにおける 発現およびセルフプロセッシングのウェスタンブロット電気泳動写真である。 図９は、ＨＳＶ−２プロテアーゼのＳｆ９細胞における発現およびセルフプロ セッシングに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を示す写真である。 図１０は、ＨＳＶ−２プロテアーゼのＳｆ９細胞における発現およびセルフプ ロセッシングのウェスタンブロット電気泳動写真である。 図１１は、ＨＳＶ−２プロテアーゼのバキュロウィルス感染したTrichoplusia ni幼虫における発現およびセルフプロセッシングに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ電 気泳動を示す写真である。 図１２は、ＨＳＶ−２プロテアーゼのバキュロウィルス感染したTrichoplusia ni幼虫における発現およびセルフプロセッシングのウェスタンブロット電気泳 動写真である。詳細な説明 定義 本明細書で使用する下記用語の定義を行う。 「ＣＫＳ」は、ＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソネー トシチジルイルトランスフェラーゼを意味し、 ＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼすなわちＣＫＳとしても知られ、公知方法により大 腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から得られる酵素である。 「ＤＮＡ発現ベクター」は自律要素であり、ＤＮＡの別の配列がその自律要素 のゲノムに挿入された後、宿主中で、その宿主の染色体とは無関係に複製できる 。 「遺伝子」は、ＤＮＡセグメントであり、その一部は、特定のポリペプチドま たはＲＮＡ分子をコードする。 「ＩＣＰ３５」は、ＨＳＶ−１および−２ゲノムと関連して確認された遺伝子 的および免疫学的に関連する１組のウィルスキャプシド蛋白質を意味する。 「プロモーター」は、一般に遺伝子の５’領域として記載されるＤＮＡ配列で あり、開始コドンのすぐ近くに位置する。プロモーター領域では、隣接する遺伝 子の転写または発現が開始される。これを転写開始部位と言う。プロモータ領域 は、操作可能に連結した構造遺伝子の発現に対するコントロールとして相互作用 するヌクレオチドの配列であると考えられる。 「操作可能に連結した」というのは、構造遺伝子によってコードされるポリペ プチドの発現の開始に対してプロモーターが 及ぼすコントロールに対する用語である。 「読み取り枠」（ＯＲＦ）は、アミノ酸をコードする一連のトリプレットを含 むＤＮＡ配列で、終結コドンは含まない。この種の配列は、蛋白質に翻訳するこ とが可能である。 「プロテアーゼ」は、蛋白分解活性物質を意味し、ヘルペスウィルスアッセン ブリー蛋白質前駆体を分解することができる対応コーティング核酸配列を意味す る。本発明のＨＳＶ−２プロテアーゼ遺伝子は、ヌクレオチド２１１で始まり、 ヌクレオチド９５１〜１１２０まで伸びるＤＮＡ配列を含む。この範囲は変更可 能であり、プロテアーゼ活性をコードする配列の全ての部分を表す。 「転写開始部位」は、ＲＮＡポリメラーゼが結合したプロモーターのＤＮＡ配 列であり、それによって続くコドンの転写が５’→３’の方向に開始される。 「転写ターミネーター」は、転写の最後に、転写を終結させるためにＲＮＡポ リメラーゼに作用するＤＮＡ配列である。 「Ｕ_L２６」は、プロテアーゼおよび隣接するＩＣＰ３５遺伝子をコードする と考えられるＨＳＶ−２ゲノムの部分を意味する。ＨＳＶ−２プロテアーゼの確認および分子クローンニング 本発明は、ＨＳＶ２型によってコードされる新規ウィルスプロテアーゼの発見 に関する。ＨＳＶ−２のゲノムは、約１５０ｋｂの大きさである。ＨＳＶ−１と 違って、ＨＳＶ−２のゲノムＤＮＡの多くは配列が決定されていない。また、今 日までに、ＨＳＶ−１に関連するほんの２、３の類似遺伝子がＨＳＶ−２ゲノム 内で確認されているだけである。今日までに確認されているこれらの遺伝子によ って発現された蛋白は、チミジンキナーゼ、糖蛋白質Ｃ＆Ｄ、ＤＮＡポリメラー ゼおよびアルカリ性エキソヌクレアーゼである。ＨＳＶ−１のＵ_L２６遺伝子に よってコードされるプロテアーゼと類似の新規プロテアーゼをＨＳＶ−２ゲノム 内に確認することができるかどうかを調べるために、ＨＳＶ−２ゲノム内で相同 性のある配列を検出するための道具として、ＨＳＶ−１プロテアーゼ遺伝子をコ ードする核酸セグメントを使用する方法を工夫した。ＨＳＶ−２ ＤＮＡは、St raus et al．j．Virol．40:516-525（1981）の方法を使用して、ＨＳＶ−２菌株 Ｇで感染させたＶｅｒｏ細胞から単離した。約１０μｇのＤＮＡをＢａｍＨＩ酵 素で消化し、１％ＴＢＥゲル上で分離した。ハイブリダイゼーションおよびサザ ン ブロット分析に対しては、ゲルを臭化エチジウムで染色して写真を撮り、サザン ブロット装置に置いてニトロセルロースに移動させた。ニックトランスレーショ ンしたＨＳＶ−１プロテアーゼ遺伝子の³²Ｐ−標識プローブをブロットに添加し 、一夜ハイブリダイゼーションを行った。充分洗浄した後、ブロットを３０分間 オートラジオグラフィーにかけた。約４．０ｋｂの大きさに対応する単一バンド を可視化した。このＤＮＡセグメントは、推定上のＨＳＶ−２プロテアーゼをコ ードする配列を含んでいた。ＨＳＶ−２ゲノムからプロテアーゼ遺伝子をクロー ン化するために、ショットガンクローン化法を使用した。この方法では、プラス ミドベクターｐＵＣ１９でランダムにクローン化したＢａｍＨＩ消化ＨＳＶ−２ ゲノムを使用した。連結したｐＵＣ１９ベクターからの形質転換された細菌コロ ニーをＤＮＡ−ＤＮＡコロニーハイブリダイゼーションによってスクリーニング した。プロテアーゼ遺伝子を含む５個のＨＳＶ−２に特異的なＤＮＡクローンを 、ニックトランスレーションしたＨＳＶ−１プロテアーゼＤＮＡプローブをハイ ブリダイゼーションしてニトロセルロースに移すことにより確認した。ｐＵＣ１ ９内に含まれるＨＳＶ−２ＤＮＡ配列の確認に対しては、陽 性の細菌コロニーを複製プレートから拾い上げて増殖させ、それからプラスミド ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化すると、各クローンは、ＨＳＶ− ２プロテアーゼ遺伝子をコードする４．０ｋｂのＤＮＡ断片を含むことが実証さ れた。ＨＳＶ−２プロテアーゼをコードする断片をさらに限定するために、４． ０ｋｂの断片をいくつかの異なる制限酵素で消化し、サザンブロット分析にかけ た。プロテアーゼ遺伝子を含む１．５ｋｂの１個のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片が サザンブロットハイブリダイゼーションにより確認され、ｐＵＣ１９でサブクロ ーン化した。このプラスミドは、全ＨＳＶ−２プロテアーゼをコードする配列を 含み、ｐＨ２Ｐｒｏと命名した。ＨＳＶ−２プロテアーゼをコードする配列のＤＮＡ配列 ＨＳＶ−２プロテアーゼをコードする配列のＤＮＡ配列を決定するために、Ｂ ａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を、一本鎖ＤＮＡ配列分析用のＭ１３ｍｐ１８およびＭ １３ｍｐ１９ファージＲＦベクターでクローン化した。形質転換されたｍｐ１８ およびｍｐ１９プレートからいくつかのファージクローンを拾い上げ、最初の１ ００塩基までの配列決定を行って、配列分析のための正しい方向を決定した。１ 個のｍｐ１９クローンを正しく方向 づけし、ＤＮＡ配列分析の的とした。プロテアーゼ遺伝子の約１９００塩基の配 列を、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩｍｐ１９クローンから決定した。 ＨＳＶ−２プロテアーゼを完全にコードする配列を図１のヌクレオチド２１１ 〜９５１に示す。ＨＳＶ−２プロテアーゼのプロモーター領域も単離され、図１ に示すヌクレオチド１〜２１０に位置する。ＩＣＰ３５をコードする配列は、ヌ クレオチド１１２６〜２１１９である。 配列は、プラスミドｐＨ２ｐｒｏＡ（全ＨＳＶ−２プロテアーゼをコードする 配列をフランキングプロモーター／調節配列およびＩＣＰ３５を部分的にコード する配列とともに含む）またはｐＨ２ｐｒｏＢ（アッセンブリー蛋白ＩＣＰ３５ の残りをコードする配列を含む）から誘導することができる。プラスミドｐＨ２ ｐｒｏＡおよびｐＨ２ｐｒｏＢは、１９９３年４月２６日、Agricultural Resea rch Service Patent Culture Collection，Peoria，Illinoisに寄託され、各々 の受理番号は、ＮＲＲＬＢ−２１１８５およびＮＲＲＬＢ−２１１８６である。 本発明の核酸配列は、図１に示す配列またはその一部を含む と考えられる。例えば、その配列は、核酸セグメントがプロテアーゼと機能上等 価なものをコードする限り、図１に示す配列より小さくても大きくてもよい。ＨＳＶ−２プロテアーゼの蛋白質配列 ＨＳＶ−２プロテアーゼをコードする領域は、図１のヌクレオチド２１１〜９ ５１に示されるアミノ酸配列を有する約２４７個のアミノ酸のポリペプチドをコ ードする。プロテアーゼの大きさは、蛋白質断片が生物学的活性または機能的活 性を保持する限り、この範囲より小さくても大きくてもよいと理解される。さら に、ここに示す隣接して伸びる１０個以上のアミノ酸に対して少なくとも７０％ 、好ましくは９０％の相同性を含む、ＨＳＶ−２源から単離されるヘルペスプロ テアーゼも本発明の範囲内であるとする。