CN115896040A - 鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆及其应用，属于病毒技术领域。本发明首次采用原核表达载体对CIAV毒株双拷贝克隆株进行构建，构建出的原核表达质粒攻毒SPF雏鸡后，发现可获得CIAV活毒株，并且经过验证，证实获取到的病毒液中除CIAV外，不存在其他外源病毒污染，通过多次试验验证了该方法具有可行性。

Description

鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆及其应用

技术领域

本发明涉及病毒技术领域，具体涉及一种鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆及其应用。

背景技术

禽用活疫苗安全性一直是企业、养殖户、监管部门非常重视的问题，为保障疫苗质量安全，《中华人民共和国兽用生物制品规程》规定禽用活疫苗SPF化。自我国禽用活疫苗SPF化以来，疫苗源性外源病毒感染报道减少，但仍有SPF鸡胚生产活疫苗存在病毒污染的报道。李阳等人在多种疫苗中检测到CIAV阳性；毛娅卿等人检测到弱毒疫苗中存在禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)的污染；Ismaila Shittu等人在尼日利亚商用活疫苗中检测到ALV、CIAV等外源病毒的污染；苏奇等人也报道从弱毒疫苗中分离到禽腺病毒4型(Fowl adeno virus serotype 4,FADV 4)毒株。弱毒疫苗中存在的外源病毒污染计量通常是微弱的，但却易引起疾病爆发，造成巨大经济损失。

鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus，CIAV)属于圆环病毒科、环状病毒属成员。作为免疫抑制性病毒，CIAV感染雏鸡后，主要攻击骨髓成红血细胞和胸腺皮质前体T细胞，引起贫血，免疫器官萎缩等典型症状。当鸡群中存在CIAV感染时，免疫抑制使得鸡群感染多种病原的几率增加。当疫苗中存在CIAV等垂直传播性免疫抑制病毒污染时，通过疫苗接种会进一步引起鸡群中免疫抑制病的流行，在降低免疫效率的同时又增大多重感染的几率。虽然已经有多个疫苗中CIAV污染的案例，但是其中CIAV致病性还未见系统报道。究其原因，一方面，多数检测均使用分子生物学方法，没有分离到活的CIAV毒株；另一方面，CIAV缺少复制启动蛋白和颈环结构，难以启动DNA复制，并且难以在动物细胞内增殖扩繁。因此，CIAV体外增殖难度大，难以分离到高滴度的CIAV活毒株。

病毒感染性克隆，是指含有病毒全长基因组的质粒。病毒感染性克隆是用于基础病毒学研究的重要工具。目前已有关于CIAV安徽分离株感染性克隆构建的报道，但其是将CIAV基因组克隆到pcDNA3.1真核表达载体中。在获得真核表达质粒后，可将其转染进宿主细胞进行表达，最终获取细胞上清，即目的病毒液。但是，CIAV常用的转染细胞MSB1细胞系转染成功率低，因此，难以通过CIAV感染性克隆转染动物细胞的方式获得高滴度的CIAV活毒株。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆及其应用。本发明以原核质粒为载体，通过双拷贝克隆技术，获得具有感染性的CIAV双拷贝克隆株；然后将CIAV双拷贝克隆株感染动物，从感染动物的病料组织中分离获得纯净的鸡传染性贫血病毒活毒株。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆，由如下方法构建而成：

以鸡传染性贫血病毒基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行扩增，得到第一扩增产物；将第一扩增产物连接至PMD-18T载体上，构建得到鸡传染性贫血病毒单拷贝感染性克隆；

以鸡传染性贫血病毒基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物进行扩增，得到第二扩增产物；将第二扩增产物连于BamHⅠ酶切后的鸡传染性贫血病毒单拷贝感染性克隆上，即构建得到鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆。

优选的，利用同源重组技术将第二扩增产物连于BamHⅠ酶切后的鸡传染性贫血病毒单拷贝感染性克隆上。

本发明的第二方面，提供上述鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆在制备CIAV拯救病毒液中的应用。

上述应用中，将所述鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆感染雏鸡，获得阳性感染的肝脾病料，研磨获得组织匀浆，与RPMI-1640培养基混合，离心后收集上清，将上清用0.22μm的滤器过滤除菌，获得CIAV拯救病毒液。

优选的，将组织匀浆与RPMI-1640培养基按照体积比1:10的比例进行混合。

优选的，离心转速为12 000r/min，离心时间为2min。

本发明的第三方面，提供上述鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆在CIAV感染与致病机制研究中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次采用原核表达载体对CIAV毒株双拷贝克隆株进行构建，构建出的原核表达质粒攻毒SPF雏鸡后，发现可获得CIAV活毒株，并且经过验证，证实获取到的病毒液中除CIAV外，不存在其他外源病毒污染，通过多次试验验证了该方法具有可行性。

