JP2005511042A5 - - Google Patents

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デング熱の病因物は、デングウイルスであり、これはフラビウイルス科ファミリーのフラビウイルス属に属している（Ｂｕｒｋｅ ａｎｄ Ｍｏｎａｔｈ，２００１）。フラビウイルスのとりわけ重要な亜群は、蚊媒介性フラビウイルスと呼ばれる群、すなわち蚊によって伝達されるフラビウイルスである。この群には、以上で言及したデングウイルス以外に、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱病（黄色熱）ウイルスのような他の重要なウイルスが含まれる（Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｆｉｅｌｄｓ Ｂ．Ｎ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ １９９６，ＩＳＢＮ：０−７８１７−０２５３−４，９３１−１０３４ページ）。これらのウイルスによって伝達される典型的な疾患は、西ナイルウイルスによって誘発される西ナイル熱および西ナイル脳炎、日本脳炎ウイルスによって誘発される脳炎、黄色熱ウイルスによって誘発される黄色熱およびデングウイルスによって誘発されるデング熱、デング出血性熱（ＤＨＦ、以下を参照のこと）およびデングショック症候群（ＤＳＳ）である。
すべてのフラビウイルスに存在する糖タンパク質ＮＳ１は、ウイルス生存性に関して重要であるようである。デングウイルスＮＳ１は、可溶性六量体形態にて、哺乳動物感染細胞より分泌される（Ｆｌａｍａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。この非共有結合六量複合体は、３つの二量体サブユニットにより形成され、３１０ｋＤａの分子量を持つ。二量体化は、ＮＳ１タンパク質の細胞質膜への輸送のために必要条件であり、その際、感染細胞表面の固有のウイルス常駐タンパク質として残る。
その４つのセロタイプ、デングウイルスセロタイプ１（Ｄｅｎ−１）〜デングウイルスセロタイプ４（Ｄｅｎ−４）までを持つデングウイルスが、ヒトの感染に関して、フラビウイルス属のもっとも重要なメンバーであり、インフルエンザ様症状から、重度または致命的な病気である、ショック症状を伴うデング出血性熱までの範囲の疾患を産生する。デング発生は、蚊ベクターが豊富である、熱帯および亜熱帯地帯の人口密度の高い領域における、主要な公衆の健康問題であり続けている。
ＤＦのほとんどの場合が、任意の４つのセロタイプによる第一感染の後に顕著化する一方で、大きな割合のＤＨＦの場合、デングウイルスの第一感染セロタイプからはことなるセロタイプによる、二回目として感染した対象において起こる。これらの観察により、適切な間隔において、異なるウイルスセロタイプによる、１つのデングセロタイプに対する抗体を持つ個体における連続感染が、結果として、特定の数の場合で、ＤＨＦとなりうるという仮説が生じる。抗体依存増強（抗体依存性増強）（ＡＤＥ）が、デングウイルスならびに他のエンベロープウイルスに関して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて示されてきており、ＤＨＦの病因における重要な機構であると考えられる。
ＤＨＦが通常、多数（３または４）のウイルスセロタイプが一緒に循環する、地理上区域で問題になることがまた観察されてきた。東南アジア諸国のような風土性ＤＨＦのある領域で、年齢特異的な発病率は、子供において非常に高く、より高年齢群でのＤＨＦケース数は減少する。これは、デングへの血清有病率の増加と大まかに相関し、天然の感染が、保護免疫を誘発することを示している。この現象は、Ａ型肝炎ウイルスのような他のウイルス感染で観察されたものと同じではない。ケーススタディ臨床観察により、患者が２回ＤＨＦを経験する可能性がある（Ｎｉｍｍａｎｎｉｔｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）が、これはまれであり、第二および続く感染を引き起こすセロタイプを実際に同定することは難しい。いままでに、すべての４つのデングウイルスセロタイプが、同一の領域で循環するにも関わらず、同一の個体での、第四の感染の報告はなかった。このことは、本質的に、２または３デングウイルスセロタイプによる、同一個体での感染が、結果として、交差反応抗体となるか、または交差反応細胞毒性リンパ球応答となりうることが示唆される。これは、本質的に、残っているデングウイルスセロタイプによる感染に対して、調整または保護しうる。
この目的のために、国際公開第９８／１３５００号公報は、全てのデングウイルスセロタイプからの抗原を発現している、組換え体改変（修飾）ワクシニアウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ））を使用すること、または各組換え体ＭＶＡが、１つのデングウイルスセロタイプの少なくとも１つの抗原を発現するような４つの組換え体ＭＶＡを使用すること、を提案している。両方の戦略により、全てのデングウイルスセロタイプに対してワクチン化するための、非常に前途有望な戦略が提供される。しかしながら、投与に際し、１つ以上のフラビウイルスに対する、または１つ以上のデングウイルスのセロタイプに対する、好ましくはすべてのデングウイルスセロタイプに対する免疫応答となる、単一のサブユニットワクチンを提供することが望ましい。さらに、国際公開第９８／１３５００号公報は、デングウイルスＮＳ１をコードしている組換え体ＭＶＡを開示している。国際公開第９８／１３５００号公報は、１つのデングウイルスセロタイプから由来する抗原が、抗原が由来するデングウイルスセロタイプに対してのみでなく、他のデングウイルスセロタイプに由来する抗原に対しても、免疫応答を誘発することは開示していない。
国際公開第９９／１５６９２号公報は、免疫増強または抗体依存増強に影響を与え得ない、デングウイルス抗原をコードしている１つまたはそれ以上のＤＮＡ配列を含み、発現可能な、組換え体ＭＶＡを開示している。国際公開第９９／１５６９２号公報は、１つのデングウイルスセロタイプから由来した抗原が、抗原が由来するデングウイルスセロタイプに対してのみでなく、他のデングウイルスセロタイプに由来する抗原に対しても、免疫応答を誘発することは開示していない。
したがって、安定であり、簡単に産生可能であり、ワクチンが由来するフラビウイルスまたはフラビウイルスセロタイプに対してのみでなく、他のフラビウイルスまたはフラビウイルスセロタイプに対しても、ワクチンを接種した（ワクチン化した）個体を保護する免疫応答を導く、フラビウイルスまたはフラビウイルスセロタイプから由来するワクチンを産生することが、本発明の目的である。ワクチンが由来する蚊媒介性フラビウイルスまたはフラビウイルスセロタイプに対してのみでなく、他の蚊媒介性フラビウイルスまたはフラビウイルスセロタイプに対しても、ワクチン化した個体を保護する、蚊媒介性フラビウイルスから由来するワクチンを提供することが、本発明の特定の目的である。デングウイルスセロタイプから由来し、少なくとも２つ、好ましくは全てのデングウイルスセロタイプとの感染に対して、個体を保護する、ワクチンを提供することが本発明のさらなる目的である。
これらの目的は、それぞれ、フラビウイルスのＮＳ１タンパク質またはその部分、およびフラビウイルスＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている発現カセットを含んでいるＤＮＡ配列を用いて解決されてきた。とりわけ、蚊媒介性フラビウイルスから由来する、およびワクチンが由来する蚊媒介性フラビウイルスによる感染に対して、また少なくとも１つの他の蚊媒介性フラビウイルスの感染に対して、個体を保護するワクチンを提供する目的は、それぞれ、蚊媒介性フラビウイルス、とりわけデングウイルス、好ましくはデングウイルスセロタイプ２のＮＳ１タンパク質またはその部分、および相当するＤＮＡ断片配列を用いることによって解決されてきた。よりとりわけ、１つのデングウイルスセロタイプから由来する、そして少なくとも、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくはすべてのデングウイルスセロタイプとの感染に対して、および好ましくはまた、他のフラビウイルス、とりわけ、日本脳炎ウイルス、黄色熱ウイルスおよび西ナイルウイルスのような蚊媒介性ウイルスでの感染に対しても、個体を保護するワクチンを提供する目的は、それぞれ、デングウイルス、とりわけデングウイルスセロタイプ２のＮＳ１タンパク質またはその部分、および相当するＤＮＡ断片配列を用いることによって解決されてきた。