この相同性は、利用できる配列分析ソ フトウェアパッケージ、例えばＤＮＡ star，Intelligenetics，the Genetics C omputer Group of the University of Wisconsin製のものにより求められる。 好ましいＨＳＶ−２プロテアーゼおよびＩＣＰ３５のＤＮＡおよび推定上のア ミノ酸配列を図１に示す。示したアミノ酸配列の他に、蛋白質の活性を破壊しな い程度の蛋白質の変形も特 定的に含まれる。これらの変形としては、それらに限定されないが、酸化、還元 などが挙げられる。さらに、翻訳中に配列に組み込まれる、アミノ酸の欠失、付 加または交代による一次構造自体の変形も、酵素の活性を破壊することなく行わ れるならば、本発明の範囲内である。組換えＨＳＶ−２プロテアーゼの発現 一般的に、ＨＳＶ−２の組換え体の産生は、典型的に、（ａ）成熟酵素をコー ドするＤＮＡを単離し、（ｂ）回収したコード配列を、複製可能な発現系で、適 切なコントロール配列と操作可能に連結し、（ｃ）適切な宿主をベクターにより 形質転換し、（ｄ）形質転換された宿主を組換えＨＳＶ−２プロテアーゼの産生 が行われる条件下で培養することを含む。 コントロール配列、発現系および形質転換法は、遺伝子の発現に使用される宿 主細胞の種類に依存する。 原核生物の最も代表的なものは種々の大腸菌株（Escherichia coli）である。 しかし、他の微生物株も使用することができ、例えば、枯草菌（Bacillus subti lis）、種々のシュードモナス（Pseudomonas）菌株または他の細菌株が挙げられ る。そのような原核生物系では、宿主と相容性のある種に由来する複製部位 およびコントロール配列を含むプラスミドベクターが使用される。例えば、大腸 菌は、典型的には、Bolivar，et al.，Gene 2:95(1977)に記載された大腸菌種由 来のプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体によって形質転換される。また、多 くの組換え蛋白質は、多角体（polyhedrin）プロモーターのコントロール下で問 題の遺伝子を含むバキュロウィルスベクターを使用することにより、培養した昆 虫細胞で発現されている（検討には、Luckow，V.A．& Summers，M.D．（1988）B ioTechnology 6，47-55参照）。多角体プロモーターの活性は昆虫細胞でかなり 高いが、幼虫ではさらに高いように思われる（Shieh，T.R．& Bohmfalk，G.T． （1980）Biotechnol．Bioeng．22，1357-1375）。幼虫の発現系は、しばしば、 外来蛋白質のミリグラムの量の発現に対して、細胞培養発現系に代わる安価な系 である（Price，P.M.，Reichelderfer，C.F.，Johansson，B.F.，Kilbourne，E. D.，& Acs，G．（1989）Proc．Natl．Acad，Sci．86，1453-1456；Medin，J.A. ，Hunt，L.，Gathy，K.，Evans，R．k.，& Coleman，M.S．（1990）Proc．Natl ．Acad．Sci．87，2760-2764）。というのは、幼虫の発現系では、特別に大規模 な組織培養設備および高価な組織培養媒体の必要性が回避されるから である。幼虫のバキュロウィルスによる感染は、ウィルスを幼虫の血リンパに注 入するか（Medin，et al.，1990，前出）、口からの摂取（Price，et al.，1989 ，前出）により達成できる。多角体蛋白質に欠けた組換えウィルスによる経口ル ートでの幼虫の感染は、野生型核多角体病ウィルスとの同時感染により改善する ことができる（Price，et al.，1989，前出）。下記に記載する実施例のいくつ かにおいては、イラクサキンウワバの幼虫の感染を、組換えウィルス単独ならび に組換え体および野生型のバキュロウィルス混合物により達成した。 本発明はまた、ＨＳＶ−２プロテアーゼの発現に適するベクターも提供する。 所望のコード配列およびコントロール配列を含む適するベクターの構成は、周知 の標準的な連結および制限法を使用する。部位特異的ＤＮＡ切断は、ＤＮＡを、 一般に周知の条件下で適切な制限酵素により処理することにより行う。 本発明のベクターに関しては、大腸菌または他の選択した宿主において機能し 、本発明のベクターによって形質転換された細胞をそのように形質転換されてい ない細胞と区別することができる選択マーカーを使用することができる。大腸菌 において、抗生物質耐性に対する優勢な選択マーカーを提供する遺伝子は、 そのような選択マーカーである。アンピシリン耐性に対する遺伝子が特に好まし い。アプラマイシン、チロシン、ピクロマイシン、オレアンドマイシン、ビオマ イシン、ネオマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ヒグロマイ シンなどの他の抗生物質に対する耐性を与える他のＤＮＡセグメントは、本明細 書に記載する薬物耐性セグメントの代わりとして、またはそれに加えて使用する ことができる。 本発明に係る形質転換ＤＮＡは、細菌、特に大腸菌での選択および複製に対す る要素を含むことができ、それによって、細菌での複製による大量のＤＮＡの産 生が容易になる。これに関して、本発明の好ましいＤＮＡは、プラスミドｐＢＲ ３２２の複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子またはそのフラグメントを含む セグメントを含むプラスミドである。 酵母は、大腸菌に代わる好ましい宿主系となる。例えば、典型的な酵母発現ベ クターは、（ｉ）酵母選択マーカー、（ii）酵母複製起点および（iii）ＨＳＶ −２プロテアーゼの発現が得られるようにユニークな制限部位に関して位置する 酵母プロモーターおよびターミネーター配列を含む。例えば、１９９２年１２月 ３０日出願の米国特許出願Ｎｏ．０７／９９８，２２６ 「酵母ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来の調節コントロール配列の使用 により高められた酵母発現」（参考文献として本明細書に取込む。）に記載され たソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）ポリペプチドの中のアミノ末端の１ １個のアミノ酸を含む非融合ベクターカセットおよび融合ベクターカセットを使 用することができる。両方のカセットは、酵母ＴＲＰ１遺伝子を含む３０コピー 酵母プラスミドに選択マーカーおよび２ミクロンの複製起点として挿入すること ができる。 周知のどの酵母複製起点もベクターの構成に使用することができる。例えば、 天然酵母プラスミド２ミクロンの複製起点を使用することができる。このプラス ミドは、容易に検出できる表現型を与えないという点で謎めいており、細胞１個 につき約１００コピー存在する。 例えば、毒性が低く、遺伝子的特徴がよく知られていることから実験室で一般 的に使用される酵母菌株であるＳ．cerevisiaeを使用することができる。この菌 株は容易に大規模培養される。本発明のＨＳＶ−２プロテアーゼをコードする組 換え体ＤＮＡをアルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子（実施例に記載）の転写お よび翻訳の開始および終結調節配列のコントロール下 におき、形質転換可能な酵母細胞（調節遺伝子を変える酵母突然変異体などを含 むが、これらに限定されない。）でのＨＳＶ−２の発現に使用する。 酵母の大部分は、実験室で一般的に使用される周知の培地および方法を使用し て、比較的均一な条件下で培養することができる。当業者であれば理解されるよ うに、酵母の典型的な成長必要条件は、炭素およびエネルギーのための有機炭素 化合物、ポリペプチドおよび核酸合成のための有機または無機窒素、種々の鉱物 、ならびにビタミン混合物を含む。そのような成長必要条件は、化学的に規定さ れた培地である酵母窒素ベース（ＹＮＢ）によって満たされ、それは、多数の微 量元素、ビタミン、成長を刺激するための痕跡量のアミノ酸、ならびに主要鉱物 であるリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムおよび塩化カルシウ ムを含む。窒素源は硫酸アンモニウムである。所望の炭素源は、約０．５％〜約 ３％の濃度で添加する。培地のｐＨ範囲は、通常、約３．０〜約８．０、好まし くは約４．５〜約６．５である。 下記の実施例では、プロテアーゼおよび隣接するＩＣＰ３５遺伝子をコードす ると考えられるＵ_L２６遺伝子の全部または 一部を含むＨＳＶ−２ウィルスゲノムのセグメントを、大腸菌、Ｓ．cerevisiae または昆虫細胞で効率的に発現を行うように設計された一連のベクターでクロー ン化する。各々の場合、クローン化すべきセグメントは、ＵＳＰ４，８８３，１ ９５および４，８８３，２０２（参考文献として本明細書に取込む。）に記載の ＰＣＲ法を用いてウィルスゲノムから増幅する。ＰＣＲ法は増幅配列に変化を導 入することが多いので、増幅されたＵ_L２６のセグメントは、各々のベクターに 組み入れてクローン化した後に配列分析を行って、それらが、ゲノムＨＳＶ−２ ＤＮＡ由来の未増幅Ｕ_L２６遺伝子を有するｐＨ２ｐｒｏＡおよびｐＨ２ｐｒｏ Ｂから得られる配列に匹敵することを調べる。