与采用真核载体构建双拷贝克隆株相比，原核表达载体在动物体内表达量高，且不含抗性基因，使用更为安全。

(2)本发明构建的双拷贝感染性克隆中，是插入两段CIAV的全基因组序列。考虑到CIAV病毒的双股闭合环状特征，本发明设计两对引物，从存在CIAV污染的疫苗中，扩增出具有不同起点及不同终点的两段CIAV全长序列，借助两段序列上共有的BamHⅠ酶切位点，通过基因重组技术获取双拷贝的CIAV克隆株。

附图说明

图1：本发明的鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆的构建技术路线。

图2：本发明的鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆的BamHⅠ酶切验证结果；图中，M为DL 5 000bp DNA Marker；泳道1为PMD-18T-D(CIAV-NDV2020)；泳道2为PMD-18T-D(CIAV-NDV2020)的XcmⅠ内切酶酶切验证结果。

图3：鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆攻毒组SPF临床症状；左图：接种鸡表现精神沉郁；右图：翅下出血症状。

图4：攻毒鸡肝脾核酸三段引物验证结果；图中，M为DL2 000bp DNA Marker；泳道1为阴性对照；泳道2为CIAV-F1/R1阳性对照；泳道3为CIAV-F2/R2阳性对照；泳道4为CIAV-F3/R3阳性对照；泳道5为待检核酸CIAV-F1/R1扩增结果；泳道6为待检核酸CIAV-F2/R2扩增结果；泳道7为待检核酸CIAV-F3/R3扩增结果。

图5：CIAV-NDV2020拯救病毒液接种细胞形态图及IFA阳性验证图；A.MDCC-MSB1空白细胞；B.CIAV-NDV2020拯救病毒液接种MDCC-MSB1细胞产生病变；C.CIAV-NDV2020拯救病毒液接种MDCC-MSB1细胞IFA结果图；D.阴性对照。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如前所述，弱毒疫苗中存在的外源病毒污染易引起疾病爆发，造成巨大经济损失。发明人前期从某鸡新城疫弱毒活疫苗中检出CIAV污染，经分子生物学技术验证该CIAV毒株为一株野毒，将其命名为CIAV-NDV2020，基因组全长2 298bp，(该毒株目前已在NCBI上传，GenBank登录号：MW660821；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW660821)。基因进化树分析结果显示CIAV-NDV2020与中国株HLJ15125(KY483139)亲缘关系最近，同源性为99.6％，对其编码氨基酸序列进行比对分析，根据病毒VP1蛋白氨基酸序列关键位点推测CIAV-NDV2020显示出强致病性及高复制能力特点。

为证实分离株在体内的分子生物学特征表现、揭示弱毒疫苗中存在CIAV污染的潜在威胁，本发明通过将双拷贝CIAV分离株全基因组串联载入PMD-18T载体获得感染性克隆株，将克隆株在一日龄SPF鸡体内完成发病模型的构建，拯救成功的病毒液在MDCC-MSB1细胞上验证CIAV分离株具有的复制特性，证实SPF CIAV分离株具有强致病力及复制能力，为进一步探究鸡传染性贫血病毒的致病机理、分子生物学特性奠定基础，并提示疫苗生产企业加强对CIAV等垂直传播性病毒的监测和预防，以期降低疫苗中外源病毒污染风险。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件；或者按照制造厂商建议的条件。

实施例1：鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆的构建

利用两端添加无意义碱基序列方法设计和合成了用于构建CIAV-NDV2020感染性克隆的引物P-CIAV-F/R(表1)，以CIAV-NDV2020阳性核酸为模版进行全基因组扩增，扩增产物经凝胶回收纯化后连接至用BamH I酶切后的PMD-18T载体上进行单拷贝克隆株PMD-18T-S(CIAV-NDV2020)的构建。利用添加了BamHⅠ酶切位点的上下游引物B-CIAV-F/R(表1)对CIAV-NDV2020阳性核酸进行另一轮全基因组扩增，将凝胶电泳图中阳性条带回收，回收产物利用同源重组技术连于BamHⅠ酶切后的PMD-18T-S(CIAV-NDV2020)。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，借助CAV-COM-2F：5’-CGAGTACAGGGTAAGCGAGCTAAA-3’；CAV-COM-2R：5’-TGCTATTCATGCAGCGGACTT-3’引物验证菌液，提取阳性质粒，获得双拷贝PMD-18T-D(CIAV-NDV2020)。

表1.CIAV-NDV2020扩增用引物

利用XcmⅠ内切酶对双拷贝克隆株进行酶切，以DL5000 DNA Marker为标尺，双拷贝质粒为比对，进行凝胶电泳，验证双拷贝感染性克隆株的稳定性。电泳结果显示在2300bp和5 000bp左右出现两条差异显著的酶切产物片段(图2)，证实双拷贝构建成功PMD-18T-D(CIAV-NDV2020)。

实施例2：CIAV重组病毒的拯救及检测

28只1日龄SPF雏鸡购自济南赛斯家禽科技有限公司，随机分为接种组和空白对照组，每组14只。将实施例1构建的PMD-18T-D(CIAV-NDV2020)感染性克隆质粒经由腿肌注射的方式感染攻毒组雏鸡，接种剂量为100μɡ/kɡ，空白对照组注射100μL/kɡPBS进行比对。

