CN110431228B - 合成嵌合痘病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及合成嵌合痘病毒、包含此类病毒的组合物以及用于产生此类合成嵌合痘病毒的系统和方法的开发和用途。合成嵌合痘病毒非常适合活病毒疫苗和药物制剂。

Description

合成嵌合痘病毒
发明背景
痘病毒(痘病毒科的成员)是可感染人和动物两者的双链DNA病毒。痘病毒基于宿主范围分为两个亚科。感染脊椎动物宿主的脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxviridae)由8个属组成，已知其中有4个属(正痘病毒(Orthopoxvirus)、副痘病毒(Parapoxvirus)、软疱疹病毒(Molluscipoxvirus)和亚塔痘病毒属(Yatapoxvirus))感染人。天花是由正痘病毒属(OPV)属的成员天花病毒(VARV)感染引起的。OPV属包括许多遗传上相关且形态上相同的病毒，包括骆驼痘病毒(camelpox virus,CMLV)、牛痘病毒(cowpox virus,CPXV)、鼠痘病毒(ectromelia virus,ECTV，“鼠痘剂(mousepox agent)”)、马痘病毒(horsepox,HPXV)、猴痘病毒(monkeypox virus,MPXV)、兔痘病毒(rabbitpox virus,RPXV)、浣熊痘病毒(raccoonpox virus)、臭鼬痘病毒(skunkpox virus)、沙鼠痘病毒(Taterapox virus)、瓦辛吉舒病病毒(Uasin Gishu virus)、痘苗病毒(vaccinia,VACV)、天花病毒(variolavirus,VARV)和田鼠痘病毒(volepox virus,VPV)。除VARV外，已知至少有三种其他OPV(包括VACV、MPXV和CPXV)会感染人。到目前为止，接种“活”VACV是唯一经证实可以抵御天花的保护。一项积极的疫苗接种计划导致于1980年消灭了天花(small pox)，停止了对公众的常规天花疫苗接种。然而，仍然需要寻找新的安全有效的方法来对个体接种针对VARV和其他OPV的疫苗。
VACV的各种制剂已被用作天花疫苗。这些疫苗中的大多数由许多相关病毒(例如Dryvax)组成，并且一种包含单个分子克隆ACAM2000。然而，与Dryvax和其他VACV疫苗一样，甚至ACAM2000也与包括心肌病和心包炎在内的严重副作用相关。为了降低风险，ACAM2000疫苗与其他活疫苗一样，具有多种禁忌症，排除患有癌症、免疫缺陷的个体、器官移植受者、特应性皮炎、湿疹、银屑病、心脏病患者和服用免疫抑制剂的患者(patients onimmunosuppressants)。据估计，15-50％的美国人口属于这些类别之一，因此确证了开发更安全的疫苗或疫苗接种方案的需要(Kennedy等，2007Kennedy R、Poland GA.2007.T-Cellepitope discovery for variola and vaccinia viruses.Rev Med Viroll 7:93-113)。因此，需要开发与Dryvax或ACAM2000TM等效但更安全的疫苗。
本发明提供了由化学合成的DNA组装和复制的嵌合痘病毒。因为化学基因组合成不依赖于天然模板，所以病毒基因组的多种结构和功能修饰是可能的。当没有天然模板用于遗传复制或通过常规分子生物学方法修饰时，化学基因组合成特别有用。
发明概述
本发明提供合成嵌合痘病毒(例如合成嵌合OPV或scOPV)、产生此类病毒的方法和此类病毒例如用作免疫原、用于免疫原性制剂中、用于体外测定中、用作异源基因表达的载体或用作溶瘤剂的用途。本发明的合成嵌合痘病毒的特征在于相对于野生型痘病毒有一个或多个修饰。
部分地，本发明涉及可从化学合成的痘病毒基因组的重叠片段产生合成嵌合痘病毒(例如scOPV)的发现。因此，本发明部分地提供了从化学合成的核酸复制和组装的合成嵌合痘病毒(例如scOPV)。本公开还提供了包含此类病毒的组合物。本公开还提供了使用根据本公开的方法产生的痘病毒的方法。
在另一个方面，本发明提供了使用本发明的合成嵌合痘病毒保护个体人和人群免受天花、天花病毒的假型和其他OPV感染的后果的方法。在另一方面，本发明是通过使用本发明的合成嵌合痘病毒保护个体人和人群免受天花(VARV)和天花病毒的假型感染的后果的方法，所述本发明的合成嵌合痘病毒的毒性、发病率和死亡率低于可用的基于VACV的疫苗。在某些方面，本发明提供了从源自合成DNA的DNA复制和再激活的合成嵌合痘病毒(scPV)，所述病毒的病毒基因组与所述病毒的野生型基因组的差异在于其具有一个或多个修饰，所述修饰源自包含化学合成的DNA、cDNA或基因组DNA的组。
在一些实施方案中，合成DNA选自以下一种或多种：化学合成的DNA、PCR扩增的DNA、工程化的DNA和包含核苷类似物的多核苷酸。在一些实施方案中，合成DNA是化学合成的DNA。
在一些实施方案中，所述一个或多个修饰包含一个或多个缺失、插入、取代或其组合。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰包含引入一个或多个独特的限制性位点的一个或多个修饰。
在一些实施方案中，病毒基因组包含异源末端发夹环。在一些实施方案中，病毒基因组包含源自痘苗病毒的末端发夹环。在一些实施方案中，左侧和右侧末端发夹环a)分别包含痘苗病毒末端发夹环的慢速形式和快速形式，b)分别包含痘苗病毒末端发夹环的快速形式和慢速形式，c)均包含痘苗病毒末端发夹环的慢速形式，或d)均包含痘苗病毒末端环的快速形式。
在一些实施方案中，从重叠的化学合成的DNA片段复制和再激活病毒，所述DNA片段对应于scPV的基本上全部病毒基因组。
在一些实施方案中，从1-14个重叠片段复制和再激活病毒。在一些实施方案中，从8-12个重叠片段复制和再激活病毒。在一些实施方案中，从10个重叠片段复制和再激活病毒。
在一些实施方案中，使用兔痘病毒催化的重组和再激活来再激活病毒。在一些实施方案中，所述兔痘病毒选自：休普氏纤维瘤病毒(SFV)、野兔纤维瘤病毒、兔纤维瘤病毒、松鼠纤维瘤病毒和粘液瘤病毒。
在某些方面，本发明提供了从源自合成DNA的DNA复制和再激活的合成嵌合正痘病毒(scOPV)，所述病毒的病毒基因组与所述病毒的野生型基因组的差异在于其具有一个或多个修饰，所述修饰源自包含化学合成的DNA、cDNA或基因组DNA的组。
在一些实施方案中，合成DNA选自以下一种或多种：化学合成的DNA、PCR扩增的DNA、工程化的DNA和包含核苷类似物的多核苷酸。在一些实施方案中，合成DNA是化学合成的DNA。
在一些实施方案中，OPV选自：骆驼痘(CMLV)病毒、牛痘病毒(CPXV)、鼠痘病毒(ECTV)、马痘病毒(HPXV)、猴痘病毒(MPXV)、痘苗病毒(VACV)、天花病毒(VARV)、兔痘病毒(RPXV)、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦辛吉舒病病毒和田鼠痘病毒(VPV)。
