JPH05260974A - Ｄｎａ配列、それによる形質転換体及びそれらを調製する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 組み換え体の同定及び単離が簡単で生成頻度
が高い、外来遺伝子の発現に使用できるＤＮＡ配列、そ
れによる形質転換体及びそれらを調製する方法を提供す
る。 【構成】 酵母及びウィルス中で複製可能なＤＮＡ配列
であって、それらがウィルスゲノム、酵母ＡＲＳ配列、
酵母ＣＥＮ配列、少なくとも１つ、好ましくは１つまた
は２つのマーカー遺伝子及び発現されるべき遺伝子によ
って置き換えられることのできる相同的に交換可能な挿
入物を含有することを特徴とするＤＮＡ配列、それらの
酵母及びウィルス中での形質転換体並びにそれらを調製
する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ウィルスゲノム、酵母
ＡＲＳ配列、酵母ＣＥＮ配列、少なくとも１つ（好まし
くは１つまたは２つ）のマーカー遺伝子、及び発現され
るべき遺伝子によって置換され得る相同的に交換可能な
挿入物を含有する、ウィルス中及び酵母中で複製可能な
ＤＮＡ配列、酵母中及びウィルス中でのその形質転換
体、及びそれらを調製するための方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】バキュロウィルスの如き大きなウィルス
は、種々の外来タンパクの発現において真核性のベクタ
ーとして広く使用されている（文献１〜３を参照）。多
くの場合、バキュロウィルスベクターは、高い発現速度
で目的とするタンパクを発現し、僅かな例外を除いて
は、これらタンパクは正確に産生され、生物学的に活性
である。バキュロウィルスの場合には、発現系は、高発
現ポリヘドリン（polyhedrin）遺伝子が、ポリヘドリン
プロモーターとそれと融合した配列であって目的とする
外来タンパクをコードするコード配列からなる組み換え
遺伝子によって置換されるという事実に基づいている。
ポリヘドリン遺伝子は該ウィルスの複製に必須のもので
はないので、得られる組み換えウィルスは充分に感染性
であり、該活性化されたポリヘドリンプロモーターは感
染の遅い段階で外来遺伝子の能率的な転写をコントロー
ルする。この系は、非常に能率的で有用であるというこ
とが証明されているが、組み換えウィルスの同定及び単
離の難しさのために、時間がかかり骨が折れるものであ
る。

【０００３】外来遺伝子の発現に最も広く使用されるバ
キュロウィルスは、 Autographa californica 核多角体
病ウィルス(AcNPV）であり、そのゲノムは約１３０ｋｂ
の環状二本鎖ＤＮＡ分子からなるものである（４）。該
ゲノムの大きさのために、例えば、制限エンドヌクレア
ーゼ切断点を使用するような従来の技術を使用して外来
ＤＮＡを挿入するのは不可能である。従って、使用され
る方法は、昆虫細胞の中に共同形質移入された（co-tra
nsfected）ウィルスのＤＮＡと好適なトランスファーベ
クターとの相同的組み換えに基礎を置く（５〜９）。該
トランスファーベクターは、ポリヘドリンプロモーター
の下流に挿入された組み換え遺伝子からなり、無傷のウ
ィルス中でポリヘドリン遺伝子の側面にある配列と同じ
配列が側面を占めている。該ウィルス中での該相同的フ
ランキング配列(flanking sequence）及び該トランスフ
ァーベクター間での生体内組み換えは、外来遺伝子によ
るポリヘドリン遺伝子の置換をもたらす。その困難性
は、特に、一般に組み換えの頻度が低いことから起こっ
ており、それは通常たった0.１〜１％に過ぎない。従っ
て、非常に重要なバックグラウンドにわたって、原ウィ
ルスから組み換えウィルスを同定することが必要であ
る。

【０００４】次の方法は、組み換えウィルスを同定する
ために従来から使用されてきた方法である： １）ポリヘドラ(polyhedra）‐陰性感染細胞からなるウ
ィルスプラークの顕微鏡検出（10）； ２）外来ＤＮＡに対して特異的なプローブへのプラーク
ハオブリダイデーションによる組み換えプラークの検
出、それに続く目視によるスクリーニング（７及び1
1）； ３）抗体によるプラークのスクリーニング（12）； これら全ての方法では、純粋な組み換えウィルスを得る
前に複数のプラーク分析を行うことが必要である。以下
に、組み換えウィルスの同定を容易にする２つの変法を
簡潔に記載する：

【０００５】第１の場合においては、該トランスファー
ベクターは、ポリヘドリンプロモーターによってコント
ロールされる外来遺伝子に加えて、第２の細菌性プロー
ターまたは非細菌性プローターのいずれかからコントロ
ールされる細菌性のｌａｃＺ遺伝子を含有する（13）。
相同的組み換えによって産生した組み換えウィルスもこ
のｌａｃＺ遺伝子を含有するから、β−ガラクトシダー
ゼ産生についてプラークを試験することによって同定さ
れ得る。第２の場合においては、原ウィルスは、ただ１
回だけ生じかつ環状ウィルスＤＮＡよりもむしろ線状Ｄ
ＮＡの形質移入を可能にする制限エンドヌクレアーゼ切
断点を含有する（14）。これは、組み換えの頻度を約１
０倍増加する。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、組み換え体
の同定及び単離が簡単で生成頻度が高い、外来遺伝子の
発現に使用できるＤＮＡ配列、それによる形質転換体及
びそれらを調製する方法を提供することを目的とするも
のである。