クローン化されたＵ_L２６のセグ メントは、Ｎ末端からＨＳＶ−２プロテアーゼによって分解できると考えられる 部位までの最初の２４７アミノ酸またはＮ末端からＩＣＰ３５遺伝子の開始に相 当すると考えられるメチオニン残基までの最初の３０６アミノ酸を含む。オペロ ンの一部としてのプロテアーゼ（プロテアーゼ遺伝子は、高度に発現された遺伝 子の下流である。）の発現も記載する。別の実施例では、プロテアーゼおよび隣 接するＩＣＰ３５セグメントを含む酵母でのＵ_L２６遺伝 子全体の発現を記載する。ＨＳＶ−２プロテアーゼを使用した抗ウィルス阻害剤候補化合物のスクリーニン グ方法 本発明のプロテアーゼは、「抗ウィルス阻害剤候補化合物」としても知られる ヘルペスウィルスプロテアーゼ阻害剤として可能性のある化合物を同定するため のスクリーニング法に有用である。このスクリーニング法は、ＨＳＶ−２プロテ アーゼ阻害の目的に役立つ化合物の一般的な同定に有用であろうと予想される。 さらに、これに関して有用な化合物は、蛋白質またはペプチド化合物に限定され るのではなく、事実、非ペプチドであり、プロテアーゼによって認識され、結合 し、強力な結合または他の化学的相互作用によって酵素の阻害に役立つ合成有機 化合物を含むことができると予想される。プロテアーゼの作用を阻害するための 該阻害剤の使用は、ＨＳＶ−２感染の治療または緩和に役立つであろう。ＨＳＶ −２プロテアーゼの阻害剤は、単独で、または他のヘルペス治療との組み合わせ により有用である。 すなわち、これらの態様において、本発明は、ＨＳＶ−２プロテアーゼを阻害 する候補化合物の能力の測定法に関し、該方 法は、反応混合物中で適切な基質を分解することができるＨＳＶ−２プロテアー ゼを含む組成物を得て、候補化合物をプロテアーゼおよび適切な基質と混合し、 候補化合物がプロテアーゼの基質分解を阻害するかどうかを測定することを含む 。 候補化合物のスクリーニングアッセイで重要な点は、プロテアーゼ組成物が比 較的純粋な形状で調製できることである。これは、少なくとも比較的純粋に調製 することができないならば、ＨＳＶ−２プロテアーゼ阻害に対するアッセイを、 そのアッセイにおける外来物質による阻害に対立するものとして、特異的に行う ことができないという点で、候補化合物のスクリーニングアッセイの重要な問題 である。とにかく、現在は、組換えＨＳＶ−２プロテアーゼの発現の成功により 初めて、このヘルペス関連蛋白質の阻害に使用できる新規化合物を同定すること ができる。 アッセイを行うために、アッセイされた候補化合物を存在させない場合の比較 的精製したＨＳＶ−２プロテアーゼの活性を候補化合物の存在下での活性に対し て測定して、候補化合物の相対的阻害能力を評価することが必要である。 実施例材料および方法 制限エンドヌクレアーゼ消化、ＤＮＡ連結反応、プラスミドの調製、大腸菌の 形質転換および他のＤＮＡ操作法、ならびにManiatis et al.，Molecular Cloni ng，A Laboratory Manual，（2nd Ed.）Cold Spring Harbor，N.Y．（1989）に 記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法に対しては、標準的方法を 使用した。昆虫細胞培養物の同時形質導入に使用するプラスミドＤＮＡは、Mani atis et al．（前出）に従って、塩化セシウム平衡密度勾配遠心法により調製し た。ＤＮＡフラグメントは、低融点アガロース（SeaPlaque Agarose，FMC，Rock land，ME．）より回収した。プラスミドの調製は、マジックＤＮＡ調製システム （Promega）を使用して行った。ＤＮＡフラグメントのｐＵＣ１８またはその誘 導体（ｐＫＢ１３０、ｐＪＯ２０１など）への挿入では、しばしば、着色試薬と してＸ−ｇａｌを使用して挿入物の有無のスクリーニングを行った。 標準的なＰＣＲ混合物は、次の成分、すなわち、５０μｌの反応物中に５０ｎ ｇのＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１． ５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０ ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ、０ ．４ｐｍｏｌ／ｍｌの各プライマー、１０％のホルムアミド、２％のグリセロー ルならびに１ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む。標準的なＰＣＲ条件は、５ ０ｎｇのＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、 １０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの硫酸アンモニウム、６ｍＭの硫酸マグネシウム、 ０．１％のトリトンＸ−１００、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰお よびｄＧＴＰ、０．４ｐｍｏｌ／ｍｌの各プライマーを含むように変えることが できる。また、０．１ｍｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ、１０％のホルムアミドお よび２％のグリセロールを含むように変えることもできる。市販の熱安定ポリメ ラーゼ、例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Thermus aquaticus）、ＶｅｎｔＤ ＮＡポリメラーゼまたはＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（Thermus thermophilus）も 添加しなければならい。サイクルの温度および時間は、適用ごとに記載する。大 腸菌のＬ培地での増殖およびプラスミドＤＮＡの大腸菌での形質転換は、Maniat is et al．（前出）の記載に従って行う。 酵母の操作で使用する一般的方法は、Sherman et al.，Meth ods in Yeast Genetics；A Laboratory Maunal，Cold Spring Harbor，N.Y．（1 983）に記載されている。最少培地は０．６７％の酵母窒素ベースおよび２％の グルコースを含む。アミノ酸の添加は、Sherman et al．（前出）に従って行う 。酵母の形質転換は、Percival et al.，Anal．Biochem．163:39（1987）に記載 されている。ｐＶＴ１００−Ｕおよびその誘導体に由来するプラスミドを含む形 質転換体を、炭素源として２％のグルコースを含む最少液体培地で、３０℃、４ ８時間、選択的に増殖させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに対しては、１０ｍｌ培養液の 細胞ペレットをまず３ｍｌのガラス蒸留水で洗浄し、１ｍｌのトリス（ｐＨ７． ４）、２ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＰＭＳＦに再懸濁し、２分間攪拌するこ とによりガラスビーズで粉砕した。１アリコートの溶解物を同量の２ｘサンプル 緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロ ール、１．４Ｍのβ−メルカプトエタノールおよび０．００４％のブロモフェノ ールブルー）と混合した。２０μｌのアリコートをＳＡＳ−ＰＡＧＥで分析した 。ＨＳＶ−２プロテアーゼの発現は、ウェスタンブロット分析により測定した。 Ｓｆ９昆虫細胞の可溶蛋白質抽出物を調製するために、２×１０⁶個の細胞を ２５ｃｍ²フラスコにプレーティングし、組換えウィルスを含む１ｍｌの培養液 および４ｍｌの新しい培地を感染させた。感染を３日間行った後、経時細胞を低 速度遠心により採取し、リン酸塩緩衝食塩水で１回洗浄した。次いで、細胞を１ ００ｍｌの低張溶菌緩衝液（１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＮａ Ｃｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂）に再懸濁し、時折攪拌しながら、２０分間、氷 上でインキュベートした。次いで、抽出物をｍｉｃｒｏｆｕｇｅで２分間ペレッ ト化して不溶物質を除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用した。 イラクサキンウワバおよび幼虫（Trichoplusia ni）をGuy，R.，Leppla，N.， Rye，J,，Green，C.，Barrette，S．& Hollien，K．（1985）in ′Handbook of Insect Rearing，Vol．II′，edited by P．Singh and R．Moore，Elsevier，Am sterdamの方法に従って飼育した。成虫は、２８℃、８０％相対湿度の飼育箱で 、光を当てる時間を１４時間とする環境下で維持し、餌として１０％ショ糖溶液 を与えた。金網かごの周囲を覆っているペーパータオル上に産卵が見られた。卵 のついたタオルの表面を希ホルマリンで消毒し、水で充分洗浄した。卵を、密閉 し た２ｌ容のプラスチック製容器中、２７℃、５０％相対湿度で２日間インキュベ ートした。新たに野化した幼虫を、３０ｍｌ容のプラスチック製ふた付コップに 入れた、新しく作って固化した昆虫の餌（小麦麦芽／大豆粉をベースとする寒天 飼料）の表面上に移した。