CZ20033184A3

CZ20033184A3 - Vakcína proti pravým neštovicím

Info

Publication number: CZ20033184A3
Application number: CZ20033184A
Authority: CZ
Inventors: Richard A. Weltzin; Thomas N. Monath
Original assignee: Acambis Inc.
Priority date: 2001-04-23
Filing date: 2002-04-23
Publication date: 2004-04-14
Also published as: US6723325B1; JP2005503126A; EA007656B1; MA26270A1; IL158549A0; CN1527722A; MXPA03009711A; CZ305819B6; US20060153873A1; HUP0303878A3; EP1381389B1; JP4397591B2; KR20040063083A; WO2002085411A1; BR0209145A; US7115270B2; NZ529265A; ES2546612T3; CA2444747C; ZA200309084B

Description

VAKCÍNA PROTI PRAVÝM NEŠTOVICÍM

Oblast techniky

Předložený vynález se vztahuje na způsob a na kompozice pro očkování proti pravým neštovicím.

Virus varioly, skutečný původce vzniku pravých neštovic, je členem rodu Orthopoxvirus genus, ke kterému rovněž náleží opičí neštovice, plané neštovice a viry kravských neštovic. Nemoc, kterou způsobují viry kmene variola major, je charakterizována malou infekční dávkou (10-100 virů), dlouhou inkubační periodou (průměrně 12 dnů), horečkou, konstitučními symptomy, rychlým postupem vzniku puchýřků, smrtí až do 30 % nakažených osob, a obličejovým zjizvením přežívajících. Nemoc se snadno rozšiřuje od osoby k osobě respiračním způsobem, kontaktem (kapénkami) a snad i prostřednictvím aerosolu.

Pravé neštovice byly během první poloviny dvacátého století jednou z nejvážnějších příčin nemocnosti a úmrtí na celém světě. Ale boj proti nemoci byl vysoce účinný, především v důsledku nedostatku živočišného zázemí viru a systematickým využíváním vakciny (živé vakcíny se sníženou účinností). Vskutku mezi 1967-1977 vyústil globální program pro vymýcení pravých neštovic až do eliminace této přírodní nemoci (Fenner a spol., WHO, Ženeva, s. 1460, 1988). Vzhledem k nepřítomnosti neštovic, a s ohledem na riziko možného nežádoucího návratu nemoci ve spojení s vakcinací, byla ukončena rutinní imunizace děti, nemocničního personálu a vojenských osob, a běžně jsou imunizovány jen osoby pracující v laboratořích s viry kravských neštovic nebo podobnými viry.. Tím způsobem podstatná část světové populace není proti neštovicím imunní. Zbývající populace má jen malou přebývající imunitu, protože vakcinační imunita trvá jen asi 5 let po první vakcinací a po obnovení vakcinace méně než 20 let. Vymýcení pravých neštovic a ukončení vakcinace způsobuje zranitelnost populace ke skrytému útoku nebo k válečnému biologickému ohrožení v případě použití viru varioly. Kdyby podobný případ nastal, rozšířila by se epidemie v celé populaci nekontrolována imunitní barierou (Anon, (redakční sdělení), Lancet 353, 1539, 1999; Henderson, Science 283, 1279-1282. 1999; Henderson a kol., J.A.M.A,, 281, 2127-2137, 1999).

• · · · · ·

Dosavadní stav techniky

Vzhledem k nejistotám obklopujících zprávy o vymýcení pravých neštovic, byla vytvořena zásoba vakcín pro nouzové použití. Např. ve Spojených státech je v současnosti skladováno 155.000 vakcínových ampulek (přibližně 15,5 milionu dávek), vyrobených firmou Wyeth Laboratories pod kontrolou Center for Disease Control and Prevention [Úřad pro kontrolu a prevenci nemocí] - CDC, Atlanta, Georgia, US), jak bylo sděleno na setkání National Vaccines Advisory Committee (Národní poradní výbor pro vakciny) v lednu 1999, kde CDC podal zprávu o stavu uskladněných národních zásob vakcín proti pravým neštovicím. V této době z 15,5 milionu dávek uložených u firmy Wyeth, 3,4 milionu dávek chybělo otestování kvality, 10,3 milionu dávek bylo po expirační době stanovené posledním kontrolním testem pro dobu účinnosti, a pouze zbývající 1,7 miliónu dávek odpovídalo specifikacím (LeDuc, Sdělení National Vaccines Advisory Sommittee, Washington D.C., 11.-12. ledna 1999). Navíc v této omezené dodávce jsou vakciny balené ve violách po 100 dávkách, což omezuje jejich distribuci a zvětšuje pravděpodobnost znehodnocení během nouzového použití.