在一些实施方案中，OPV是VACV。在一些实施方案中，病毒基因组基于VACV株ACAM2000的基因组，并且与ACAM2000基因组的差异在于其具有一个或多个修饰。在一些实施方案中，病毒基因组基于VACV株IOC的基因组，并且与IOC基因组的差异在于其具有一个或多个修饰。在一些实施方案中，病毒基因组基于VACV毒株MVA的基因组，并且与MVA基因组的差异在于其具有一个或多个修饰。在一些实施方案中，病毒基因组基于VACV株MVA-BN的基因组，并且与MVA-BN基因组的差异在于其具有一个或多个修饰。在一些实施方案中，野生型VACV基因组是选自以下株的基因组：Western Reserve、克隆3、Tian Tian、Tian Tian克隆TT9、Tian Tian克隆TP3、NYCBH、Wyeth、Copenhagen、Lister 107、Lister-LO、IHD-W、LC16m18、Lederle、Tashkent克隆TKT3、Tashkent克隆TKT4、USSR、Evans、Praha、LIVP、Ikeda、EM-63、Malbran、Duke、3737、CV-1、Connaught Laboratories、Serro 2、CM-01、Dryvax克隆DPP13、Dryvax克隆DPP15、Dryvax克隆DPP20、Dryvax克隆DPP17、Dryvax克隆DPP21以及绒毛膜尿囊痘苗病毒Ankara。
在一些实施方案中，所述一个或多个修饰包含一个或多个缺失、插入、取代或其组合。
在一些实施方案中，所述一个或多个修饰包含引入一个或多个独特的限制性位点的一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰包含消除一个或多个限制性位点的一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰包含消除一个或多个AarI限制性位点的一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰包含消除所有AarI限制性位点的一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰包含消除一个或多个BsaI限制性位点的一个或多个修饰。
在一些实施方案中，病毒基因组包含异源末端发夹环。在一些实施方案中，病毒基因组包含源自痘苗病毒的末端发夹环。在一些实施方案中，左侧和右侧末端发夹环a)分别包含痘苗病毒末端发夹环的慢速形式和快速形式，b)分别包含痘苗病毒末端发夹环的快速形式和慢速形式，c)均包含痘苗病毒末端发夹环的慢速形式，或d)均包含痘苗病毒末端环的快速形式。在一些实施方案中，慢速形式包含与SEQ ID NO:11的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列，并且快速形式包含与SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，慢速形式包含与SEQ ID NO:11的序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，并且快速形式包含与SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，慢速形式包含与SEQ ID NO:11的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列，并且快速形式包含与SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，慢速形式由SEQ ID NO:11的核苷酸序列组成，而快速形式由SEQ ID NO:12的核苷酸序列组成。
在一些实施方案中，从重叠的化学合成的DNA片段复制和再激活病毒，所述DNA片段对应于OPV的基本上全部病毒基因组。
在一些实施方案中，从1-14个重叠片段复制和再激活病毒。在一些实施方案中，从8-12个重叠片段复制和再激活病毒。在一些实施方案中，从10个重叠片段中复制和再激活病毒。
在一些实施方案中，使用兔痘病毒催化的重组和再激活来再激活病毒。在一些实施方案中，所述兔痘病毒选自：休普氏纤维瘤病毒(SFV)、野兔纤维瘤病毒、兔纤维瘤病毒、松鼠纤维瘤病毒和粘液瘤病毒。
在某些方面，本发明提供了从合成DNA复制和再激活的合成嵌合马痘病毒(scHPXV)，该病毒基因组与HPXV的野生型基因组的差异在于其具有一个或多个修饰，所述修饰源自包含化学合成的DNA、cDNA或基因组DNA的组。
在一些实施方案中，所述合成DNA选自以下的一种或多种：化学合成的DNA、PCR扩增的DNA、工程化的DNA和包含核苷类似物的多核苷酸。在一些实施方案中，合成DNA是化学合成的DNA。
在一些实施方案中，病毒基因组基于HPXV株MNR-76的基因组，并且与MNR-76基因组的差异在于其具有一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰包含一个或多个缺失、插入、取代或其组合。
在一些实施方案中，所述一个或多个修饰包含引入一个或多个独特的限制性位点的一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰存在于HPXV044或HPXV095中。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰包含表3中列出的一个或多个突变。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰包含消除一个或多个限制性位点的一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰包含消除一个或多个AarI限制性位点的一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰包含消除所有AarI限制性位点的一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰包含消除一个或多个BsaI限制性位点的一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰包含表2中列出的一个或多个突变。
