JPH06100465A - フラビウイルス科に属するウイルスの組み換え生ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 より中和抗体価の高い生ワクチンの提供。 【構成】 フラビウイルス科に属するウイルス由来の表
面抗原タンパク質を発現する組み換えワクチニアウイル
スと、フラビウイルス科に属するウイルス由来のプロテ
アーゼを発現する組み換えワクチニアウイスルとの混合
物を主成分とするか、又はフラビウイルス科に属するウ
イルス由来の表面抗原タンパク質とプロテアーゼとを発
現する組み換えワクチニアウイルスの主成分生ワクチン
を用いることにより、高い中和抗体価が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、フラビウイルス科に属
するウイルスに対するワクチンに関し、さらに詳しくは
フラビウイルス科に属するウイルスに対する組み換え種
痘生ワクチンに関する。

【０００２】

【従来の技術】日本脳炎ウイルスやデングウイルスなど
に代表されるフラビウイルスは、一本鎖ＲＮＡをゲノム
（ウイルスの遺伝情報を担う本体）としたウイルスであ
る。このＲＮＡをもとに翻訳された一本のポリペプチド
が感染細胞内において、シグナラーゼやプロテアーゼに
よって切断され１０個のタンパク質となることが知られ
ている。１０個のタンパク質とは、順にＣ、ｐｒＭ
（Ｍ）、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、Ｎ
Ｓ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５である（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４、６４９−６８８（１９９
０））。これらのタンパク質のうちｐｒＭ（Ｍ）タンパ
ク質は、ｐｒｅＭとＭに分けて表現されることもある。
またＮＳ３タンパク質のアミノ末端側の領域はプロテア
ーゼ活性を担うドメインである事が知られている（Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．、６５、６０４２ー６０５０（１９９
１））。また、フラビウイルス感染培養細胞や乳のみマ
ウス脳に感染したフラビウイルスは子孫ウイルス以外に
非感染性ヘマグルチニン（以下ＳＨＡと略す）粒子を細
胞外に放出することが知られている（”Ｔｈｅ Ｔｏｇ
ａ Ｖｉｒｕｓｅｓ”ｐｐ５０３−５２９、Ｒ．Ｗ．Ｓ
ｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ．，Ｉｎｃ．）。

【０００３】現在、フラビウイルスのワクチンとしては
黄熱病ウイルスの弱毒生ワクチン、不活化日本脳炎ウイ
ルスを有効成分とするワクチンが実用化されているがそ
の製造工程は、繁雑であり、危険を伴う。例えば現行の
日本脳炎ワクチンは、健康なマウス脳内に日本脳炎ウイ
ルス北京株を接種し、発症したマウスから脳を無菌的に
採取し、アルコール・プロタミン法により精製、不活化
してワクチン原液を得ている（国立予防衛生研究所学友
会編「日本のワクチン」改訂２版、昭和５２年１月２０
日丸善株式会社発行）が、このようなワクチンの製造法
においては、精製操作が複雑であり、また大量の日本脳
炎ウイルスそのものを取り扱うために、ワクチン製造担
当者にとっては危険性が極めて高い。ワクチンは、ウイ
ルスそのもの以外に、ウイルスの抗原性を有する抗原タ
ンパク質を用いて製造することもできる。このような観
点から、組み換えＤＮＡ技術によって原核細胞や真核細
胞を用いて抗原タンパク質を製造する方法が検討されて
いる。特にワクチニアウイルスやバキュロウイルスをベ
クターとして作製した組み換えウイルスは、正しくプロ
セスされた抗原性のよいＥタンパク質を発現することを
我々は見いだした（特開昭６４−７４９８２、特開平１
−２８５１９８）。ワクチニアウイルスは天然痘に対す
る生ワクチンとして用いられたウイルスであり、この種
痘生ワクチンによって天然痘を世界から撲滅させる事が
できた。ワクチニアウイルスは天然痘に対する免疫を賦
与する能力以外に組み換え生ワクチンとして用いた場
合、細胞性免疫の誘導や耐熱性など極めて優れた性質が
ある。従って組み換え種痘生ワクチンは次世代のワクチ
ンとして有望視されている。先に述べたように特開昭６
４−７４９８２で記述された組み換えワクチニアウイル
スは日本脳炎ウイルス攻撃試験での有効性や中和抗体価
を誘導する事が確認されたが、尚一層の中和抗体価の上
昇が望まれていた。組み換えワクチニアウイルスの免疫
原性を向上させる方法として組み換えウイルスが感染細
胞外に抗原蛋白を多く放出するようになれば接種動物の
免疫応答を更に誘導することが出来ると考えられる。本
発明者らは最近、フラビウイルスのＥタンパク質とプロ
テアーゼをコードするｃＤＮＡを組み込んだ組み換えウ
イルスを細胞に感染させた場合、あるいはフラビウイル
スのＥタンパク質を発現する組み換えウイルスとフラビ
ウイルスのプロテアーゼを発現する組み換えウイルスを
細胞に重感染させた場合に、その培養上清に多量のフラ
ビウイルス科に属するウイルスのＥタンパク質を含む非
感染性の構造物粒子を産生することを見い出した。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者らは、
かかる従来技術や知見の下で、組み換えワクチニアウイ
ルスを主成分とする生ワクチンの開発を目指して鋭意検
討を進めた結果、フラビウイルスのＥタンパク質とプロ
テアーゼをコードするｃＤＮＡを組み込んだ組み換えワ
クチニアウイルスを主成分とするか、あるいはフラビウ
イルスのＥタンパク質を発現する組み換えワクチニアウ
イルスとフラビウイルスのプロテアーゼを発現する組み
換えワクチニアウイルスとを混合したものを主成分とす
る生ワクチンを見い出し、本発明を完成させるに至っ
た。