Navíc kromě zásob uskladněných v US existuje zásoba vakciny (Lister, kmen Elstree), uskladněná v National Institute of Public Health, (Národní ústav veřejného zdraví), Bilthoven, Nizozemí, a určité zásoby vakciny proti pravým neštovicím mají uskladněny i některé jiné země. Tyto zásoby obsahovaly v době vymýcení neštovic zhruba 300 milionů dávek. Lze však předpokládat, že v důsledků problémů se stabilitou při skladování je celková zásoba menší než 50 milionů dávek (Henderson, Science, 283, 1279-1282, 1999).

Podstata vynálezu

Předložený vynález se zabývá stabilními kmeny viru kravských neštovic, které jsou izolovány z kulturních buněk, na kterých byl pěstován Dryvax® a jejichž charakteristika je činí vhodnými pro humánní očkovací vakcinu proti pravým neštovicím. Vynález se tedy zabývá způsobem přípravy těchto kmenů a způsoby jejich využití k prevenci nákazy onemocněním pravými neštovicemi.

Prvním aspektem předloženého vynálezu je klonování oslabeného kmene viru kravských neštovic, izolovaného z kulturních buněk, na kterých byl pěstován Dryvax® a který po podání člověku v dostatečném účinném množství postačí k vytvoření ochranné nebo therapeuticky imunní odezvy proti viru varioly u člověka, a je pro člověka přijatelně oslabený.

Vyklonovaný kmen může např. mít v zásadě stejnou virulenci a/nebo imunogenicitu jako • · ··· ·

O ^w ·

Q ···· ··· ··· ··«

Dryvax®. Výhodně virus kravských neštovic vzniká v zásadě ve stejném nebo větším množství jako Dryvax® při naočkování do buněčné kultury, a/nebo vykazuje v podstatě stejný model štěpení jako Dryvax® při štěpení restrikční endonukleázou.

Vyklonovaný kmen může mít např. v zásadě stejnou virulenci a/nebo imunigenicitu jako kmen virů kravských neštovic ACAM1000 (uložený jako vklad ATCC pod č. PTA-3321 z 19. dubna 2001; viz klon 2 níže) při testování na odpovídajícím živočišném modelu nebo na člověku. Výhodně se takový kmen viru kravských neštovic připraví v podstatě ve stejném nebo větším množství jako kmen kravských neštovic ACAM1000 při naočkování do buněčné kultury, a/nebo má v podstatě stejnou štěpící schopnost jako kmen viru kravských neštovic ACAM1000 při štěpení restrikční endonukleázou. Jedním z příkladů kmene viru kravských neštovic zahrnutý do předloženého vynálezu je ACAM1000 (ATCC vklad č. PTA-3321).

Druhým aspektem předloženého vynálezu je popis farmaceutické kompozice obsahující vyklonovaný kmen viru kravských neštovic, jak je popsáno shora a zde kdekoliv dále a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.

V třetím aspektu předloženého vynálezu je popisován způsob prevence nebo léčení infekce virem varioly u pacienta podáním zmíněné farmaceutické kompozice pacientovi, použití takové kompozice k uvedenému účelu a dále použití takové kompozice k přípravě léčebného prostředku ke zmíněnému účelu. Farmaceutická kompozice může být podávána pacientovi např. skarifikací v množství 1 x 10⁴ až 1 x 10⁶ jednotky vytvářející plak.

Ve čtvrtém aspektu předloženého vynálezu je popisován způsob výroby oslabeného klonovaného kmene viru kravských neštovic, vhodného k použití pro vakcínu. Tento způsob zahrnuje (i) rozmnožení Dryvaxu® v systému buňkové kultury, a (ii) izolaci systému s nakloňovaným kmenem viru kravských neštovic, který vykazuje v podstatě stejnou virulenci, imunogenicitu, růstové charakteristiky při kultivaci nebo při štěpení restrikční endonukleázou jako Dryvax® nebo kmen viru kravských neštovic ACAM1000. Virulence viru kravských neštovic může být přezkoušena např. testem na králičí kůži nebo neurovirulentním testem sajícího myšího mláděte .Růstové charakteristiky kultury mohou být určeny např. za použití humánních diploidních buněk (MRC-5). Výhodně může být virus kravských neštovic identifikován způsobem, při kterém je lidskému pacientovi podáno takové účinné množství, které je schopné u člověka vyvolat imunní ozvu na virus neštovic, a je pro člověka přijatelně avirulentní.

Předložený vynález přináší několik výhod. Např. dříve byla vakcina proti pravým neštovicím • · ··· · • ♦ ♦ · • · · · • · · · připravována inokulací viru kravských neštovic do kůže telat, s následným odškrabem z kůže telat k získání živého viru. Takto získaný surový virus byl před použitím pro vakcinaci humánního adresáta podroben pouze minimálnímu přečištění, a tak byla možnost patogenní kontaminace zachována otevřená. Vakcíny podle předloženého vynálezu jsou připravovány pěstováním na systému kultivovaných buněk, a tento způsob je přijatelný jako Moderní standard pro výrobu vakcín. Protože jsou vysoce přečištěné, eliminují zmíněný problém.

