JPH05260974A - Dna配列、それによる形質転換体及びそれらを調製する方法 - Google Patents

Dna配列、それによる形質転換体及びそれらを調製する方法

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JPH05260974A
JPH05260974A JP4267339A JP26733992A JPH05260974A JP H05260974 A JPH05260974 A JP H05260974A JP 4267339 A JP4267339 A JP 4267339A JP 26733992 A JP26733992 A JP 26733992A JP H05260974 A JPH05260974 A JP H05260974A
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Genentech Inc
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 組み換え体の同定及び単離が簡単で生成頻度
が高い、外来遺伝子の発現に使用できるDNA配列、そ
れによる形質転換体及びそれらを調製する方法を提供す
る。 【構成】 酵母及びウィルス中で複製可能なDNA配列
であって、それらがウィルスゲノム、酵母ARS配列、
酵母CEN配列、少なくとも1つ、好ましくは1つまた
は2つのマーカー遺伝子及び発現されるべき遺伝子によ
って置き換えられることのできる相同的に交換可能な挿
入物を含有することを特徴とするDNA配列、それらの
酵母及びウィルス中での形質転換体並びにそれらを調製
する方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、ウィルスゲノム、酵母
ARS配列、酵母CEN配列、少なくとも1つ(好まし
くは1つまたは2つ)のマーカー遺伝子、及び発現され
るべき遺伝子によって置換され得る相同的に交換可能な
挿入物を含有する、ウィルス中及び酵母中で複製可能な
DNA配列、酵母中及びウィルス中でのその形質転換
体、及びそれらを調製するための方法に関する。
【0002】
【従来の技術】バキュロウィルスの如き大きなウィルス
は、種々の外来タンパクの発現において真核性のベクタ
ーとして広く使用されている(文献1〜3を参照)。多
くの場合、バキュロウィルスベクターは、高い発現速度
で目的とするタンパクを発現し、僅かな例外を除いて
は、これらタンパクは正確に産生され、生物学的に活性
である。バキュロウィルスの場合には、発現系は、高発
現ポリヘドリン(polyhedrin)遺伝子が、ポリヘドリン
プロモーターとそれと融合した配列であって目的とする
外来タンパクをコードするコード配列からなる組み換え
遺伝子によって置換されるという事実に基づいている。
ポリヘドリン遺伝子は該ウィルスの複製に必須のもので
はないので、得られる組み換えウィルスは充分に感染性
であり、該活性化されたポリヘドリンプロモーターは感
染の遅い段階で外来遺伝子の能率的な転写をコントロー
ルする。この系は、非常に能率的で有用であるというこ
とが証明されているが、組み換えウィルスの同定及び単
離の難しさのために、時間がかかり骨が折れるものであ
る。
【0003】外来遺伝子の発現に最も広く使用されるバ
キュロウィルスは、 Autographa californica 核多角体
病ウィルス(AcNPV)であり、そのゲノムは約130kb
の環状二本鎖DNA分子からなるものである(4)。該
ゲノムの大きさのために、例えば、制限エンドヌクレア
ーゼ切断点を使用するような従来の技術を使用して外来
DNAを挿入するのは不可能である。従って、使用され
る方法は、昆虫細胞の中に共同形質移入された(co-tra
nsfected)ウィルスのDNAと好適なトランスファーベ
クターとの相同的組み換えに基礎を置く(5〜9)。該
トランスファーベクターは、ポリヘドリンプロモーター
の下流に挿入された組み換え遺伝子からなり、無傷のウ
ィルス中でポリヘドリン遺伝子の側面にある配列と同じ
配列が側面を占めている。該ウィルス中での該相同的フ
ランキング配列(flanking sequence)及び該トランスフ
ァーベクター間での生体内組み換えは、外来遺伝子によ
るポリヘドリン遺伝子の置換をもたらす。その困難性
は、特に、一般に組み換えの頻度が低いことから起こっ
ており、それは通常たった0.1〜1%に過ぎない。従っ
て、非常に重要なバックグラウンドにわたって、原ウィ
ルスから組み換えウィルスを同定することが必要であ
る。
【0004】次の方法は、組み換えウィルスを同定する
ために従来から使用されてきた方法である: 1)ポリヘドラ(polyhedra)‐陰性感染細胞からなるウ
ィルスプラークの顕微鏡検出(10); 2)外来DNAに対して特異的なプローブへのプラーク
ハオブリダイデーションによる組み換えプラークの検
出、それに続く目視によるスクリーニング(7及び1
1); 3)抗体によるプラークのスクリーニング(12); これら全ての方法では、純粋な組み換えウィルスを得る
前に複数のプラーク分析を行うことが必要である。以下
に、組み換えウィルスの同定を容易にする2つの変法を
簡潔に記載する:
【0005】第1の場合においては、該トランスファー
ベクターは、ポリヘドリンプロモーターによってコント
ロールされる外来遺伝子に加えて、第2の細菌性プロー
ターまたは非細菌性プローターのいずれかからコントロ
ールされる細菌性のlacZ遺伝子を含有する(13)。
相同的組み換えによって産生した組み換えウィルスもこ
のlacZ遺伝子を含有するから、β−ガラクトシダー
ゼ産生についてプラークを試験することによって同定さ