ＮＳ１タンパク質またはその部分に加えて、発現カセットが、分離タンパク質／ペプチドとして、さらなるフラビウイルスタンパク質／ペプチドを発現する場合、発現カセットは、ＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている配列と、さらなるフラビウイルスタンパク質をコードしている配列の間に、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含みうる。ＩＲＥＳ要素は、当業者に公知である。ＩＲＥＳ要素に関する例は、ピコルナウイルスＩＲＥＳ要素またはＣ型肝炎ウイルスの５’非コード領域である。
好ましい実施様態において、ＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしているＤＮＡ配列の上方に、Ｅ−タンパク質の糖鎖付加（形成）シグナル配列（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をコードしている配列が存在する。この実施様態にしたがって、融合タンパク質は、ＮＳ１タンパク質またはその部分に融合したＥ−タンパク質糖鎖形成シグナル配列を含むように産生される。以上で指摘したように、Ｅ−タンパク質由来アミノ酸ストレッチは、可能な限り短いべきであり、このアミノ酸ストレッチが、ＡＤＥおよびＤＨＦの産生に関与するエピトープを含むことを排除すべきである。Ｅ−タンパク質の糖鎖形成シグナル配列は、この要求を満たす。
本発明の好ましい実施様態にしたがって使用した発現カセット中のフラビウイルス配列の一般的な構造を理解するために、フラビウイルスのゲノム構造を簡単に要約することが役に立つ。天然のフラビウイルス感染の間、ウイルスは、まず宿主細胞プロテアーゼによって、ついでウイルスにコードされたプロテアーゼによって、以下のタンパク質、Ｃ、ＰｒＭおよびＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５（ポリタンパク質前駆体に沿ったタンパク質順）に切断される、単一ポリタンパク質を産生する。したがって、ＤＮＡ配列、とりわけ、ＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしているｃＤＮＡ配列は、「ＡＴＧ」開始コドンを必要とするはずである。好ましい実施様態において、開始ＡＴＧに、糖鎖付加シグナルをコードしている配列が続き、新規に合成したＮＳ１タンパク質が、小胞体内で糖付加される。そのようなシグナル配列が、当業者に公知である。最終的に、タンパク質コードカセットは終止コドンが必要であり、ｃＤＮＡ配列をコードしているタンパク質の３’末端に付加したＴＡＧでありうる。本発明で使用した例において、「ＡＴＧ＋シグナル配列」要素は、アミノ酸Ｍ（ＡＴＧ）で始まるＥタンパク質の疎水性Ｃ末端（デングウイルスニューギニア株「ＮＧＣ株」に関する、ＧｅｎｅＢａｎｋ受け入れ番号第ＡＦ０３８４０３号の最後の２８アミノ酸）をコードしている配列から由来した。本発明にしたがった典型的な発現カセットは、図２およびＳＥＱ：ＩＤ Ｎｏ９およびＳＥＱ：ＩＤ Ｎｏ１０にて示されている。
語句「ＮＳ１タンパク質またはその部分（ＮＳ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｒ ｐａｒｔ ｔｈｅｒｏｆ）」の文脈中の語句「その部分（ｐａｒｔ ｔｈｅｒｅｏｆ）」は、ＮＳ１タンパク質のアミノ酸ストレッチを意味し、「その部分」が由来するＮＳ１タンパク質に対する特異的免疫応答を誘発するのに十分長い。フラビウイルスがデングウイルスである場合、アミノ酸ストレッチは、すべてのデングウイルスセロタイプのＮＳ１タンパク質に対して、ヒトを含むワクチン接種（ワクチン化）動物中で、免疫応答を誘発する、アミノ酸ストレッチであるべきである。実施例項において、当業者が、どのようにして、ＮＳ１タンパク質またはその部分が、すべてのデングウイルスセロタイプに対して特異的な免疫応答を誘発するかどうかを決定可能であるかを示している。好ましい実施様態にしたがって、フラビウイルスＤＮＡ配列は、全ＮＳ１タンパク質をコードしている。したがって、語句「ＮＳ１タンパク質またはその部分」は、天然に存在するＮＳ１タンパク質の全配列、および免疫応答を誘発する、より短いエピトープストレッチを意味する。
さらに、語句「ＮＳ１タンパク質」はまた、天然に存在するＮＳ１タンパク質の誘導体（誘発体）に関する。そのような誘発体は、天然に存在するＮＳ１タンパク質に関連して、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を持つタンパク質でありうる。実施例の方法によって、そのような誘発体は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸配列における相同性を持つ。したがって、語句「その部分」もまた、そのようなＮＳ１タンパク質誘発体の部分に関する。
本発明はさらに、上述したようなＤＮＡを含むベクター、および本発明にしたがった免疫応答を誘発するための、前記ベクターの使用に関する。語句「ベクター」は、当業者に公知の任意のベクターを意味する。ベクターは、ｐＢＲ３２２のようなプラスミドベクター、またはｐＵＣシリーズのベクターでありうる。より好ましくは、ベクターは、ウイルスベクターである。本発明の文脈において、語句「ウイルスベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）」または「ウイルスベクター（ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）」は、ウイルスゲノムを含む感染性ウイルスを意味する。この場合、本発明のＤＮＡは、それぞれのウイルスベクターのウイルスゲノム内にクローン化されるべきである。組換え体ウイルスゲノムがついでパッケージされ、したがって、得られた組換え体ベクターは、細胞および細胞株の感染のため、とりわけヒトを含む生動物の感染のために使用可能である。本発明にしたがって使用しうる典型的なウイルスベクターはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）に基づいたベクターである。もっとも好ましいのは、ポックスウイルスベクターである。ポックスウイルスは、好ましくはカナリア痘ポックスウイルス（ｃａｎａｒｙｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、鶏痘ポックスウイルス（ｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓ）またはワクシニアウイルスである。より好ましいのは、修飾ワクシニアウイルスアンカラ（Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．［１９９４］、Ｖａｃｃｉｎｅ １２：１０３１−４０）である。典型的なＭＶＡ株は、寄託番号第ＥＣＡＣＣ Ｖ００１２０７０７号にて欧州菌培養収集所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託された、ＭＶＡ５７５である。もっとも好ましいのは、ＰＣＴ明細書国際公開第０２／４２４８０号（ＰＣＴ／ＥＰ０１／１３６２８）にて記述された、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘発体である。この明細書の内容は、本明細書に参考文献にて組み込まれている。ＭＶＡ−ＢＮは、寄託番号第ＥＣＡＣＣ Ｖ０００８３００８号にて、欧州菌培養収集所に寄託された。ＭＶＡ−ＢＮウイルスベクターが、極度に弱毒化されたウイルスであることが示されたので、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘発体を使用することによって、フラビウイルスに対するとりわけ安全なウイルスワクチンを提供するためのさらなる技術的な問題が解決された。とりわけ、ＭＶＡ−ＢＮは、本技術分野で以前より公知のＭＶＡ株よりもより弱毒化されたことが示された。ＭＶＡ−ＢＮは改変ワクシニアアンカラウイルスより由来し、ヒト細胞株における増殖複製のその能力の欠如により特徴づけられる。ＭＶＡ−ＢＮは、ヒトにおける複製の欠如により、他の公知のワクシニアウイルス株よりも安全である。好ましい実施様態において、本発明は、以上で定義したようなＤＮＡを含むウイルスベクターとして、ＭＶＡ−ＢＮおよびＭＶＡ−ＢＮの誘発体に関する。ＭＶＡ−ＢＮの特徴、ＭＶＡ株が、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘発体であるかどうかを評価可能である生物学的アッセイの記述、またはＭＶＡ−ＢＮまたはその誘発体を得ることを可能にする方法の記述は、国際公開第０２／４２４８０号にて開示されている。