イラクサキンウワバ幼虫の半合成飼料の組成および調 製に関する詳細は、Guy，et al.，1985およびMedin，et al.，1990に見ることが できる。試薬および酵素 細菌および酵母の成長培地は、Difco，Detroit，Michiganから購入した。酵素 は全て、New England BioLabs，Beverley，Massachusetts；Bethesda Research Laboratories（BRL），Gaithersburg Marylandから購入した。Zymolyase 60Tは 、Miles Laboratory，Elkhart，Indianaから購入した。ニックトランスレーショ ンキットおよびニックトランスレーション用の他の試薬は、Amersham Corporati on，Arlington Heights，Illinoisから得た。熱安定ポリメラーゼは、New Engla nd BioLabs，Beverley，MA，Epicentre Technologies，Madison，WI，Pharmacia P-L Biochemicals，Milwaukee，WI，and Promega，Inc.から購入した。Factor Xaは、Boehringer-Mannheim，Indianapoli s，INから購入し、製造者の取扱説明書に従って使用した。発現用の宿主細胞培養物およびベクター Vero細胞を、１０％牛胎児血清を補充したダルベッコの改良イーグル培地（Ｄ ＭＥＭ）で増殖させた。ＨＳＶ−２菌株Ｇは、ＡＴＣＣから得た（ＡＣＴ ＶＲ −７３４）。ウィルスストックは増殖させ、Vero細胞上で力価を測定した。 形質転換用の大腸菌株ＸＬ１−ＢｌｕｅおよびＤＨ５αコンピテント細胞は、 各々、StratageneおよびＢＲＬから購入した。Saccharomyces cerevisiae菌株Ｙ ＪＯ（ｕｒａ３〜５２、ｌｅｕ２〜３、１１２、ｇａｌ４Δ、ｇａｌ８０Δ）は 、Dr．B．Kohorn，Duke University，Durham，NCから得た。酵母ベクターｐＶＴ １００−Ｕ（酵母アルコールデヒドロゲナーゼ１〔ＡＤＨ１〕発現カセット、酵 母ＵＲＡ３選択マーカーおよび酵母２μ複製起点を含む。Ｇｅｎｅ５２、２２５ 〜２３３、１９８７）は、Dr．D．Thomas，Biotechnology Research Institute ，National Research Council of Canada，Montreal，Que.，Canadaから得た。 バキュロウィルス発現系（バキュロゴールド昆虫ウィルスを含む）、発現ベクタ ーｐＶＬ１３９２、Ｓｆ９昆虫細胞およびＴＭＮ−ＦＨ血清補充培養培地は、 Pharmingen，San Diego，Californiaから得た。組織培養細胞の取扱および組換 えウィルスの増殖は、Gruenwald et al.，Baculovirus Expression Vector Syst em：Procedures and Methods Manual，2nd Ed．に指示されているように、供給 者の取扱説明書に従って行った。Ｓｆ９昆虫細胞培養物は、７５ｃｍ²組織培養 フラスコで２７℃に保持した。細胞には、２〜３日ごとに新しいＴＭＮ−ＦＨ培 地を与え、１週間に１回、１：５に分けた。細胞は、正常な対数増殖期を確保す るために、トランスフェクションまたは感染に使用する１〜２日前に、新しい培 養液に分けた。ウィルスストックは全て４℃で保存し、日光に当てないようにし た。オリゴヌクレオチドの合成および精製 全てのオリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems model 380A DNAシンセサ イザー（the Molecular Biology Services Facility，Abbott laboratories）で 合成した。粗オリゴヌクレオチド調製物は、ＨＰＬＣによって精製した。ＤＮＡ配列分析 推定上のＨＳＶ−２プロテアーゼおよびＩＣＰ３５遺伝子を含む陽性コロニー のＤＮＡ配列に対しては、ＢａｍＨＩ−Ｓａ ｌＩ、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩフラグメントをＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍ ｐ１９ファージＲＦベクターに組み込んでクローン化し、一本鎖ＤＮＡ配列分析 を行った。一本鎖ＤＮＡ配列分析は、United Biochemical Sequenaseキット（登 録商標）を使用して行った。ＤＮＡ配列分析は、アルカリ変性、ＵＳＢ Sequena seキットおよびプロトコール、ならびに³³Ｐ−ｄＡＴＰ（DuPont-NEN，Wilmingt on，DE）を使用するプライマーウォーキングによりプラスミドＤＮＡから行った 。Ｇ−Ｃ ＤＮＡが多いことによる配列分析の困難性を解決するために、デアザ ヌクレオチドおよび変化反応条件を使用した。標識化反応は氷上で５〜１０分行 い、終結反応は４２℃で行った。 実施例１ＨＳＶ−２ヌクレオキャプシドおよびウィルスＤＮＡの調製 ＨＳＶ−２ＤＮＡをStraus et al.前出（1981）の方法を使用して、細胞１個 につき０．００１プラーク形成単位の多重度でＨＳＶ−２（Ｇ）で感染させたＶ ｅｒｏ細胞から単離した。細胞を採取し、低速（３０００ｒｐｍ）で遠心降下さ せ、１×溶菌緩衝液〔０．５％ＮＰ−４０、３．６ｍＭのＣａＣｌ₂、５ｍＭの 酢酸マグネシウム、１２５ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭ のＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）、６ｍＭのβ−メルカプトエタノール、０．５％のデ オキシコール酸塩〕に再懸濁した。細胞溶解物を、１分攪拌して、４℃、１００ ０ｒｐｍで１０分遠心することにより、フレオンで１回抽出した。水相を除去し 、５％及び４０％の不連続勾配のグリセロール／１ｘ溶菌緩衝液上で層にし、３ ３，０００ｒｐｍで４５分遠心した。遠心後、細胞ペレットを２×ＳＴＥ〔０． １Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＥＤＴＡ、２％のＳＤＳ〕に取 り、プロテイナーゼＫを添加して最終濃度を２００ｍｇ／ｍｌとし、５０℃で３ ０分間インキュベートした。ウィルスＤＮＡを、フェノールで１回、フェノール ／クロロホルム混合物で１回、およびクロロホルム／イソアミルアルコール混合 物で１回洗浄することにより穏やかに抽出した。ＨＳＶ−２ＤＮＡを含む上方の 水相を、広径ピペットにより注意深く取り除き、−２０℃で３容のエタノールに 沈澱させた。 実施例２ＨＳＶ−２ＤＮＡのサザンブロット分析 サザンブロットおよびハイブリダイゼーションを、本質的に、Maniatis et al ．前出（1982）の記載に従って行った。約１０ μｇのＨＳＶ−２ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、ゲル電気泳動（１％Ｔ ＢＥアガロースゲル、１００Ｖ、３時間）により分離した。電気泳動を行った後 、ゲルを臭化エチジウムで染色し、写真を撮り、サザンブロット装置に置いてニ トロセルロースに移した。ＤＮＡは、０．２５ＮのＨＣｌ溶液中で５分間脱プリ ンを行い、１．５ＭのＮａＣｌおよび０．５ＭのＮａＯＨの溶液中で変性し、中 和した。ＨＳＶ−１プロテアーゼ配列由来のニックトランスレーションしたプロ ーブを使用してハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションを一 夜行った後、２×ＳＳＣ〔３００ｍＭのＮａＣｌ、０．９０ｍＭのクエン酸ナト リウム、３ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０〕／０．１％ＳＤＳで合計３０分間洗浄 し、脱水してＸ−線フィルムにさらした。同様のブロットに対して、ＢａｍＨＩ −ＳａｌＩ制限酵素消化を使用して、種々の制限酵素消化パターンを作った。ＨＳＶ−２ ＤＮＡゲノムライブラリーの作製 ＨＳＶ−２ ＤＮＡゲノムフラグメントの大腸菌由来ライブラリーの作製に対 しては、Straus et al.前出（1981）の記載と同様に、ＨＳＶ−２ ＤＮＡをＢ ａｍＨＩ、ＳａｌＩおよび ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩで消化し、得られた消化ＤＮＡを酵素制限したｐＵＣ１９ ベクターでクローン化した。連結ＤＮＡを使用してコンピテントＪＭ１０９細胞 を形質転換し、コロニーを拾い上げてＨＳＶ−２由来のゲノムライブラリーを作 製した。ＤＮＡ−ＤＮＡコロニーハイブリダイゼーション どの場合も、コロニーハイブリダイゼーションを使用してｐＵＣ１９でＨＳＶ −２プロテアーゼ特異的クローンを同定した。ゲノムライブラリーに由来するコ ロニーをニトロセルロース上でレプリカプレーティングを行った。細菌コロニー を溶解し、Maniatis et al．前出（1982）の記載と同様に調製した。中和した後 、コロニーブロットを３ＭＭペーパーに移し、８０℃で２時間熱処理した。コロ ニーブロットの予備ハイブリダイゼーションを４時間行った後、ニックトランス レーションしたＨＳＶ−１プロテアーゼ菌株Ｆ由来のプローブを変性して予備ハ イブリダイゼーション溶液に添加し、ハイブリダイゼーションを一夜行った。洗 浄後、ブロットを乾燥し、オートラジオグラフを行った。