【課題を解決するための手段】上記の文献から知られて
いる方法の欠点は、細胞感染に必要な感染性ウィルスＤ
ＮＡがウィルス及び酵母中で複製または繁殖できるＤＮ
Ａ配列の相同的組み換えによって得られるならば治癒さ
れ得るということが今や分かってきた。このＤＮＡ配列
は、ウィルスゲノム、自律的な複製の原因である酵母−
ＡＲＳ配列、ＤＮＡ分子に対して有糸分裂動原体機能を
付与しかつプラスミドＤＮＡの安定な低コピー数を保持
するＣＥＮ配列、少なくとも１つ（好ましくは１つまた
は２つ）のマーカー遺伝子及び発現されるべき遺伝子に
よって置換され得る相同的に交換可能な挿入物を含有す
る。

【０００７】使用されるウィルスゲノムは、例えば、 A
utographa californica 核多角体病ウィルス(AcNPV）
（４）の如きバキュロウィルスであってもよく、該自律
的に複製できる酵母ＤＮＡ配列は、例えば、ＡＲＳ１配
列の如きＡＲＳ配列であってもよく、該動原性配列は、
例えば、ＣＥＮ４配列（43）の如きＣＥＮ配列であって
もよく、該選択可能なマーカー遺伝子は、例えば、ＵＲ
Ａ３−（44）、ｃａｎｌ−１００、ａｄｅ２−１、ＣＹ
２、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３またはＬＹＳ２遺伝
子であってもよく、該相同的に交換可能な挿入物は、例
えば、ＳＵＰ４−ｏ−（42）、ＣＡＮ１、ＵＲＡ３また
はＬＹＳ２遺伝子であってもよく、該真核細胞は、Ｓｆ
９細胞であってもよく、そして発現される遺伝子は、ウ
ィルス中で発現されることのできるいかなる遺伝子、例
えば、インターフェロン遺伝子、ＣＲＥＢ１またはＣＲ
ＥＢ２（41）であってもよい。

【０００８】一例として、転写因子群の２つのメンバー
であるＣＲＥＢ／ＡＴＦの発現を挙げると、本発明によ
る方法は、例えば、バキュロウィルス、酵母中でのＤＮ
Ａの自律複製に必要なＡＲＳ配列（15及び16）、ＤＮＡ
分子に対し有糸分裂動原体機能を付与し且つプラスミド
ＤＮＡの安定な低コピー数を保持するＣＥＮ配列（1
7）、ＵＲＡ３マーカー遺伝子及び任意に選択可能なＳ
ＵＰ４−ｏ遺伝子（18）を使用して、対応する−Ｘ−Ａ
−Ｕ−Ｃ配列（ここで、Ｘは発現されるべき遺伝子を表
し、ＡはＴＲＰ１／ＡＲＳ１配列を表し、ＵはＵＲＡ３
遺伝子を表し、ＣはＣＥＮ４遺伝子を表す。）（図１参
照）によるポリヘドリンプロモーターによって制御され
た遺伝子の相同的置換によって、以下のように行われ
る。

【０００９】

【実施例】第１工程 ブルースクリプトプラスミド〔ストラタ遺伝
子（Stratagene）〕にＴＲＰ１／ＡＲＳ１、ＣＥＮ４及
びＵＲＡ３配列を挿入することによって、プラスミドｐ
ＢＹ３を以下のようにして調製した：ＴＲＰ１／ＡＲＳ
１配列（フラグメントＡ）を含有する８４０ｂｐ長のフ
ラグメントをブルースクリプトプラスミドのＥｃｏＲＩ
切断点及びＨｉｎｄIII 切断点の間に挿入し、次いで、
ＵＲＡ３遺伝子（フラグメントＵ）を含有する１１００
ｂｐ長のフラグメントをＨｉｎｄIII 切断点に挿入し、
最後に、ＣＥＮ４遺伝子（フラグメントＣ）を含有する
１０００ｂｐ長のフラグメントをＸｈｏ１切断点とＫｐ
ｎ１切断点の間に挿入した。このようにして得られた酵
母カセットをＢａｍＨ１−Ｋｐｎ１フラグメントとして
切除し、トランスファーベクターｐＡｃＣ4 （19）のＢ
ａｍＨ１−Ｋｐｎ１切断点に挿入して、酵母カセットＡ
−Ｕ−Ｃを含有するプラスミドｐＡｃＡＵＣを得た。こ
のようにして得られたベクターをＳｆ９細胞の中に野性
型バキュロウィルスＤＮＡ（ＡｃＮＰＶ−ＤＮＡ）と共
同形質移入し、それによって組み換えバキュロウィルス
ＹＣｂｖを得、プラーク分析を繰り返して目視で同定し
精製した〔（９）も参照〕。このベクターはポリヘドリ
ン遺伝子の代わりに上記の酵母カセットを含有する。

【００１０】第２工程 上記のバキュロウィルス（ＹＣ
ｂｖ）の細胞外ウィルスからウィルスＤＮＡを調製し、
ウラシル依存 S.cerevisiae 株ｙ６５７で形質転換し
た。該形質転換した細胞をウラシルを欠く培養によって
選択した。数個のＵｒａ⁺ 形質転換体を得た。その幾つ
かについて、バキュロウィルス配列の存在を検出するた
めのプローブとして完全ウィルスＤＮＡを使用したサザ
ーンブロット分析によって試験した。試験した全てのＵ
ｒａ⁺ コロニーは、予想したウィルス配列を含有してい
た。ＹＧＰ１と命名された、酵母カセットＡ−Ｕ−Ｃを
含有するこれら形質転換体の１つから、完全ＤＮＡを単
離し、ショ糖勾配遠心分離法によって部分的に精製して
Ｓｆ９細胞中に形質移入した。３日後に培養液の上清を
得、新たなＳｆ９細胞を感染するのに使用した。該細胞
の顕微鏡試験を行ったところ、感染性ウィルスの存在を
示した。これは、プラーク分析によって確認した。感染
した細胞からウィルスＤＮＡを調製し、これには、Ｕｒ
ａ⁺ 酵母中に形質転換した場合にウラシル非依存性を伝
達する能力が残っていたことが見出された。従って、組
み換えバキュロウィルスＤＮＡ（ＹＣｂｖ）が、如何な
る顕著な困難性もなく、酵母及び昆虫細胞の間を往復で
きることが明らかになった。