れ得る。第2の場合においては、原ウィルスは、ただ1
回だけ生じかつ環状ウィルスDNAよりもむしろ線状D
NAの形質移入を可能にする制限エンドヌクレアーゼ切
断点を含有する(14)。これは、組み換えの頻度を約1
0倍増加する。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、組み換え体
の同定及び単離が簡単で生成頻度が高い、外来遺伝子の
発現に使用できるDNA配列、それによる形質転換体及
びそれらを調製する方法を提供することを目的とするも
のである。
【課題を解決するための手段】上記の文献から知られて
いる方法の欠点は、細胞感染に必要な感染性ウィルスD
NAがウィルス及び酵母中で複製または繁殖できるDN
A配列の相同的組み換えによって得られるならば治癒さ
れ得るということが今や分かってきた。このDNA配列
は、ウィルスゲノム、自律的な複製の原因である酵母−
ARS配列、DNA分子に対して有糸分裂動原体機能を
付与しかつプラスミドDNAの安定な低コピー数を保持
するCEN配列、少なくとも1つ(好ましくは1つまた
は2つ)のマーカー遺伝子及び発現されるべき遺伝子に
よって置換され得る相同的に交換可能な挿入物を含有す
る。
【0007】使用されるウィルスゲノムは、例えば、 A
utographa californica 核多角体病ウィルス(AcNPV)
(4)の如きバキュロウィルスであってもよく、該自律
的に複製できる酵母DNA配列は、例えば、ARS1配
列の如きARS配列であってもよく、該動原性配列は、
例えば、CEN4配列(43)の如きCEN配列であって
もよく、該選択可能なマーカー遺伝子は、例えば、UR
A3−(44)、canl−100、ade2−1、CY
2、TRP1、LEU2、HIS3またはLYS2遺伝
子であってもよく、該相同的に交換可能な挿入物は、例
えば、SUP4−o−(42)、CAN1、URA3また
はLYS2遺伝子であってもよく、該真核細胞は、Sf
9細胞であってもよく、そして発現される遺伝子は、ウ
ィルス中で発現されることのできるいかなる遺伝子、例
えば、インターフェロン遺伝子、CREB1またはCR
EB2(41)であってもよい。
【0008】一例として、転写因子群の2つのメンバー
であるCREB/ATFの発現を挙げると、本発明によ
る方法は、例えば、バキュロウィルス、酵母中でのDN
Aの自律複製に必要なARS配列(15及び16)、DNA
分子に対し有糸分裂動原体機能を付与し且つプラスミド
DNAの安定な低コピー数を保持するCEN配列(1
7)、URA3マーカー遺伝子及び任意に選択可能なS
UP4−o遺伝子(18)を使用して、対応する−X−A
−U−C配列(ここで、Xは発現されるべき遺伝子を表
し、AはTRP1/ARS1配列を表し、UはURA3
遺伝子を表し、CはCEN4遺伝子を表す。)(図1参
照)によるポリヘドリンプロモーターによって制御され
た遺伝子の相同的置換によって、以下のように行われ
る。
【0009】
【実施例】第1工程 ブルースクリプトプラスミド〔ストラタ遺伝
子(Stratagene)〕にTRP1/ARS1、CEN4及
びURA3配列を挿入することによって、プラスミドp
BY3を以下のようにして調製した:TRP1/ARS
1配列(フラグメントA)を含有する840bp長のフ
ラグメントをブルースクリプトプラスミドのEcoRI
切断点及びHindIII 切断点の間に挿入し、次いで、
URA3遺伝子(フラグメントU)を含有する1100
bp長のフラグメントをHindIII 切断点に挿入し、
最後に、CEN4遺伝子(フラグメントC)を含有する
1000bp長のフラグメントをXho1切断点とKp
n1切断点の間に挿入した。このようにして得られた酵
母カセットをBamH1−Kpn1フラグメントとして
切除し、トランスファーベクターpAcC4 (19)のB
amH1−Kpn1切断点に挿入して、酵母カセットA
−U−Cを含有するプラスミドpAcAUCを得た。こ
のようにして得られたベクターをSf9細胞の中に野性
型バキュロウィルスDNA(AcNPV−DNA)と共
同形質移入し、それによって組み換えバキュロウィルス
YCbvを得、プラーク分析を繰り返して目視で同定し
精製した〔(9)も参照〕。このベクターはポリヘドリ
ン遺伝子の代わりに上記の酵母カセットを含有する。
【0010】第2工程 上記のバキュロウィルス(YC
bv)の細胞外ウィルスからウィルスDNAを調製し、
ウラシル依存 S.cerevisiae 株y657で形質転換し
た。該形質転換した細胞をウラシルを欠く培養によって
選択した。数個のUra+ 形質転換体を得た。その幾つ
かについて、バキュロウィルス配列の存在を検出するた
めのプローブとして完全ウィルスDNAを使用したサザ
ーンブロット分析によって試験した。試験した全てのU
ra+ コロニーは、予想したウィルス配列を含有してい
た。YGP1と命名された、酵母カセットA−U−Cを
含有するこれら形質転換体の1つから、完全DNAを単
離し、ショ糖勾配遠心分離法によって部分的に精製して
Sf9細胞中に形質移入した。3日後に培養液の上清を
得、新たなSf9細胞を感染するのに使用した。該細胞
の顕微鏡試験を行ったところ、感染性ウィルスの存在を
示した。これは、プラーク分析によって確認した。感染
した細胞からウィルスDNAを調製し、これには、Ur
+ 酵母中に形質転換した場合にウラシル非依存性を伝
達する能力が残っていたことが見出された。従って、組
み換えバキュロウィルスDNA(YCbv)が、如何な
る顕著な困難性もなく、酵母及び昆虫細胞の間を往復で
きることが明らかになった。
【0011】第3工程 発現されるべき外来遺伝子を含
有するトランスファーベクターで相同的組み換えを行っ
たYCbv誘導体の検出を容易にするために、第2の選