陽性コロニーを拾い上 げ、増殖させて、制限消化分析を行った。 実施例３ＨＳＶ−２プロテアーゼの同定および分子クローニング ＨＳＶ−２ ＤＮＡを、上記実施例１に記載したように、ＨＳＶ−２菌株Ｇで 感染させたＶｅｒｏ細胞から単離した。約１０μｇのＤＮＡをＢａｍＨＩ酵素で 消化し、１％ＴＢＥゲル上で分離した。ハイブリダイゼーションおよびサザンブ ロット分析のために、ゲルを臭化エチジウムで染色して写真を撮り、サザンブロ ット装置に入れてニトロセルロースに移した。ニックトランスレーションしたＨ ＳＶ−１（Ｆ）プロテアーゼ遺伝子の³²Ｐ−標識プローブをブロットに加えて、 一夜ハイブリダイゼーションを行った。充分洗浄した後、ブロットのオートラジ オグラフィーを３０分行った。約４．０ｋｂの大きさに対応する単一のバンドを 可視化した。このＤＮＡセグメントには、推定上のＨＳＶ−２プロテアーゼ遺伝 子が含まれていた。 プロテアーゼ遺伝子を、プラスミドベクターｐＵＣ１９でランダムにクローン 化したＢａｍＨＩ消化ＨＳＶ−２ゲノムを利用するショットガンクローニング法 を用いてＨＳＶ−２ゲノムからクローン化した。連結したｐＵＣ１９ベクターか らの形質転換された細菌コロニーをＤＮＡ−ＤＮＡコロニーハイブリダ イゼーションによりスクリーニングした。プロテアーゼ遺伝子を含む５個のＨＳ Ｖ−２特異的ＤＮＡクローンを、ニックトランスレーションしたＨＳＶ−１プロ テアーゼＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションしてニトロセルロースに移す ことにより同定した。ｐＵＣ１９に含まれるＨＳＶ−２ ＤＮＡ配列の確認に対 しては、陽性の細菌コロニーをレプリカプレートから拾い上げて増殖させ、プラ スミドＤＮＡを抽出した。ＤＮＡのＢａｍＨＩ消化から、各クローンは、ＨＳＶ −２プロテアーゼ遺伝子をコードする４．０ｋｂのＤＮＡフラグメントを含むこ とがわかった。ＨＳＶ−２プロテアーゼをコードするフラグメントをさらに限定 するために、４．０ｋｂフラグメントをいくつかの異なる制限酵素で消化し、サ ザンブロット分析を行った。プロテアーゼ遺伝子を含む１個の１．５ｋｂＢａｍ ＨＩ−ＳａｌＩフラグメントをサザンブロットハイブリダイゼーションによって 同定し、ｐＵＣ１９でサブクローン化した。また、さらに制限分析を行うと、１ ．９ｋｂのＳａｌＩフラグメントを別のコード配列とともに含むｐＵＣ１９由来 のクローンが示された。このプラスミドをｐＨ２ＰｒｏＡと命名した。これは、 ＨＳＶ−２プロテアーゼ全体をコードする配列を、フランキン グプロモーター／調節配列およびＩＣＰ３５の一部をコードする配列とともに含 む。 ＩＣＰ３５アッセンブリー蛋白質のコード配列の３’端を同定するために、プ ローブとして既存のＩＣＰ３５配列を使用して同様のＤＮＡ−ＤＮＡコロニーハ イブリダイゼーションを行い、全長のＩＣＰ３５遺伝子を同定した。ＨＳＶ−２ ＢａｍＨＩライブラリー由来のいくつかの陽性クローンを同定し、配列分析を 行った。このプラスミドをｐＨ２ＰｒｏＢと命名した。これは、アッセンブリー 蛋白質ＩＣＰ３５の残りのコード配列を含む。プラスミドｐＨ２ＰｒｏＡおよび ｐＨ２ＰｒｏＢを一緒にすると、ＨＳＶ−２プロテアーゼおよびアッセンブリー 蛋白質ＩＣＰ３５の全長が含まれる。 実施例４ＨＳＶ−２プロテアーゼ遺伝子のＤＮＡ配列 ＨＳＶ−２プロテアーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を決定するために、ＢａｍＨＩ− ＳａｌＩフラグメントをＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９ファージＲＦベク ターでクローン化して、一本鎖ＤＮＡ配列分析を行った。形質転換したｍｐ１８ およびｍｐ１９プレートからいくつかのファージクローンを拾い上げ、 最初の１００個の塩基の配列分析を行って、配列分析のための正しい方向を決定 した。１個のｍｐ１９クローンを正しく方向づけして、ＤＮＡ配列分析の的とし た。さらに、ｐＨ２ＰｒｏＡ由来の１．９ｋｂのＳａｌＩフラグメントおよびｐ Ｈ２ＰｒｏＢ由来のＢａｍＨＩフラグメントの両方をＭ１３ｍｐ１９でクローン 化して配列分析を行った。 実施例５ＣＫＳ融合蛋白質としてのＨＳＶ−２プロテアーゼ（１〜２４７）の発現 図２に示すように、プロテアーゼ遺伝子の大腸菌での発現のために、カセット 系を使用してＵ_L２６遺伝子部分をクローン化した。カセット系は、非相同末端 およびクローン化に適する制限部位を有するプライマーを使用してＨＳＶ−２ゲ ノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。部分Ａは、プロテアーゼの５’ＭＥＴ ＡＴＧ からヌクレオチド１７７のユニークなＡｃｃＩ部位までを含む。部分Ｂは、ヌク レオチド１７７のＡｃｃＩ部位からヌクレオチド７４１までを含み、アミノ酸２ ４７の切断部位までのプロテアーゼ遺伝子をコードする。部分Ｃは、ヌクレオチ ド７２５からヌクレオチド９２１を含み、ユニークなＡｆｌ III部位からその分子のＩＣＰ３５部分の開始までのプロテアーゼの３’端をコ ードする。 プラスミドｐＡ１Ｂ６の構築は、部分ＡおよびＢのＰＣＲ増幅によって達成さ れ、発現ベクターｐＪＯ２０１でクローン化されて、Ｃ−末端融合ＨＳＶ−２プ ロテアーゼ（１〜２４７）の発現が得られる。 ＰＣＲは、５０μｌの反応物中に５０ｎｇのＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡ、２０ｍ Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２ｍＭのＭｇＳＯ₄、１０ｍＭのＫＣｌ、 １０ｍＭの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、 ０．２ｍＭのｄＴＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．４μＭの各オリゴヌクレオ チドプライマー、１０％のホルムアミド、２％のグリセロールおよび１Ｕ Ｖｅ ｎｔＤＮＡポリメラーゼを含む混合物を使用して行った。混合物を９５℃で１時 間加熱した後、Ｖｅｎｔを添加した。９５℃で３０秒の変性、４４℃で３０秒の アニーリング、７２℃で４５秒の伸長を５回繰り返した後、９５℃で３０秒の変 性、５４℃で３０秒のアニーリング、７２℃で４５秒の伸長を２５回繰り返した 。最後に７２℃で１０分の伸長を行って反応を完了した。全ＰＣＲ産物は、 ＤＮＡ配列分析によって確認した。 部分Ａの５’（上流）ＰＣＲプライマーは、５’−ＴＡＧＡＴＧＡＡＴＴＣＡ ＴＡＧＡＡＧＧＴＣＧＴＡＴＧＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＴＧＣＧＴＧＡＡＣ ＧＴＴＴＡＧＡＧＧＣＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＧＡＣＣＧＧ−３’であった。それ は、クローニングのためのＥｃｏＲＩ部位およびＣＫＳ／ＨＳＶ−２結合でのＸ ａ因子切断部位を有する。最初の１０個のアミノ酸に対するコドンは、第３位置 （ｔｈｉｒｄ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）で最適化された。続く２１個のヌクレオチド は、ＰＣＲプライミングに対して完全に相同性を有する。部分Ａの３’プライマ ーは、５’−ＡＧＴＡＧＴＣＴＡＧＡＧＴＣＴＡＣＧＴＴＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧ ＧＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧ−３’であった。それは、クローニングのためのＸｂａ Ｉ部位およびＡｃｃＩ部位で終わる２８ヌクレオチドの相同配列を有する。ＰＣ Ｒ産物は２１３ヌクレオチドであった。 部分Ｂの５’プライマーは、５’−ＡＧＴＡＧＴＣＴＡＧＡＧＴＡＧＡＣＣＡ ＣＣＧＣＧＣＴＣＧＧＴＧＣＧＡＧＧＴＧＧ−３’であった。それは、クローニ ングのためのＸｂａＩ部位およびＡｃｃＩ部位から始まる相同配列の２２ヌクレ オチドを 有する。部分Ｂの３’プライマーは、５’−ＡＧＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＣＧ ＣＣＴＧＡＡＧＧＴＡＣＧＴＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＴ−３’であった。それは 、クローニングのためのＰｓｔＩ部位、ＴＡＡ停止コドンおよび２７ヌクレオチ ドの相同配列を有する。ＰＣＲ産物は５９１ヌクレオチドであった。 発現ベクターはｐＪＯ２０１であった。それは、アンピシリン耐性遺伝子およ び、ＣＫＳをコードする遺伝子であり、修飾ｌａｃプロモーターによって作用す るｋｄｓＢを有する。ＣＫＳ（ＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ）は細胞壁の生合成 に関与する大腸菌酵素である。該酵素は、修飾ｌａｃプロモーターを使用して大 腸菌で過発現されており、多くの遺伝子の過発現のための融合相手として使用さ れている（BioTechniques，Vol.8，No.5（1990））。 多重クローニング部位をｋｄｓＢの３’端で作った。カセットは、ＥｃｏＲＩ ／ＰｓｔＩ制限フラグメントとしてクローン化した。部分ＡおよびＢは、ｐＪＯ ２０１（４．０ｋｂ）でクローン化して、４．８ｋｂのプラスミドｐＡ１Ｂ６と した。