于7d.p.i.时观察到接种组鸡出现典型的贫血症状并有部分鸡呈现典型的翅下出血(图3)。应用抗体检测试剂盒对接种组和空白对照组的血清抗体检测结果显示，针对ALV-J、ALV-A、REV、FAdV的血清学检测均呈阴性；但对14d.p.i.、21d.p.i.两个时间节点采集到的实验鸡血液样本通过竞争法酶联免疫吸附技术进行CIAV血清抗体的检测，结果显示实验中攻毒鸡只血清在两个时间节点均可检测到CIAV抗体阳性，阳性率达60％～80％，空白对照组始终为阴性，表明除CIAV外无ALV、REV、FAdV等其它外源病毒污染。

21d.p.i.时剖检全部实验鸡，对肝脏、脾脏多点取样后进行核酸提取，应用三对引物扩增核酸中拟存在的CIAV全基因组，将PCR产物进行凝胶电泳，凝胶成像显示成功扩增到阳性条带(图4)。将三段条带进行回收连于PMD-18T载体进行转化，挑取阳性克隆菌液送测序公司进行序列测定，对反馈结果序列拼接后得到CIAV-NDV2020，证实感染性克隆被成功拯救。

表2.CIAV三段式扩增引物

将验证阳性感染的肝脾病料剪碎研磨获得组织匀浆，与RPMI-1640培养基按照1:10的比例混合，12 000r/min离心2min后收集上清，将上清用0.22μm的滤器过滤除菌，获得病毒滤液，置于-80℃保存备用。

选取生长良好MDCC-MSB1细胞进行计数，以10⁶个细胞/孔将MDCC-MSB1铺于6孔细胞培养板中，每孔接种130μL病毒滤液于37℃、CO₂培养箱中孵育2小时后维持液维持三天后盲传三代，第三代培养物维持七天后，以间接免疫荧光(IFA)法验证细胞感染阳性。观察到CIAV-NDV2020病毒液接种细胞出现细胞边缘不整、内部空泡化等典型病变。普通PCR扩增结果显示前六代次均可检测到CIAV核酸阳性。以鼠源抗CIAV VP3蛋白作为一抗，FITC标记的羊抗鼠作为二抗对第三代培养细胞进行IFA实验，将细胞置于荧光显微镜下进行观察，拍摄到CIAV感染阳性细胞，证实MDCC-MSB1细胞成功感染到CIAV毒株(图5)。同时取病毒滤液进行十倍梯度稀释，取七个稀释梯度以100μL/胚剂量卵黄囊途径接种购自济南赛斯家禽科技有限公司的SPF 7日龄鸡胚，每梯度6胚，于接种后第12日剖取鸡胚肝脾，对肝脾核酸进行PCR扩增，按照Reed-Meunch方法计算其EID50。鸡胚定量结果显示CIAV-NDV2020拯救病毒液病毒载量为10^3.83/100μLEID50。

综上，本发明对CIAV-NDV2020株进行扩增，成功构建出双拷贝感染性克隆，并在动物模型中证实该感染性克隆可以引发CIAV，且阳性核酸测序验证其未发生变异。病毒研磨液接种细胞后可以观察到明显细胞病变，且在盲传6代后，仍可检测到胞内核酸阳性，表明CIAV-NDV2020在细胞中具有强复制能力，证实该毒株VP1蛋白序列139位赖氨酸(K)、144位谷氨酸(E)指示毒株具有强复制能力。对于394谷氨酰胺(Q)指示的强致病能力，和强水平传播特性需要进一步试验进行验证。

本研究中利用同源重组技术构建出CIAV的双拷贝感染性克隆，并在体内获取到未突变的活病毒株，该项技术路线为疫苗中或混合感染病例中CIAV的分离提供技术路线参考。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆，其特征在于，由如下方法构建而成：

以鸡传染性贫血病毒基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行扩增，得到第一扩增产物；将第一扩增产物连接至PMD-18T载体上，构建得到鸡传染性贫血病毒单拷贝感染性克隆；

以鸡传染性贫血病毒基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物进行扩增，得到第二扩增产物；将第二扩增产物连于BamHⅠ酶切后的鸡传染性贫血病毒单拷贝感染性克隆上，即构建得到鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆。

2.根据权利要求1所述的鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆，其特征在于，利用同源重组技术将第二扩增产物连于BamHⅠ酶切后的鸡传染性贫血病毒单拷贝感染性克隆上。

3.权利要求1或2所述的鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆在制备CIAV拯救病毒液中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆感染雏鸡，获得阳性感染的肝脾病料，研磨获得组织匀浆，与RPMI-1640培养基混合，离心后收集上清，将上清用0.22μm的滤器过滤除菌，获得CIAV拯救病毒液。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将组织匀浆与RPMI-1640培养基按照体积比1:10的比例进行混合。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，离心转速为12 000r/min，离心时间为2min。

7.权利要求1或2所述的鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆在CIAV感染与致病机制研究中的应用。

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