択可能な相同的に置換可能である挿入物をYGP1酵母
中に含まれたYCbv−DNA中に挿入した(図1参
照)。この目的のために、オーカーコドンを抑制するt
RNATyr 遺伝子の対立遺伝子である、SUP4−o遺
伝子(フラグメントS)を選択した。好適な酵母細胞に
おいて、例えば、Y657において、SUP4−oは負
または正の選択の下で配置され得る。本発明による方法
において、ADE2及びCAN1遺伝子中にオーカー突
然変異を含有する株が使用された。ADE2はアデニン
生合成ルートにおける必須酵素をコードする(20及び2
1)。この遺伝子の突然変異は、宿主のアデニン依存性
を伝達するのみならず、アデニン合成ルートの中間生成
物(ホスホリボシルアミノイミダゾール,AIR)の蓄
積をももたらし、それは、該細胞コロニーをピンクに変
える。該CAN1遺伝子は酵素アルギニン透過酵素をコ
ードし、該細胞を有害アルギニン類縁体カナバニンに対
し感受性を有するようにする(22)。Can- 突然変異
体は如何なる機能性アルギニン透過酵素も合成すること
ができず、従って、カナバニンに対し耐性がある。
【0012】SUP4−o遺伝子をYCbv−DNA中
に導入するために、SUP4−o遺伝子を含有し、ポリ
ヘドリン翻訳開始コドンの上流とTPR1/ARS1配
列の下流に位置した配列により1つの側面を占められた
トランスファーベクター、例えば、プラスミドpAcY
−Sを構築した。続くYCbvを含有する酵母(YGP
1)への形質転換及びYCbvと該ベクターの間での相
同的組み換えは、YCbv中へのSUP4−oの挿入を
導く。この方法で得られた組み換え体をYGP2と命名
した。それはS−A−U−Cカセットを含有し、その単
離及び同定は以下に説明される。図2は、SUP4−o
遺伝子を持つかまたは持たないY657細胞から誘導し
た細胞の種々の表現型を纏めたものである。その本質的
な特徴は、カナバニン耐性が強い対抗選択を可能にして
いるのに反して、アデニン非依存性がSUP4−oの存
在のための正の選択を保証しているということである。
【0013】必要とされるベクターは、次のようにして
構築した:トランスファーベクターpAcY1(図3参
照) 840bp長のTPR1/ARS1配列をブルー
スクリプトプラスミドのEcoRI−HindIII 切断
点に挿入することによって得た。このようにして得られ
たプラスミドpBY1をXbalで消化し、クレノー
(klenow)ポリメラーゼで末端を充填し、再度BamI
で消化した(フラグメント1)。pAcC4−DNA
(19)をBstEIIで消化し、クレノー・ポリメラーゼ
で末端を充填し、再度BamHIで切断し、ポリヘドリ
ンプロモーター及び5'-フランキング配列を含有する3
kbフラグメントを単離した(フラグメント2)。この
ようにして得られたフラグメント2をプラスミドpBY
1から得たフラグメント1と結さつし、NcoI及びE
coRI切断点の間に位置するDNAフラグメントをポ
リリンカーによって置き換え、プラスミドpAcY1を
得た。このベクターの欠くことのできない特徴は、それ
が、3kbの5'-フランキングバキュロウィルス配列と
共にポリヘドリンプロモーター、該プロモーターのすぐ
下流でただ一回だけ生成する幾らかの制限部位を含有す
るポリリンカー、及びポリヘドリン−5'−非コード配列
を含有することであり、その後にYCbcを構築するた
めに使用される酵母ARS配列が続く(図4参照)。該
ポリリンカーのNcoI切断点はポリヘドリン−ATG
−開始コドンを含有する。
【0014】トランスファーベクターpAcY2 プラ
スミドpAcYM1(23)のBstEII−BamHIフ
ラグメントを上記のフラグメントの代わりに使用したこ
と以外は同様にして得た。このベクターは、外来遺伝子
の挿入に使用したポリリンカーの他は、ベクターpAc
Y1に非常に類似している(図3参照)。しかしなが
ら、ポリヘドリン−ATG−コドンが失われており、結
果として、挿入された外来配列によって開始コドンが作
られなければならない(図5参照)。このことは、挿入
物が両側でバキュロウィルスDNAによって側面を占め
られている上記に記載したベクターとは異なって、これ
ら2つの新規なベクターにおいては、挿入物はウィルス
配列によって5’側で及び酵母ARS配列によって3’
側で占められていることを意味している。
【0015】トランスファーベクターpAcY2−S
SUP4−o遺伝子を含有するトランスファーベクター
pAcY2−Sを、プラスミドp464をEcoRIで
消化することにより得られかつオーカーサプレッサー遺
伝子SUP4−oを含有する300bp長フラグメント
をトランスファーベクターpAcY2のEcoRI切断
点に挿入することにより得た。このEcoRI切断点は
ARS1酵母配列のちょうど上に位置している。このよ
うにして得られたpAcY2−Sプラスミドを、酵母形
質転換のために、ARS1配列中にあるBglII切断点
及び該トランスファーベクターのバキュロウィルス配列
中にあるXhoI切断点で切断し、先に得たYGP1で
組み換えた。このようにして得られた形質転換細胞をア
デニンを欠く培養によって選択し、次いで、ヒスチジ
ン、トリプトファン、アデニン及びロイシンを添加した
SD−寒天プレート上でコロニーを精製した。個々のコ
ロニーをカナバニンの存在下での成育について試験し、
同時に、更に試験するためカナバニンに対して感受性で
あるコロニーを選択しYGP2と命名した。選択したY
GP2コロニーは、tRNAサプレッサーSUP4−o
の存在下で望ましい表現型、即ち、オーカー突然変異a
de2−1の抑制及びCAN1−100突然変異の抑制
の結果としてのカナバニン感受性に基づくアデニン非依