第ＥＣＡＣＣ Ｖ０００８３００８号にて寄託したようなウイルスの「誘導体（誘発体）（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」という語句、すなわちＭＶＡ−ＢＮの誘発体を、国際公開第０２／４２４８０号公報にて定義したように、本発明で使用する。以下で、ＭＶＡ−ＢＮの誘発体の特徴を簡単に要約する。ＭＶＡ−ＢＮの誘発体の定義に関するより詳細な情報、とりわけ、ＭＶＡウイルスが、ＭＶＡ−ＢＮの誘発体であるかどうかを決定するために使用した生物学的アッセイに関する詳細な情報に関して、参考文献が、国際公開第０２／４２４８０号公報に対して作製される。したがって、前記語句は、寄託された株ＭＶＡ−ＢＮの以下の特徴のうち少なくとも１つを示し、そのゲノムの１つまたはそれ以上の部分で相違が見られるワクシニアウイルスを意味する。好ましくは、誘発体は、少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、もっとも好ましくはすべての、以下のＭＶＡ−ＢＮの４つの特徴を持つ。
−ニワトリ胎児繊維芽細胞（ＣＥＦ）、幼児ハムスター腎臓細胞株ＢＨＫ（第ＥＣＡＣＣ８５０１１４３３号）における増殖複製の能力、ただし、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔ（Ｂｏｕｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．１９８８，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０６（３）：７６１−７１）における増殖複製の能力はない。
−生体内における複製の失敗
−致死チャレンジモデルにおける、公知の株ＭＶＡ５７５（第ＥＣＡＣＣ Ｖ００１２０７０７号）と比較した場合の、より高い免疫原性の誘発、および／または
−ＤＮＡ−プライム／ワクシニアウイルスブースト法と比較した場合、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブースト法において、少なくとも本質的に同一のレベルの誘発
とりわけ、ＭＶＡ−ＢＮの誘発体は、ＭＶＡ−ＢＮと比べて、本質的に同一の複製特性を持つ。寄託されたウイルスに比べて、同一の「複製特性（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）」を持つウイルスは、ＣＥＦ細胞および細胞株ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＨａＣａｔおよび１４３Ｂにおいて、寄託された株と比べて、同様の増幅比で複製され、ＡＧＲ１２９トランスジェニックマウスモデルにおいて決定されたように、生体内にて同様の複製を示すウイルスである。
語句「増殖複製の能力無し（Ｎｏｔ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」が、国際公開第０２／４２４８０号にて定義されたように、本明細書で使用される。したがって、「増殖複製の能力無し」であるウイルスは、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔ（Ｂｏｕｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．１９８８，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０６（３）：７６１−７１）において、１より少ない増幅比を示すウイルスである。好ましくは、本発明にしたがったベクターとして使用したウイルスの増幅比は、ヒト細胞株ＨａＣａｔにて、０．８またはそれ以下である。ウイルスの「増幅比（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）」は、第一の位置で細胞を感染させるために元々使用した量（Ｉｎｐｕｔ）に対する、感染細胞から産生されるウイルス（Ｏｕｔｐｕｔ）の比である（「増幅比」）。ＯｕｔｐｕｔおよびＩｎｐｕｔ間の「１」の比は、感染細胞から産生されるウイルス量が、細胞を感染させるために最初に使用した量と同一である、増幅状態を定義する。
ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘発体の定義の文脈において、語句「生体内における複製の失敗（ｆａｉｌｕｒｅ ｔｏ ｒｅｐｌｉｃａｔｅ ｉｎ ｖｉｖｏ）」が、国際公開第０２／４２４８０号にて定義されたように、本明細書で使用される。したがって、前記語句は、国際公開第０２／４２４８０号において説明したように、ヒトおよびマウスモデルにおいて、複製しないウイルスである。国際公開第０２／４２４８０号にて使用したマウスは、成熟ＢおよびＴ−細胞の産生が不可能である（ＡＧＲ１２９マウス）。とりわけ、ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘発体は、腹腔（腹膜）内に投与された１０ ７ ｐｆｕウイルスでのマウスの感染の後、少なくとも４５日以内、より好ましくは少なくとも６０日以内、もっとも好ましくは９０日以内、ＡＧＲ１２９マウスを殺さない。このましくは、「生体内における複製の失敗」が、マウスに１０７ｐｆｕウイルスを腹膜内投与した後、少なくとも４５日間、より好ましくは少なくとも６０日間、もっとも好ましくは９０日間、ＡＧＲ１２９マウスの器官または組織から、ウイルスが回収されないことでさらに特徴づけられる。
ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘発体は、好ましくは、国際公開第０２／４２４８０号にて説明したような致死チャレンジマウスモデルにおいて測定されたように、公知の株ＭＶＡ５７５と比較して、より大きな免疫原性によって特徴づけられる。そのようなモデルにおいて、ワクチン化されていないマウスは、ウエスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ）株Ｌ９２９ ＴＫ＋またはＩＨＤ−Ｊのような、複製能力を有するワクシニア株の感染の後、死亡する。複製能力を有するワクシニアウイルスの感染は、致死チャレンジモデルの記述の文脈中、「チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）」として参照される。チャレンジの４日後、マウスを通常殺し、卵巣におけるウイルスタイターを、ＶＥＲＯ細胞を用いる標準のプラークアッセイによって決定する。ウイルスタイターは、ワクチン化していないマウス、およびＭＶＡ−ＢＮおよびその誘発体でワクチン化したマウスに関して決定する。よりとりわけ、ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘発体が、１０２ ＴＣＩＤ５０／ｍｌウイルスでのワクチン化の後、この試験にて、卵巣ウイルスタイターが、ワクチン化していないマウスと比較して、少なくとも７０％まで、好ましくは少なくとも８０％まで、より好ましくは少なくとも９０％まで減少することで特徴づけられる。
以上で定義したようなＤＮＡを、ポックスウイルスＤＮＡ内に挿入するための方法、および組換え体ポックスウイルスを得るための方法は、当業者に公知である。組換え体ワクシニアウイルスにおいて、本発明にしたがったＤＮＡの発現が、好ましくは、しかし排他的ではなく、ポックスウイルスプロモーターの、より好ましくはワクシニアウイルスプロモーターの転写制御下である。本発明にしたがったＤＮＡの挿入は、好ましくは、ウイルスゲノムの非必須領域内である。本発明の他の好ましい実施様態において、異種核酸配列を、（第ＰＣＴ／ＥＰ９６／０２９２６号明細書にて開示された）ＭＶＡゲノムの天然に存在する欠失部位にて挿入する。