在一些实施方案中，病毒基因组包含异源末端发夹环。在一些实施方案中，病毒基因组包含源自痘苗病毒的末端发夹环。在一些实施方案中，左侧和右侧末端发夹环a)分别包含痘苗病毒末端发夹环的慢速形式和快速形式，b)分别包含痘苗病毒末端发夹环的快速形式和慢速形式，c)均包含痘苗病毒末端发夹环的慢速形式，或d)均包含痘苗病毒末端环的快速形式。在一些实施方案中，慢速形式包含与SEQ ID NO:11的序列具有至少85％同一性的核苷酸序列，并且快速形式包含与SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，慢速形式包含与SEQ ID NO:11的序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，并且快速形式包含与SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，慢速形式包含与SEQ ID NO:11的序列具有至少95％同一性的核苷酸序列，并且快速形式包含与SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，慢速形式由SEQ ID NO:11的核苷酸序列组成，并且快速形式由SEQ ID NO:12的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，病毒基因组包含源自骆驼痘病毒、牛痘病毒、鼠痘病毒、猴痘病毒、天花病毒、兔痘病毒、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦辛吉舒病病毒和田鼠痘病毒的末端发夹环。
在一些实施方案中，从重叠的化学合成的DNA片段复制和组装病毒，所述DNA片段对应于HPXV的基本上全部病毒基因组。
在一些实施方案中，从1-14个重叠片段复制和再激活病毒。在一些实施方案中，从8-12个重叠片段复制和再激活病毒。在一些实施方案中，从10个重叠片段中复制和再激活病毒。
在一些实施方案中，使用兔痘病毒催化的重组和再激活来再激活病毒。在一些实施方案中，所述兔痘病毒选自：休普氏纤维瘤病毒(SFV)、野兔纤维瘤病毒、兔纤维瘤病毒、松鼠纤维瘤病毒和粘液瘤病毒。
在某些方面，本发明提供了产生合成嵌合痘病毒(scPV)的方法，其包括以下步骤：(i)化学合成对应于痘病毒的基本上全部病毒基因组的重叠DNA片段；(ii)将重叠的DNA片段转染到辅助病毒感染的细胞中；(iii)培养所述细胞以在所述细胞中产生辅助病毒和合成嵌合痘病毒颗粒的混合物；(iv)将混合物涂布在对scPV具有特异性的宿主细胞上以回收scPV。
在一些实施方案中，辅助病毒是兔痘病毒。在一些实施方案中，所述兔痘病毒选自：休普氏纤维瘤病毒(SFV)、野兔纤维瘤病毒、兔纤维瘤病毒、松鼠纤维瘤病毒和粘液瘤病毒。在一些实施方案中，兔痘病毒是SFV。
在一些实施方案中，辅助病毒是禽痘病毒。
在一些实施方案中，辅助病毒是补骨脂素灭活的辅助病毒。
在一些实施方案中，辅助病毒感染的细胞是BGMK细胞。
在一些实施方案中，步骤(i)还包括化学合成来自痘病毒的末端发夹环并将它们连接到包含病毒基因组的左侧和右侧末端的片段上。
在某些方面，本发明提供了产生合成嵌合正痘病毒(scOPV)的方法，其包括以下步骤：(i)化学合成对应于OPV的基本上全部病毒基因组的重叠DNA片段；(ii)将重叠的DNA片段转染到辅助病毒感染的细胞中；(iii)培养所述细胞以在所述细胞中产生辅助病毒和scOPV颗粒的混合物；(iv)将该混合物铺在对OPV具有特异性的宿主细胞上以回收scOPV。
在一些实施方案中，辅助病毒是兔痘病毒。在一些实施方案中，所述兔痘病毒选自：休普氏纤维瘤病毒(SFV)、野兔纤维瘤病毒、兔纤维瘤病毒、松鼠纤维瘤病毒和粘液瘤病毒。在一些实施方案中，兔痘病毒是SFV。
在一些实施方案中，辅助病毒是禽痘病毒。
在一些实施方案中，辅助病毒是补骨脂素灭活的辅助病毒。
在一些实施方案中，辅助病毒感染的细胞是BGMK细胞。
在一些实施方案中，OPV特异性宿主细胞是BSC-40细胞。
在一些实施方案中，OPV选自：骆驼痘病毒、牛痘病毒、鼠痘病毒、马痘病毒、猴痘病毒、痘苗病毒、天花病毒、兔痘病毒、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦辛吉舒病病毒和田鼠痘病毒。
在一些实施方案中，步骤(i)还包括化学合成来自OPV的末端发夹环并将它们连接到包含病毒基因组的左侧和右侧末端的片段上。
在某些方面，本发明提供了产生合成嵌合马痘病毒(scHPXV)的方法，其包括以下步骤：(i)化学合成对应于基本上全部HPXV基因组的重叠DNA片段；(ii)将重叠的DNA片段转染到辅助病毒感染的细胞中；(iii)培养所述细胞以在所述细胞中产生辅助病毒和scHPXV颗粒的混合物；以及(iv)将混合物铺在对HPXV具有特异性的宿主细胞上以回收scHPXV。
在某些方面，本发明提供了产生合成嵌合马痘病毒(scHPXV)的方法，其包括：(i)化学合成对应于基本上全部HPXV基因组的重叠DNA片段；(ii)将重叠的DNA片段转染到休普氏纤维瘤病毒(SFV)感染的细胞中；(iii)培养所述细胞以在所述细胞中产生SFV和scHPXV颗粒的混合物；以及(iv)将混合物铺在对HPXV具有特异性的宿主细胞上以回收scHPXV。
在一些实施方案中，辅助病毒是兔痘病毒。在一些实施方案中，所述兔痘病毒选自：休普氏纤维瘤病毒(SFV)、野兔纤维瘤病毒、兔纤维瘤病毒、松鼠纤维瘤病毒和粘液瘤病毒。在一些实施方案中，兔痘病毒是SFV。
在一些实施方案中，辅助病毒是禽痘病毒。
在一些实施方案中，辅助病毒是补骨脂素灭活的辅助病毒。
在一些实施方案中，辅助病毒感染的细胞是BGMK细胞。
在一些实施方案中，HPXV特异性宿主细胞是BSC-40细胞。
在一些实施方案中，步骤(i)还包括化学合成来自OPV的末端发夹环并将它们连接到包含HPXV基因组的左侧和右侧末端的片段上。
在一些实施方案中，重叠DNA片段包含：i)与SEQ ID NO:1-10的序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；ii)与SEQ ID NO:1-10的序列具有至少90％同一性的核苷酸序列；(iii)与SEQ ID NO:1-10的序列具有至少95％同一性的核苷酸序列；或(iv)由SEQ ID NO:1-10的序列组成的核苷酸序列。
在一些实施方案中，SFV感染的细胞是BGMK细胞。
在一些实施方案中，HPXV特异性宿主细胞是BSC-40细胞。
在某些方面，本发明提供了通过本公开的方法产生的合成嵌合痘病毒(scPV)。
在某些方面，本发明提供了通过本公开的方法产生的合成嵌合正痘病毒(scOPV)。
在某些方面，本发明提供了通过本公开的方法产生的合成嵌合马痘病毒(scHPXV)。
在某些方面，本发明提供了包含药学上可接受的载体和本公开的scPV的组合物。
在某些方面，本发明提供了包含药学上可接受的载体和本公开的scOPV的组合物。
在某些方面，本发明提供了触发或加强针对天花病毒的免疫应答的方法，其包括向有此需要的受试者施用包含本公开的scOPV的组合物。
在某些方面，本发明提供了触发或加强针对痘苗病毒的免疫应答的方法，其包括向有此需要的受试者施用包含本公开的scOPV的组合物。
在某些方面，本发明提供了触发或加强针对猴痘病毒的免疫应答的方法，其包括向有此需要的受试者施用包含本公开的scOPV的组合物。