Další výhodou použití klonovaného viru podle předloženého vynálezu je, že změna charakteristiky těchto virů během jejich kultivace a výroby vakcín je v porovnání se směsí virových kmenů nepravděpodobná. Dokázali jsme, že genotyp virů podle předloženého vynálezu je zachován i po opakovaném pěstování a rozmnožování a že v buněčné kultuře nedochází ke kontaminaci a je schopný k přípravě buněčné kultury v množství vhodném pro výrobu vakcín ve velkém množství.

Další skutečnosti a výhody předloženého vynálezu jsou zřejmé z následujícího detailního popisu, z výkresů a nároků.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1A - 1D jsou sérií grafů ukazující výsledky experimentů, při kterých na sající mládě myši byl přenesen klon indikovaných kravských neštovic, preparát polyklonovaného viru kravských neštovic nebo Dryvax®. Je uváděn počet přeživších myší a průměrný čas přežití po odezvě.

Obr. 2 ukazuje výsledky štěpení restrikčním enzymem Hindlll při analýze vakcínového klonu podle předloženého vynálezu v porovnání s preparátem polyklonovaného viru a Dryvaxem®.

Podstata vynálezu

Předložený vynález uvádí oslabený klonovaný kmen viru kravských neštovic, který může být použit při způsobu vakcinace proti pravým neštovicím (tj. viru varioly). Jak je popisováno níže, oslabený klonovaný kmen viru kravských neštovic podle vynálezu lze připravit izolací klonu kravských neštovic z buněčné kultury, ve které byl pěstován Dryvax®. Vynález dále popisuje způsob použití vakciny obsahující virus kravských neštovic podle předloženého vynálezu k prevenci před pravými neštovicemi a rovněž způsob přípravy klonovaného kmene viru kravských neštovic.

Vakcíny podle předloženého vynálezu jsou odvozeny a mají stejnou charakteristiku jako ···· ·

Dryvax® (New York city Board of Health strain, Wyeth Laboratoriem), který je licencován US Food and Drug Administration (FDA) a obsahuje smíšenou populaci virů kravských neštovic vypěstovaných na telecí kůži. Vakcíny musí mít přijatelně oslabenou virulenci pro člověka, který je jimi očkován. Přijatelná hladina oslabení může být např. hladina stejná jako u Dryvaxu®, (tj. nesmí se od něho význačným způsobem statisticky odlišovat) a může být stanovena jakýmkoliv způsobem in vitro nebo in vivo popsaným níže. Jednou z vlastností viru kravských neštovic je jejich neurotropismus, nebo jejich schopnost replikace v buňkách centrálního nervového systému, a zapříčinit tak záněty (tj. encefalitidu). Výborné je, že vakcíny podle předloženého vynálezu nejsou více neurotropní než Dryvax® a nevyvolávají postvakcinační encefalitidu u ošetřených pacientů.

Vakcíny a metodika podle předloženého vynálezu jsou popisovány dále.

Indikace použití

Hlavním smyslem použití vakcín podle předloženého vynálezu je prevence před pravými neštovicemi u populace vystavené nebo potenciálně vystavené pravým neštovicím v důsledku aktu bioterorismu nebo při biologické válce. Účinnost vakcinace podle předloženého vynálezu je výhodně vysoká (> 95 %) a vakcíny chrání jak před rozšiřováním viru od osoby k osobě, tak i při primárním vystavení vysoké dávce aerosolu při použití biologických zbraní. Podle uvedených základních indikací mohou být vakcíny podle vynálezu použity např. k vytvoření nové národní zásoby vakcín proti pravým neštovicím (kravským neštovicím) a výroba může k zajištění kontinuální zásoby s platnou dobou použití vzhledem k prodloužené době použitelnosti pokračovat po celý rok.

Vakcíny však nejsou určeny k rutinnímu používání, vyjma u laboratorních pracovníků, kteří jsou vystaveni nebezpečí nákazy kravskými neštovicemi, planými neštovicemi, opičími neštovicemi, pravými neštovicemi, nebo jinými členy rodu Orthopoxvirus genus. Jinak mohou být vakcíny uvolněny k použití v případě nouzového stavu, vyhlášeného úřadem národní bezpečností a veřejného zdraví. V případech takových okolností, jako je nouzový stav je riziko negativních příhod spojených s vakcinací převáženo potenciálními výhodami individuální ochrany před pravými neštovicemi a celé společnosti před rozšířením této nemoci. Lze předpokládat, že nouzové využití vakcín je obtížné kontrolovat, a že děti vystavené vyššímu riziku postvakcinální encefalitidy a dostávající vakciny je třeba sledovat. Dále je třeba dbát opatrnosti a kontrolovat kontraindikační příznaky při použití vakcín pro osoby s doprovodnými protiindikacemi (výskyt ekzémů, těhotenství a imunosuprese). V těchto případech je důležité, aby vakciny odvozené z buněčných kultur podle předloženého vynálezu nebyly více virulentní než běžně licencovaný výrobek.