存性を有する。該組み込まれたSUP4−o遺伝子の存
在も、サザーンハイブリダイゼーション分析によって検
出された。このようにして得られた酵母株YGP2は、
相同的組み換えによるポリヘドリンプロモーターの下流
への外来遺伝子の挿入にとって、高度に適した受容株で
ある。
【0016】第4工程 転写因子群の2つの異なるメン
バーであるCREB/ATFを含有するバキュロウィル
ス組み換え体を単離するために、新規な方法を使用し
た。これら群のメンバーは、DNA配列5’TT/GA
CGTCA3’に特異的に結合しており、それらは、上
昇したcAMP濃度を介して転写活性化を伝達すること
ができ(24)、またアデノウィルスE1Aタンパクも結
合している(25)。この群のメンバーをコードする少な
くとも10の異なったcDNAが報告されている(26及
び30)。これらは全てホモダイマーとしてDNAに結合
することができるが、それらの多くはお互いに相互作用
することもできヘテロダイマーとして結合することがで
きる。結果として生ずる非常に重要な複雑さは、このタ
ンパク群の個々のメンバーを大量に入手できることによ
って、より容易なものとなった。行った実験について、
CREB1及びCREB2(CRE−BP1、ATF−
2)cDNA中に含有される組み換え体を選択した。こ
れらは、CREB1活性がcAMPまたはキナーゼA活
性(31)を上昇させる他の条件によって調節され、CR
EB2活性がE1Aタンパクによって調節される(32〜
34)ので格別に興味深い。両方の場合において、cDN
AはベクターpAcY2(図6及び図7参照)中に挿入
され、次いで、酵母TRP1遺伝子(45)を含有する共
同形質転換プラスミドと共にYGP2酵母細胞中に挿入
された(図1参照):
【0017】該pAcY2−CREB1プラスミドは、
600bp長の非コード配列を3’末端に含むCREB
1配列を含有する1.6kb長EcoRIフラグメントを
トランスファーベクターpAcY2のEcoRI切断点
中に挿入することによって得られ、該pAcY2−CR
EB2プラスミドは、CREB2コード配列を含有する
末端を充填したHincII−ClaIフラグメントをプ
ラスミドpAcY2ののSmaI切断点に挿入すること
によって得られた。得られたトランスファーベクターp
AcY2−CREB1を、相同的組み換えを容易にする
ためにSalIで線状にし、酵母TRP1遺伝子を含有
するプラスミドと共に、YGP2−スフェロプラストで
形質転換した。得られた形質転換体をトリプトファンを
欠いた培養によって選択し、個々の形質転換体をカナバ
ニンを含有するプレート上でのレプリカ平板法によって
カナバニン耐性について試験した。この種の耐性形質転
換体は、SUP4−oをCREB1によって置き換えな
がら、内因性YGP2及びpAcY2−CREB1−D
NA間での相同的組み換えによって生成する。耐性形質
転換体の生成頻度は、80%のオーダー内であることが
見出された。CREB1配列によるSUP4−oの置換
について、12の異なる耐性形質転換体をサザーンハイ
ブリダイゼーションによって試験し、これら形質転換体
の1つをYBP3と命名した(YCbv::CREB1を
含有する)。この現象がそれぞれの個々の形質転換体に
おいて起こったという事実が、使用した選択システムの
有効性を証明した。従って、耐性コロニーをサザーンハ
イブリダイゼーションによって常に試験することは不要
であることが明らかである。
【0018】pAcY2−CREB2ベクターをXho
Iで線状化したこと以外は、類似の方法を使用してCR
EB2を含有する組み換え体を単離した。得られた形質
転換体の1つをYGP4と命名した(YCbv::CRE
B2を含有する)。YGP3の完全DNA及びYGP4
を含有する酵母細胞を、ショ糖勾配遠心分離法を使用し
て部分的に分別した。PCR分析を使用してウィルスD
NAの位置を即座に決定した。ウィルスDNAは全勾配
で見出されたとは言え、DNAの大部分は使用した条件
でおよそ中程の勾配に集まった(酵母DNAの生成も参
照のこと)。
【0019】第5工程 上記で得られたDNAをリポフ
ェクションによってSf9細胞に挿入した(図1参
照)。感染した細胞は3日後に明瞭に目視可能となっ
た。後の感染用に上清を保存し、組み換えタンパクの存
在について該細胞を試験した。分別されていない完全D
NA試料を使用してもうまく感染することができた。し
かしながら、成功率は変動し、しかも何らかの成功を見
込めるためには広範囲のDNA濃度で試験しなければな
らないことが分かった。成功率の差は、酵母DNA試料
中に含有されている、形質移入操作を妨害する阻害物質
が原因であると考えられる。対照的に、ショ糖勾配物質
を使用すると信頼できる結果が得られた。この工程は絶
対不可欠ではないが好ましいものである。
【0020】ウィルス感染Sf9細胞中でのCREB1
及びCREB2タンパクの発現は、電気泳動分析法によ
って分析した。全細胞抽出物を調製し、フィブロネクチ
ンATF/CRE結合部位を含有する標識したオリゴヌ
クレオチドプローブを使用して、特異的DNA結合活性
について試験した。図8のAに示すように、感染後1日
目で特異的タンパク−DNA複合体が目視できた。該複
合体の移動度はCREB1のC末端ペプチドに対する抗
体の存在で遅くなったが(35)非特異的抗体によっては
影響を受けないでいた。次の2日の間に結合活性のレベ
ルは有意に上昇した。しかしながら、感染後2日を越え
る時点においては、多くのCREB1タンパクは退化
し、一連のより速く移動する複合体になった。長時間の
インキュベートで、感染されていない抽出物中にも結合
活性が見出されたが、この内因性活性はCREB1抗体
によっては認識されなかった。結合の特異性は、標識さ