在某些方面，本发明提供了免疫人受试者以保护所述受试者免受天花病毒感染的方法，其包括向所述受试者施用包含本公开的scOPV的组合物。
在某些方面，本发明提供了治疗天花病毒感染的方法，其包括向有此需要的受试者施用包含本公开的scOPV的组合物。
在某些方面，本发明提供了包含药学上可接受的载体和本公开的scHPXV的组合物。
在某些方面，本发明提供了触发或加强针对天花病毒的免疫应答的方法，其包括向有此需要的受试者施用包含本公开的scHPXV的组合物。
在某些方面，本发明提供了触发或加强针对痘苗病毒的免疫应答的方法，其包括向有此需要的受试者施用包含本公开的scHPXV的组合物。
在某些方面，本发明提供了触发或加强针对猴痘病毒的免疫应答的方法，其包括向有此需要的受试者施用包含本公开的scHPXV的组合物。
在某些方面，本发明提供了免疫人受试者以保护所述受试者免受天花病毒感染的方法，其包括向所述受试者施用包含本公开的scHPXV的组合物。
在某些方面，本发明提供了治疗天花病毒感染的方法，其包括向有此需要的受试者施用包含本公开的scHPXV的组合物。
在某些方面，本发明提供了试剂盒，其包含含有本公开的scPV的组合物。
在某些方面，本发明提供了试剂盒，其包含含有本公开的OPV的组合物。
在某些方面，本发明提供了试剂盒，其包含含有本公开的scHPXV的组合物。
在某些方面，在痘病毒治疗设施中施用本发明的组合物。在某些方面，痘病毒治疗设施是其中可以在使得需要用本发明的组合物或方法进行免疫或治疗的受试者与不打算进行免疫或治疗的其他受试者或可能被受治疗的受试者感染的其他受试者(例如，护理人员和家庭成员)隔离的环境中对其进行免疫或治疗的设施。在一些实施方案中，不打算被治疗或可能被受治疗的受试者感染的受试者包括HIV患者、正在接受化疗的患者、正在接受癌症、风湿病症或自身免疫性疾病治疗的患者、正在接受或已接受器官或组织移植的患者、患有免疫缺陷的患者、儿童、孕妇、患有特应性皮炎、湿疹、银屑病、心脏病的患者和使用免疫抑制剂的患者等。在一些实施方案中，痘病毒治疗设施是正痘病毒治疗设施。在一些实施方案中，痘病毒治疗设施是天花治疗设施。
在某些方面，由天花不良事件方面的专家施用本发明的组合物。在一些实施方案中，天花不利事件包括但不限于湿疹疫苗、进行性牛痘、接种后后脑炎、心肌炎和扩张型心肌病。
附图简述
当结合附图阅读时，将更好地理解前述概述以及本发明的以下详细描述。出于说明本发明的目的，在附图中示出了目前优选的一个或多个实施方案。然而，应该理解，本发明不限于所示的精确排列和手段。
图1A和1B.线性dsDNA HPXV基因组(株MNR；Genbank登录号DQ792504)的示意图。A.图1A举例说明HPXV基因组的未修饰基因组序列，显示了单独的HPXV基因(紫色)和天然存在的AarI和BsaI位点。B.图1B描绘使用重叠的基因组DNA片段(以红色显示的)化学合成的经修饰的合成嵌合HPXV(scHPXV)基因组。还显示了用于将VACV末端发夹环连接至ITR上的工程化的SapI限制性位点以及左侧和右侧ITR片段中的未修饰的BsaI位点。SapI位点分别位于紧接左侧反向末端重复(LITR)和右侧反向末端重复(RITR)的左端和右端的质粒载体位点中。
图2A-2C.经修饰的scHPXV YFP-gpt::095基因组和VACV(WR株)末端发夹环的详细示意图。A.图2A描绘了经修饰的scHPXV YFP-gpt::095基因组。未修饰的BsaI位点在基因组上显示为蓝线。在HPXV044(VACV F4L同源物)中生成的新型AvaI和StuI限制性位点也被标记(绿线)。还显示了选择标记黄色荧光蛋白/鸟苷磷酸核糖基转移酶(yfp/gpt)在Frag_3的HPXV095基因座(VACV J2R同源物)中的位置(黄色)。B.图2B描绘了末端发夹环的S(SEQ IDNO:11)和F(SEQ ID NO:12)形式的核苷酸序列，并且在(C)中解释了颜色编码。C.图2C描绘了末端发夹环的F型和S型的二级结构预测，所述末端发夹环共价连接至VACV的线性dsDNA基因组的末端。末端环序列以绿色突出显示。串联体分辨序列用红色框表示。
图3A和3B.～70bp VACV末端发夹可以连接到左侧和右侧HPXV ITR片段。A.图3A描绘了标记SapI和PvuII识别位点的位置的左侧和右侧HPXV ITR片段的示意图。显示了用SapI和PvuII消化后DNA的预测片段大小。B.图3B描绘了将～70bp末端发夹连接到用SapI切割的1472bp ITR片段后左侧和右侧ITR片段的琼脂糖凝胶电泳。随后用PvuII切割连接的DNA，以便于检测由于添加发夹而引起的小的尺寸变化。
图4A-4C.scHPXV YFP-gpt::095基因组的PCR分析和限制性消化证实scHPXV YFP-gpt::095的成功再激活。A.图4A描绘了scHPXV YFP-gpt::095克隆的PCR分析结果。位于VACV和scHPXV YFP-gpt::095中的保守BsaI限制性位点两侧的引物用于扩增一系列～1kbp的产物。随后用BsaI消化PCR产物，并通过琼脂糖凝胶电泳分离所得的DNA片段。切割VACV，但已从两种不同的scHPXV YFP-gpt::095克隆中删除了所有BsaI位点。B.图4B描绘了VACV-WR和scHPXV YFP-gpt::095基因组DNA的脉冲场凝胶电泳(PFGE)。病毒DNA用BsaI、HindIII消化或不处理，然后在1％Seakem金琼脂糖凝胶上于14℃以5.7V/cm分离14小时，切换时间为1至10秒。观察到完整VACV与scHPXV YFP-gpt::095基因组之间的大小的略微差异。标有星号(*)的微弱条带或者为不完整的DNA消化产物，或者可为经常污染VACV病毒体制剂的切割的线粒体DNA片段。C.图4C描绘了用BsaI或HindIII消化的VACV-WR和scHPXV YFP-gpt::095基因组DNA的常规琼脂糖凝胶电泳。通过用SybrGold DNA染料对凝胶进行染色来使DNA片段可视化。
图5A和5B.将VACV末端发夹成功连接到scHPXV YFP-gpt::095ITR片段上。A.Illumina序列读数被定位至scHPXV YFP-gpt::095参照序列。切割SapI位点(在载体中，顶链序列)以产生将用于将端粒发夹连接到左侧和右侧ITR片段上的点。显示了VACV衍生的末端发夹的末端环的位置，以及串联体分辨位点。在串联体分辨位点中的第一个A也是针对HBXV(NCBI DQ792504)报道的第一个核苷酸，使用VACV作为参照设计了该“A”的左侧序列的其余部分。请注意，仅将“C”作为支架添加，以避免装配程序截断读取。B.包含延伸超出已知HPXV序列的最长Illumina测序读数的亚组与polydC模板对齐进行显示。这些读数跨越未折叠发夹的整个长度，如最初使用合成寡核苷酸所提供的。由于痘病毒中的反向末端重复，所以来自左端和右端的所有读数都“堆积”在一起，并且任何原始取向或分布都会丢失。显然，在八种不同的病毒测序反应中检测到VACV发夹的F型和S型，并且该区域中F-读数与S-读数的比率为1.03±0.01(SEM)。