【０００５】

【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、第一の発明として、フラビウイルス科に属するウイ
ルス由来のＥタンパク質を発現する組み換えワクチニア
ウイルス（１）とプロテアーゼを発現する組み換えワク
チニアウイルス（２）とを混合したものを主成分とする
生ワクチン（第一のワクチン）が提供される。また、第
二の発明として、フラビウイルス科に属するウイルス由
来のＥタンパク質とプロテアーゼとを発現する組み換え
ワクチニアウイルス（３）を主成分とする生ワクチン
（第二のワクチン）が提供される。本発明の第一のワク
チンにおいては、フラビウイルス科に属するウイルスの
Ｅタンパク質を発現する組み換えワクチニアウイルス
（１）とプロテアーゼを発現する組み換えワクチニアウ
イルス（２）が用いられる。組み換えワクチニアウイル
ス（１）は、少なくともフラビウイルス科に属するウイ
ルスのＥタンパク質をコードするｃＤＮＡ（ａ）を親ウ
イルスの非必須領域に組み込んだものである。このよう
なｃＤＮＡは、公知の技術（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ” Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら編、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を用いて調製することがで
きる。また、ｃＤＮＡの由来となるフラビウイルスは、
フラビウイルスに属するウイルスであれば特に限定され
ず、その具体例として、日本脳炎ウイルス、デングウイ
ルス、黄熱病ウイルス、ウエストナイルウイルスなどが
挙げられる。例えば日本脳炎ウイルスＳａｇａｙａｍａ
株（米国コネチカツト州のエール大学アーボウイルスリ
サーチユニツト）から調製されたｃＤＮＡ５０３７は特
開昭６４−７４９８２号の実施例で開示されているが、
本発明においては上記ｃＤＮＡと実質的に同一の機能を
有する範囲において、修飾されたｃＤＮＡ（即ち、塩基
配列が置換、挿入、欠失したもの）であってもよい。も
ちろん、実質的に同一の機能を有するかぎり、アミノ酸
配列が異なる程度に修飾されたものであってもよい。