れていないフィブロネクチンオリゴヌクレオチドの過剰
量(これは非特異的オリゴヌクレオチドとは対照的に結
合に関しよく競合する)と競合させることによって確認
した(図8のBを参照)。感染後3日を越える感染した
抽出物中のCREB1タンパクの存在及びその分解は、
ウェスタンブロットによって確認した。
【0021】CREB2含有組み換え体で感染した細胞
からの抽出物も、ATFオリゴヌクレオチドと特異的に
相互作用する有意に上昇した結合活性レベルを有した
(図9参照)。感染後2日して、感染された抽出物から
生じた多くの複合体が出現した。特に、移動性がCRE
B2のN末端またはC末端の近くに位置するタンパクに
向けられた抗体によって影響を受けたときに、無傷のC
REB2タンパクは最も遅い複合体移動度を高確率で生
じた。加えて、ウェスタンブロット分析によって、CR
EB2について予想された位置に移動タンパクの存在が
示された。より速い移動複合体が、無傷のタンパクのタ
ンパク分解性開裂によって生じた。これらは、N末端抗
体ではなくC末端抗体によって認識される。CREB1
の場合のように、感染後多くの時間が経過した時点で
は、より小さな生成物だけが生成した。両方のCREB
タンパクが、組み換えウィルスによって感染された細胞
中で合成されるとは言え、これらのタンパクの蓄積され
たレベルは、相互に有意に相違する。感染2日後に、総
タンパクを基準として25%のCREB1タンパクと僅
か1〜2%のCREB2タンパクが見出された。これら
の差はおそらく安定性の差に帰することができよう。
【0022】原料及び方法 細胞 昆虫セルラインSf9(ATCC No. CRL1711)及び「野性
型AcNPV」(株E2)の作成は既に説明した通りで
ある(10)。使用した株、即ち、 S.cerevisiae y65
7(matα、his3−11,15 trp−1 ade2
−1 leu2−3,112 ura3−52 can−100
his4::HIS3)が、アンディー・ニューマン(And
y Newman)(38)によって提供された。バキュロウィル
ス/cenプラスミドを含有するこの株またはその誘導
体の成育は、富培地〔酵母抽出物/ペプトン/デキスト
ロース(YPD)〕または20μg/mlのヒスチジン、
20μg/mlのトリプトファン、20μg/mlのアデニ
ン、60μg/mlのロイシン及び10μg/mlのカザミ
ノ酸を加えた合成最少培地(SD)中で行った。2%の
寒天、SD、通常のアミノ酸添加物及び60μg/mlの
硫酸カナバニン(シグマ社製)を含有するプレート上で
カナバニン耐性の形質転換体を選択した。それぞれの場
合において、酵母の成育は30℃で行った。
【0023】酵母の形質転換 酵母スフェロプラストを調製し、次のようにして形質転
換した(39):50mlの酵母培養液を光学密度がOD
600 =0.5〜1までの好適な培地中で培養した。該細胞
を2Kで5分間遠心分離にかけ、得られたペレットを蒸
留水で1回、1Mソルビトールで1回洗浄し、次いで、
20mlのSCEM(1Mソルビトール、0.1Mクエン酸
ソーダpH5.8、10mMEDTA及び30mMβ−メルカ
プトエタノール)中で再懸濁し、1000ユニットのリ
チカーゼ(シグマ社製)中で再懸濁した。90%の細胞
がスフェロプラストに変化するまで30℃で20〜30
分間、該細胞懸濁液をインキュベートした。該スフェロ
プラストを注意して1Kで6〜7分間遠心分離し、得ら
れたペレットを20mlのSTC(1Mソルビトール、1
0mMトリス/HClpH7.5及び10mM塩化カルシウ
ム)で洗浄し、最後に2mlのSTC中に懸濁した。適切
な外来DNAを含有する5μgのトランスファーベクタ
ーをポリヘドリン配列内及びARS配列内またはARS
配列のすぐ下で切断した。切断したプラスミドをエタノ
ールで沈澱し、得られた100μlのスフェロプラスト
で形質転換に使用した。該酵母プラスミドDNA混合物
を周囲温度で10分間放置した後、1mlのPEG溶液
(10mMトリス/HClpH7.5、10mM塩化カルシウ
ム及び20%PEG8000)を加え、10分間インキ
ュベートを続けた。該スフェロプラストを1Kで6〜7
分間遠心分離し、得られたペレットを150μl のSD
S緩衝液〔1Mソルビトール、6.5mM塩化カルシウム、
0.25%酵母抽出物(Difco)及び0.5%バクトペ
プトン(Difco)〕中に懸濁し、30℃で15〜3
0分間インキュベートした。次いで、適切な添加物を含
有する8mlの溶融した上部の寒天(molten top agar)を
該スフェロプラスト懸濁液に加え、これを、添加物であ
るヒスチジン、ロイシン、アデニン及びトリプトファン
と共にSD培地を含有する寒天プレートの表面上に直接
撒いた。形質転換用のために、TRP1遺伝子を含有す
る0.5μgのプラスミドを該切断したトランスファーベ
クターに加えた。選択は、トリプトファンを含まない培
地中で行った。
【0024】酵母DNAの調製 (40)に記載されているようにして、完全酵母DNAを
調製した:YGP3またはYGP4酵母細胞250ml
を、好適な添加物及びカザミノ酸を含有するSD培地中
で、光学密度がOD600 =1〜2が得られるまで培養し
た。該形質転換法で記載されたようにして該スフェロプ
ラストを調製し、4.5MのGuHCl、0.1MのEDT
ApH8、0.15MのNaCl及び0.05%のサルコシ
ルを含有する15mlの細胞溶解緩衝液中に注意して懸濁
した。65℃で10分間経過した後、周囲温度まで懸濁
液を冷やし、15mlの冷エタノールで該DNAを沈澱さ
せ、ソルボール(Sorvall)SS34ローター中で10,0
00rpmで10分間遠心分離することによって分離し
た。得られたペレットを10mlの0.1MトリスpH7.