• · · · · ·

V závislosti na okolnostech, které nelze předem s určitostí předpovědět, je však třeba učinit závažné rozhodnutí o profylaxi u určitých skupin osob, zahrnující především vojenský personál, civilní lékařské osoby a tzv. „první respondenty“. Základní bezpečnostní podmínkou při použití vakciny uvedeného profilu u těchto skupin je zvýšení uvážlivosti při použití vakcín a zamezení jejich použití u individuí s rizikovým faktorem pro nebezpečné příhody. Za těchto podmínek je hlavním nebezpečím autoinokulace, vznik očních kravských neštovic a případné zavedení infekce, což jsou všechno osobně omezující nebezpečné možnosti. Jinak existuje jen malé nebezpečí náhodné infekce jinými bezprostředními rizikovými faktory.

Je samozřejmé, že se podmínky v zemích nebo na celém světě mění, takže rutinní vakcinace dalších osob populace (tj. dětí), nebo i celé populace, se může objevit jako žádoucí a vakciny podle předloženého vynálezu mohou být použity i v takovém případě.

Způsoby podávání a podávané množství

Vakciny podle předloženého vynálezu jsou připravované vypěstováním požadovaného kmene viru kravských neštovic (tj. kmene ACAM1000; ATCC vklad č. PTA-3321; viz níže) v systému kulturních buněk a přečištěním kultivovaného kmene z uvedeného systému za použití standardních postupů. Např. kmen může být kultivován na diploidních humánních plicních fibroplastových buňkách, jako MRC-5, primárních kuřecích zárodečných fibroplastových buňkách nebo na jiných odpovídajících typech buněk, jak může být rozhodnuto pracovníkem zkušeným v oboru. Kultura může využívat jakýkoliv vhodný systém, jako např. Nunc Cell Factory®.

Vyčištěný virus může být lyofilizován pro pozdější použití nebo může být okamžitě zpracován do farmaceutického roztoku. Zkušeným pracovníkům v oboru jsou dobře známé početné farmaceuticky přijatelné roztoky použitelné pro přípravu vakcín, které jsou snadno upravitelné pro použití podle předloženého vynálezu. (Viz např. Remington's Pharmaceutical Science (18. vydání), vyd. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA). Viry mohou být jednoduše zředěny fyziologicky přijatelným roztokem, jako je sterilní solný roztok nebo sterilní pufrovaný solný roztok, s nebo bez pomocných látek nebo nosiče. Výhodně může farmaceutický roztok obsahovat složku upravující viskozitu (tj. glycerin) a/nebo složku s baktericidálními vlastnostmi (tj. fenol). Vakciny mohou být skladovány při koncentracích 10⁷- 10⁹ jednotek vytvářejících plak (PFU)/ml, např. 10⁸ PFU/ml.

Všechny vakciny vyrobené podle předloženého vynálezu mohou být pacientům podávány • · 0··4 např. skarifikací podle standardních způsobů. Např. ktomu účelu může být použita rozdvojená jehla. Alternativně mohou být vakcíny podávané jinými standardními způsoby, které určí jako vhodné pracovník zkušený v oboru. Např. může být vakcína podávána subkutánní nebo intradermální injekcí, nebo jinou parenterální cestou, jako je intramuskulámí injekce. Množství podávané vakcíny průměrné vzrostlé osobě je např. 1 x 10⁴ až 1 x 10⁶jednotek vytvářejících plak. Ve specifickém případě může být podáno 2,5 x 10⁵ jednotek vytvářejících plak.

Výhodně je vakcinace prováděná před jakýmkoliv vystavením variole, ale vakcinace může být provedena u pacientů, kteří byli variole vystaveni, a to výhodně několik málo dnů po vystavení. Vakcinace může být u dané osoby provedena pouze jednou za život, nebo může být opakována v době zahrnující několik let (tj. 5-10 let), a může být určena pracovníkem zkušeným v oboru.

Identifikace kandidátů vakcíny

Předložený vynález rovněž obsahuje způsoby identifikace kandidátů pro vakcíny kravských neštovic. Kandidáty je možné identifikovat izolací klonovaného kmene z buněčných kultur naočkovaných Dryvaxem® a charakterizací těchto klonů za použití jakéhokoliv analytického postupu in vitro nebo in vivo, jak jsou popisovány níže. Např. může být kandidát kmene pro vakcínu porovnán s rozměrem plaku Dryvaxem®, získaného z buněčné kultury (za použití např. buněk MRC-5), stanovením králičí podkožní virulencí, neurovirulencí sajícího myšího mláděte, neurovirulencí u opice, nebo ochranným modelem odezvy u myši. Přednostní kandidáti jsou ti, jejichž virulence je stejná nebo menší než jako u Dryvaxu®, a také mají růstovou charakteristiku stejnou nebo větší než vykazuje Dryvax®.