【０００６】Ｅタンパク質の発現のためには、Ｅタンパ
ク質の実質的に全部をコードするｃＤＮＡに加え、Ｅタ
ンパク質をコードするｃＤＮＡの上流に、Ｃタンパク質
のカルボキシ末端側約６２アミノ酸程度以上のペプチド
をコードするｃＤＮＡをｐｒＭ（Ｍ）タンパク質をコー
ドするｃＤＮＡと一連に組み込むことが粒子の製造効率
の向上の点からは好ましい。組み換えワクチニアウイル
スの作製に供されるウイルス（親ウイルス）はワクチン
株であれば特に限定されないが、好ましくはリスター株
の温度感受性変異株（米国特許第４，５６７，１４７
号、特開昭６２−４４１７８号参照）、ＮｅｗＹｏｒｋ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ株、ＬＣ１６ｍ８株
などの種痘ワクチン株などが例示される。これらのウイ
ルスの中でも孵化鶏卵しょう尿膜上でのポックスサイズ
が３ｍｍ以下でかつウサギ腎臓細胞での増殖不能温度が
４１℃以下のものが好適であり、その具体例としては前
記特開昭６２−４４１７８号記載の弱毒痘そう株ＬＡ株
および、ＬＢ株（ＣＮＴＭ−１−４２３）、前記ＬＣ１
６ｍ８株などが弱毒性であり安全性の面で有利である。
組み換えワクチニアウイルス（１）の作製方法は特に限
定されないが、例えば、以下の方法によって作製するこ
とができる。まず親ウイルスの増殖に非必須なＤＮＡ領
域が組み込まれ、さらにその領域内に親ウイルスで働く
プロモーター遺伝子が挿入された第一の組み換えベクタ
ーが作製される。第一の組み換えベクターの具体例とし
ては、例えば特開昭６４−７４９８２号の実施例で開示
されたプラスミドｐＡＫ８などが例示される。次いでＥ
タンパク質の実質的に全部をコードするｃＤＮＡが第一
の組み換えベクターのプロモーターの後ろに挿入された
第二の組み換えベクターが作製される。プロモーター
は、挿入されるｃＤＮＡの転写を調節するために有効で
ある。組み込むプロモーターは、親ウイルス内で機能す
る限りにおいて特に限定されないが、好ましくは７．５
Ｋプロモーターの２倍以上、より好ましくは１０倍以
上、特に好ましくは１５倍以上の活性を有するプロモー
ターである。このようなプロモーターの具体例として
は、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１０、７７１−７８４
（１９８２）記載の合成プロモーターや、７．５Ｋプロ
モーターの約２０倍の活性を持つ合成プロモーターＳL
（配列番号１）が挙げられる。

【０００７】

【化１】配列番号１：合成プロモーターＳL

【０００８】次に、ベクターＤＮＡと親ウイルスゲノム
ＤＮＡ間に相同組み換えを起こさせて組み換えウイルス
を作製する。組み換えウイルスの作製にあたっては常法
に従えば良い。例えば、ワクチニアウイルスを感染させ
た動物培養細胞に第二の組み換えベクターを移入し、組
み換えワクチニアウイルスを作製する。例えば”ＤＮＡ
ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌ．ＩＩ ａ ｐｒａｃｔｉｃ
ａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”ｐｐ．１９１−２１１、
（Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編、ＩＲＬプレス、オックスフ
ォード、ワシントン）の記述に従って実施できる。すな
わちワクチニアウイルスを感染させた宿主細胞にリン酸
カルシウム共沈法により第二の組み換えベクターを移入
させ、得られる組み換えウイルスを含むウイルス集団を
チミジンキナーゼ欠損細胞に感染させＢＵｄＲ存在下生
育してくるプラークを選択し、組み換えウイルス候補株
とする。これら候補株の中から日本脳炎ウイルスのｃＤ
ＮＡが組み込まれたウイルスを選択する方法は、該ｃＤ
ＮＡをプローブとするハイブリダイゼーション法を利用
してプラーク純化をすれば良い。このような組み換えウ
イルス（１）の例としては、組み換えワクチニアウイル
スＬＡＪ６株やＬＡＪ４株（特開昭６４−７４９８２号
公報記載、日本脳炎ウイルスのＥタンパク質を発現す
る）などが挙げられる。特に、Ｃタンパク質の一部をコ
ードするｃＤＮＡとｐｒＭ（Ｍ）タンパク質の実質的に
全部をコードするｃＤＮＡとＥタンパク質の実質的に全
部をコードするｃＤＮＡとＮＳ１タンパク質の一部をコ
ードするｃＤＮＡとを組み込んだ組み換えウイルスが好
ましく、そのような組み換えウイルスの具体例として
は、組み換えワクチニアウイルスＬＡＪ６株が挙げられ
る。