5、0.01MのEDTA及び50μl のRNAseA
(10mg/ml)中に再懸濁した。37℃で60分インキ
ュベートした後、150μl のプロテイナーゼK(10
mg/ml)を加え、65℃で更に30分間インキュベート
を続けた。フェノールで該DNAを2回抽出し、エタノ
ールで析出させ、TE(10mMトリス及び1mMのEDT
A)中で懸濁させた。
【0025】記載した実験の大半で使用した完全DNA
をショ糖勾配遠心分離法で分別した。該DNAは、20
0mMNaCl、10mMトリスpH7.5及び2mMEDTA
中の5〜20%ショ糖勾配の最上部に位置していた。各
勾配は35Kで3時間及びSW40ローター中で遠心分
離した。このような状況で、バキュロウィルスDNAの
大多数は該勾配の下方から中程下方に移動した。該勾配
を分別し、冷エタノールの2容量をバキュロウィルスD
NAを含有する画分に加えた。析出したDNAをTE
(10mMトリス及び1mMのEDTA)中に再懸濁し、こ
の形で昆虫細胞の形質移入に使用した。
【0026】昆虫細胞の形質移入 ショ糖勾配分別DNAをリポフェクチン(Gibco)
を使用してSf9細胞中に導入した。5〜10μl の分
別したDNAに水を加えて総容量を12μl にした。8
μl のリポフェクチンを含有する同じ容量のリポフェク
チン緩衝液を4μl の水と混合しDNAに加えた。この
2つの溶液を注意して一緒に混合し、室温での15分間
のインキュベートの後、1mlの無血清培地中に1.5×1
6 のSf6細胞を含有する35mm組織培養皿に加え
た。28℃で16時間経過した後、培地を除いて10%
FCSを含有する新たな培地で置き換えた。第3日また
は第4日までに、細胞は目に見えて感染され、同時に分
析目的のために該細胞を採取して新たな細胞の再感染用
に上清を蓄えた。
【0027】電気泳動移動分析 35mm皿からの感染されまたは「リポフェクション」さ
れたSf9細胞をPBSで洗浄し、該細胞を、10mMの
ヘペス(hepes)pH7.9、1.5mMのMgCl2、0.1mMの
EDTA、5%のグリセロール、0.5mMのDTT及び0.
5mMのPMSFを含有する100μl の抽出緩衝液中で
再度洗浄した。0℃で5分間経過した後、該溶解産物を
10秒間遠心分離し、上清を新しい試験管に移した。ペ
レットは、0.35MのNaClを含有する50μl の抽
出緩衝液中に再懸濁し、4℃で15分間インキュベート
した。細胞片を10分間の遠心分離で除いた後、45μ
lの上清を100μl の低塩溶解産物と混合し、0.1M
の最終塩濃度で目的とする細胞抽出物を得た。フィブロ
ネクチンATF/CREB結合部位を含有するオリゴヌ
クレオチドを使用した電気泳動移動分析法は既に説明し
た(41)。1μl の細胞抽出物を各分析で使用した。結
合反応の開始後5分で、抗体を添加して、複合体の移動
度について特異抗体の効果を試験した。次の抗体を使用
した:CREB1抗体は、文献で公知であり(35)、ヒ
トCREB1タンパクの10末端アミノ酸を認識する。
N末端CREB2抗体(NJ2)はヒトCREB2タン
パクのアミノ酸85〜96を含有するペプチドを認識
し、C末端抗体はアミノ酸490〜505を含有するペ
プチドを認識する。
【0028】参照文献のリスト 1. ラッコウ(Luckow, V.A )及びサマーズ(Summers
、 M.D.),Virology 167,56-71, (1988) 2. ミラー(Miller, L.K.), Ann.Rev.Microbiol. 42,
177-199 (1988) 3. マエダ(Maeda, S.), Ann. Rev. Entomology 24, 35
1-372(1988) 4. バーゲス(Burgess, S.), J. Gen. Virol. 37, 501-
510 (1977) 5. ペノック(Pennock, G.D.),ショーマーカー(Shoemak
er, C.), ミラー,Mol.Cell. Biol. 399-406 (198
4) 6. スミス(Smish, G.E.),フラスター(Fraser, M.J.)及
びサマーズ,J. Virol.46, 584-593 (1983) 7. グリーンフィールド(Greenfield, C.), パテル(Pat
el, G.),クラーク(Clark, S.),ジョンズ(Jones. N.C.),
ウォーターフィールド(Waterfield, M.D.), EMBO J.
, 139-146 (1988) 8. パテル及びスターベル(Stabel, S.), Cell Signall
ing , 227-250 (1989) 9. パテル及びジョンズ,Nucl. Acids. Res. 18, 2909
-2915 (1990) 10. サマーズ及びスミス,Texas Agricultural Experim
ent Station Bulletin No. 1555 (1987) 11. ペン(Pen. J.),ウェリング(Welling, G.W.) 及びウ
ェリング−ウェブスター(Welling-Webster, S.), Nucl.
Acids Res. 17, 451 (1989) 12. カポン(Capone, J.), Gene Anal. Tech.,62-66
(1989) 13. ズイデマ(Zuidema, D.),シャウテン(Schouten,
A.), アスマニー(Usmany, M.), マウル(Maule, A.JH.),
ベルシャム(Belsham, G.J.),ルーシェン(Roosien,
J.),クリンゲールーデ(Klinge-Roode, E.C.), バン・レ
ント(Van Lent, J.W.M.)及びラックVlak, J.M.), J. Vi
rol. 71,2201-2209 (1990)
【0029】14. キッツ(Kitts, P.A.),アイレス (Ayre
s, M.D.)及びポジー(Possee, R.D.),Nucl. Acids. Re
s. 18, 5667-5672 (1990) 15. ブロイワー(Brewer, B.J.)及びファングマン(Fangm
an, W.L.), Cell 51, 463-471 (1987) 16. スティンコンブ(Stinchcomb, D.T.), ストルール(S
truhl, K.)及びデイビス(Davis, R.W.), Nature 282
39-43 (1979) 17. フィッツゲラルド−ヘイズ(Fitzgerald-Hayes, M.)
Yeast ,187-200 (1987) 18. ゲステランド(Gesteland, R.F.),ボルフナー(Wolfn
er、M.),グリザフィ(Grisafi, P.),フィンク(Fink,
G.), ボッツティン(Botstein, D.)及びロス(Roth.J.
R.), Cell , 381-390 (1976) 19. ラッコウ及びサマーズ,Bio Technology ,47-5
5 (1988) 20. シルバー(Silver, J.M.)及びイートン(Eaton, N.