V době před předloženým vynálezem byla izolace klonovaného kmene s uspokojivou charakteristikou kandidáta vakcíny nepředpověditelná, protože dlouhá doba přípravy viru kravských neštovic umožnila vznik generace řady podpopulačních variant (tj. genetického hejna) s potenciálně stejnými fenotypickými charakteristikami s řadou variant v původní směsi virové populace. Skutečně před předloženým vynálezem bylo překvapující, pokud se tak stalo.

Vývoj a předklinická charakterizace vakcín podle předloženého vynálezu jsou popisovány v následujícím.

Vývoj a předklinická charakterizace vakcín kravských neštovic

Jak bylo diskutováno shora, Dryvax® je vakcína kravských neštovic licencovaná v současné ·· 9999

9 9 9 9 • 99 · 99

99 době FDA, která byla odvozena od kmene New York City Board of Health (NYCBH) a byla vyráběna do roku 1982 firmou Wyeth-Lederle způsobem používajícím telecí lymfu skotu (viz také ATCC vklad č. VR-325). Dryvax® je složen z živých oslabených virů kravských neštovic a neexistuje jako výrobek na základě buněčné kultury. Přizpůsobili jsme kmen pravých neštovic vakcínovému kmenu viru kravských neštovic pro pěstování za kontrolovaných podmínek pro laboratorní růst kultur na buňkách humánního plicního fibroplastu tak, aby bylo možno využít tuto moderní techniku pro výrobu vakcín. Pro vývoj vakciny z buněčné kultury bylo třeba separovat Dryvax® od potenciálního náhodného znečistění viry při konečném zředění, a tento postup jsme provedli s klonováním a bez klonování, jak je dále diskutováno. Ze směsi variant (genetického hejna) v Dryvaxu® jsme vybrali kandidáty pro vakciny, které mají shodné zvířecí a genomové biologické charakteristiky s licencovanou vakcínou a tak zajistili vysoký stupeň jistoty, že jsou klinicky účinné jako originální výrobek za použití výrobku připraveného pomocí telecí lymfy.

V jedné ze strategií použitých pro adaptaci byl virus kravských neštovic klonován k izolaci viru od možných znečisťujících mikroorganizmů odvozených z telecí kůže. Při použití této strategie bylo izolováno šest klonů. Klonované viry vykazovaly rozličné charakteristiky s větší či menší virulencí při porovnání s Dryvaxem®. S překvapením bylo zjištěno, že při zavedení očekávané směsi variant do Dryvaxu®, měly tři klony shodnou virulenci jako Dryvax® při zkoušce virulence u zvířat a lišily se především v rychlosti růstu v buněčné kultuře. Některé z těchto kmenů, stejně jako jiné se shodnou charakteristikou mohou podle předloženého vynálezu být použity při vakcinaci proti pravým neštovicím.

Podle jiné strategie virus nebyl klonován v očekávání, že virus odvozený tímto způsobem se bude chovat podobně jako kmen, ze kterého byl odvozen. S překvapením jsme zjistili, že kmen připravený bez klonování se choval podobně jako Dryvax® při zkoušce in vitro, ale nevykazuje charakteristiku vakcinového kmene a je skutečně podstatně virulentnější při zkouškách na laboratorních zvířatech. Proto jsme se v našem výzkumném snažení zaměřili na klonované viry s charakteristikou shodnou jakou má vakcinový kmen Dryvax®. Detaily naší charakterizace jsou uvedeny dále.

Dryvax® byl naočkován do buněk kultury MRC-5 a po vyčistění plaku bylo získáno šest klonů virů kravských neštovic. Každý klon by znovu dvakrát překlonován, aby se zajistila klonalita a nepřítomnost kontaminujících nečistot. Dryvax® byl také naočkován do kultury buněk MRC-5 s mnohonásobnou infekcí (MOI) s 0,001 PFU na buňku k odvození neklonovaného (polyklonálního) viru. Tento virus skutečně postupně prošel buňkami MRC-5 dvakrát častěji při nízkém MOI. Všech šest klonů a polyklonální přípravky byly zkoušeny in •4 4444 vitro a in vivo na charakteristiky v rozsáhlých sériích porovnávacích analýz vedle Dryvaxu® . Každý klon a polyklonální preparát byl zvlášť analyzován na morfologii plaku, získaného v buňkách MRC-5, byly provedený zkoušky s restrikční endonukleázou, sledováno vytváření kožních neštovic u králíků a testována neurovirulence u myší. Část klonů byla dále zkoušena na vyvolání ochranné imunity u myší. Cílem bylo vybrat vakcínový kmen ze skupiny Dryvax® s biologickou shodností s Dryvaxem®. Tabulka 1 shrnuje výsledky těchto studií.