图6A-6C.scHPXV YFP-gpt::095区域96,050至96,500中的BsaI位点被正确突变。A.图6A描绘了被定位至HPXV(DQ792504)基因组的一个区域的Illumina序列读数。仅显示了一小部分读数。位置96,239和位置96437处的测序读数的不一致分别以蓝色和黄色突出显示。B.图6B描绘了来自被定位至HPXV(DQ792504)的位置96239附近的scHPXV YFP-gpt::095的Illumina测序读数的放大图。检测到核苷酸取代(T96239C)(参见表2)。C.图6C描绘了来自被定位至HPXV(DQ792504)的位置96437的scHPXV YFP-gpt::095的Illumina测序读数的放大图。检测到核苷酸取代(A96437C)(参见表2)。将这些突变引入用于组装scHPXV YFP-gpt::095的克隆中，以便删除不需要的BsaI识别位点(GGTCTC)。
图7A-7C.用于产生独特的限制性位点AvaI和StuI的scHPXV YFP-gpt::095的HPXV044基因中的核苷酸变化。A.图7A描绘了被定位至HPXV(DQ792504)基因组中的HPXV044基因的Illumina序列读数。仅显示了一小部分读数。HPXV044编码VACV F4L的HPXV同源物。其中序列读数与原始HPXV(DQ792504)序列不匹配的位点以黄色垂直线突出显示。B.图7B描绘了来自被定位至HPXV(DQ792504)的位置44,512的scHPXV YFP-gpt::095的Illumina测序读数的放大图。鉴定出核苷酸取代(T44512G)，其产生AvaI位点(CYCGRG；参见表2)。C.图7C描绘了来自被定位至HPXV(DQ792504)的位置45,061的scHPXV YFP-gpt::095的Illumina测序读数的放大图。检测到核苷酸取代(T45061G)，其产生StuI位点(AGGCCT；参见表2)。
图8A-8C.ScHPXV YFP-gpt::095像其他正痘病毒一样生长，但在BSC-40细胞中表现出小的噬斑表型。A.图8A举例说明BSC-40细胞系(左上图)、HeLa细胞系(顶部中间图)、原代HEL细胞系(右上图)和Vero细胞系(左下图)中VACV-WR、DPP15、CPXV和scHPXV YFP-gpt::095的多步生长。B.图8B举例说明VACV-WR、DPP15、CPXV与scHPXV YFP-gpt::095之间的噬斑大小比较。用指定的病毒感染BSC-40细胞，并在感染后48小时固定细胞并染色。在3个独立实验中对每种病毒测量24个噬斑的面积(以任意单位[A.U.]表示)。数据表示为平均噬斑直径。**，P<0.01；****，P<0.0001。C.图8C描绘了用指定病毒感染72小时的BSC-40细胞的噬斑形态。将细胞固定，染色并扫描以进行可视化。
图9.VACV(株ACAM2000；Genbank登录号AY313847)的线性dsDNA基因组的示意图。示意显示了VACV ACAM2000的未修饰的基因组序列，其中标出了天然存在的AarI和BsaI识别位点。重叠的DNA片段用蓝色表示。左侧(LITR_ACAM2000)和右侧(RITR_ACAM2000)片段以橙色显示。
图10.向小鼠施用各种组合物和剂量后随时间的重量损失％的图示。所描绘的数据从5只雌性BALB/c小鼠的组生成，所述小鼠用指定剂量的scHPXV YFP-gpt::095(也称为scHPXV(ΔHPXV_095/J2R)或scHPXV(yfp/gpt))、scHPXV(wt)、Dryvax DPP15或VACV WR(于10μl PBS中)接种。每天称重小鼠，持续28天，对任何失去>25％的初始重量的小鼠进行安乐死。数据点代表平均分数，误差条代表标准偏差。
图11A和11B.向小鼠施用各种组合物和剂量后随时间的重量损失％的图示。从先前已接种疫苗(图10)，然后用致死剂量的VACV WR(106PFU)鼻内攻击的小鼠产生所描绘的数据。图11A显示体重变化，图11B显示每天记录(持续13天)的小鼠的临床评分。对任何失去>25％的它们的初始重量的老鼠进行安乐死。基于皱褶、驼背姿势、呼吸困难和活动性降低的外观赋予小鼠临床评分。数据点表示重量或评分的平均差异，误差条代表标准偏差。表示在给定的日期死于VACV感染的小鼠数量。
图12.在向小鼠施用各种组合物和剂量后存活率％随时间的图示。从先前接种疫苗(图10)，并且用致死剂量的VACV WR(106 PFU)进行鼻内攻击的小鼠生成所描绘的数据。图12显示用致死剂量的VACV WR(106PFU)鼻内攻击的小鼠的存活曲线。表示在指定的日期死于VACV感染的小鼠数量。
图13A和13B.VACV-HPXV杂交病毒的表征。A.VACV株WR中的HPXV插入物。使用Illumina平台对病毒基因组进行测序，然后组装，并使用LAGAN32和“Base-by-Base”33软件对齐并生成所示的图谱。根据差异对其中VACV序列(白色)已被HPXV序列替换的位置进行颜色编码。通过将VACV DNA与HPXV片段_3共转染到SFV感染的细胞中获得第一杂交病毒(“VACV/HPXV+片段3”)。绿色标记的插入编码YPF-gpt选择标记。通过从该第一杂交基因组中纯化DNA并将其与HPXV片段2、4、5和7一起再次转染到SFV感染的细胞中，获得克隆1-3。B.用于鉴定杂交体和再激活的病毒的基于PCR的筛选方法。设计用于靶向HPXV和VACV的PCR引物并用于扩增跨越在合成HPXV克隆中突变的BsaI位点的DNA区段。PCR扩增后，用BsaI消化产物以区分VACV序列(切割的)与HPXV(未切割的)。VACV/HPXV杂交体表现出BsaI敏感和抗性位点的混合，而再激活的scHPXV YFP-gpt::095克隆是完全BsaI抗性的。
图14A-14C.scHPXV对比scHPXV YFP-gpt::095的生长特性。A.噬斑尺寸测量。将同源重组用于用胸苷激酶基因序列替换scHPXV YFP-gpt::095中的YFP-gpt基因座。这产生了具有HPXV基因(scHPXV)的完全野生型互补物(fully wild-type complement)的病毒。用指定的病毒感染BSC-40细胞并培养3天。将培养皿染色并使用扫描的数字图像测量噬斑面积。注意到统计学上显著的差异****P<0.0001)。B.噬斑图像。C.培养中的多步病毒生长。以0.01的感染复数用scHPXV或scHPXV YFP-gpt::095感染指定的细胞系，在指定的时间收获病毒，并以一式三份在BSC-40细胞上进行滴定。在这些体外测定中未检测到这些病毒的生长的显著差异。
发明详述
一般技术