【００１１】第３工程 発現されるべき外来遺伝子を含
有するトランスファーベクターで相同的組み換えを行っ
たＹＣｂｖ誘導体の検出を容易にするために、第２の選
択可能な相同的に置換可能である挿入物をＹＧＰ１酵母
中に含まれたＹＣｂｖ−ＤＮＡ中に挿入した（図１参
照）。この目的のために、オーカーコドンを抑制するｔ
ＲＮＡ^Tyr 遺伝子の対立遺伝子である、ＳＵＰ４−ｏ遺
伝子（フラグメントＳ）を選択した。好適な酵母細胞に
おいて、例えば、Ｙ６５７において、ＳＵＰ４−ｏは負
または正の選択の下で配置され得る。本発明による方法
において、ＡＤＥ２及びＣＡＮ１遺伝子中にオーカー突
然変異を含有する株が使用された。ＡＤＥ２はアデニン
生合成ルートにおける必須酵素をコードする（20及び2
1）。この遺伝子の突然変異は、宿主のアデニン依存性
を伝達するのみならず、アデニン合成ルートの中間生成
物（ホスホリボシルアミノイミダゾール，ＡＩＲ）の蓄
積をももたらし、それは、該細胞コロニーをピンクに変
える。該ＣＡＮ１遺伝子は酵素アルギニン透過酵素をコ
ードし、該細胞を有害アルギニン類縁体カナバニンに対
し感受性を有するようにする（22）。Ｃａｎ^- 突然変異
体は如何なる機能性アルギニン透過酵素も合成すること
ができず、従って、カナバニンに対し耐性がある。

【００１２】ＳＵＰ４−ｏ遺伝子をＹＣｂｖ−ＤＮＡ中
に導入するために、ＳＵＰ４−ｏ遺伝子を含有し、ポリ
ヘドリン翻訳開始コドンの上流とＴＰＲ１／ＡＲＳ１配
列の下流に位置した配列により１つの側面を占められた
トランスファーベクター、例えば、プラスミドｐＡｃＹ
−Ｓを構築した。続くＹＣｂｖを含有する酵母（ＹＧＰ
１）への形質転換及びＹＣｂｖと該ベクターの間での相
同的組み換えは、ＹＣｂｖ中へのＳＵＰ４−ｏの挿入を
導く。この方法で得られた組み換え体をＹＧＰ２と命名
した。それはＳ−Ａ−Ｕ−Ｃカセットを含有し、その単
離及び同定は以下に説明される。図２は、ＳＵＰ４−ｏ
遺伝子を持つかまたは持たないＹ６５７細胞から誘導し
た細胞の種々の表現型を纏めたものである。その本質的
な特徴は、カナバニン耐性が強い対抗選択を可能にして
いるのに反して、アデニン非依存性がＳＵＰ４−ｏの存
在のための正の選択を保証しているということである。

【００１３】必要とされるベクターは、次のようにして
構築した：トランスファーベクターｐＡｃＹ１（図３参
照） ８４０ｂｐ長のＴＰＲ１／ＡＲＳ１配列をブルー
スクリプトプラスミドのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII 切断
点に挿入することによって得た。このようにして得られ
たプラスミドｐＢＹ１をＸｂａｌで消化し、クレノー
（klenow）ポリメラーゼで末端を充填し、再度ＢａｍＩ
で消化した（フラグメント１）。ｐＡｃＣ４−ＤＮＡ
（19）をＢｓｔＥIIで消化し、クレノー・ポリメラーゼ
で末端を充填し、再度ＢａｍＨＩで切断し、ポリヘドリ
ンプロモーター及び５'-フランキング配列を含有する３
ｋｂフラグメントを単離した（フラグメント２）。この
ようにして得られたフラグメント２をプラスミドｐＢＹ
１から得たフラグメント１と結さつし、ＮｃｏＩ及びＥ
ｃｏＲＩ切断点の間に位置するＤＮＡフラグメントをポ
リリンカーによって置き換え、プラスミドｐＡｃＹ１を
得た。このベクターの欠くことのできない特徴は、それ
が、３ｋｂの５'-フランキングバキュロウィルス配列と
共にポリヘドリンプロモーター、該プロモーターのすぐ
下流でただ一回だけ生成する幾らかの制限部位を含有す
るポリリンカー、及びポリヘドリン−5'−非コード配列
を含有することであり、その後にＹＣｂｃを構築するた
めに使用される酵母ＡＲＳ配列が続く（図４参照）。該
ポリリンカーのＮｃｏＩ切断点はポリヘドリン−ＡＴＧ
−開始コドンを含有する。

【００１４】トランスファーベクターｐＡｃＹ２ プラ
スミドｐＡｃＹＭ１（23）のＢｓｔＥII−ＢａｍＨＩフ
ラグメントを上記のフラグメントの代わりに使用したこ
と以外は同様にして得た。このベクターは、外来遺伝子
の挿入に使用したポリリンカーの他は、ベクターｐＡｃ
Ｙ１に非常に類似している（図３参照）。しかしなが
ら、ポリヘドリン−ＡＴＧ−コドンが失われており、結
果として、挿入された外来配列によって開始コドンが作
られなければならない（図５参照）。このことは、挿入
物が両側でバキュロウィルスＤＮＡによって側面を占め
られている上記に記載したベクターとは異なって、これ
ら２つの新規なベクターにおいては、挿入物はウィルス
配列によって５’側で及び酵母ＡＲＳ配列によって３’
側で占められていることを意味している。