【０００９】一方、組み換えウイルス（２）は、少なく
ともフラビウイルス科に属するウイルスのプロテアーゼ
の実質的に全部をコードするｃＤＮＡを親ウイルスの非
必須領域に組み込んだものである。ｃＤＮＡとして、プ
ロテアーゼをコードするｃＤＮＡ（ｂ）を用いること以
外は、前記の組み換えウイルス（１）と同様にして得ら
れる。プロテアーゼタンパク質の発現のためには、プロ
テアーゼの実質的に全部をコードするｃＤＮＡに加え
て、その上流にＮＳ２Ｂタンパク質をコードするｃＤＮ
Ａを連結することが好ましい。また、プロテアーゼドメ
インはＮＳ３タンパク質のアミノ末端側にあるため、必
ずしも、ＮＳ３タンパク質全部をコードするｃＤＮＡを
用いる必要はない。このような組み換えワクチニアウイ
ルス（２）の例として、黄熱病ウイルスのプロテアーゼ
を発現する組み換えワクチニアウイルス株（Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．、６５、６０４２−６０５０（１９９１））、デ
ングＩＶ型ウイルスのプロテアーゼを発現する組み換え
ワクチニアウイルス（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５、２４６
７−６４７５（１９９１））、日本脳炎ウイルスを発現
する組み換えワクチニアウイルスＬＡＪＮＳ２ｂ＋３株
（本願明細書実施例１参照）などが挙げられる。特に、
ＮＳ２Ｂタンパク質の実質的に全部をコードする遺伝子
とプロテアーゼドメインの実質的に全部をコードする遺
伝子を組み込んだ組み換えワクチニアウイルスが好まし
く、そのような組み換えウイルスの具体例としては、組
み換えワクチニアウイルスＬＡＪＮＳ２ｂ＋３株が挙げ
られる。本発明の第一のワクチンとしては、組み換えウ
イルス（１）と（２）を混合して調製される。その組成
はワクチンとして使うにふさわしい物であれば特に限定
されないが、ワクチンの具体例としてウサギ初代腎臓細
胞で組み換えウイルス（１）と（２）を増殖させた後、
それらを１：１の比で混合し、安定剤として５％ソルビ
トール、５％プロテオースペプトン等を加え、０．２％
ゼラチン加イーグルＭＥＭでウイルス量を適当になる様
に希釈したものをバイアル瓶に分注し、そのまま液状ま
たは凍結乾燥して製剤化したものが挙げられる。本発明
の第二のワクチンは、Ｅタンパク質とプロテアーゼとを
同時に発現しうる組み換えワクチニアウイルス（３）を
主成分とする生ワクチンである。この発明の組み換えワ
クチニアウイルス（３）は、少なくともフラビウイルス
科に属するウイルスのＥタンパク質の実質的に全部をコ
ードするｃＤＮＡ（ａ）とプロテアーゼの実質的に全部
をコードするｃＤＮＡ（ｂ）を親ウイルスの非必須領域
に組み込んだものである。この組み換えワクチニアウイ
ルスの作製は、ｃＤＮＡ（ａ）と（ｂ）を同じ親ウイル
スに組み込むこと以外は組み換えウイルス（１）、
（２）の場合に準じて行われる。かかる組み換えウイル
ス（３）の具体例としては、Ｃタンパク質のカルボキシ
末端側（６２アミノ酸分）をコードするｃＤＮＡ
（ｃ）、ｐｒＭ（Ｍ）タンパク質の実質的に全部をコー
ドするｃＤＮＡ（ｄ）、Ｅタンパク質の実質的に全部を
コードするｃＤＮＡ、ＮＳ２Ｂタンパク質の実質的に全
部をコードするｃＤＮＡ（ｅ）とＮＳ３タンパク質のプ
ロテアーゼドメインをコードするｃＤＮＡ（ｆ）とを一
連に組み込んだ組み換えワクチニアウイルスＬＡＪ１４
−ＳL （本願明細書実施例１参照）が挙げられる。この
ような組み換えワクチニアウイルス（３）を主成分とす
る第二のワクチンの組成はワクチンとして使うにふさわ
しい物であれば特に限定されないが、ワクチンの具体例
として第一のワクチンと同様、ウサギ初代腎臓細胞で組
み換えウイルス（３）を増殖させた後、安定剤として５
％ソルビトール、５％プロテオースペプトン等を加え、
０．２％ゼラチン加イーグルＭＥＭでウイルス量を適当
になる様に希釈したものをバイアル瓶に分注し、そのま
ま液状または凍結乾燥して製剤化したものが挙げられ
る。