好ましい実施様態において、本発明は、数種のフラビウイルスまたはフラビウイルスセロタイプに対するワクチン化のための、本発明にしたがったＤＮＡによって、または本発明にしたがったベクターによってコードされたＮＳ１タンパク質またはその部分の実用性に関する。本発明にしたがったＮＳ１タンパク質またはその部分の定義に関しては、参考としては、ＮＳ１をコードしているＤＮＡが、前記ＤＮＡから発現した産物によって定義された、以上の記述部分である。本発明にしたがったタンパク質に関する以下の要約はしたがって、本発明の制限としては認識されるべきでない。まとめとして、ＮＳ１タンパク質は、任意のフラビウイルスによってコードされた単離ＮＳ１タンパク質またはその部分でありうる。ＮＳ１タンパク質またはその部分は、好ましくはデングウイルス、より好ましくはデングウイルスセロタイプ２から由来する。タンパク質は、ウイルスＮＳ１タンパク質またはその部分のアミノ酸配列のみを含みうる。好ましい実施様態において、ＮＳ１タンパク質は、タンパク質の効果的な発現のために必要な追加アミノ酸を含みうる。そのようなアミノ酸／アミノ酸配列に関する例は、以上で示しており、追加ＡＴＧコドンによってコードされたタンパク質のＮ−末端におけるメチオニン、およびＮＳ１タンパク質またはその部分の糖付加のためのシグナル配列としてはたらく、Ｅ−タンパク質のＣ−末端から由来するアミノ酸配列である。他のシグナル配列もまた、本発明の範囲内である。他の実施様態において、ＮＳ１アミノ酸配列またはその部分は、他のタンパク質／ペプチドに融合可能である。融合パートナーに関する例としては、タグのようなタンパク質の同定を可能にする配列、または他のフラビウイルスタンパク質またはその部分である。
以上で説明したように、本発明の発明者らは、１つのフラビウイルスの本発明にしたがったＮＳ１タンパク質またはその部分が、他のフラビウイルスのＮＳ１タンパク質に対する免疫応答を誘発することを発見した。以上で指摘したように、「フラビウイルス」は、好ましくは蚊媒介性フラビウイルスである。言い換えれば、本発明の発明者らは、他の実施様態において、１つの蚊媒介性フラビウイルスの本発明にしたがったＮＳ１タンパク質またはその部分が、ワクチンが由来する蚊媒介性フラビウイルスのＮＳ１タンパク質に対する、およびまた他の蚊媒介性フラビウイルスに対する免疫応答を誘発することを発見した。したがって、蚊媒介性フラビウイルスから由来するワクチンは、１つまたはそれ以上の蚊媒介性フラビウイルスに対するワクチンとして有用である。本明細書の文脈中の語句「フラビウイルスから由来したベクター（ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａ Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）」または同様の語句は、以上で定義したようなベクター（たとえばポックスウイルスベクターまたはプラスミド）が、以上で定義したようなＤＮＡを含むことを意味する。したがって、この語句は、ベクターの挿入部分を意味し、ベクター骨格を意味しない。「フラビウイルスに由来したベクター」の例は、ポックスウイルスプロモーター、フラビウイルスＮＳ１タンパク質またはその部分を含む発現カセットを含む、ＭＶＡのような、ポックスウイルスベクターであって、その際フラビウイルスＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている配列は、ＡＴＧコドンおよび糖鎖形成シグナル配列が上方にあり、前記コード配列は翻訳の終止コドンにて終止する。
したがって、ＤＮＡ、ベクターまたはＮＳ１タンパク質またはその部分でのワクチン化は、広い範囲のフラビウイルスまたは少なくともフラビウイルスセロタイプに対する、単一サブユニットワクチンとして有用である。フラビウイルスまたはフラビウイルスセロタイプからのＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしているＤＮＡまたはベクター、または前記フラビウイルスまたはセロタイプからのＮＳ１タンパク質またはその部分はしたがって、それぞれ他のフラビウイルスおよびフラビウイルスセロタイプに対するワクチン接種のためのワクチンとして使用することができる。たとえば、デングウイルスセロタイプ２から由来したワクチンは、１つ、２つまたはすべてのセロタイプ１、３および４に対するワクチンとして、ならびセロタイプ２に対するワクチンとして使用可能である。さらに、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、黄色熱ウイルスのような、他のフラビウイルスに対して、個体を保護するためにも、さらに有用であり得る。
好ましい実施様態において、本発明にしたがったＤＮＡをワクチンとして使用する。本発明でのように、真核細胞発現カセットを含む裸のＤＮＡの投与、とりわけ、ＤＮＡの筋肉内注射が、発現カセットによってコードされたタンパク質の発現を導くことは、当業者によって知られている。タンパク質は、免疫システムに暴露され、特定の免疫応答が起こる。
ワクチン接種（ワクチン化）のために使用される、ワクシニアウイルスに基づくワクチン、とりわけＭＶＡ−ＢＮに基づくワクチンを、凍結乾燥状態で保存することが、とりわけ好ましい。１つのフラビウイルスのＮＳ１タンパク質によって誘発される、それぞれ異なるフラビウイルスおよびフラビウイルスセロタイプのＮＳ１タンパク質に対する、免疫応答並びに免疫応答の交差反応の割合は、ワクチン化に使用されるウイルスを、凍結乾燥ウイルスとして保存したときに、とりわけ高いことが実施例において示されている。したがって、ワクチンショットは、好ましくは、製剤化においてウイルスの段階的凍結乾燥によって産生することが可能である。この製剤（処方）は、生体内投与に好適な、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースまたはポリビニルピロリドンのような追加添加物、または抗酸化剤、不活性気体、安定剤、または組換え体タンパク質（たとえば ヒト血清アルブミン）を含みうる。凍結乾燥に好適な典型的なウイルス含有処方は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１８．９ｇ／ｌデキストラン（ＭＷ３６０００−４００００）、４５ｇ／ｌスクロース、０．１０８ｇ／ｌ Ｌ−グルタミン酸一カリウム塩一水和物 ｐＨ７．４を含む。凍結乾燥の後、ついでガラスアンプルを密封し、４℃〜室温の間で、数ヶ月間保存可能である。しかしながら、必要性がない限り、アンプルは、好ましくは−２０℃以下の温度で保存する。ワクチン化のために、凍結乾燥物を、水、生理食塩水またはＴｒｉｓ緩衝液のような水性の溶液０．１〜０．５ｍｌ中に溶解可能であり、そして、全身または局所いずれかで、すなわち、非経口、筋肉内または実施者に公知の他の任意の投与経路にて投与可能である。投与の様式、投与の用量と回数は、公知の様式で当業者によって最適可能である。ポックスウイルスベクターに対してもっとも好ましいのは、皮下または筋肉内投与である。もっとも好ましくは、ワクチン化は、たとえば３〜５週間の間隔での、２ワクチンショットの投与によって実施する。
ワクチンが、本発明にしたがったＤＮＡを含むＭＶＡ−ＢＮベクターまたはその誘発体である場合、本発明の特定の実施様態は、第一バイアル／容器内における第一ワクチン化（「初回（ｐｒｉｍｉｎｇ）」）のための、および第二バイアル／容器内における第二ワクチン化（「追加 （ｂｏｏｓｔｉｎｇ）」のための、本発明にしたがったＭＶＡ−ＢＮウイルスベクターを含むワクチン化のためのキットに関する。
ワクチンが、以上で定義したようなＤＮＡを含むＭＶＡ−ＢＮベクターまたはその誘発体である場合、本発明の特定の実施様態は、第一接種（初回接種）（「初回接種」）および第二接種（「追加 接種」）における、治療的に効果的な量のワクチンの接種に関する。初回接種と追加 接種の間の間隔は、たとえば２〜１２週間、好ましくはたとえば３〜６週間、より好ましくはたとえば約３週間である。ワクチン化に使用するウイルス量は、少なくとも１×１０２ＴＣＩＤ５０、好ましくはたとえば１×１０７ＴＣＩＤ５０〜１×１０９ＴＣＩＤ５０であるべきである。さらに、本発明の特定の実施様態は、第一バイアル／容器内における第一ワクチン化（「初回（ｐｒｉｍｉｎｇ）」）のための、および第二バイアル／容器内における第二ワクチン化（「追加 （ｂｏｏｓｔｉｎｇ）」のための、本発明にしたがったＭＶＡ−ＢＮウイルスベクターを含むワクチン化のためのキットに関する。
したがって、本発明は、ワクチン実施様態において、以上で定義したようなＤＮＡ、ベクターまたはＮＳ１タンパク質またはその部分を含むワクチン、および、ワクチンの調製のための、前記ＤＮＡ、ベクターまたはタンパク質の使用に関する。好ましい実施様態にしたがって、本発明は、ワクチンの調製のための、前記ＤＮＡ、ベクターまたはタンパク質の使用に関し、その際ＮＳ１タンパク質またはその部分、ＤＮＡまたはベクターによってコードされたＮＳ１タンパク質またはその部分が、１つのデングウイルスセロタイプより由来し、前記ＤＮＡ、ベクターまたはＮＳ１タンパク質またはその部分が、２つ、３つまたはすべてのデングウイルスセロタイプに対するワクチンとして使用される。もっとも好ましくは、デングウイルスセロタイプは、セロタイプ２である。