【００１５】トランスファーベクターｐＡｃＹ２−Ｓ
ＳＵＰ４−ｏ遺伝子を含有するトランスファーベクター
ｐＡｃＹ２−Ｓを、プラスミドｐ４６４をＥｃｏＲＩで
消化することにより得られかつオーカーサプレッサー遺
伝子ＳＵＰ４−ｏを含有する３００ｂｐ長フラグメント
をトランスファーベクターｐＡｃＹ２のＥｃｏＲＩ切断
点に挿入することにより得た。このＥｃｏＲＩ切断点は
ＡＲＳ１酵母配列のちょうど上に位置している。このよ
うにして得られたｐＡｃＹ２−Ｓプラスミドを、酵母形
質転換のために、ＡＲＳ１配列中にあるＢｇｌII切断点
及び該トランスファーベクターのバキュロウィルス配列
中にあるＸｈｏＩ切断点で切断し、先に得たＹＧＰ１で
組み換えた。このようにして得られた形質転換細胞をア
デニンを欠く培養によって選択し、次いで、ヒスチジ
ン、トリプトファン、アデニン及びロイシンを添加した
ＳＤ−寒天プレート上でコロニーを精製した。個々のコ
ロニーをカナバニンの存在下での成育について試験し、
同時に、更に試験するためカナバニンに対して感受性で
あるコロニーを選択しＹＧＰ２と命名した。選択したＹ
ＧＰ２コロニーは、ｔＲＮＡサプレッサーＳＵＰ４−ｏ
の存在下で望ましい表現型、即ち、オーカー突然変異ａ
ｄｅ２−１の抑制及びＣＡＮ１−１００突然変異の抑制
の結果としてのカナバニン感受性に基づくアデニン非依
存性を有する。該組み込まれたＳＵＰ４−ｏ遺伝子の存
在も、サザーンハイブリダイゼーション分析によって検
出された。このようにして得られた酵母株ＹＧＰ２は、
相同的組み換えによるポリヘドリンプロモーターの下流
への外来遺伝子の挿入にとって、高度に適した受容株で
ある。

【００１６】第４工程 転写因子群の２つの異なるメン
バーであるＣＲＥＢ／ＡＴＦを含有するバキュロウィル
ス組み換え体を単離するために、新規な方法を使用し
た。これら群のメンバーは、ＤＮＡ配列５’ＴＴ／ＧＡ
ＣＧＴＣＡ３’に特異的に結合しており、それらは、上
昇したｃＡＭＰ濃度を介して転写活性化を伝達すること
ができ（24）、またアデノウィルスＥ１Ａタンパクも結
合している（25）。この群のメンバーをコードする少な
くとも１０の異なったｃＤＮＡが報告されている（26及
び30）。これらは全てホモダイマーとしてＤＮＡに結合
することができるが、それらの多くはお互いに相互作用
することもできヘテロダイマーとして結合することがで
きる。結果として生ずる非常に重要な複雑さは、このタ
ンパク群の個々のメンバーを大量に入手できることによ
って、より容易なものとなった。行った実験について、
ＣＲＥＢ１及びＣＲＥＢ２（ＣＲＥ−ＢＰ１、ＡＴＦ−
２）ｃＤＮＡ中に含有される組み換え体を選択した。こ
れらは、ＣＲＥＢ１活性がｃＡＭＰまたはキナーゼＡ活
性（31）を上昇させる他の条件によって調節され、ＣＲ
ＥＢ２活性がＥ１Ａタンパクによって調節される（32〜
34）ので格別に興味深い。両方の場合において、ｃＤＮ
ＡはベクターｐＡｃＹ２（図６及び図７参照）中に挿入
され、次いで、酵母ＴＲＰ１遺伝子（45）を含有する共
同形質転換プラスミドと共にＹＧＰ２酵母細胞中に挿入
された（図１参照）：

【００１７】該ｐＡｃＹ２−ＣＲＥＢ１プラスミドは、
６００ｂｐ長の非コード配列を３’末端に含むＣＲＥＢ
１配列を含有する1.６ｋｂ長ＥｃｏＲＩフラグメントを
トランスファーベクターｐＡｃＹ２のＥｃｏＲＩ切断点
中に挿入することによって得られ、該ｐＡｃＹ２−ＣＲ
ＥＢ２プラスミドは、ＣＲＥＢ２コード配列を含有する
末端を充填したＨｉｎｃII−ＣｌａＩフラグメントをプ
ラスミドｐＡｃＹ２ののＳｍａＩ切断点に挿入すること
によって得られた。得られたトランスファーベクターｐ
ＡｃＹ２−ＣＲＥＢ１を、相同的組み換えを容易にする
ためにＳａｌＩで線状にし、酵母ＴＲＰ１遺伝子を含有
するプラスミドと共に、ＹＧＰ２−スフェロプラストで
形質転換した。得られた形質転換体をトリプトファンを
欠いた培養によって選択し、個々の形質転換体をカナバ
ニンを含有するプレート上でのレプリカ平板法によって
カナバニン耐性について試験した。この種の耐性形質転
換体は、ＳＵＰ４−ｏをＣＲＥＢ１によって置き換えな
がら、内因性ＹＧＰ２及びｐＡｃＹ２−ＣＲＥＢ１−Ｄ
ＮＡ間での相同的組み換えによって生成する。耐性形質
転換体の生成頻度は、８０％のオーダー内であることが
見出された。ＣＲＥＢ１配列によるＳＵＰ４−ｏの置換
について、１２の異なる耐性形質転換体をサザーンハイ
ブリダイゼーションによって試験し、これら形質転換体
の１つをＹＢＰ３と命名した（ＹＣｂｖ::ＣＲＥＢ１を
含有する）。この現象がそれぞれの個々の形質転換体に
おいて起こったという事実が、使用した選択システムの
有効性を証明した。従って、耐性コロニーをサザーンハ
イブリダイゼーションによって常に試験することは不要
であることが明らかである。