【００１０】

【発明の効果】本発明によれば、第一の発明として、フ
ラビウイルスウイルス科に属するウイルス由来のＥタン
パク質を発現する組み換えワクチニアウイルス（１）と
プロテアーゼを発現する組み換えワクチニアウイルス
（２）とを混合したものを主成分とする生ワクチン（第
一のワクチン）が提供される。また、第二の発明とし
て、フラビウイルス科に属するウイルス由来のＥタンパ
ク質とプロテアーゼとを発現する組み換えワクチニアウ
イルス（３）を主成分とする生ワクチン（第二のワクチ
ン）が提供される。

【００１１】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。 （参考例１） 日本脳炎ウイルス由来のプロテアーゼタ
ンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング 蚊由来株化細胞Ｃ６／３６（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．、４０、５３１−５４４（１９７８））に日本脳炎
ウイルスＳａｇａｙａｍａ株を感染させ、ウイルスを増
殖させた後、培養上清とポリエチレングリコールとを混
合し遠心分離により日本脳炎ウイルスを精製した。ウイ
ルスゲノムＲＮＡ（約１１ｋｂｐ）は精製ウイルスから
フェノール抽出後、エタノールを加えて沈澱させ分離し
た。Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６１、４９７−５１０（１９
８７）（著者：Ｈ．Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉら）に報告され
た日本脳炎ウイルスの塩基配列を基に下記の３本のオリ
ゴヌクレオチド（配列番号２、３、４）を作製した。配
列番号２、３、４はそれぞれ以下の通りである。

【００１２】

【化２】配列番号２ 5'-GGGAGCCCTCTCAAAGCTTCTGCC-3'

【００１３】

【化３】配列番号３ 5'-CCCCGCTCTTTGGAGGCACATTGC-3'

【００１４】

【化４】配列番号４ 5'-CCCATCTTCCCTATACCCTTTCGC-3'

【００１５】上記３本のオリゴヌクレオチドをそれぞれ
プライマーとし、ウイルスＲＮＡを鋳型として、４種
（Ａ．Ｇ．Ｃ．Ｔ）のデオキシリボヌクレオシド三リン
酸と、逆転写酵素を働かせて、ファーストストランドｃ
ＤＮＡをそれぞれ合成した。次に大腸菌ＲＮａｓｅＨ
と、４種（Ａ．Ｇ．Ｃ．Ｔ）のデオキシリボヌクレオシ
ド三リン酸と大腸菌ＤＮＡポリメラーゼを使って二本鎖
ｃＤＮＡを作製し（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂ．、（１９８２）ｐ．２１１〜２４６）、ターミナル
トランスフェラーゼでｄＣ鎖を付加した。一方、プラス
ミドｐＵＣ９（ファルマシア製）を制限酵素ＰｓｔＩで
消化後、ターミナルトランスフェラーゼでｄＧ鎖を付加
し、これと、前記ｃＤＮＡを混合し、ライゲーション反
応を行ない環状化した。この組み換えプラスミドを大腸
菌ＨＢ１０１コンピテントセルに導入し、それぞれ形質
転換菌を得た。得られた形質転換菌の中から目的のｃＤ
ＮＡを含む組み換えプラスミドを含む形質転換菌を以下
に述べる方法で選択した。それぞれのｃＤＮＡを作製す
るのに用いた配列番号２、３、４のオリゴヌクレオチド
をＴ４ＤＮＡカイネースで末端をラジオアイソトープで
標識し、それをプローブとしてコロニーハイブリダイゼ
ーションでプローブと反応するコロニーをそれぞれ複数
個選んだ。次にそれからプラスミドを取り出し、挿入さ
れたｃＤＮＡの長さを比較し、それぞれのグループの中
で最も長いｃＤＮＡを選択した（選択したｃＤＮＡクロ
ーンをそれぞれ２１４２、１０８５、２０４１と命名し
た）。制限酵素による切断パターンよりクローニングし
た３つのクローンは図１に示す位置関係にあることがわ
かった。