本発明はさらに、接種が必要である、ヒトを含む動物に、以上のようなＤＮＡ、以上のようなベクター、または以上のようなＮＳ１タンパク質またはその部分を接種させることを含む、フラビウイルス感染の処置または予防のための方法に関する。とりわけ、本発明は、以上のような方法に関し、その際、ＮＳ１タンパク質またはその部分、またはＤＮＡまたはベクターによってコードされたＮＳ１タンパク質またはその部分が、１つのデングウイルスセロタイプより由来し、前記ＤＮＡ、ベクターまたはＮＳ１タンパク質またはその部分が、２つ、３つまたはすべてのデングウイルスセロタイプに対するワクチンとして使用される。
核酸又はＮＳ１タンパク質またはその部分が由来する、蚊媒介性フラビウイルスに対する、および少なくとも１つの他の蚊媒介性フラビウイルスに対するワクチンの調製のための、
−転写調節要素および、少なくとも蚊媒介性フラビウイルスのＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている配列を含む、発現カセットを含む核酸。
−前記核酸を含むベクター、および／または
−前記フラビウイルスのＮＳ１タンパク質またはその部分、
の使用。
核酸又はＮＳ１タンパク質またはその部分が由来する、前記蚊媒介性フラビウイルスが、デングウイルスである、前記のような使用。
すべてのデングウイルスセロタイプに対する、そして任意に少なくとも１つの他の蚊媒介性フラビウイルスに対する、ワクチンの調製のための、
−転写調節要素および、少なくともデングウイルスセロタイプのＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている配列を含む、発現カセットを含む核酸。
−前記核酸を含むベクター、および／または
−前記デングウイルスセロタイプのＮＳ１タンパク質またはその部分、
の使用。
核酸又はＮＳ１タンパク質またはその部分が由来する、前記デングウイルスが、デングウイルス セロタイプ２である、前記のような使用。
前記ポックスウイルスベクターが、修飾ワクシニアウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ；ＭＶＡ）、とりわけ、番号第Ｖ０００８３００８号にて、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託されたＭＶＡ−ＢＮまたはその誘発体である、前記のような使用。
接種を必要としているヒトを含む動物に、
−転写調節要素および、少なくとも蚊媒介性フラビウイルスのＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている配列を含む、発現カセットを含む核酸、
−前記核酸を含むベクター、および／または
−前記フラビウイルスのＮＳ１タンパク質またはその部分、
を接種させることを含む、フラビウイルス感染の処置または予防のための方法であって、前記フラビウイルス感染が、核酸又はＮＳ１タンパク質またはその部分が由来する、蚊媒介性フラビウイルスによる感染、および／または他の蚊媒介性フラビウイルスによる感染である、方法。
核酸又はＮＳ１タンパク質またはその部分が由来する、前記蚊媒介性フラビウイルスが、デングウイルスである、前記のような使用。
接種を必要としているヒトを含む動物に、
−転写調節要素および、少なくともデングウイルスセロタイプのＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている配列を含む、発現カセットを含む核酸、
−前記核酸を含むベクター、および／または
−前記デングウイルスセロタイプのＮＳ１タンパク質またはその部分、
を接種させることを含む、フラビウイルス感染の処置または予防のための方法であって、前記フラビウイルス感染が、核酸又はＮＳ１タンパク質またはその部分が由来する、デングウイルスセロタイプによる感染、および／または他のデングウイルスセロタイプによる感染および／または他の蚊媒介性フラビウイルスによる感染である、方法。
前記ポックスウイルスベクターが、修飾ワクシニアウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ；ＭＶＡ）株である、前記のような方法。
前記ポックスウイルスベクターまたは薬学的調合物が、第一接種（初回接種）「初回接種」および第二接種「追加 接種」にて、治療的に効果的な量で投与される、前記のような方法。
転写調節要素および、少なくともフラビウイルスＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている配列を含む、発現カセットを含むＤＮＡを持つポックスウイルスベクターであって、前記ポックスウイルスが、番号第Ｖ０００８３００８号にて、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託されたＭＶＡ株ＢＮまたはその誘発体である、ポックスウイルスベクター。
フラビウイルスＮＳ１タンパク質またはその部分をコードしている配列に、ＡＴＧコドンおよび糖鎖形成シグナル配列が上方に存在し、前記コード配列が、翻訳の終止コドンによって終止する、前記のようなポックスウイルスベクター。
第一バイアル／容器内における第一接種（初回接種）（「初回接種」）のための、および第二バイアル／容器内における第二接種（「追加接種」）のための、前記のようなポックスウイルスベクターまたは前記のような薬学的調合物を含む、初回／追加免疫のためのキット。
図面の簡単な説明
図１Ａ：
本発明において例として使用したコンストラクトの、デングＮＧＣ株「シグナル配列＋ＮＳ１」ｃＤＮＡタンパク質コード配列。通常の文脈におけるＮＳ１遺伝子の開始を、矢印によって示す。重要な特徴は、ＡＴＧ開始コドンおよび終止コドン（本例では「ＴＡＧ」）の添加である。ヌクレオチド配列数字は、ＮＧＣ株ゲノム中の位置を意味する（Ｇｅｎｂａｎｋ委託番号第ＡＦ０３８４０３号）。図１Ａにおけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＳＥＱ：ＩＤ Ｎｏ．５に相当する。アミノ酸は別に、ＳＥＱ：ＩＤ Ｎｏ．６として示す。
図１Ｄ：
上段：デングＮＧＣ株ＮＳ１アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＦ０３８４０３号のデングＮＣＧポリタンパク質のアミノ酸７７６〜１１２７）のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性プロット。ゼロより上の値＝疎水性。
下段：Ｅタンパク質のＣ−末端の最後の２８アミノ酸から由来するシグナル配列を含む、デングＮＧＣ株ＮＳ１アミノ酸配列（アミノ酸７４８〜７７５）の、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性プロット。全アミノ酸配列は、この株に関して、「ＡＴＧ」開始コドンにて開始するが、終止コドンを欠く、デングＮＣＧポリタンパク質（Ｇｅｎｅｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ 第ＡＦ０３８４０３号）のアミノ酸７４８〜１１２７を表している。Ｓｉｇ＝シグナル配列。ゼロより上の値＝疎水性。
図２：
「ポックスウイルスプロモーター＋シグナル配列＋ＮＳ１」発現カセットのヌクレオチド配列。図２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＳＥＱ：ＩＤ Ｎｏ．９に相当する。アミノ酸は、ＳＥＱ：ＩＤ Ｎｏ．１０として別に示す。簡単に記すと、最小のポックスウイルス早期／後期プロモーター要素が、デングウイルスセロタイプ２のＮＳ１タンパク質の発現を制御し、その際、ＮＳ１タンパク質のＮ−末端は、Ｅ−タンパク質の２８Ｃ−末端アミノ酸に融合する。翻訳は、核酸配列内へ挿入されたＴＡＧ終止コドンにて終止する。
図４：
すべての３匹のウサギに関する、免疫後血清滴定の、エライザ（ＥＬＩＳＡ）吸光度（吸収）読み取りのプロット。
図５：
エライザ交差反応研究。第３８日（上部）および第６６日（下部）のウサギ血清の、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４、ＪＥＶおよびＷＮＶが感染した細胞の溶解物との交差反応を、エライザアッセイで試験した。
例１：
ｍＢＮ０７の構築