R.), Biochem. Biophys. Res. Comm. 34, 301-305 (196
9) 21. ウッズ(Woods, R.A.), Mol. Gen. Genet. 105,31
4-316 (1969) 22. ホッフマン(Hoffmann, W.), J. Biol. Chem. 26
0,11831-11837 (1985) 23. マツウラ(Matsuura, Y.), ポジー,オバートン(Ove
rton, H.A.) 及びビショップ(Bishop, D.H.L.), J. Ge
n. Virol. 68, 1233-1250 (1987) 24. モントミニィ(Montminy, M.R.), サバリノ(Savarin
o, K.A.), ワグナー(Wagner, J.A.), マンデル(Mandel,
G.)及びグッドマン(Goodman, R.H.), Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA. 86, 6682-6686 (1986) 25. リー(Lee, K.A.W.),ハイ(Hai, T.Y.),シバラマン(S
hivaraman, L.), チマッポヤ(Thimmappaya, B.),ハース
ト(Hurst, H.C.),ジョンズ及びグリーン(Green, M.R.),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA.84, 8355-8359 (1987)
【0030】26. ホエフラー(Hoeffler, J.P.), ミーヤ
ー(Meyer, T.E.),ユン(Yun, Y.) ジェムソン(Jameson,
J.L.) 及びハベナー(Habener, J.F.), Science242, 14
30-1433 (1988) 27. ゴンザレス(Gonzalez, G.A.), ヤマモト(Yamamoto,
K.K.),フィッシャー(Fischer, W.H.),カール(Karr,
K.), マンゼル(Manzel, P.), ビッグス(Biggs III,
W.),バーレ(Vale, W.W.)及びモントミニー(Montminy,
M.R.), Nature 337,749-752 (1989) 28. ハイ(Hai, T.Y.),リウ(Liu, F.),コーカス(Coukos,
W.J.)及びグリーン(Green, M.R.), Genes Devel. ,
2083-2090 (1989) 29. マエカワ(Maekawa, T.),サクラ(Sakura, H.), カネ
イ−イシイ(Kanei-Ishii, C.),スドウ(Sudo, T.), ヨシ
ムラ(Yoshimura, T.),フジサワ(Fujisawa, J.), ヨシダ
(Yoshida, M.) 及びイシイ(Ishii, S.), EMBO J., 20
23-2028 (1989) 30. ヨシムラ,フジサワ,及びヨシダ(Yoshida, M.), E
MBO J.,2537-2542 (1990) 31. ゴンザレス及びモントミニー,Cell 59, 675-680
(1989) 32. リウ及びグリーン,Cell 61, 1217-1224 (1990) 33. マエカワ、マツダ、フジサワ、ヨシダ及びイシイ,
Oncogene, 627-632 (1991) 34. フリント(Flint, K.) 及びジョンズ,Oncogene, in
Press 35. ハースト(Hurst, H.C.),マーソン(Masson, N.), ジ
ョンズ及びリー(Lee, K.A.W.), Mol. Cell. Biol. 10,
6192-6203 (1990) 36. ワード(Ward, M.), スコット(Scott, R.J.),ダーベ
イ(Davey, M.R.),クロチナー(Clothier, R.H.), コッキ
ング(Cocking, E.C.) 及びバールズ(Balls, M.),Somat.
Cell. Mol. Genet.12,101-109 (1986) 37. グニルク(Gnirke, A.), バーンス(Barnes, T.S.),
パターソン(Patterson,D.),シルド(Schild, D.),フィ
ーザーストン(Featherstone, T.)及びオルセン(Olsen,
M.V.), Embo J.10, 1629-1634 (1981)
【0031】38. ニューマン(Newman, A.)及びノーマン
(Norman, C.), Cell 65, 115-123 (1991) 39. バーゲス(Burgess, P.M.J.) 及びバーシバル(Perci
val, K.J.), Anal. Biochem.163, 391-397 (1987) 40. ホルム(Holm, C.), ミークス−ワグナー(Meeks-Wag
ner, D.W.), ファングマン(Fangman, W.L.) 及びボッツ
テオン(Botsteon, D.), Gene 42, 169-173 (1986) 41. ベンブロック(Benbrook, D.M.)及びジョンズ Oncog
ene ,295-302 (1990) 42. ロッツティン(Rotstein, R.), Cell. 17, 185-190
(1979) 43. マーン(Mann, C.)及びデイビス(Davis, R.W.), Mo
l. Cell. Biol. ,241-245 (1986) 44. ローズ(Rose, M.), グリサフィ(Grisafi, P.) 及び
ボッツティン(Botstein,D.), Gene 29, 113-124 (1984) 45. ツクンバー(Tschumber, G.) 及びカーボン(Carbon,
J.), Gene 10, 157-166 (1980)
【図面の簡単な説明】
【図1】中間宿主として S.cerevisiae を使用した組み
換えバキュロウィルスの単離のための経路の概略図であ
る。ARS、URA及びCEN酵母成分は、それぞれ
A、U及びCで示した。
【図2】SUP4−o遺伝子を含有するかまたは含有し
ないy657酵母誘導体の表現型を示したものである。
y657株は出発原料として使用される。YGP2は、
酵母配列SUP4−o、ARS、URA及びCENがポ
リヘドリンプロモーターの下流に挿入された、エピソー
ムのように保持されたバキュロウィルスDNAを含有す
る。YGP3及びYGP4は、複製可能なゲノムがSU
P4−o遺伝子の代わりにCREB1及びCREB2c
DNA配列を含有するYGP2誘導体である。
【図3】トランスファーベクターpAcY1及びpAc
Y2の構築の特徴を示す。実線部分、濃淡をつけた部分
または透明部分によって示されるプラスミド領域は、そ
れぞれ酵母ARS、バキュロウィルス及びベースプラス
ミド配列を示す。