【００１６】（参考例２） 日本脳炎ウイルス由来のＮ
Ｓ２ｂタンパク質、ＮＳ３タンパク質をコードするｃＤ
ＮＡを組み込んだ組み換えベクター（ｐＡＫＪＮＳ２ｂ
＋３）の作製 特開昭６４−７４９８２号の実施例で開示されたｐＡＫ
８を制限酵素ＮｃｏＩと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断
し、そこに合成ヌクレオチドアダプター（配列番号５）
を挿入し、ｐＡＫ１１を作製した。

【００１７】

【化５】配列番号５

【００１８】また参考例１で得られたｃＤＮＡクローン
２０４１を制限酵素ＢａｍＨＩと制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで二重切断し、約０．９６ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ま
たｃＤＮＡクローン１０８５を制限酵素ＢａｍＨＩと制
限酵素ＰｓｔＩで二重切断して約０．６５ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片を回収し、制限酵素ＰｓｔＩと制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで二重切断したプラスミドｐＡＫ８に挿入し、プ
ラスミドｐＪＥ４９２１／６５２９を作製した。ｐＡＫ
１１を制限酵素ＢａｌＩと制限酵素ＥｃｏＲＩで切断
し、参考例１で得られたｃＤＮＡクローン２１４２を制
限酵素ＢａｌＩと制限酵素ＰｓｔＩで切断して得られる
約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片と、ｐＪＥ４９２１／６５
２９を制限酵素ＰｓｔＩと制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し
て得られる約１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を挿入してプラ
スミドｐＡＫＪＮＳ２ｂ＋３を作製した。

【００１９】（参考例３） 日本脳炎ウイルス由来のＣ
タンパク質の一部、ｐｒＭ（Ｍ）タンパク質、Ｅタンパ
ク質をコードするｃＤＮＡを組み込んだ組み換えベクタ
ー（ｐＡＫＪ６−ＳL ）の作製 特開昭６４−７４９８２号公報、第２４頁、実施例１
（７）３記載のｐＡＫＪ６（プロモーターが７．５Ｋプ
ロモーターであり、日本脳炎ウイルスのｐｒＭ（Ｍ）、
Ｅタンパク質をコードするｃＤＮＡを含んでいる。）を
制限酵素ＰｓｔＩと制限酵素ＳａｌＩで処理し、配列番
号１記載の合成プロモーターＳL を、７．５Ｋプロモー
ターの代わりに挿入し、約６．２Ｋｂｐのプラスミドを
得た。このプラスミドをｐＡＫＪ６−ＳL と命名した。
図２に本プラスミドが有する日本脳炎ウイルス由来の遺
伝子の位置を示した。

【００２０】（参考例４） 日本脳炎ウイルス由来のＣ
タンパク質の一部、ｐｒＭ（Ｍ）タンパク質、表面抗原
（Ｅ）タンパク質、ＮＳ２ｂタンパク質、およびＮＳ３
タンパク質のプロテアーゼドメインをコードするｃＤＮ
Ａを組み込んだ組み換えベクター（ｐＡＫＪ１４−ＳL
）の作製 参考例３で作製されたプラスミドｐＡＫＪ６−ＳL を制
限酵素ＢｇｌＩＩと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、
そこに合成ヌクレオチドアダプター（配列番号６）を挿
入し、ｐＳＡＫＪ６を作製した。図２に本プラスミドが
有する日本脳炎ウイルス由来の遺伝子の位置を示した。

【００２１】

【化６】配列番号６

【００２２】ｐＳＡＫＪ６を制限酵素ＢａｌＩと制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩで二重切断し、参考例２で作製したプ
ラスミドｐＡＫＪＮＳ２ｂ＋３を制限酵素ＢａｌＩと制
限酵素ＨＩｎｄＩＩＩで切断して得られた約０．９３ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドｐＡＫＪ１４
−ＳL を作製した。図２に本プラスミドが有する日本脳
炎ウイルス由来の遺伝子の位置を示した。