【００１８】ｐＡｃＹ２−ＣＲＥＢ２ベクターをＸｈｏ
Ｉで線状化したこと以外は、類似の方法を使用してＣＲ
ＥＢ２を含有する組み換え体を単離した。得られた形質
転換体の１つをＹＧＰ４と命名した（ＹＣｂｖ::ＣＲＥ
Ｂ２を含有する）。ＹＧＰ３の完全ＤＮＡ及びＹＧＰ４
を含有する酵母細胞を、ショ糖勾配遠心分離法を使用し
て部分的に分別した。ＰＣＲ分析を使用してウィルスＤ
ＮＡの位置を即座に決定した。ウィルスＤＮＡは全勾配
で見出されたとは言え、ＤＮＡの大部分は使用した条件
でおよそ中程の勾配に集まった（酵母ＤＮＡの生成も参
照のこと）。

【００１９】第５工程 上記で得られたＤＮＡをリポフ
ェクションによってＳｆ９細胞に挿入した（図１参
照）。感染した細胞は３日後に明瞭に目視可能となっ
た。後の感染用に上清を保存し、組み換えタンパクの存
在について該細胞を試験した。分別されていない完全Ｄ
ＮＡ試料を使用してもうまく感染することができた。し
かしながら、成功率は変動し、しかも何らかの成功を見
込めるためには広範囲のＤＮＡ濃度で試験しなければな
らないことが分かった。成功率の差は、酵母ＤＮＡ試料
中に含有されている、形質移入操作を妨害する阻害物質
が原因であると考えられる。対照的に、ショ糖勾配物質
を使用すると信頼できる結果が得られた。この工程は絶
対不可欠ではないが好ましいものである。

【００２０】ウィルス感染Ｓｆ９細胞中でのＣＲＥＢ１
及びＣＲＥＢ２タンパクの発現は、電気泳動分析法によ
って分析した。全細胞抽出物を調製し、フィブロネクチ
ンＡＴＦ／ＣＲＥ結合部位を含有する標識したオリゴヌ
クレオチドプローブを使用して、特異的ＤＮＡ結合活性
について試験した。図８のＡに示すように、感染後１日
目で特異的タンパク−ＤＮＡ複合体が目視できた。該複
合体の移動度はＣＲＥＢ１のＣ末端ペプチドに対する抗
体の存在で遅くなったが（35）非特異的抗体によっては
影響を受けないでいた。次の２日の間に結合活性のレベ
ルは有意に上昇した。しかしながら、感染後２日を越え
る時点においては、多くのＣＲＥＢ１タンパクは退化
し、一連のより速く移動する複合体になった。長時間の
インキュベートで、感染されていない抽出物中にも結合
活性が見出されたが、この内因性活性はＣＲＥＢ１抗体
によっては認識されなかった。結合の特異性は、標識さ
れていないフィブロネクチンオリゴヌクレオチドの過剰
量（これは非特異的オリゴヌクレオチドとは対照的に結
合に関しよく競合する）と競合させることによって確認
した（図８のＢを参照）。感染後３日を越える感染した
抽出物中のＣＲＥＢ１タンパクの存在及びその分解は、
ウェスタンブロットによって確認した。

【００２１】ＣＲＥＢ２含有組み換え体で感染した細胞
からの抽出物も、ＡＴＦオリゴヌクレオチドと特異的に
相互作用する有意に上昇した結合活性レベルを有した
（図９参照）。感染後２日して、感染された抽出物から
生じた多くの複合体が出現した。特に、移動性がＣＲＥ
Ｂ２のＮ末端またはＣ末端の近くに位置するタンパクに
向けられた抗体によって影響を受けたときに、無傷のＣ
ＲＥＢ２タンパクは最も遅い複合体移動度を高確率で生
じた。加えて、ウェスタンブロット分析によって、ＣＲ
ＥＢ２について予想された位置に移動タンパクの存在が
示された。より速い移動複合体が、無傷のタンパクのタ
ンパク分解性開裂によって生じた。これらは、Ｎ末端抗
体ではなくＣ末端抗体によって認識される。ＣＲＥＢ１
の場合のように、感染後多くの時間が経過した時点で
は、より小さな生成物だけが生成した。両方のＣＲＥＢ
タンパクが、組み換えウィルスによって感染された細胞
中で合成されるとは言え、これらのタンパクの蓄積され
たレベルは、相互に有意に相違する。感染２日後に、総
タンパクを基準として２５％のＣＲＥＢ１タンパクと僅
か１〜２％のＣＲＥＢ２タンパクが見出された。これら
の差はおそらく安定性の差に帰することができよう。

【００２２】原料及び方法 細胞 昆虫セルラインＳｆ９（ATCC No. CRL1711）及び「野性
型ＡｃＮＰＶ」（株Ｅ２）の作成は既に説明した通りで
ある（10）。使用した株、即ち、 S.cerevisiae ｙ６５
７（ｍａｔα、ｈｉｓ３−11,15 ｔｒｐ−１ ａｄｅ２
−１ ｌｅｕ２−３,112 ｕｒａ３−52 ｃａｎ−100
ｈｉｓ４::ＨＩＳ３）が、アンディー・ニューマン(And
y Newman）（38）によって提供された。バキュロウィル
ス／ｃｅｎプラスミドを含有するこの株またはその誘導
体の成育は、富培地〔酵母抽出物／ペプトン／デキスト
ロース（ＹＰＤ）〕または２０μｇ／mlのヒスチジン、
２０μｇ／mlのトリプトファン、２０μｇ／mlのアデニ
ン、６０μｇ／mlのロイシン及び１０μｇ／mlのカザミ
ノ酸を加えた合成最少培地（ＳＤ）中で行った。２％の
寒天、ＳＤ、通常のアミノ酸添加物及び６０μｇ／mlの
硫酸カナバニン（シグマ社製）を含有するプレート上で
カナバニン耐性の形質転換体を選択した。それぞれの場
合において、酵母の成育は３０℃で行った。