１．ＮＳ１抗原の詳細（図１）
本実施例は、ニューギニア（Ｎｅｗ Ｇｕｉｎｅａ）Ｃ株−ＮＧＣ株から由来するセロタイプ２のＮＳ１に関する（例：Ｇｅｎｂａｎｋ配列第ＡＦ０３８４０３号）。フラビウイルスのＮＳ１タンパク質は、ポリタンパク質前駆体の部分として産生されるので、相当するＤＮＡ内のＮＳ１遺伝子は、「ＡＴＧ」開始コドンが上方に存在しない。
したがって、ＮＳ１タンパク質をコードしているｃＤＮＡ配列は、「ＡＴＧ」開始コドンの添加が必要でなければならない。ついで、新規に合成されたＮＳ１タンパク質が、小胞体中で糖付加されるように、シグナル配列を付加（添加）する。最終的に、タンパク質コードカセットは、終止コドンが必要であり、この実施例では、タンパク質コードｃＤＮＡ配列の３’末端に、ＴＡＧを添加した。本発明で使用した実施例において、「ＡＴＧ＋シグナル配列」要素が、Ｅタンパク質の疎水性Ｃ末端から由来した（最後の２８アミノ酸、ＮＧＣに関して、アミノ酸Ｍ（ＡＴＧ）によって開始）。
ＲＴ−ＰＣＲ産物をついで、多くの市販されている入手可能な細菌クローニングプラスミドに存在する任意のマルチクローニングサイト（多重クローニング部位）のＢａｍＨＩ部位内にクローン化可能であり、ただし本実施例では、ｐＡＦ７内にクローン化して、ｐＡＦ７Ｄ２ＮＳ１を作製した。ｐＡＦ７Ｄ２ＮＳ１に関する配列の詳細に関しては、図１Ｂおよび１Ｃを参照のこと。図１Ｄは、ＮＳ１アミノ酸配列、およびＥタンパク質のＣ−末端アミノ酸コード配列からの付加（添加）シグナル配列を含むＮＳ１の、疎水性プロットを示している。短いＮ−末端疎水性ドメインが、シグナル配列を示している。
２．ＮＳ１発現カセットの詳細（図２）
カナリア痘ポックス、鶏痘ポックス、ワクシニアまたはＭＶＡのようなポックスウイルスベクターからのこの「シグナル配列＋ＮＳ１」を発現するために、ポックスウイルスプロモーターが、本ｃＤＮＡの５’末端に添加される必要がある。ポリアデニル化シグナル配列は、すべてのポックスウイルス合成ＲＮＡが、この機能を実施するために、ポリＡ添加シグナル配列を必要としない、ウイルスがコードした酵素によってポリアデニル化されるので、必要ない。このカセットの発現のために、任意のポックスウイルスプロモーターが使用可能である。図２およびＳＥＱ：ＩＤ Ｎｏ．９および１０は、本発明の実施例として使用した、「ポックスウイルスプロモーター＋シグナル配列＋ＮＳ１」カセットのヌクレオチド配列を示している。
ＰＣＲプライマーはＰｓプロモーターを持つ。
ｏＢＮ３３８：５’−ＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＧＴＡＧＡＣＴＴＡＡＴＴＡ（３０マー）（ＳＥＱ：ＩＤ Ｎｏ．１）
ｏＢＮ３４５：
５’−ＣＡＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＣＧＡＴＡＡＴＡＣＣＡＴＧＧ−３’（ＳＥＱ：ＩＤ Ｎｏ．２）
（下線ヌクレオチドは、ポックスウイルス最小プロモーター配列を表している。）
最初の５サイクルのための、ＰＣＲ増幅反応に関するアニーリング温度は、ｏＢＮ３４５のクローニングベクター内の相同配列に結合するヌクレオチド配列より計算した。
３．ＭＶＡ内へのＮＳ１発現カセットの組み込み
ＰＣＲ増幅産物の、切断され、平滑末端化されたプラスミドｐＢＮＸ０７（図３ａを参照のこと）のＸｈｏＩ部位への平滑末端クローニングにより、プラスミドｐＢＮ４１（図３ａを参照のこと）が形成した。ｐＢＮ４１は、相同組換えによって、ＭＶＡの欠失部位２内へ「ポックス プロモーター＋シグナル配列＋ＮＳ１」カセットを組み込むためのベクターである。
ｐＢＮ４１（図３ａを参照のこと）の必須の特徴は、以下のようである。
−プラスミド骨格は、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−プラス（Ｇｅｎｂａｎｋ ＶＢ００７８）である。
−Ｄ２Ｆ１：欠失２フランク１相同組換えアーム。これは、ＭＶＡ Ｇｅｎｂａｎｋ配列Ｕ９４８４８の２０１１７〜２０７１７のヌクレオチド配列を表している。
−ＰＰｒ：ポックスウイルスプロモーター
−ＮＰＴ ＩＩ：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質コード配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｖ００６１８のタンパク質コード配列）
−ＩＲＥＳ：脳心筋炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）からの内部リボソーム侵入配列（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ１６８０２）
−ＥＧＦＰ：増強グリーンフルオレセンスタンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）コード配列（タンパク質コード配列−Ｇｅｎｂａｎｋ配列Ｕ５７６０９からのヌクレオチド６７５〜ヌクレオチド１３９４）
−ＮＳ１：デングＮＧＣ株からの「シグナル配列＋ＮＳ１」タンパク質コード配列
−Ｄ２Ｆ２：欠失２フランク２相同組換えアーム。これは、ＭＶＡ Ｇｅｎｂａｎｋ配列Ｕ９４８４８の２０７１９〜２１３４３のヌクレオチド配列を表している。
−ＡｍｐＲ：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのアンピシリン耐性遺伝子
３．１ 相同組換えによる、ＭＶＡの欠失部位内へのデング「ポックスプロモーター＋シグナル配列＋ＮＳ１」の組み込み
３．１．１ 相同組換えによる、ＭＶＡゲノム内への組み込み
上記組み込みベクターｐＢＮ４１を使用して、ｐＢＮ４１のフランク１とフランク２アーム、およびＭＶＡゲノム内の相同標的配列間の相同組換えによって、ＭＶＡゲノム内へ、デングＮＳ１発現カセット＋さらにレポーターカセット（Ｐｏｘプロモーター＋ＮＰＴＩＩ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ）を挿入する。これは、先に低い感染多重度（ＭＯＩ、たとえば０．０１感染ユニット／細胞）で、ＭＶＡを先に感染させた、ニワトリ胎児繊維芽細胞（ＣＥＦ）内へ、直線化組み込みベクターをトランスフェクトすることによって達成する。感染後４８時間の時点、または感染が密に達成されたときに、ウイルス抽出物を調製し、望む組換え遺体ＭＶＡ（ｒＭＶＡ）の選別およびクローン精製の準備のために、−２０℃にて保存する。
３．１．２ ｒＭＶＡの選別およびクローン精製
非組換え体ＭＶＡ（空ベクターウイルス）の除去およびｒＭＶＡの増幅は、Ｇ４１８の存在下で、低いＭＯＩにて、コンフルエントな（コンフレント）ニワトリ胎児繊維芽細胞（ＣＥＦ）の感染によって達成する（Ｇ４１８の量は、ＣＥＦ細胞を殺さない、もっとも高い用量を決定するために最適化されなければならない）。ＮＰＴＩＩ遺伝子を含まず、挿入されていない任意のウイルスは、細胞維持培地に加えたＧ４１８の存在下で複製はしない。Ｇ４１８は、ＤＮＡ複製を阻害するが、ＣＥＦ細胞が、静止非複製状態であるので、Ｇ４１８の活性によって影響を受けないであろう。ｒＭＶＡが感染したＣＥＦ細胞は、増幅フルオレセントグリーンタンパク質の発現のために、蛍光顕微鏡下で可視化可能である。
相同組換え段階からのウイルス抽出物を、連続希釈し、Ｇ４１８の存在下で、新鮮なＣＥＦ細胞を感染させるために使用し、低融点アガロースでオーバーレイした。感染２日後、アガロース感染プレートを、緑色感染細胞の単一叢（ｓｉｎｇｌｅ ｆｏｃｉ）に関して、蛍光顕微鏡下で観察する。これらの細胞をマークし、細胞の感染叢を含むアガロースプラグをとり、無菌細胞保持培養液を含む１．５ｍｌ微小遠心チューブに入れる。ウイルスを、チューブを３回、−２０℃にて凍結融解することによって、アガロースプラグより放出させる。
もっともよいクローンまたはクローン類をさらに、ＰＣＲ解析によって、空のベクターの汚染の兆候がないまで（３〜３０ラウンドのクローン精製）、アガロース下でクローン精製する。これらのクローンを次いで、正確な挿入配置、プロモーター外来遺伝子カセットの配列確認、およびＲＴ−ＰＣＲによる発現解析のための、さらなる厳格な試験のために増幅する。これらの解析の後、ただ１つのクローンを、Ｇ４１８選別下、さらに増幅し、さらなる特性化および免疫原性試験のために、マスターストックを調製する。
本発明で記述した挿入デングＮＳ１発現カセットを含む組換え体ＭＶＡを、ｍＢＮ０７と名付けた。図３ｂは、ｍＢＮ０７内の挿入外来配列の配置を示している。
４．ＭＶＡによる、真性ＮＳ１の発現