そのプラスミドを大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅで形質転換して菌株ＳＳＨＰ １とした。 その菌株をＬ−培地で０．５〜１．０のＯＤ₆₀₀に増殖させ、１ｍＭのＩＰＴ Ｇで誘発してさらに４〜１６時間増殖させた。ＣＫＳ／ＨＳＶ−２プロテアーゼ の発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。ＣＫＳに融合したＨＳＶ−２プ ロテアーゼの予想される分子量（５５キロダルトン）に対応するバンドが図３に 示すように得られた。融合蛋白質は、１：２００（ｗ／ｗ）の酵素：基質比で、 １２時間、Ｘａ因子による消化によって切断した。切断は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥお よびＣＫＳ蛋白質に対する抗体を使用するウェスタンブロットにより評価した。 ＨＳＶ−２プロテアーゼ（２６．６ｋＤａ）およびＣＫＳ（２８．８ｋＤａ）の 予想分子量に対応するバンドが得られた。 実施例６ＨＳＶ−２プロテアーゼに対する抗体の産生 ＣＫＳ／ＨＳＶ−２プロテアーゼ（１〜２４７）をコードするプラスミドｐＡ １Ｂ６を含む菌株ＳＳＨＰ１（上記と同様に調製）を、実施例５に記載したよう に増殖して発現させた。分取用のＳＤＳ−ＰＡＧＥを全細胞溶解物のアリコート に対して行った。蛋白質を０．２５ＭのＫＣｌ／１ｍＭのジチオトレイトールで 可視化した後、１ｍＭのジチオトレイトールで着色を 取り除いた。ＣＫＳ／ＨＳＶ−２プロテアーゼ（１〜２４７）の予想分子量（５ ５ｋＤａ）に対応するバンドを切り取り、抗体産生の免疫原として使用した。そ の蛋白質をフロイント完全アジュバントに懸濁して約０．１ｍｇ／ｍｌとし、動 物の注射に使用した。２匹のウサギに最初の注射および約１か月間隔で３回の追 加免疫を行った。最後の追加免疫の２週間後に動物を犠牲にし、大量の血を抗体 源として得た。その抗体に大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ溶解物を４８時間予備吸収さ せ、１：１０００の希釈度でウェスタンブロットに使用した。 実施例７ｐＡ１Ｂ６Ｃの構築およびＣＫＳ融合蛋白質としてのＨＳＶ−２プロテアーゼ１ 〜３０７の発現 実施例５および図２に記載のカセット系を使用してＨＳＶ−２プロテアーゼ（ １〜３０７）のＣＫＳ溶融物を構成した。部分Ｃは新しいＰＣＲ産物であり、部 分ＡおよびＢは実施例５に記載のものと同一であった。ＰＣＲ条件は実施例５に 記載した通りであった。部分Ｃの５’プライマーは、５’−ＴＡＧＡＴＣＴＡＧ ＡＡＴＣＧＣＣＧＧＡＣＡＣＡＣＧＴＡＣＣＴＴＣＡＧＧＣ−３’であった。そ れは、クローニングのためのＸｂａ Ｉ部位、ＡｆｌIII部位および２６ヌクレオチドの相同配列を含む。３’プライ マーは、５’−ＡＧＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＴＣＧＧＣＣＧＧＴＧＣＣＧＧＡ ＡＡＡＧＡＡ−３’であった。それは、クローニングのためのＰｓｔＩ部位、Ｔ ＡＡ停止コドンおよび２８ヌクレオチドの相同配列を含む。ＰＣＲ産物は２２３ ヌクレオチドであった。 部分Ａ、ＢおよびＣをｐＪＯ２０１でクローン化すると５．０ｋｂのプラスミ ドｐＡ１Ｂ６Ｃ３が得られ、これを大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅで形質転換すると 、菌株ＳＳＨＰ２が得られた。その菌株を増殖させ、実施例１に記載の発現に対 して評価した。図４に示すように、融合蛋白質の予想分子量（６１ｋＤａ）に対 応するバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で認められた。さらに、アミノ酸２４７切断 部位でセルフプロセッシングされたＣＫＳ／ＨＳＶ−２プロテアーゼの分子量（ ５５ｋＤａ）に対応するバンドも認められた。 実施例８ｐＡ１Ｂ６Ｃｍｕｔの構築および２４７突然変異を有するＣＫＳ／ＨＳＶ−２の 発現 ＨＳＶ−２プロテアーゼの２４７番目のアミノ酸で突然変異 を誘発してプロテアーゼクリップ部位でアラニン残基をグリシン残基に変換し、 それによって、アミノ酸２４７でのセルフプロセッシングを取り除いた。カセッ ト系は実施例５に記載した通りであった。 部分Ｃ_mutは新しいＰＣＲ産物であり、部分ＡおよびＢは実施例１と同一であ った。突然変異を部分Ｃ_mutの５’ＰＣＲプライマーに導入した。部分Ｃ_mutの５ ’プライマーは、５’−ＴＡＧＡＴＣＴＡＧＡＡＴＣＧＣＧＧＡＣＡＣＡＣＧＴ ＡＣＣＴＴＣＡＧＧＧＧＡＧＣＧＡＡＡ−３’であった。それは、クローニング のためのＸｂａＩ、ＡｆｌIII、Ａｌａ−Ｇｌｙ突然変異および３３ヌクレオチ ドの相同配列を含む。３’プライマーは、実施例７に記載の部分Ｃに対して使用 した３’プライマーと同一であった。ＰＣＲは実施例５の記載と同様に行い、２ ２３ヌクレオチドのＰＣＲ産物を得た。 部分Ａ、ＢおよびＣ_mutをｐＪＯ２０１でクローン化すると、５．０ｋｂのプ ラスミドｐＡ１Ｂ６Ｃ_mut、が得られ、これをＸＬ１−Ｂｌｕｅで形質転換する と、菌株ＳＳＨＰ３が得られた。その菌株を増殖させ、実施例５に記載したよう に発現に対する評価を行った。融合蛋白質の予想分子量（６１ｋＤａ）に 対応するバンドが、図３に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認された。セルフ プロセッシングされたＣＫＳ／ＨＳＶ−２プロテアーゼに対応すると思われる５ ５ｋＤａのバンドは認められなかった。 実施例９ｐＡ２Ｂ６の構築および翻訳上ＣＫＳに結合したＨＳＶ−２プロテアーゼ（１〜 ２４７）の発現 ＨＳＶ−２プロテアーゼ（１〜２４７）を、翻訳上ＣＫＳに結合して発現させ た。非融合ＨＳＶ−２プロテアーゼを産生するために、リボソーム結合部位を、 ｋｄｓＢ（実施例５に記載）の４０ヌクレオチドの５’フラグメントとＨＳＶ− ２プロテアーゼの遺伝子との間に挿入した。カセット系は実施例５に記載した通 りであった。部分Ａ２は新しいＰＣＲ産物であり、部分Ｂは実施例５と同一であ った。部分Ａ２に対する５’プライマーは、５’−ＴＡＧＡＴＧＴＣＧＡＣＴＡ ＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＴＡＡＴＧＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＴＧＣＧＴＧＡ ＡＣＧＴＴＴＡＧＡＧＧＣＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＧＡＣＣＧＧ−３’であった。 それは、クローニングのためのＳａｌＩ部位、共通リボソーム結合部位およびＣ ＫＳのＴＡＡ停止コドン（ＨＳＶ−２プロテアーゼのＡＴＧ開始部位と重複する ）を含む。 ＨＳＶ−２プロテアーゼの最初の１０個のアミノ酸のコドンを、大腸菌に対して ｔｈｉｒｄ ｐｏｓｉｔｉｏｎで最適化した。続く２１個のヌクレオチドはＰＣ Ｒプライミングに対して完全な相同性を有していた。３’プライマーは実施例５ の部分Ａに対する３’プライマーと同一であった。ＰＣＲを実施例５の記載と同 様に行うと、２１６ヌクレオチドＰＣＲ産物が得られた。 発現ベクターはｐＪＯ２０１であった。ｋｄｓＢ ＡＴＧ開始コドンの４０ヌ クレオチド下流にあるユニークなＳａｌＩ部位および多重クローニング部位のＰ ｓｔＩ部位を使用してＰＣＲ産物をクローニングした。翻訳上の結合により、ｋ ｄｓＢおよびＨＳＶ−２プロテアーゼ（１〜２４７）から１９アミノ酸産物が得 られた。部分Ａ２およびＢをｐＪＯ２０１でクローン化すると、４．１ｋｂのプ ラスミドｐＡ２Ｂ６が得られた。プラスミドを大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅで形質 転換すると、菌株ＳＳＨＰ４が得られた。その菌株を増殖させ、実施例５に記載 したように、発現に対する評価を行った。ＨＳＶ−２プロテアーゼの予想分子量 （２７ｋＤａ）に対応するバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図４）およびウェスタン ブロット（図５）で得られた。 実施例１０ｐＡ２Ｂ６Ｃ３の構築および翻訳上ＣＫＳに結合したＨＳＶ−２プロテアーゼ（ １〜３０７）の発現 ＨＳＶ−２プロテアーゼ（１〜３０７）を、翻訳上ＣＫＳに結合して発現させ た。この実施例でも、実施例５および図２に記載のカセット系を使用した。部分 Ａ２は実施例９に記載され、部分ＢおよＣは実施例５および７に記載されたもの であった。部分Ａ２、ＢおよびＣをｐＪＯ２０１でクローン化すると、４．３ｋ ｂのプラスミドｐＡ２Ｂ６Ｃ３が得られた。そのプラスミドを大腸菌株ＸＬ１− Ｂｌｕｅで形質転換すると、菌株ＳＳＨＰ５が得られた。その菌株を増殖させ、 実施例５に記載したように発現に対する評価を行った。図４に示すように、ＨＳ Ｖ−２プロテアーゼ（１〜３０７）の予想分子量（３３ｋＤａ）に対応するバン ドが確認された。さらに、セルフプロセッシングされたＨＳＶ−２プロテアーゼ の分子量（２７ｋＤａ）に対応するバンドも確認された。 実施例１１ｐＡ２Ｂ６Ｃ_mutの構築およびアミノ酸２４７突然変異を有するＨＳＶ−２プロ テアーゼの発現 実施例８に記載したアミノ酸２４７のプロテアーゼセルフプロセッシング部位 での突然変異を翻訳上結合した非融合プロテアーゼに導入した。ここでも、実施 例５のカセット系を使用した。