【００２３】酵母の形質転換 酵母スフェロプラストを調製し、次のようにして形質転
換した（39）：５０mlの酵母培養液を光学密度がＯＤ
₆₀₀ ＝0.５〜１までの好適な培地中で培養した。該細胞
を２Ｋで５分間遠心分離にかけ、得られたペレットを蒸
留水で１回、１Ｍソルビトールで１回洗浄し、次いで、
２０mlのＳＣＥＭ（１Ｍソルビトール、0.１Ｍクエン酸
ソーダｐＨ5.８、１０mMＥＤＴＡ及び３０mMβ−メルカ
プトエタノール）中で再懸濁し、１０００ユニットのリ
チカーゼ（シグマ社製）中で再懸濁した。９０％の細胞
がスフェロプラストに変化するまで３０℃で２０〜３０
分間、該細胞懸濁液をインキュベートした。該スフェロ
プラストを注意して１Ｋで６〜７分間遠心分離し、得ら
れたペレットを２０mlのＳＴＣ（１Ｍソルビトール、１
０mMトリス／ＨＣｌｐＨ7.５及び１０mM塩化カルシウ
ム）で洗浄し、最後に２mlのＳＴＣ中に懸濁した。適切
な外来ＤＮＡを含有する５μｇのトランスファーベクタ
ーをポリヘドリン配列内及びＡＲＳ配列内またはＡＲＳ
配列のすぐ下で切断した。切断したプラスミドをエタノ
ールで沈澱し、得られた１００μｌのスフェロプラスト
で形質転換に使用した。該酵母プラスミドＤＮＡ混合物
を周囲温度で１０分間放置した後、１mlのＰＥＧ溶液
（１０mMトリス／ＨＣｌｐＨ7.５、１０mM塩化カルシウ
ム及び２０％ＰＥＧ８０００）を加え、１０分間インキ
ュベートを続けた。該スフェロプラストを１Ｋで６〜７
分間遠心分離し、得られたペレットを１５０μl のＳＤ
Ｓ緩衝液〔１Ｍソルビトール、6.５mM塩化カルシウム、
0.２５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）及び0.５％バクトペ
プトン（Ｄｉｆｃｏ）〕中に懸濁し、３０℃で１５〜３
０分間インキュベートした。次いで、適切な添加物を含
有する８mlの溶融した上部の寒天(molten top agar）を
該スフェロプラスト懸濁液に加え、これを、添加物であ
るヒスチジン、ロイシン、アデニン及びトリプトファン
と共にＳＤ培地を含有する寒天プレートの表面上に直接
撒いた。形質転換用のために、ＴＲＰ１遺伝子を含有す
る0.５μｇのプラスミドを該切断したトランスファーベ
クターに加えた。選択は、トリプトファンを含まない培
地中で行った。

【００２４】酵母ＤＮＡの調製 （40）に記載されているようにして、完全酵母ＤＮＡを
調製した：ＹＧＰ３またはＹＧＰ４酵母細胞２５０ml
を、好適な添加物及びカザミノ酸を含有するＳＤ培地中
で、光学密度がＯＤ₆₀₀ ＝１〜２が得られるまで培養し
た。該形質転換法で記載されたようにして該スフェロプ
ラストを調製し、4.５ＭのＧｕＨＣｌ、0.１ＭのＥＤＴ
ＡｐＨ８、0.１５ＭのＮａＣｌ及び0.０５％のサルコシ
ルを含有する１５mlの細胞溶解緩衝液中に注意して懸濁
した。６５℃で１０分間経過した後、周囲温度まで懸濁
液を冷やし、１５mlの冷エタノールで該ＤＮＡを沈澱さ
せ、ソルボール(Sorvall）ＳＳ３４ローター中で１0,０
００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって分離し
た。得られたペレットを１０mlの0.１ＭトリスｐＨ7.
５、0.０１ＭのＥＤＴＡ及び５０μl のＲＮＡｓｅＡ
（１０mg／ml）中に再懸濁した。３７℃で６０分インキ
ュベートした後、１５０μl のプロテイナーゼＫ（１０
mg／ml）を加え、６５℃で更に３０分間インキュベート
を続けた。フェノールで該ＤＮＡを２回抽出し、エタノ
ールで析出させ、ＴＥ（１０mMトリス及び１mMのＥＤＴ
Ａ）中で懸濁させた。

【００２５】記載した実験の大半で使用した完全ＤＮＡ
をショ糖勾配遠心分離法で分別した。該ＤＮＡは、２０
０mMＮａＣｌ、１０mMトリスｐＨ7.５及び２mMＥＤＴＡ
中の５〜２０％ショ糖勾配の最上部に位置していた。各
勾配は３５Ｋで３時間及びＳＷ４０ローター中で遠心分
離した。このような状況で、バキュロウィルスＤＮＡの
大多数は該勾配の下方から中程下方に移動した。該勾配
を分別し、冷エタノールの２容量をバキュロウィルスＤ
ＮＡを含有する画分に加えた。析出したＤＮＡをＴＥ
（１０mMトリス及び１mMのＥＤＴＡ）中に再懸濁し、こ
の形で昆虫細胞の形質移入に使用した。

【００２６】昆虫細胞の形質移入 ショ糖勾配分別ＤＮＡをリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ）
を使用してＳｆ９細胞中に導入した。５〜１０μl の分
別したＤＮＡに水を加えて総容量を１２μl にした。８
μl のリポフェクチンを含有する同じ容量のリポフェク
チン緩衝液を４μl の水と混合しＤＮＡに加えた。この
２つの溶液を注意して一緒に混合し、室温での１５分間
のインキュベートの後、１mlの無血清培地中に1.５×１
０⁶ のＳｆ６細胞を含有する３５mm組織培養皿に加え
た。２８℃で１６時間経過した後、培地を除いて１０％
ＦＣＳを含有する新たな培地で置き換えた。第３日また
は第４日までに、細胞は目に見えて感染され、同時に分
析目的のために該細胞を採取して新たな細胞の再感染用
に上清を蓄えた。