Tabulka 1. Charakterizace 7 kandidátů virů kravských neštovic

Výsledky (vztaženy k relativní kvalitativní hodnotě Dryvaxu®)

Zkouška	Dryvax®	Klon 1	Klon 2	Klon 3	Klon 4	Klon 5	Klon 6	Klon 7
Velikost plaku (střed, mm)	0,42	0,42	0,49	0,36	0,65	0,25	0,27	0,46
Výtěžnost v MRC5*	4,0	13,5	7,0	10,6	15,6	4,7	1,5	7,0
Analýza RE		Stejná	Stejná	Stejná	Stejná	Stejná	Stejná	Stejná
Zkouška s kůží králíka		Vysoká	Stejná	Vysoká	Stejná	Vysoká	Stejná	Vysoká
Neurovirulence sající myši		Vysoká	Stejná	Vysoká	Stejná	Vysoká	Stejná	Vysoká
Imunigenicita myši		Nezkou sena	Stejná	Stejná	Stejná	Nezkou sena	Nezkouše na	Nezkou šena

¹PFU/ml x 10⁴

Podle těchto studií mají klony 2 a 4 charakteristiku, ukazující, že tyto klony jsou vhodné pro novou vakcinu proti pravým neštovicím. Klon 6 má rovněž vyhovující charakteristiku, ale neroste v kultuře tak dobře jako klony 2 a 4.

Neurovirulescence sajícího myšího mláděte

Dospělé myši se ukázaly jako nevnímavé k intrakraniální (IC) inokulaci nemodifikovaného Dryvaxu®. Byla proto vyvinuta zkouška využívající sající mládě myši. Sajícímu mláděti myši (ve stáří 3-4 dnů) byl injektován desetinásobně zředěný virus a určen čas přežití po odezvě. Byly provedeny tři zkoušky za použití Dryvaxu® jako standardu. Bylo zjištěno, že sající mláďata myši inokulované IC Dryvaxem® jednotně vykázaly fatální encefalitidu LD₅₀ při ~ 21,0 log₁₀ PFU a střední čas do smrti sedm dní. Způsob provedení zkoušky byl uznán jako vhodný pro porovnání neurovirulescence vakcínových kandidátů se základním Dryvaxem®. Výsledky provedených zkoušek jsou shrnuty v tabulce 2, a počet přežívajících myší a průměrný čas přežití na základě provedených zkoušek je ukázán na obr. 1A - 1D.

Tabulka 2. Neurovirulecence sajících myších mláďat, kandidáti vakcíny kravských neštovic.

•9 9999

	Parametr
Zkouška	Virus	LD_5o'	LD90'	ast^j	(SD)
1	Dryvax®.	1,68	3,03	7,78	(4,19)
	Polyklonální	<1,3	1,94	6,09	(1,14)
	Klon 1	<2,3	<2,3	4,20	(1,03)
2	Dryvax®.	1,3	2,1	6,67	(0,71)
	Klon2	1,55	2,25	6,80	(2,74)
	Klon3	<1,3	<1,3	5,00	(1,16)
3	Dryvax®.	2,4	4,15	8,64	(3,42)
	Klon5	< 1,3	< 1,3	4,08	(1,08)
	Klon 6	1,57	2,47	7,73	(4,03)

¹ 50 % intracerebrální letální dávky na 0,02 ml inokula desátého dne po infekci ² 90 % intracerebrální letální dávky na 0,02 ml inokula desátého dne po infekci ³ Průměrná doba přežití, dny (standardní odchylka) při ~ 10 - 100 LD50

Pro zkoušku virulescence kandidátů vakcíny je možné použít rovněž další zkoušky. Vyvinuli jsme např. zkoušku králičí kožní virulescence. Tato zkouška byla úspěšně vyvinuta za použití intradermální inokulace nezpracovaného Dryvaxu®, při které vznikly dávce úměrná poranění, charakterizovaná erythremou, indurací a v některých případech centrálním zraněním. Jinak může být použita zkouška opičí neurovirulescence. V tomto případě byl zkoušen kandidát odvozený od klonovaného Dryvaxu® proti Dryvaxu® při IC inokulací odstupňovanou dávkou viru.

Vyvinuli jsme dále model pro odezvu u myší při ochranné zkoušce. U tohoto modelu byl kmen WR kravských neštovic zkoušen na odezvu u 6 - 8 měsíců starých myší intranasálním způsobem (IN). Hodnota LD₅o byla ~ 4,5 log₁₀ PF a střední doba do smrti byla 6-7 dnů po odezvě. Zkouška je dostatečně robustní k použití pro studie předklinické odolnosti s novým kandidátem pro vakcínu. Mohou být rovněž použity podobné modely využívající neštovicové orthoviry, jako jsou viry kravských neštovic.