除非本文另有定义，否则本申请中使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，与本文所述的药理学、细胞和组织培养、分子生物学、细胞和癌症生物学、神经生物学、神经化学、病毒学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学相关的命名法和技术是公知的并且在本领域中常用的命名法和技术。如果发生矛盾，以本说明书(包括定义)为准。
除非另有说明，本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术在本领域的技术范围内。此类技术在诸如以下文献中有充分解释：Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，编辑，1984)；Methods in Molecular Biology、Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis，编辑，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，编辑，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts、1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths和D.G.Newell，编辑，1993-1998)J.Wiley和Sons；Methods in Enzymology(Academic Press、Inc.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos，编辑，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等，编辑，1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction、(Mullis等，编辑，1994)；Sambrook和Russell、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press、Cold Spring Harbor、NY(2001)；Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology、John Wiley&Sons、NY(2002)；Harlow and Lane Using Antibodies:ALaboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY(1998)；Coligan等，Short Protocols in Protein Science、John Wiley&Sons、NY(2003)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons、1999)。
根据制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术，如本领域通常实现的或如本文所述的。与本文所述的分析化学、生物化学、免疫学、分子生物学、合成有机化学以及药物和药物化学结合使用的命名法以及其实验室程序和技术是本领域公知的和常用的那些命名法以及实验室程序和技术。标准技术用于化学合成和化学分析。
在整个说明书和实施方案中，词语“包含”或诸如“含有”或“具有”的变化形式将被理解为暗示包括所述整数或整数组但不排除任何其他整数或整数组。
应当理解，在本文中使用语言“包含”描述实施方案的任何地方，还提供了以“由...组成”和/或“基本上由......组成”描述的其他类似实施方案。
术语“包括”用于表示“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
术语“例如(e.g.)”或“诸如(for example)”之后的任何实例并不意味着穷举或限制。
除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
本文中使用冠词“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”是指该冠词的一个或不止一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“元素”意指一个元素或不止一个元素。本文中对“约”值或参数的引用包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。数字范围包括定义该范围的数字。
尽管阐明本发明广泛范围的数字范围和参量是近似值，但具体实例中阐述的数值应尽可能予以精确报道。然而，任何数字固有地包含必然由在其各自的测试测量中发现的标准偏差带来的某些误差。此外，本文公开的所有范围应理解为包括其中包含的任何和所有子范围。例如，“1到10”的规定的范围应被视为包括最小值1与最大值10之间的任何和所有子范围(并且包括1和10)；也就是说，所有子范围以最小值1或更大，例如1到6.1开始，并以最大值10或更小，例如5.5到10结束。
在根据马库什组或可选择要素的其它分组描述了本发明的方面或实施方案的情况下，本发明不仅包括作为整体列出的整个组，还个别地包括该组的各成员和主要组的所有可能亚组，以及还包括缺少一个或多个组成员的主要组。本发明还预见到明确排除具体化的发明中任何组成员中的一个或多个。
本文描述了示例性方法和材料，尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试。材料、方法和实施例仅是说明性的而非限制性的。
定义
除非另有说明，否则以下术语应理解为具有以下含义：
如本文中所用，术语“野生型病毒”、“野生型基因组”，“野生型蛋白质”或“野生型核酸”是指在某一群体(例如，特定的病毒种等)中天然存在的氨基酸或核酸序列。
术语“嵌合的”或“工程化的”或“经修饰的”(例如，嵌合痘病毒、工程化多肽、经修饰的多肽、工程化核酸、经修饰的核酸)或其语法变化形式在本文中可互换使用，以指代已被操作而相对于天然序列具有一个或多个变化的非天然序列。
如本文中所用，“合成病毒”是指最初衍生自合成DNA的病毒(例如化学合成的DNA、PCR扩增的DNA、工程化DNA、包含核苷类似物的多核苷酸等，或其组合)并且包括其后代，并且由于天然的、偶然的或有意的突变，后代可能不一定与原始的亲本合成病毒完全相同(在形态学或基因组DNA互补物中)。在一些实施方案中，合成病毒是指其中基本上所有病毒基因组最初源自化学合成的DNA的病毒。
如本文其他地方所概述的，可以改变病毒基因组的某些位置。本文中使用的“位置”是指基因组序列中的位置。通常通过与其他亲本序列比对来确定相应的位置。
如本文中所用，“残基”是指蛋白质中的位置及其相关的氨基酸身份。