【００２７】電気泳動移動分析 ３５mm皿からの感染されまたは「リポフェクション」さ
れたＳｆ９細胞をＰＢＳで洗浄し、該細胞を、１０mMの
ヘペス(hepes）ｐＨ7.９、1.５mMのＭｇＣl₂、0.１mMの
ＥＤＴＡ、５％のグリセロール、0.５mMのＤＴＴ及び0.
５mMのＰＭＳＦを含有する１００μl の抽出緩衝液中で
再度洗浄した。０℃で５分間経過した後、該溶解産物を
１０秒間遠心分離し、上清を新しい試験管に移した。ペ
レットは、0.３５ＭのＮａＣｌを含有する５０μl の抽
出緩衝液中に再懸濁し、４℃で１５分間インキュベート
した。細胞片を１０分間の遠心分離で除いた後、４５μ
lの上清を１００μl の低塩溶解産物と混合し、0.１Ｍ
の最終塩濃度で目的とする細胞抽出物を得た。フィブロ
ネクチンＡＴＦ／ＣＲＥＢ結合部位を含有するオリゴヌ
クレオチドを使用した電気泳動移動分析法は既に説明し
た（41）。１μl の細胞抽出物を各分析で使用した。結
合反応の開始後５分で、抗体を添加して、複合体の移動
度について特異抗体の効果を試験した。次の抗体を使用
した：ＣＲＥＢ１抗体は、文献で公知であり（35）、ヒ
トＣＲＥＢ１タンパクの１０末端アミノ酸を認識する。
Ｎ末端ＣＲＥＢ２抗体（ＮＪ２）はヒトＣＲＥＢ２タン
パクのアミノ酸８５〜９６を含有するペプチドを認識
し、Ｃ末端抗体はアミノ酸４９０〜５０５を含有するペ
プチドを認識する。

【００２８】参照文献のリスト 1. ラッコウ（Luckow, V.A ）及びサマーズ（Summers
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A.), アスマニー(Usmany, M.), マウル(Maule, A.JH.),
ベルシャム(Belsham, G.J.),ルーシェン(Roosien,
J.),クリンゲールーデ(Klinge-Roode, E.C.), バン・レ
ント(Van Lent, J.W.M.)及びラックVlak, J.M.), J. Vi
rol. 71，2201-2209 (1990)

【００２９】14. キッツ(Kitts, P.A.),アイレス (Ayre
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hivaraman, L.), チマッポヤ(Thimmappaya, B.),ハース
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【００３０】26. ホエフラー(Hoeffler, J.P.), ミーヤ
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ムラ(Yoshimura, T.),フジサワ(Fujisawa, J.), ヨシダ
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J.), Gene 10, 157-166 (1980)

【図面の簡単な説明】

【図１】中間宿主として S.cerevisiae を使用した組み
換えバキュロウィルスの単離のための経路の概略図であ
る。ＡＲＳ、ＵＲＡ及びＣＥＮ酵母成分は、それぞれ
Ａ、Ｕ及びＣで示した。

【図２】ＳＵＰ４−ｏ遺伝子を含有するかまたは含有し
ないｙ６５７酵母誘導体の表現型を示したものである。
ｙ６５７株は出発原料として使用される。ＹＧＰ２は、
酵母配列ＳＵＰ４−ｏ、ＡＲＳ、ＵＲＡ及びＣＥＮがポ
リヘドリンプロモーターの下流に挿入された、エピソー
ムのように保持されたバキュロウィルスＤＮＡを含有す
る。ＹＧＰ３及びＹＧＰ４は、複製可能なゲノムがＳＵ
Ｐ４−ｏ遺伝子の代わりにＣＲＥＢ１及びＣＲＥＢ２ｃ
ＤＮＡ配列を含有するＹＧＰ２誘導体である。

【図３】トランスファーベクターｐＡｃＹ１及びｐＡｃ
Ｙ２の構築の特徴を示す。実線部分、濃淡をつけた部分
または透明部分によって示されるプラスミド領域は、そ
れぞれ酵母ＡＲＳ、バキュロウィルス及びベースプラス
ミド配列を示す。

【図４】トランスファーベクターｐＡｃＹ１の制限エン
ドヌクレアーゼ地図を示す。該プラスミドは、ウィルス
配列によって上方及び酵母ＴＲＰ／ＡＲＳ配列によって
下方を占められたバキュロウィルスポリヘドリンプロモ
ーター及びリーダー配列を含有する。リーダー配列の下
流に位置する切断点及び外来コード配列の挿入に好適な
切断点に印を付した。このトランスファーベクターの最
終翻訳はＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ切断点の間に位置した
オリゴヌクレオチドを含有し、示した配列を有する。

【図５】トランスファーベクターｐＡｃＹ２の制限エン
ドヌクレアーゼ地図を示す。該プラスミドは、ウィルス
配列によって上方及び酵母ＴＲＲ／ＡＲＳ配列によって
下方を占められたバキュロウィルスポリヘドリンプロモ
ーター及びリーダー配列を含有する。リーダー配列の下
流に位置する切断点及び外来コード配列の挿入に好適な
切断点に印を付した。

【図６】ヒトＣＲＥＢ１ｃＤＮＡ配列の挿入物を含有す
るｐＡｃＹ１誘導体の制限エンドヌクレアーゼ地図を示
す。

【図７】ヒトＣＲＥＢ２（ＣＲＥ−ＢＰ１）ｃＤＮＡ配
列の挿入物を含有するｐＡｃＹ１誘導体の制限エンドヌ
クレアーゼ地図を示す。

【図８】フィブロネクチンＣＲＥ／ＡＴＦ結合部位を含
有するオリゴヌクレオチドと結合した、バキュロウィル
スによって合成されたＣＲＥＢ１のゲル遅滞分析法を示
す。Ｓｆ９細胞はバキュロウィルスＣＲＥＢ１組み換え
体で感染され、感染後１、1.５、２及び３日の各場合に
おいて、その全抽出物が調製された。各抽出物のアリコ
ートを、ＣＲＥＢ１に特異的または非特異的な抗体の存
在下または不存在下で（Ａ）、または１００倍モル過剰
のフィブロネクチンオリゴヌクレオチドまたは非特異的
なオリゴヌクレオチドの存在下または不存在下で
（Ｂ）、オリゴヌクレオチドを含有する〔³²Ｐ〕標識Ｃ
ＲＥで試験した。