Vhodnost Dryvaxu® a klonů 2 a 4 byla zkoušena jako odezva na vznik ochranné imunity proti kravským neštovicím typu WR u myší. Zkoušen byl rovněž klon 3, aby se zjistilo, zda klon s větší virulencí rovněž zvyšuje imunitní odezvu. Čtyři týdny staré myši byly imunizovány odstupňovanými dávkami každého virového kmene. Viry byly inokulovány do kůže skarifikací s dvojitou jehlou, což je vlastně způsob provádění humánní inokulace Dryvaxem®. Tři týdny po imunizaci byla myším podána dávka 6,5 log₁₀ PFU (100 LD₅₀) virů kravských neštovic typu WR IN způsobem. Byl stanoven podíl přežívajících po 14 dnech po odezvě. U všech kmenu virů byla nalezena ochranná odpověď a všechny klony chránily myši alespoň stejně dobře jako Dryvax®. Neobjevily se rozdíly mezi ochrannou aktivitou jednotlivých klonů. Průměrný čas přežití po různých imunizujících dávkách je shrnut v tabulce 3 a výsledky po podání 50 %ní ochranné dávky (PD₅₀) jsou ukázány v tabulce 4.

Tabulka 3. Doba přežití imunizovaných myší po podání dávky 100 LD₅₀ viru kravských neštovic WR po odezvě.

Imun. Dávka (log₁₀ PFU/ml)	Průměrná	doba	přežití (dny)
Dryvax®	Klon 3	Klon 2	Klon 4
8	14,0	NT	14,0	NT
7	14,0	14,0	14,0	14,0
6	12,0	14,0	12,4	12,4
5	7,6	8,8	7,2	7,0
4	5,2	5,2	7,8	5,4
3	5,6	5,4	5,4	4,8
2	5,2	5,8	5,2	NT

(NT nezkoušeno)

Tabulka 4. 50 %ní ochranné dávky Dryvaxu® a kandidátů pro vakcínu

PD_5o (log₁₀ PFU)
Dryvax®	Klon 3	Klon 2	Klon 4
5,5	5,2	5,4	5,5

Analýza restrikční endonukleázou

K rozhodnutí, zda mezi kmeny jsou genetické rozdíly, byla DNA Dryvaxu® a každého kandidáta pro vakcínu vyčištěna a podrobena digesci restrikční endonukleázou za použití HINDIII. Jak ukazuje elektroforetické analýza digestovaného genomu DNA na obr. 2 nebyly nalezeny žádné rozdíly

Výběr buňkového substrátu

Byla provedena replikační studie Dryvaxu®, sledována výtěžnost na buňkách MRC-5 a na buňkách primárního kuřecího embryového fibroplastu (CEF) a zjištěno, že výsledky jsou na buňkách CEF nižší než na MRC-5, a proto byly buňky MRC-5 vybrány jako vhodný substrát pro vývoj vakcíny. Možné viry mohou být přezkoušeny na CEF nebo jiných buňkách pro porovnání výtěžnosti vakcíny.

Dále byla porovnávána růstová media pro buňky MRC-5. Zjištěno, že media Williams E, minimální základní medium (MEM) a Dulbecco's MEM dávají ekvivalentní výsledky. V ohledu na životnost buněk nebo jejich růst neprokázalo následné obohacení medií fetálním šerem skotu (FBS), nezákladními aminokyselinami, vitaminy a pyruvátem sodným (sodná sůl kyseliny pyrohroznové) žádné výhody oproti mediu s 10 % FBS. Růstová kinetika na MRC-5 byla adekvátní hustotě rozsevu buněk . Nalezená hustota rostoucích buněk byla 2 ·· ···· • ·

Ί2 ♦··· ♦·· ··· ·<· x 10⁴ buněk/cm². Doba štěpení byla určena na 3 - 5 dní a zdvojení populace/štěpu byla nalezena úměrná 1 - 1,5. Byl definován způsob výroby buňkových bank a expanze růstu virů. Standardní způsob trypsínizace se ukázal vhodný pro disociaci buněk. Alternativní způsob používající bakteriální pronézu se ukázal jako užitečný a má výhodu vtom, že zamezuje znečistění živočišnými produkty při výrobě.