如本领域中已知的，本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指具有任何长度的核苷酸链，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基，和/或其类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶掺入链中的任何底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在，可以在链组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分缀合。其他类型的修饰包括例如“帽”、类似物对一个或多个天然存在的核苷酸的取代、核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷的键联(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨甲酸酯等)和带电荷的键联(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些核苷酸间修饰、含有侧挂部分的那些核苷酸间修饰，例如蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂等)的那些核苷酸间修饰、含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些核苷酸间修饰、含有烷基化剂的那些核苷酸间修饰、具有经修饰的键联(例如，α异头核酸等)的那些核苷酸间修饰，以及多核苷酸的未修饰形式。另外，通常存在于糖中的任何羟基可以被例如膦酸酯基团、磷酸基团替代，被标准保护基团保护，或被激活以制备对另外的核苷酸的另外的键联，或者可以与固体支持物缀合。5'和3'末端OH可以被磷酸化或被胺或1-20个碳原子的有机封端基团部分取代。其他羟基也可被衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-或β-异头糖、差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、非环状类似物和无碱基核苷类似物诸如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键联可以被替代性连接基团替代。这些替代性连接基团包括但不限于其中磷酸酯被P(O)S(“硫代物”)、P(S)S(“二硫代物”)、(O)NR2(“酰胺酯”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛”)替代的实施方案，其中每个R或R'独立地是H或者取代的或未取代的烷基(1-20C)，任选地包含醚(-O-)键联、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。并非多核苷酸中的所有键联都必须相同。前面的描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指具有任何长度的氨基酸链。链可以是直链或支链的，其可以包含经修饰的氨基酸，和/或可以被非氨基酸中断。该术语还包括已被天然修饰或通过干预而修饰的氨基酸链；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分的缀合。定义中还包括，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。应理解，多肽可以作为单链或相关链存在。
“同源”以其所有语法形式和拼写变化形式指具有“共同进化起源”的两种蛋白质(包括来自生物体的相同物种的超家族的蛋白质以及来自生物体的不同物种的同源蛋白质)之间的关系。此类蛋白质(及其编码核酸)具有序列同源性，如其序列相似性(无论是根据同一性百分比还是通过特定残基或基序和保守位置的存在)所反映的。
然而，在通常的用法和本申请中，术语“同源的”当用诸如“高度”的副词修饰时，可以指序列相似性，并且可以与或可以不与共同的进化起源相关。
术语“序列相似性”，以其所有语法形式，指核酸或氨基酸序列之间的同一性或对应性程度，其可以共享或可以不共享共同的进化起源。
相对于参照多肽(或核苷酸)序列的“百分比(％)序列同一性”被定义为在比对序列并引入缺口(如有必要)以实现最大的序列同一性百分比后，并且在不考虑任何保守取代作为序列同一性的部分的情况下，候选序列中与参照多肽(核苷酸)序列中的氨基酸残基(或核酸)相同的氨基酸残基(或核酸)的百分比。出于测定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件(诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件)来实现。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
如本文中所用，“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是用于掺入多核苷酸插入物的一个或多个载体的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、偶然的或有意的突变，后代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学或基因组DNA互补物方面)。宿主细胞包括用本发明的核酸体内转染和/或转化的细胞。
如本文中所用，“载体”意指构建体，其能够在宿主细胞中递送，并且优选表达一个或多个目标基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞，诸如生产者细胞。
如本文中所用，“表达控制序列”意指指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，诸如组成型或诱导型启动子，或增强子。表达控制序列与待转录的核酸序列可操作地连接。
如本文中所用，“分离的分子”(其中分子是例如多肽、多核苷酸或其片段)是就其起源或衍生源而言(1)不与在其天然状态中伴随其的一种或多种天然存在的组分相关联，(2)基本上不含来自相同物种的一种或多种其他分子，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不存在于自然界的分子。因此，化学合成的或在与其所天然源自的细胞不同的细胞系统中表达的分子将与其天然关联的组分是“分离”的。还可使用本领域熟知的纯化技术通过分离使分子基本上不含天然关联的组分。可通过本领域熟知的许多手段测定分子纯度或同质性。例如，可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，并使用本领域熟知的技术对凝胶进行染色以使多肽可视化来测定多肽样品的纯度。出于某些目的，可通过使用HPLC或本领域熟知的用于纯化的其他手段来提供更高的分辨率。