組換え体ＭＶＡ、ｍＢＮ０７からのＮＳ１タンパク質の発現を、非変性条件下での標準のウエスタンブロット解析によって確かめた。よりとりわけ、ＮＳ１発現を、精製ｍＢＮ０７を、哺乳動物組織培養細胞、たとえばＢＨＫ−２１細胞を、１．０感染ユニット／細胞のＭＯＩにて感染させるために使用した後に、解析した。未精製タンパク質抽出物を、感染２４〜３０時間後に、これらの感染細胞より調製し、その際、これらの抽出物の部分を、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）含有、または２−ＭＥを含まないＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルローディング緩衝液と混合した。これらの試料＋陽性対照として、デングＮＧＣ株に感染した細胞（蚊細胞）からのタンパク質抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて、電気泳動分離し、ついで、ニトロセルロース膜上にブロットした。膜を、抗デングＮＳ１モノクローナル抗体でプローブした。
ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１が、抗デングＮＳ１モノクローナル抗体によって認識されること、およびデング感染細胞からのＮＳ１と同様な、正確な二量体形態を形成すること（２−ＭＥなし未煮沸ｍＢＮ０７レーンを、２−ＭＥなし未煮沸ＤＥＮ２レーンと比較する）が示された。さらに、二量体形態が、変性条件下で、単量体形態に分解されることが示された（２−ＭＥありの煮沸ｍＢＮ０７レーン）。
ｍＢＮ０７に感染した細胞内で発現したＮＳ１はまた、回復患者の保存血清によって、および、ウエスタンブロット解析におけるすべての４つのデングのセロタイプのＮＳ１に交差反応するモノクローナル抗体で、認識される。このことは、ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１が免疫原性であることを示唆している。
例２：
ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１の、セロタイプ２以外のデングウイルスのＮＳ１、および日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）および西ナイルウイルス（ＷＮＶ）のＮＳ１に対する交差免疫原性
１．ｍＢＮ０７から発現したＮＳ１：患者回復期血清に対する応答性
ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１が、先のデングウイルス感染の証拠を持つ個体からの、回復期患者血清によって認識される可能性を試験した。（デングセロタイプ１〜４から調製した、真正抗体に対するイムノブロッティングによって）デングウイルスエンベロープタンパク質に対する抗体を持つ６８人の個体からの血清を、ｍＢＮ０７感染細胞抽出物から、および対照としてＭＶＡ−ＧＦＰ感染細胞抽出物から調製した免疫ブロットストリップに対する試験のために選別した。抗原含有細胞溶解物を、２メルカプトエタノール無しの試料緩衝液で処理し、熱しなかった。試験した６８人の個々の血清の内、６２（９１．２％）が、免疫ブロットにて、ｍＢＮ０７によって発現したＢＮ０７ ＮＳ１に反応した。これらの血清を、すべての４つのデングウイルスセロタイプ、ならびに日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）のＮＳ１に対する反応性に関して解析した。結果は表１に示している。５４の血清が、すべてのデングウイルスセロタイプおよび日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）のＮＳ１に反応し、これらの５４血清のうち５３（９８．２％）がまた、ｍＢＮ０７から発現したＮＳ１と反応した。７血清が、少なくとも１つのデングウイルスセロタイプのＮＳ１に関して特異的であり、ＪＥＶのＮＳ１とは反応しなかった。すべてのこれらの７血清がまた、ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１と反応した。他の７血清は、ＪＥＶのＮＳ１とのみ反応したが、任意のデングウイルスセルタイプのＮＳ１とは反応せず、これらのＪＥＶ−特異的血清のうち２つ（２８．６％）はまた、ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１と反応した。
同一の６８血清をまた、前膜（ｐｒｅｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質に対する反応性によって解析した。本発明者らの実験において、前膜に対する抗体は、ＮＳ１またはＥに対する抗体よりも、非常に特異的である。したがって、デングが感染した患者は、デングウイルス前膜を認識するが、ＪＥＶ前膜は認識しない、およびその逆の抗体を産生する可能性がある。これらの株にそった解析により、個体の感染の歴史のよりよい予測が提供されうる。表２は、２２人の患者からの血清が、真正デング前膜タンパク質のみと反応することを示しており、したがって、これらの２２人の患者が、デングウイルスに対してのみ暴露され、ＪＥＶに対しては暴露されていないことが示唆されている。すべてのこれらの２２の血清が、ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１と反応した。他の２２患者は、デングおよびＪＥＶ両方が先に感染した証拠を持ち、再びすべての２２の血清が、ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１と反応した。このシリーズにて、ＪＥＶのみの先の感染の証拠を持つ２１人の患者がまた存在する（これらの血清は、デングＥに対して交差反応する抗体を有するけれども）。興味深いことに、２１の内１７（８２％）のＪＥＶ反応者は、ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１と反応した。全セットのうち、デングまたはＪＥＶいずれかの前膜タンパク質と反応しなかったものが、ただ３血清、ただし、これらのうち１つがｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１と反応した。このことに関してもっとも可能性のある理由は、抗体タイターが低すぎて、免疫ブロッティングによって検出できないことである。
表２：真正前膜およびＢＮ０７ ＮＳ１に対する抗血清反応の比較。括弧内：試験した陽性試料の数／試験した試料の総数。ＤＥＮ＝デング、ＪＥＶ＝日本脳炎ウイルス。
表２でのデータはまた、ｍＢＮ０７によって発現したＮＳ１と反応しなかった６血清のうち、４つが、デングではなく、ＪＥＶに先に感染した個体からのものであったことを、明らかに示している。残りの２人は、デングまたはＪＥＶいずれかの前膜タンパク質に対する検出可能な抗体を持たず、低いタイターである可能性があった。
２．ウサギのｍＢＮ０７ワクチン化および、デングウイルスおよび日本脳炎ウイルス免疫ブロットおよびエライザアッセイに対する、免疫後血清の試験
３匹の特異的病原体フリーウサギを、以下で示したような、ワクチン化スケジュールにしたがって、皮下経路によって免疫した。各ウサギを、第０日に無菌水にて１ｍｌまで再構成した、１バイアルの凍結乾燥ワクチン（１×１０ｅ８ ＴＣＩＤ５０ ＢＮ０７凍結乾燥ワクチン）によってワクチン化し、ついで第２８日目に再び行った。血液試料を、第一ワクチン化前（前採血）、および再び第二ワクチン化１０日後に採取した。
０日目＝前採血、つづいて第一ワクチン化
２８日目＝第二ワクチン化
３８日目＝血液採取
５６日目＝第三ワクチン化
６６日目＝血液採取
１１２日目＝各ウサギから５０ｍｌ血液採取
２．１ デングセロタイプ２免疫ブロットに対する前採血および免疫後血清の試験
デング２ウイルス抗体および未感染Ｃ６／３６細胞の抗体を、非変性条件下で、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分離した。免疫ブロット解析のために、３８日目の血清（１：２００に希釈）を使用した。結果は、ｍＢＮ０７によるワクチン化に際し、すべての３匹のウサギが、組織培養蚊細胞のデングセロタイプ２感染から産生された、真正ＮＳ１と交差反応する高タイターの高ＮＳ１抗体を産生したことを明らかに示唆した。ワクチン化の前に採取した血清は、免疫ブロットにおいて、どのデングタンパク質に対しても反応しなかった。
各ウサギの免疫後血清に関する滴定結果を、図４で示したようにプロットした。各ウサギ免疫後血清に関する予想されたエンドポイントタイターは、１：１０００である。