部分Ａ２は実施例９に記載した通りであり、部分 Ｂは実施例９に記載した通りであり、部分Ｃ_mutは実施例８に記載した通りであ り、これらをｐＪＯ２０１でクローン化すると、４．３ｋｂのプラスミドｐＡ２ Ｂ６Ｃ_mutが得られた。そのプラスミドを大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅで形質転換 すると、菌株ＳＳＨＰ６が得られた。その菌株を増殖させ、実施例５に記載した ように発現に対する評価を行った。図３に示すように、ＨＳＶ−２プロテアーゼ （１〜３０７）の予想分子量（３３ｋＤａ）に対応するバンドが確認された。セ ルフプロセッシングされたＨＳＶ−２プロテアーゼの分子量（２７ｋＤａ）に対 応するバンドは認められなかった。 実施例１２ｐＨＰＢ−１の構築 この実施例では、アッセンブリー蛋白質ＩＣＰ３５の残りの配列をコードする ０．７ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントのみを含むｐＨ２ＰｒｏＢ（実施例３の記 載に従って調製）のサブク ローンを構築した。ｐＨ２ＰｒｏＢの０．７ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントをｐ ＵＣ１８でサブクローン化した。この構築は、その後のＨＳＶ−２プロテアーゼ およびＩＣＰ３５を含むＵ_L２６クローンの全長の構築に必要であった。 実施例１３ｐＳＳＰＩ１−１１の構築およびＨＳＶ−２プロテアーゼ／ＩＣＰ３５の発現 図６に概説するように、ＣＫＳ融合を、ＨＳＶ−２プロテアーゼおよびＩＣＰ ３５をコードするＵ_L２６全体に対して構築した。実施例７に記載のプラスミド ｐＡ１Ｂ６ＣをＮｃｏＩ／ＰｓｔＩで消化し、それを、ｐＨ２ＰｒｏＡのＮｃｏ Ｉ／ＳａｌＩフラグメント（５５７ｂｐ）および実施例１２に記載のｐＨＰＢ− １のＳａｌＩ／ＰｓｔＩフラグメント（８１ｂｐ）に連結した（トリプル連結） 。次いで、得られた中間体クローンｐＩＴＬ−６を、ＲｓｒII／ＨｉｎｄIIIで 消化し、ｐＨＰＢ−１のＲｓｒII／ＨｉｎｄIIIフラグメント（６１０ｂｐ）と 連結して、５．９ｋｂの最終プラスミドｐＳＳＰＩ１−１１を得た。そのプラス ミドを大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅで形質転換すると、菌株ＳＳＨＰ７が得られた 。その菌株を増殖させ、実 施例５に記載したように発現に対する評価を行った。ＣＫＳ／ＨＳＶ−２プロテ アーゼ／ＩＣＰ３５融合体の予想分子量（９５ｋＤａ）に対応するバンドが認め られた。 実施例１４Ｈｉｓ−１４８突然変異を含むｐＡＬＴＨＭ−４の構築 ＨＳＶ−２プロテアーゼの１４８番目のヒスチジン残基を突然変異誘発してア ラニン残基にした。変化部位突然変異誘発キット（Promega製）を製造者のプロ トコールに従って使用した。ｐＳＳＰＩ１−１１のＫｐｎＩ／ＳｐｈＩフラグメ ントをそのキットに入っているｐＡＬＴＥＲ−１突然変異誘発ベクターでサブク ローン化した。ＨＳＶ−２プロテアーゼのヌクレオチド４４２〜４４３の突然変 異誘発を行った。すなわち、ＣＡＣがＧＣＣに変化することによりＨｉｓ−１４ ８がＡｌａに変換され、突然変異体の分析のためのＥａｇＩ部位が作られた。ｐ ＡＬＴＨＭ−４が所望の突然変異を含むことが、ＤＮＡ配列分析により確認され た。 実施例１５ｐＳＳＰＩ２の構築ならびに翻訳上ＣＫＳに結合したＨＳＶ−２プロテアーゼお よびＩＣＰ３５の発現 この実施例では、ＨＳＶ−２プロテアーゼおよびＩＣＰ３５をコードするＵ_L ２６遺伝子を翻訳上ＣＫＳに結合した。プラスミドｐＡ２Ｂ６Ｃは、この構成体 の親ベクターであった。ＨＳＶ−２プロテアーゼの３’部分およびＩＣＰ３５遺 伝子を含むｐＳＳＰＩ１−１１のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメント（１４４ １ｂｐ）をｐＡ２Ｂ６Ｃでクローン化すると、５．２ｋｂのプラスミドｐＳＳＰ Ｉ２が得られた。そのプラスミドを大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅで形質転換すると 、菌株ＳＳＨＰ８が得られた。その菌株を増殖させ、実施例５に記載したように 発現に対する評価を行った。図７に示すように、ＨＳＶ−２プロテアーゼ／ＩＣ Ｐ３５融合体の予想分子量（６７ｋＤａ）に対応するバンドが、ＨＳＶ−２プロ テアーゼ（１〜２４７）の分子量に対応する２７ｋＤａのセルフプロセッシング された蛋白質とともに確認された。 実施例１６ｐＳＳＰＩ２Ｍの構築ならびに翻訳上ＣＫＳに結合した突然変異体ＨＳＶ−２プ ロテアーゼおよびＩＣＰ３５の発現 実施例８に記載したアミノ酸２４７が欠失したＨＳＶ−２プロテアーゼおよび ＩＣＰ３５をコードするＵ_L２６遺伝子を翻 訳的にＣＫＳに結合させた。プラスミドｐＡ２Ｂ６Ｃ_mutは、この構成体の親ベ クターであった。ＨＳＶ−２プロテアーゼの３’部分およびＩＣＰ３５遺伝子を 含むｐＳＳＰＩ１−１１のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメント（１４４１ｂｐ ）をｐＡ２Ｂ６Ｃ_mutでクローン化すると、プラスミドｐＳＳＩ２Ｍが得られた 。そのプラスミドを大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅで形質転換すると、菌株ＳＳＨＰ ９が得られた。その菌株を増殖させ、実施例５に記載したように発現に対する評 価を行った。ＨＳＶ−２プロテアーゼ／ＩＣＰ３５の予想分子量（６７ｋＤａ） に対応するバンドが、図７に示すように認められた。ＨＳＶ−２プロテアーゼ（ １〜２４７）の分子量に対応する２７ｋＤａのセルフプロセッシングされた蛋白 質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでもウェスタンブロットでも認められなかった。 実施例１７Ｕ_L２６のＳ．cerevisiaeでの発現 実施例１３の記載に従って調製したプラスミドｐＳＳＰＩ１−１１をＥｃｏＲ Ｉで消化し、付着末端を製造者の指示に従ってＤＮＡポリメラーゼの大きいフラ グメントにより平滑末端にした。次いで、そのＤＮＡをＸｂａＩで消化し、１％ 低融点ア ガロースゲルによる電気泳動にかけた。Ｕ_L２６遺伝子を含む２．３ｋｂのフラ グメントをゲルから切り取り、ＰｖｕII／ＸｂａＩ部位でｐＶＴ１００−Ｕに連 結した。連結混合物を大腸菌ＤＨ５αで形質転換した。Ｕ_L２６遺伝子を含むプ ラスミドｐＶＴ１００−Ｕ Ｕ_L２６を、ＨｉｎｄIII／ＸｂａＩで消化する（２ ．３ｋｂのフラグメントが放出される）ことにより確認した。 酵母菌株ＹＪＯは、ウラシル原栄養に対する選択を用いて、ｐＶＴ１００−Ｕ またはｐＶＴ１００−Ｕ Ｕ_L２６により形質転換した。形質転換体は、ウラシ ルが欠失し、２％グルコースを含む液体培地中、３０℃で増殖させ、実施例５に 記載したように発現に対する評価を行った。２７ｋＤａの免疫反応性バンドが検 出され（図８、レーン５、６）、これは、Ｕ_L２６遺伝子産物（ＨＳＶ−２プロ テアーゼ）がＳ．cerevisiaeで活性であることを示す。 実施例１８野生型および突然変異体のＨＳＶ−２プロテアーゼのバキュロウィルス系での発 現およびｉｎ ｖｉｖｏ活性の実証 高レベルのＨＳＶ−２プロテアーゼ発現を得るために、その 遺伝子を、バキュロウィルスであるAutographa californica核多角体病ウィルス の強力な多角体プロモーターのコントロール下においたトランスファーベクター ｐＶＬ１３９２でクローン化した。次いで、その遺伝子を、昆虫細胞宿主におい て、相同的組換えにより、線状化したBaculogoldウイルスに組み込んだ。次いで 、組換え体ウィルスを使用して組織培養の昆虫細胞を感染させ、プロテアーゼを 産生した。ＨＳＶ−２プロテアーゼＵ_L２６遺伝子をコードするＤＮＡフラグメ ントを次の方法でプラスミドｐＳＳＰＩ１−１１（実施例１３に記載）から切り 出した。まず、プラスミドをＸｂａＩで消化した後、ＤＮＡポリメラーゼのクレ ノウフラグメントで処理して平滑端を作り、ＥｃｏＲＩで消化した。得られた約 ２ｋｂのＤＮＡラグメントをアガロースゲルにより精製し、予めＥｃｏＲＩおよ びＳｍａＩで消化したトランスファーベクターｐＶＬ１３９２に連結してプラス ミドｐＡｃＵ_L２６を作った。同様に、活性部位Ｈｉｓ−１４８の突然変異を有 するＨＳＶ−２Ｕ_L２６遺伝子を含むプラスミドｐＡＬＴＨＭ−４（実施例１３ に記載）をＨｉｎｄIIIで消化し、クレノウポリメラーゼで平滑端にしてＥｃｏ ＲＩで切断し、得られた２ｋｂのＤＮＡフラグメントを ゲル精製して、ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで切断したｐＶＬ１３９２に連結する と、プラスミドｐＡｃＨ１４８が得られた。 キットに入っているリン酸カルシウム沈澱用試薬を使用して、５μｇのｐＡｃ Ｕ_L２６またはｐＡｃＨ１４８を０．５μｇの線状化したBaculogold ＤＮＡとと もに同時トランスフェクションすることにより、組換え体ウィルスを誘導した。 Baculogold ＤＮＡは、ＯＲＦ１６２９の致死欠失を含み、ＯＲＦ１６２９お よび発現すべき遺伝子を含むトランスファーベクターとの組換えによる救援がな ければ、生長できない。すなわち、組換え体ウィルスが選択される。トランスフ ェクションの後、Ｓｆ９細胞を４ｍｌのＴＭＮ−ＦＨ培地で５日間インキュベー トし、感染のサイン、すなわち細胞の拡大、細胞の生存能力の減少または細胞溶 解をモニターした。