【００２３】（実施例１） 組み換えワクチニアウイル
スの作製 ２５ｃｍ² のカルチャーボトルに培養されたＲＫ−１３
細胞に弱毒痘そうウイルス株［特開昭６２−４４１７８
号公報記載の弱毒痘そう株ＬＡ（ウサギ腎細胞における
増殖不能温度４１℃、孵化鶏卵しょう尿膜上でのポック
サイズ２〜３ｍｍ）］を0.1 P.F.U.／細胞の割合で接種
し、４５分後、参考例２または参考例３または参考例４
で得た組み換えプラスミドｐＡＫＪＮＳ２ｂ＋３または
ｐＡＫＪ６−ＳL またはｐＡＫＪ１４−ＳL の１０μｇ
を２．２ｍｌの滅菌水に溶解し、樋高ら（蛋白・核酸・
酵素、２７、３４０（１９８５））の方法によってＤＮ
Ａ−リン酸カルシウム共沈物をつくり、その０．５ｍｌ
を感染ＲＫ−１３細胞上にそれぞれ滴下した。３０分
間、３７℃、７％ＣＯ₂ インキュベーターに静置し、５
％牛胎児血清を含むイーグルＭＥＭ ４．５ｍｌを加え
た。その３時間後、培養液を交換し、４８時間、３７
℃、７％ＣＯ₂ インキュベーター内で培養し、培養細胞
ごとに３度凍結融解した。組み換え体選択のために、直
径１０ｃｍのペトリ皿に培養されたＴＫ−１４３細胞に
上記のウイルス液を接種し、３０分後、１％アガロー
ス、５％牛胎児血清、２５μｇ／ｍｌのＢＵｄＲ加イー
グルＭＥＭを積層し、３日間培養後、感染細胞を０．０
１％ニュートラルレッドで染色した。出現したプラーク
からパスツールピペットでウイルスを抜取り、これを２
％ゼラチンを含むＰＢＳに懸濁し、一部はドットハイブ
リダイゼーションをするため、セルロースメンブレンに
スポットし、残りは−２０℃で保存した。スポットした
メンブレンは、０．５Ｎ水酸化ナトリウムで１０分間、
１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で５分間の処理
を３回繰り返したのち、１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で５分間処理した。
２倍ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエ
ン酸ナトリウム）で飽和させ、８０℃、２時間焼き付け
た。

【００２４】４倍ＳＥＴ［０．６Ｍ ＮａＣｌ、０．０
８Ｍトリス−塩酸、４ｍＭ ＥＤＴＡ、（ｐＨ７．
８）］−１０倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ−０．１％ＳＤＳで６
８℃、２時間処理した。４倍ＳＥＴ−１０倍Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ−０．１％ＳＤＳ−０．１％Ｎａ₄ Ｐ₂ Ｏ₄ −５
０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡとニックトランスレー
ションによって３２ｐで標識した日本脳炎ウイルスのＥ
タンパク質のｃＤＮＡを入れて６８℃、１４時間ハイブ
リダイゼーションした。洗浄後、メンブレンとＸ線フィ
ルムを重ね、オートラジオグラフィーを行い、フィルム
が黒化するスポットを選択した。黒化したスポットに対
応するウイルス液を再度ＴＫ- １４３細胞に接種し、３
０分後、１％アガロース、５％牛胎児血清、２５μｇ／
ｍｌのＢＵｄＲを含むイーグルＭＥＭを積層し、３日間
培養後、感染細胞を０．０１％ニュートラルレッドで染
色した。出現したプラークについて、上記と同様な操作
を行い、出現するすべてのプラークがドットハイブリダ
イゼーションで黒化するまで純化の操作を繰り返した。
こうして得られたウイルスは、それぞれ目的の組み換え
ワクチニアウイルスである。これらの組み換えワクチニ
アウイルスをそれぞれＬＡＪＮＳ２ｂ＋３、ＬＡＪ６−
ＳL 、ＬＡＪ１４−ＳL と命名した。