２．２ デングウイルスセロタイプ１、３および４、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス免疫ブロットに対する、前採血および免疫後血清の試験
３８日目の各ウサギ血清を、デング１、２、３、４およびＪＥウイルスの免疫ブロットストリップ＋非変性条件下、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分離した未感染Ｃ６／３６細胞の対照ストリップ上で、１：１０００希釈にて試験した。各ウサギ免疫後血清は、デングセロタイプ１、３および４からのＮＳ１、ならびに日本脳炎ウイルス免疫ブロット上のＮＳ１と反応することが示された。
６６日目の各ウサギ血清を、デング１、３、４、ＷＮＶおよびＪＥウイルス抗原の免疫ブロットストリップ＋非変性条件下、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分離した未感染Ｃ６／３６細胞の対照ストリップ上で、１：１０００希釈にて試験した。各ウサギ免疫後血清は、デングセロタイプ１、３および４からのＮＳ１、ならびに日本脳炎ウイルスおよび西ナイルウイルス免疫ブロット上のＮＳ１と反応することが示された。
免疫ブロットアッセイを確認するために、エライザ交差反応アッセイを実施した。マイクロタイタープレートのウェルを、ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−３、ＤＥＮＶ−４、ＪＥＶ、ＷＮＶおよび未感染細胞溶解物で、１：２５０希釈にてコートした。血清は、３８日目（図５Ａ）および６６日目（図５Ｂ）からの血清であった。
免疫ブロットアッセイ、ならびにエライザ実験から、デングウイルスＮＳ１によって誘発された抗体が、すべてのデングセロタイプ、ＪＥＶおよびＷＮＶと交差反応すると結論づけることが可能である。
２．３ 結論
−ｍＢＮ０７ワクチンによって免役したウサギは、真正デングウイルスセロタイプ２ＮＳ１を認識する抗体を誘発した。
−非常に高い免疫応答が、エンドポイントがそれぞれ免疫ブロットアッセイおよびエライザ両方で、１：１０−４および１：１０−３であった場合に観察された。
−ウサギにて誘発された抗体は、すべての他のデングセロタイプ（１、３および４）と交差反応した。
−抗体はまた、ＪＥＶおよびＷＮＶのような、異種ウイルスからのＮＳ１と交差反応した。
３．マウスにおける免疫原性試験
メスアウトブレッドマウスを、以下で示すような異なる量およびスケジュールにて、デングウイルスＮＳ１を発現しているｍＢＮ０７にて、腹膜内経路によって免疫した。ｍＢＮ０８、ｍＢＮ０７に相当するがＮＳ１を発現していないＭＶＡおよびＰＢＳを、対照として使用した。マウスの血清を使用して、マウスで産生された抗体が、それぞれ異なるフラビウイルスセロタイプから、および日本脳炎ウイルスからのＮＳ１タンパク質と、ウエスタンブロット上で反応可能であるかどうかを確認した。対照マウスからの血清は、すべての試験で陰性であった。
次のグループを調べた。
Figure 2005511042
 前記免疫ブロット実験により、以下の結果が得られた。
非常に似た実験を、Ｂａｌｂ／ｃマウスで行った。マウスを、０日目および２１日目にて、１×１０８ ＴＣＩＤ５０ ＢＮ０７（凍結乾燥および水による再構成）の２ショットでワクチン化した。血清を４２日目に得た。１００％の血清が、デングウイルス２ ＮＳ１と反応し、１００％の血清が、すべての４つのデングウイルスセロタイプからのＮＳ１タンパク質と反応し、７５の血清が、ＪＥＶのＮＳ１タンパク質と反応した。１×１０８ ＴＣＩＤ５０非凍結乾燥ＢＮ０７によって得られた結果は以下のようであった。１００％の血清が、すべての４つのデングウイルスセロタイプ由来のＮＳ１と反応した。血清は、凍結乾燥ＢＮ０７によってワクチン化したマウスから得られた血清とは同じ程度ではないが、ＪＥＶからのＮＳ１を認識した。
図１Ａは、本発明において例として使用したコンストラクトの、デングＮＧＣ株「シグナル配列＋ＮＳ１」ｃＤＮＡタンパク質コード配列を示す。 図１Ｂは、デングＮＧＣ株「シグナル配列＋ＮＳ１」タンパク質コード配列を含むプラスミドｐＡＦ７ＮＳ１のダイアグラムを示す。 図１Ｃは、ｏＢＮ４５およびｏＢＮ３３８でのカセットのＰＣＲ増幅のためのプライマー結合部位を示している、プラスミドｐＡＦ７内のＮＳ１カセットのヌクレオチド配列を示す。 図１Ｄの上段：デングＮＧＣ株ＮＳ１アミノ酸配列（デングＮＣＧポリタンパク質Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＦ０３８４０３号）のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性プロットを示し、下段はＥタンパク質のＣ−末端の最後の２８アミノ酸から由来するシグナル配列を含む、デングＮＧＣ株ＮＳ１アミノ酸配列（アミノ酸７４８〜７７５）の、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性プロットを示す。 図２は、「ポックスウイルスプロモーター＋シグナル配列＋ＮＳ１」発現カセットのヌクレオチド配列を示す。 図３ＡはクローンｐＢＮ４１を産生するための、ＮＳ１発現カセットの、ｐＢＮＸ０７の平滑末端化ＸｈｏＩ部位内へのクローニング（平滑末端クローニング）を示す。 図３ＢはＭＶＡの６つの欠失部位の局所を示す、ＭＶＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｕ９４８４８）のＨｉｎｄ ＩＩＩマップ（−Ｊ−＝欠失部位の連結）を示す。 図４はすべての３匹のウサギに関する、免疫後血清滴定の、エライザ吸収読み取りのプロットを示す。 図５はエライザ交差反応研究を示す。

Claims (4)

  1. 転写調節要素、ならびに全フラビウイルスＮＳ１タンパク質または免疫応答を誘発するその部分、および任意に他のペプチド／タンパク質をコードしている配列を含む、発現カセットを含むＤＮＡを含有するポックスウイルスベクターであって、前記ポックスウイルスが、番号第Ｖ０００８３００８号下で、欧州菌培養収集所にて寄託された改変（修飾）ワクシニアウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ：ＭＶＡ）ＢＮ株またはその誘導体（誘発体）であり、前記ペプチド／タンパク質が全Ｅ−タンパク質でない、ポックスウイルスベクター。
  2. 株ＭＶＡ−ＢＮの誘発体が、少なくとも１つの以下の特徴、
    （ｉ）ニワトリ胎児繊維芽細胞（ＣＥＦ）、幼児ハムスター腎臓細胞株ＢＨＫにおいて増殖複製（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）ができること、ただし、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔにおいては増殖複製ができないこと、
    （ｉｉ）生体内において複製ができないこと、
    （ｉｉｉ）致死チャレンジモデルにおいて、公知の株ＭＶＡ５７５と比較した場合に、より高い免疫原性を誘発すること、および／または
    （ｉｖ）ＤＮＡ−プライム／ワクシニアウイルスブースト法と比較した場合、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブースト法において、少なくとも本質的に同一のレベルの免疫性を誘発すること、
    を持つことによって特徴づけられる、請求項１に記載のポックスウイルスベクター。
  3. 前記ワクチンを、核酸又はＮＳ１タンパク質またはその部分が由来するフラビウイルスまたはフラビウイルスセロタイプに対する、および／または１つまたはそれ以上のフラビウイルスおよび／またはフラビウイルスセロタイプに対するワクチン接種のために使用する、請求項１０に記載のポックスウイルスベクター。
  4. ＮＳ１タンパク質またはその部分が誘導されるフラビウイルスまたはフラビウイルスセロタイプに対する、および／または１つまたはそれ以上のさらなるフラビウイルスおよび／またはフラビウイルスセロタイプに対するワクチンの調製のための、転写調節要素、ならびに全フラビウイルスＮＳ１タンパク質または免疫応答を誘発するその部分、および任意にさらなるペプチド／タンパク質をコードしている配列を含む発現カセットを含むＤＮＡを含有するポックスウイルスベクターの使用であって、前記さらなるペプチド／タンパク質が、全Ｅタンパク質ではない、前記使用。
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