上清を採取し、細胞を低速遠心により除去し、この低タイタ ーウィルスストックの１ｍｌを使用して２×１０⁶個のＳｆ９細胞を含む新しい フラスコを感染させた。もう一度、細胞を、感染のサインが現れるまで、すなわ ち高タイターウィルスストックの産生を示すまで、３〜５日間インキュベートし た。 Ｕ_L２６またはＨｉｓ−１４８突然変異体遺伝子の発現をア ッセイするために、新しいＳｆ９細胞に、上記のように作製したｖＡｃＵ_L２６ またはｖＡｃＨ１４８の高タイターストックを感染させ、可溶抽出物を調製した 。図９に、未感染細胞（レーン３）、野生型バキュロウィルス感染溶解物（レー ン４）、ｖＡｃＵ_L２６感染溶解物（レーン５）、およびｖＡｃＨ１４８感染溶 解物（レーン６）の２０μｌアリコートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を、クー マシーブルーで染色して示す。予想されたように、ｖＡｃＵ_L２６感染細胞で作 られたＵ_L２６遺伝子由来のポリ蛋白質は、オート蛋白質分解を受けて２７ｋＤ ａプロテアーゼおよび４０ｋＤａのＩＣＰ３５蛋白質を産生する。これは、ＨＳ Ｖ−２プロテアーゼがこれらの細胞で活性であることを示す。ｖＡｃＨ１４８感 染細胞では、プロテアーゼの活性部位の突然変異により、オート蛋白質分解がか なり減少し、６７ｋｄのポリ蛋白質が主な形態として認められる。このことは、 ポリ蛋白質のプロセッシングがウィルスまたは細胞起源の内因性プロテアーゼに よるのではなく、活性ＨＳＶ−２プロテアーゼ自体の固有の機能によることを示 す。図１０に示すウェスタンブロットから、ウィルス感染細胞で産生した蛋白質 は、ＨＳＶ−２プロテアーゼの成熟前および成熟 した形であることが確認される。 実施例１９ＨＳＶ−２プロテアーゼの２３６〜２４７領域に対する抗体の調製 Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ −Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａの配列のペプチドを、標準的方法を使用して商業的に 合成した。この配列は、Ｕ_L２６遺伝子産物の残基２３６〜２４７およびＨＳＶ −２プロテアーゼの成熟形のカルボキシ末端の１２個のアミノ酸に対応する。そ のペプチドを市販キット（Pierce）を使用してｋｅｙｈｏｌｅ笠貝ヘモシアニン とコンジュゲートした。次いで、コンジュゲートしたペプチドをフロイントのア ジュバントで乳化し、ニュージーランドの白色ウサギのいくつかの皮下投与部位 に注入した（１回の免疫感作につき約０．５ｍｇのペプチド）。追加免疫感作も 、２週間および６週間後に投与した。その動物は、最初の免疫感作の前ならびに 最初の免疫感作の４週、８週および１０週間後に採血した。凝固血液から遠心に より血清を採取し、５６℃で３０分加熱した後、−２０℃で保存した。 実施例２０組換えバキュロウィルスベクターを使用する幼虫でのＵ_L２６遺伝子の発現 イラクサキンウワバの幼虫を、２７℃、５０％相対湿度で、半合成の餌により 第４齢まで成長させた。脱皮の少し後に、昆虫を餌の所から移し、個々にプラス チック製ペトリ皿に入れて、１８時間飢餓状態においた。次いで、昆虫を１０μ ｌの昆虫細胞培養液（実施例１８参照）と接触させた。該培養液は、１）野生型 核多角体病ウィルス（Autographa californica）、２）ＨＳＶ−２のＵ_L２６遺 伝子を有する組換えバキュロウィルス（ｖＡｃＵ_L２６）、３）１０：１の組換 えバキュロウィルスおよび野生型核多角体病ウィルス、または４）バキュロウィ ルスなしのいずれかを感染させた。各々の細胞培養液は、飲を刺激するために１ ０％のショ糖を含んでいた。幼虫が培養液の一部を飲むまで観察を行い、その後 、さらに３時間、各々の培養液に接触させたままにした。この期間の後、幼虫を 新しい半合成の餌の表面上に置き（＜６匹の幼虫／１カップ）、２８℃、７０％ の相対湿度で保持した。感染の３〜５日後に、死んだ幼虫および死にかけた幼虫 を集めて−７０℃で凍結した。 凍結した幼虫を解凍し、抽出緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５ ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．４ｍＭのβ−メルカプトエ タノール、０．５％のトリトンＸ−１００および１０％グリセロール）に、１０ μｌ緩衝液／ｍｇ幼虫の割合で入れた。幼虫懸濁物を乳鉢および乳棒を使用して ホモジェネートした。アリコートを取り出し、高速で３分間、ｍｉｃｒｏｆｕｇ ｅで遠心した。上清フラクションからのアリコートを変性し、１２．５％ＳＤＳ −ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動にかけた。ゲルは、クーマシーブリリ アントブルーＲ−２５０を使用して蛋白質の染色を行うか、ウェスタンブロット 分析用のＰＶＤＦメンブランに電気泳動的に移した。一次の抗体溶液は、０．７ ５％牛血清アルブミンおよび２３６〜２４７ＨＳＶ−２プロテアーゼペプチド（ 実施例１９）またはＣＫＳ−ＨＳＶ−２プロテアーゼ融合蛋白質（実施例６）か ら得られる抗体を含むＴＢＳＴ緩衝液中で調製した。 図１１に示すように、クーマシーで染色されたゲルは、野生型バキュロウィル スのみが感染した幼虫またはウィルスの感染がない幼虫には存在しない２７ｋＤ ａの存在を示す。これらのデータは、組換えｖＡｃＵ_L２６バキュロウィルス感 染した幼 虫が約２７ｋＤａの蛋白質を発現したことを示唆する。この解釈は、ＨＳＶ−２ プロテアーゼの２３６〜２４７ペプチドフラグメントに対する一次抗体が、ｖＡ ｃＵ_L２６で処理した幼虫における２７ｋＤａのバンドおよびいくつかの少量分 解産物とのみ正に反応することを示すウェスタンブロットにより確認される。こ れらの結果は、Trichoplusia niで産生されたＵ_L２６蛋白質が活性で、２７ｋＤ ａの成熟した形にセルフプロセッシングできることを示す。 当業者であれば明らかなように、本発明の特定の態様は、本発明の範囲または 精神を逸脱することなく、修正または変形することができる。例えば、コドンの 縮退により、下線部のＤＮＡ配列は、蛋白質配列に影響を及ぼさないならば変え ることができる。さらに、生物学的機能の同等性という考えにより、蛋白質構造 を変化させ、さらに有用なプロテアーゼを達成することができる。そのような修 正は全て、請求の範囲内に含まれるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 カツツ，レオナード アメリカ合衆国、イリノイ・60090、ホイ ーリング、プラム・クリーク・ドライブ・ 375 (72)発明者 マクゴニガル，トマス・ピー アメリカ合衆国、イリノイ・60087、ウオ キーガン、ラグビー・コート・3211 (72)発明者 サースイー，アパーナ・ブイ アメリカ合衆国、イリノイ・60087、ウオ キーガン、ドロシー・コート・4836 (72)発明者 シヨーン，シヤロン・イー アメリカ合衆国、イリノイ・60626、シカ ゴ、ジユーンウエイ・テラス・1505

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 単純ヘルペスウィルス２型由来のヘルペスプロテアーゼ。 ２． さらにヘルペスウィルスアッセンブリー蛋白質前駆体を切断する能力を有 することを特徴とする請求項１に記載のヘルペスプロテアーゼ。 ３． さらに単純ヘルペスウィルス２型のヘルペスウィルスアッセンブリー蛋白 質前駆体を切断する能力を有することを特徴とする請求項１に記載のヘルペスプ ロテアーゼ。 ４． さらに図１のアミノ酸配列を含むことにより確認されることを特徴とする 請求項１に記載のヘルペスプロテアーゼ。 ５． 図１のアミノ酸配列に対する相同性が少なくとも約７０％であるアミノ酸 配列。 ６． 図１のアミノ酸配列に対する相同性が少なくとも約９０％であるアミノ酸 配列。 ７． 単純ヘルペスウィルス２型プロテアーゼまたはその一部をコードする単離 された核酸配列。 ８． ヘルペスウィルスアッセンブリー蛋白質前駆体を切断する能力を有するプ ロテアーゼをコードすることを特徴とする請 求項７に記載の核酸配列。 ９． 単純ヘルペスウィルス２型のヘルペスウィルスアッセンブリー蛋白質前駆 体を切断する能力を有するプロテアーゼをコードすることを特徴とする請求項７ に記載の核酸配列。 １０． 図１に示すヘルペスプロテアーゼをコードする核酸配列。 １１． 図１の核酸配列に対する相同性が少なくとも約７０％である核酸配列を 含む核酸セグメント。 １２． 図１の核酸配列に対する相同性が少なくとも約９０％である核酸配列を 含む核酸セグメント。 １３． 単純ヘルペスウィルス２型プロテアーゼまたはその一部をコードする核 酸配列を含む組換えベクター。 １４． さらに発現ベクターとして確認されることを特徴とする請求項１３に記 載のベクター。 １５． させにプロモーターを含むことにより確認されることを特徴とする請求 項１４に記載のベクター。 １６． 単純ヘルペスウィルス２型プロテアーゼまたはその一部をコードする核 酸配列を含む組換えベクターで形質転換された組換え宿主細胞。 １７． 宿主が細菌、酵母または昆虫細胞から選択されることを特徴とする請求 項１６に記載の組換え宿主細胞。 １８． 宿主が、大腸菌、Saccharomyces cerevisiaeまたはTrichoplusia niで あることを特徴とする請求項１７に記載の宿主細胞。