【００２５】（実施例２） 組み換えワクチニアウイル
スＬＡＪ１４−ＳL を主成分とする生ワクチンの性能評
価 実施例１で得られた組み換えウイルスＬＡＪ１４−ＳL
をウサギ初代腎臓細胞に接種し、３０℃、７０時間培養
後の培養上清に５％ソルビトール、５％プロテオースペ
プトンを安定剤として加え、０．２％ゼラチン加イーグ
ルＭＥＭでウイルス量２×１０7 ＴＣＩＤ50／ｍｌとな
るよう希釈し、ワクチンとした。４週齢雌ｄｄＹマウス
１０匹の腹腔中に、この製剤１０⁷ ＴＣＩＤ₅₀／０．５
ｍｌをそれぞれ一回接種した。２週間後尾静脈より部採
血を行った後、マウス脳内で増殖させた日本脳炎ウイル
ス北京株（１．４４ＬＤ₅₀）を１０^-1希釈したものを部
採血後のマウス腹腔に接種し、更に３週間観察し、生存
率を算出した。また日本脳炎ウイルス攻撃試験前のマウ
スの日本脳炎に対する抗体価の上昇を中和法（生物学的
製剤基準、厚生省、１９８９）で測定した。その結果を
表１にまとめた。

【００２６】（実施例３） 組み換えワクチニアウイル
スＬＡＪ６−ＳL とＬＡＪＮＳ２ｂ＋３とを混合したも
のを主成分とする組み換え生ワクチンの性能評価 実施例１で得られた組み換えウイルスＬＡＪ６−ＳL と
ＬＡＪＮＳ２ｂ＋３を、各々ウサギ初代腎臓細胞に接種
し、３０℃、７０時間培養した培養上清をウイルス量で
それぞれ１：１に混合した。この液に５％ソルビトー
ル、５％プロテオースペプトンの安定剤を加え、０．２
％ゼラチン加イーグルＭＥＭでウイルス量２×１０⁷ Ｔ
ＣＩＤ₅₀／ｍｌとなるよう希釈し、ワクチンとした。４
週齢雌ｄｄＹマウス１０匹の腹腔中に、この製剤１０⁷
ＴＣＩＤ₅₀／０．５ｍｌをそれぞれ一回接種した。２週
間後尾静脈より部採血を行った後、マウス脳内で増殖さ
せた日本脳炎ウイルス北京株（１．４４ＬＤ₅₀）を１０
^-1希釈したものを部採血後のマウス腹腔に接種し、更に
３週間観察し、生存率を算出した。また日本脳炎ウイル
ス攻撃試験前のマウスの日本脳炎に対する抗体価の上昇
を中和法（生物学的製剤基準、厚生省、１９８９）で測
定した。その結果を表１にまとめた。

【００２７】（比較例１） ＬＡＪ６−ＳL あるいはＬ
ＡＪＮＳ２ｂ＋３のみを主成分とする生ワクチンの性能
評価 実施例１で得られた組み換えウイルスＬＡＪ６−ＳL 又
はＬＡＪＮＳ２ｂ＋３をウサギ初代腎臓細胞に接種し、
３０℃、７０時間培養後の培養上清に５％ソルビトー
ル、５％プロテオースペプトンを安定剤として加え、
０．２％ゼラチン加イーグルＭＥＭでウイルス量２×１
０⁷ ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌとなるよう希釈し、ワクチンとし
た。実施例１および２と全く同様にしてＬＡＪ６−ＳL
のみ又はＬＡＪＮＳ２ｂ＋３のみを主成分とする生ワク
チンの性能評価をおこなった。その結果を表１にまとめ
た。

【００２８】

【図面の簡単な説明】

【図１】日本脳炎ウイルスのゲノム構造とクローニング
した３つのｃＤＮＡクローンの領域を示した説明図であ
る。

【図２】日本脳炎ウイルスのゲノム構造と作製した各組
み換えプラスミドが有するｃＤＮＡクローンの領域を示
した説明図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 7/01 15/40 (72)発明者 渡邊 邦子 千葉県我孫子市白山２−８−12

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 フラビウイルス科に属するウイルス由来
   の表面抗原タンパク質を発現する組み換えワクチニアウ
   イルス（１）と、フラビウイルス科に属するウイルス由
   来のプロテアーゼを発現する組み換えワクチニアウイル
   ス（２）とを混合したものを主成分とする生ワクチン。
2. 【請求項２】 フラビウイルス科に属するウイルス由来
   の表面抗原タンパク質とプロテアーゼとを発現する組み
   換えワクチニアウイルス（３）を主成分とする生ワクチ
   ン。
3. 【請求項３】 フラビウイルス科に属するウイルスが日
   本脳炎ウイルスであるところの請求項１および２の生ワ
   クチン。