【図９】オリゴヌクレオチドを含有するＣＲＥ／ＡＴＦ
と結合した、バキュロウィルスによって合成されたＣＲ
ＥＢ２のゲル遅滞分析法を示す。Ｓｆ９細胞はバキュロ
ウィルスＣＲＥＢ２組み換え体で感染され、感染２日後
にその全抽出物が調製された。該抽出物を、２つの異な
るＣＲＥＢ２特異的ペプチド抗体または非特異的抗体の
存在下または不存在下で、〔³²Ｐ〕標識フィブロネクチ
ンオリゴヌクレオチドに対するその結合について試験し
た。非感染細胞からの抽出物で同じ分析を行った。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 7/01 7236−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 7/00 (71)出願人 592006486 ジェネンテック・インコーポレイテッド ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ， ＩＮＣＯＲＰＯＲ ＡＴＥＤ アメリカ合衆国、カリフォルニア・94080、 サウス・サン・フランシスコ、ポイント・ サン・ブルーノ・ブルヴァード・460 (71)出願人 592210108 インペリアル キャンサー リサーチ テ クノロジー リミテッド イギリス ロンドン ダブリューシー２エ イ ３エヌエル サーディニア ストリー ト サーディニア ハウス （番地なし) (72)発明者 キム ネイスミス オーストリア アー1060 ウィーン リン ケ ウィーンツァイレ ４−２−５ (72)発明者 ニコラス シー ジョーンズ イギリス エセックス シーエム13 １エ ルエックス ハットン レイリー ロード 115 (72)発明者 ジー パテル イギリス サリー シーアール２ １イー エヌ パーリー グリスデイル ガーデン ス ３

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵母及びウィルス中で複製可能なＤＮＡ
   配列であって、それらがウィルスゲノム、酵母ＡＲＳ配
   列、酵母ＣＥＮ配列、少なくとも１つのマーカー遺伝子
   及び発現されるべき遺伝子によって置き換えられること
   のできる相同的に交換可能な挿入物を含有することを特
   徴とするＤＮＡ配列。
2. 【請求項２】 使用されるウィルスゲノムがバキュロウ
   ィルスのように大きなウィルスであることを特徴とす
   る、請求項１記載のＤＮＡ配列。
3. 【請求項３】 使用されるマーカー遺伝子がＵＲＡ３、
   ｃａｎ１−１００、ａｄｅ２−１、ＣＹ２、ＴＲＰ１、
   ＬＥＵ２、ＨＩＳ３またはＬＹＳ２配列であることを特
   徴とする、請求項１記載のＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】 相同的に交換可能な挿入物として、ＳＵ
   Ｐ４−ｏ−、ＣＡＮ１、ＵＲＡ３またはＬＹＳ２遺伝子
   が使用されることを特徴とする、請求項１記載のＤＮＡ
   配列。
5. 【請求項５】 該バキュロウィルスＤＮＡが、ポリヘド
   リン遺伝子の代わりに、フラグメント −Ａ−Ｕ−Ｃ−、 −Ｓ−Ａ−Ｕ−Ｃ−及び −Ｘ−Ａ−Ｕ−Ｃ− （ここで、ＡはＴＲＰ１／ＡＲＳ１配列を表し、ＵはＵ
   ＲＡ３遺伝子を表し、ＣはＣＥＮ４遺伝子を表し、Ｓは
   ＳＵＰ４−ｏ−遺伝子を表し、Ｘは発現されるべき遺伝
   子を表す。）を含有することを特徴とする、請求項１ま
   たは２記載のＤＮＡ配列。
6. 【請求項６】 式 −Ａ−Ｕ−Ｃ−、 −Ｓ−Ａ−Ｕ−Ｃ−及び −Ｘ−Ａ−Ｕ−Ｃ− （式中、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｓ及びＸは請求項５と同じ意味を
   有する。）のフラグメント。
7. 【請求項７】 Ｘがインターフェロン、ＣＲＥＢ１また
   はＣＲＥＢ２をコードする配列を表すことを特徴とす
   る、請求項５または６記載のＤＮＡ配列。
8. 【請求項８】 請求項１〜７に記載のＤＮＡ配列を含有
   する形質転換体。
9. 【請求項９】 請求項１〜５に記載のＤＮＡ配列を調製
   する方法であって、酵母中で、酵母ＡＲＳ配列、酵母Ｃ
   ＥＮ配列、少なくとも１つのマーカー配列及び相同的に
   交換可能な挿入物を含有する酵母カセットを有するウィ
   ルスゲノムを複製し、次いで、必要に応じて、相同的に
   交換可能な挿入物を相同的組み換えによって発現される
   べき遺伝子によって置き換えることを特徴とする方法。
10. 【請求項１０】 請求項６に記載のＤＮＡフラグメント
    を調製する方法であって、個々のフラグメントが一緒に
    結さつされ、次いで、好適な宿主中で増殖することを特
    徴とする方法。
11. 【請求項１１】 請求項８に記載の形質転換体を調製す
    る方法であって、請求項１〜７に記載のＤＮＡ配列でウ
    ィルスを組み換えることを特徴とする方法。
12. 【請求項１２】 請求項８に記載の形質転換体を調製す
    る方法であって、請求項１〜７に記載のＤＮＡ配列で酵
    母を形質転換することを特徴とする方法。