Další předměty předloženého vynálezu jsou zakotveny v následujících patentových nárocích.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Klonovaný kmen oslabeného viru kravských neštovic vyznačující se tím, že je izolovaný z buňkové kultury, na které byl pěstován Dryvax®, a je schopen po podání lidské osobě v dostačujícím množství vyvolat ochrannou nebo therapeutickou imunní odezvu proti viru varioly u zmíněné osoby, a oslabený je přijatelný pro zmíněnou osobu.
2. Klonovaný kmen oslabeného viru kravských neštovic podle nároku 1, v y z n a č u jící se tím, že zmíněný virus kravských neštovic má zásadně stejnou virulenci jako Dryvax®.
3. Klonovaný kmen oslabeného viru kravských neštovic podle nároku 1, v y z n-a č u jící se tím, že zmíněný virus kravských neštovic má zásadně stejnou imunogenicitu jako Dryvax®.
4. Klonovaný kmen oslabeného viru kravských neštovic podle nároku 1,vyznaču- j í c í s e tím, že zmíněný virus kravských neštovic vzniká po naočkování do buněčné kultury zásadně ve stejném nebo větším množství jako Dryvax®.
5. Klonovaný kmen oslabeného viru kravských neštovic podle nároku 1,vyznačují c í se tím, že zmíněný virus kravských neštovic má zásadně stejnou digestivní schopnost jako Dryvax® při digesci s restrikční endonukleázou.
6. Klonovaný kmen zeslabeného viru kravských neštovic podle nároku 1, vyznačují c í se tím, že zmíněný virus kravských neštovic má zásadně stejnou virulenci jako kmen viru kravských neštovic ACA1000 (ATCC vklad č. PTA-3321).
7. Klonovaný kmen zeslabeného viru kravských neštovic podle nároku 1, vyznačující se tím, že zmíněný virus kravských neštovic má zásadně stejnou imunogenicitu jako kmen viru kravských neštovic ACAM1000 (ATCC vklad č. PTA3321).
8. Klonovaný kmen zeslabeného viru kravských neštovic podle nároku 1,vyznačují c í se tím, že zmíněný virus kravských neštovic vzniká po naočkování do buněčné kultury zásadně ve stejných nebo větších množstvích jako kmen viru ·· ···· • · · • · · • · · · • · ♦ · ·· ·· ή 4 ♦··· kravských neštovic ACAM 1000 (ATCC vklad č. PTA-3321),
9. Klonovaný kmen oslabeného viru kravských neštovic podle nároku 1,vyznačují c í se t í m, že zmíněný virus kravských neštovic má zásadně digestivní schopnost jako kmen viru kravských neštovic ACAM1000 (ATCC vklad č. PTA-3321) při digesci restrikční endonukleázou.
10. Klonovaný kmen oslabeného viru kravských neštovic podle nároku 1,vyznačují c i se tím, že zmíněný virus kravských neštovic je ACAM1000 (ATCC vklad č. PTA-3321).
11. Farmaceutická kompozice vyznačující se tím, že obsahuje zmíněný klonovaný kmen viru kravských neštovic uváděný v nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.
12. Způsob využití farmaceutické kompozice podle nároku 11,vyznačující se t í m, že se zmíněná farmaceutická kompozice podává pacientovi jako prevence nebo při ošetření zmíněného pacienta při infekci zmíněného pacienta virem varioly.
13. Způsob využití farmaceutické kompozice podle nároku 12, vyznačující se t i m, že se zmíněná farmaceutická kompozice podává pacientovi skararifikací.
14. Způsob využití farmaceutické kompozice podle nároku 12, vyznačující se t i m, že se zmíněná farmaceutická kompozice podává pacientovi v množství od 1 x 10⁴ do 1 χ 10⁶ jednotek vytvářejících plak
15. Způsob využití farmaceutické kompozice podle nároku 12, vyznačující se t i m, že zmíněný klonovaný kmen viru kravských neštovic je ACAM1000 (ATCC vklad č. PTA-3321).
16. Způsob přípravy klonovaného kmene viru kravských neštovic pro použití jako vakcínu, vyznačující se tím, že zmíněný způsob obsahuje (i) pěstování Dryvaxu® na systému buněčné kultury, a (ii) izolaci klonovaného kmene viru kravských neštovic ze zmíněného systému buněčné kultury, který má zásadně stejnou virulenci, imunogenicitu, růstové charakteristiky na kulturách nebo digestivní schopnost restrikční endinukleázou jako Dryvax® nebo virus kravských neštovic ACAM1000 (ATCC vklad č. PTA-3321).

·· ····
17. Způsob přípravy klonovaného kmene viru kravských neštovic pro použití jako vakcínu podle nároku 16, vyznačující se tím, že virulence zmíněného kmene viru kravských neštovic je stanovena zkouškou na králičí kůži.
18. Způsob přípravy klonovaného kmene viru kravských neštovic pro použití jako vakcínu podle nároku 16, vyznačující se tím, že virulence zmíněného kmene viru kravských neštovic je stanovena neurovirulescenční zkouškou se sajícím mládětem myši.
19. Způsob přípravy klonovaného kmene viru kravských neštovic pro použití jako vakcínu podle nároku 16, vyznačující se tím, že zmíněný kmen viru kravských neštovic po podání lidskému pacientovi v účinném množství je schopen vyvolat ochrannou nebo therapeutickou odezvu proti viru varioly u zmíněného pacienta, a je pro zmíněného pacienta přijatelně virulentní.
20. Způsob přípravy klonovaného kmene viru kravských neštovic pro použití jako vakcínu podle nároku 16, vyznačující se tím, že zmíněná růstová charakteristika zmíněného kmene kravských neštovic na kultuře je stanovena za pomoci buněk