【図4】トランスファーベクターpAcY1の制限エン
ドヌクレアーゼ地図を示す。該プラスミドは、ウィルス
配列によって上方及び酵母TRP/ARS配列によって
下方を占められたバキュロウィルスポリヘドリンプロモ
ーター及びリーダー配列を含有する。リーダー配列の下
流に位置する切断点及び外来コード配列の挿入に好適な
切断点に印を付した。このトランスファーベクターの最
終翻訳はNcoI及びEcoRI切断点の間に位置した
オリゴヌクレオチドを含有し、示した配列を有する。
【図5】トランスファーベクターpAcY2の制限エン
ドヌクレアーゼ地図を示す。該プラスミドは、ウィルス
配列によって上方及び酵母TRR/ARS配列によって
下方を占められたバキュロウィルスポリヘドリンプロモ
ーター及びリーダー配列を含有する。リーダー配列の下
流に位置する切断点及び外来コード配列の挿入に好適な
切断点に印を付した。
【図6】ヒトCREB1cDNA配列の挿入物を含有す
るpAcY1誘導体の制限エンドヌクレアーゼ地図を示
す。
【図7】ヒトCREB2(CRE−BP1)cDNA配
列の挿入物を含有するpAcY1誘導体の制限エンドヌ
クレアーゼ地図を示す。
【図8】フィブロネクチンCRE/ATF結合部位を含
有するオリゴヌクレオチドと結合した、バキュロウィル
スによって合成されたCREB1のゲル遅滞分析法を示
す。Sf9細胞はバキュロウィルスCREB1組み換え
体で感染され、感染後1、1.5、2及び3日の各場合に
おいて、その全抽出物が調製された。各抽出物のアリコ
ートを、CREB1に特異的または非特異的な抗体の存
在下または不存在下で(A)、または100倍モル過剰
のフィブロネクチンオリゴヌクレオチドまたは非特異的
なオリゴヌクレオチドの存在下または不存在下で
(B)、オリゴヌクレオチドを含有する〔32P〕標識C
REで試験した。
【図9】オリゴヌクレオチドを含有するCRE/ATF
と結合した、バキュロウィルスによって合成されたCR
EB2のゲル遅滞分析法を示す。Sf9細胞はバキュロ
ウィルスCREB2組み換え体で感染され、感染2日後
にその全抽出物が調製された。該抽出物を、2つの異な
るCREB2特異的ペプチド抗体または非特異的抗体の
存在下または不存在下で、〔32P〕標識フィブロネクチ
ンオリゴヌクレオチドに対するその結合について試験し
た。非感染細胞からの抽出物で同じ分析を行った。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 7/01 7236−4B C12N 7/00 (71)出願人 592006486 ジェネンテック・インコーポレイテッド GENENTECH, INCORPOR ATED アメリカ合衆国、カリフォルニア・94080、 サウス・サン・フランシスコ、ポイント・ サン・ブルーノ・ブルヴァード・460 (71)出願人 592210108 インペリアル キャンサー リサーチ テ クノロジー リミテッド イギリス ロンドン ダブリューシー2エ イ 3エヌエル サーディニア ストリー ト サーディニア ハウス (番地なし) (72)発明者 キム ネイスミス オーストリア アー1060 ウィーン リン ケ ウィーンツァイレ 4−2−5 (72)発明者 ニコラス シー ジョーンズ イギリス エセックス シーエム13 1エ ルエックス ハットン レイリー ロード 115 (72)発明者 ジー パテル イギリス サリー シーアール2 1イー エヌ パーリー グリスデイル ガーデン ス 3

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 酵母及びウィルス中で複製可能なDNA
    配列であって、それらがウィルスゲノム、酵母ARS配
    列、酵母CEN配列、少なくとも1つのマーカー遺伝子
    及び発現されるべき遺伝子によって置き換えられること
    のできる相同的に交換可能な挿入物を含有することを特
    徴とするDNA配列。
  2. 【請求項2】 使用されるウィルスゲノムがバキュロウ
    ィルスのように大きなウィルスであることを特徴とす
    る、請求項1記載のDNA配列。
  3. 【請求項3】 使用されるマーカー遺伝子がURA3、
    can1−100、ade2−1、CY2、TRP1、
    LEU2、HIS3またはLYS2配列であることを特
    徴とする、請求項1記載のDNA配列。
  4. 【請求項4】 相同的に交換可能な挿入物として、SU
    P4−o−、CAN1、URA3またはLYS2遺伝子
    が使用されることを特徴とする、請求項1記載のDNA
    配列。
  5. 【請求項5】 該バキュロウィルスDNAが、ポリヘド
    リン遺伝子の代わりに、フラグメント −A−U−C−、 −S−A−U−C−及び −X−A−U−C− (ここで、AはTRP1/ARS1配列を表し、UはU
    RA3遺伝子を表し、CはCEN4遺伝子を表し、Sは
    SUP4−o−遺伝子を表し、Xは発現されるべき遺伝
    子を表す。)を含有することを特徴とする、請求項1ま
    たは2記載のDNA配列。
  6. 【請求項6】 式 −A−U−C−、 −S−A−U−C−及び −X−A−U−C− (式中、A、U、C、S及びXは請求項5と同じ意味を
    有する。)のフラグメント。
  7. 【請求項7】 Xがインターフェロン、CREB1また
    はCREB2をコードする配列を表すことを特徴とす
    る、請求項5または6記載のDNA配列。
  8. 【請求項8】 請求項1〜7に記載のDNA配列を含有
    する形質転換体。
  9. 【請求項9】 請求項1〜5に記載のDNA配列を調製
    する方法であって、酵母中で、酵母ARS配列、酵母C
    EN配列、少なくとも1つのマーカー配列及び相同的に
    交換可能な挿入物を含有する酵母カセットを有するウィ
    ルスゲノムを複製し、次いで、必要に応じて、相同的に
    交換可能な挿入物を相同的組み換えによって発現される
    べき遺伝子によって置き換えることを特徴とする方法。
  10. 【請求項10】 請求項6に記載のDNAフラグメント
    を調製する方法であって、個々のフラグメントが一緒に
    結さつされ、次いで、好適な宿主中で増殖することを特
    徴とする方法。
  11. 【請求項11】 請求項8に記載の形質転換体を調製す
    る方法であって、請求項1〜7に記載のDNA配列でウ
    ィルスを組み換えることを特徴とする方法。
  12. 【請求項12】 請求項8に記載の形質転換体を調製す
    る方法であって、請求項1〜7に記載のDNA配列で酵
    母を形質転換することを特徴とする方法。
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