如本文中所用，术语“分离的”在病毒的背景中是指源自单一亲本病毒的病毒。可使用本领域技术人员已知的常规方法(包括但不限于基于噬斑纯化和有限稀释的那些方法)分离病毒。
如本文中所用，短语“感染复数”或“MOI”是每个感染细胞的平均病毒数。通过将加入的病毒数(加入的ml×噬斑形成单位(PFU))除以加入的细胞数(加入的ml×细胞/ml)来确定MOI。
如本文中所用，“纯化”及其语法变化形式是指从含有多肽和一种或多种杂质的混合物中去除(无论是完全地还是部分地)至少一种杂质，从而提高(即，通过减少组合物中杂质的量(ppm))组合物中的多肽的纯度水平。如本文中所用，在病毒的背景中“纯化的”是指基本上不含来自病毒所源自的细胞或组织来源的细胞物质和培养基的病毒。术语“基本上不含细胞物质”包括病毒制剂，其中所述病毒与从中分离或从其重组产生的细胞的细胞组分分离。因此，基本上不含细胞物质的病毒包括具有少于约30％、20％、10％或5％(按干重计)的细胞蛋白质(在本文中也称为“污染蛋白质”)的蛋白质制剂。病毒也基本上不含培养基，即培养基占病毒制剂体积的小于约20％、10％或5％。可使用本领域技术人员已知的常规方法(包括但不限于色谱法和离心)纯化病毒。
如本文中所用，“基本上纯的”是指纯度为至少50％(即，不含污染物)，更优选纯度为至少90％，更优选纯度为至少95％，更优选纯度为至少98％，最优选纯度为至少99％的材料。
术语“患者”、“受试者”或“个体”在本文中可互换使用，并且指人或非人动物。这些术语包括哺乳动物，诸如人、灵长类动物、家畜动物(包括牛、猪、骆驼等)、伴侣动物(例如，犬科动物、猫科动物等)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。
如本文中所用，术语“预防”、“防止”和“预防(prevention)”是指作为疗法(预防剂或治疗剂)施用的结果而防止受试者的疾病(例如，痘病毒感染)的一个或多个症状的复发或发作或减少。例如，在针对感染向受试者施用疗法的情况下，“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指作为疗法(例如，预防剂或治疗剂)施用或治疗组合的施用(例如，预防剂或治疗剂的组合)的结果而抑制或减少受试者的感染(例如，痘病毒感染或与其相关的病况)发展或发作，或防止感染(例如，痘病毒感染或与之相关的病况)的复发、发作或其一个或多个症状的发展。
“治疗”病况或患者是指采取步骤以获得有益或期望的结果，包括临床结果。关于感染(例如，痘病毒感染)，治疗是指由于施用一种或多种疗法(包括但不限于，施用一种或多种预防或治疗剂)而导致的传染因子(例如，痘病毒)的复制的根除或控制、传染因子数量的减少(例如，痘病毒滴度的降低)、感染(例如，痘病毒感染或与其相关的病况或症状)的进展、严重程度和/或持续时间的减少或改善，或者一个或多个症状的改善。关于癌症，治疗是指由于施用一种或多种本发明治疗剂导致的原发性、局部或转移性癌组织的根除、去除、缓和或控制。在某些实施方案中，此类术语是指由于向具有此种疾病的受试者施用一种或多种本发明的治疗剂而导致的癌症扩散的最小化或延迟。在其他实施方案中，此类术语是指消除引起疾病的细胞。
可使用本领域技术人员已知的多种方法之一向受试者“施用”或“施予”物质、化合物或药剂。例如，可通过舌下或鼻内、通过吸入至肺中或经直肠施用化合物或药剂。还可进行施用例如一次、多次和/或持续一个或多个延长的时段。在一些方面，施用包括直接施用(包括自我施用)和间接施用，包括开药物处方的行为。例如，如本文中所用，指导患者自我施用药物或使药物由另一个人施用和/或为患者提供药物处方的医生向患者施用药物。
本文描述的每个实施方案可以单独使用或与本文描述的任何其他实施方案组合使用。
概述
痘病毒是在感染的细胞的细胞质中复制的大(～200kbp)DNA病毒。正痘病毒(OPV)属包括许多痘病毒，所述痘病毒感染不同宿主的能力差异很大。例如，痘苗病毒(VACV)可感染广泛的宿主组，而天花的病原体天花病毒(VARV)仅感染人。许多(如果不是全部的话)痘病毒的共同特征是它们在宿主中非遗传地“再激活”的能力。非遗传再激活是指这样的过程，其中被一种痘病毒感染的细胞可促进本身是非感染性的第二“死亡”病毒(例如通过加热灭活的病毒)的恢复。
纯化的痘病毒DNA不具有感染性，因为病毒生命周期需要通过包装在病毒体中的病毒编码的RNA聚合酶转录早期基因。然而，如果将病毒DNA转染到先前用辅助痘病毒感染的细胞中，从而反式地提供转录、复制和包装转染的基因组所需的必需因子(Sam CK、Dumbell KR.Expression of poxvirus DNA in coinfected cells and marker rescueof thermosensitive mutants by subgenomic fragments of DNA.Ann Virol(InstPast).1981；132:135-50)，则可以克服这种缺陷。虽然这会产生混合的病毒后代，但通过在支持两种病毒繁殖的细胞系中进行再激活反应，然后通过将病毒混合物铺在不支持辅助病毒生长的细胞上来消除辅助病毒(Scheiflinger F、Dorner F、Falkner FG.Constructionof chimeric vaccinia viruses by molecular cloning and packaging.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America.1992；89(21):9977-81)，可以克服该问题。
先前，其中由兔痘病毒、休普氏纤维瘤病毒(SFV)催化的高频重组反应的方法可以与SFV催化的再激活反应偶联，以使用病毒DNA的多个重叠片段快速组装重组VACV株(YaoXD、Evans DH.High-frequency genetic recombination and reactivation oforthopoxviruses from DNA fragments transfected into leporipoxvirus-infectedcells.Journal of virology.2003；77(13):7281-90)。首次描述了使用化学合成的重叠双链DNA片段再激活和表征功能性痘病毒(合成嵌合马痘病毒[scHPXV])。所述原理可以类似地应用并外推至其他痘病毒，包括但不限于骆驼痘病毒(CMLV)、牛痘病毒(CPXV)、鼠痘病毒(ECTV，“鼠痘剂”)、马痘(HPXV)、猴痘病毒(MPXV)、兔痘病毒(RPXV)、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦辛吉舒病病毒、痘苗病毒(VACV)和田鼠痘病毒(VPV)。
此处进一步显示，本发明的合成嵌合痘病毒(例如合成嵌合马痘病毒)的一个实施方案可以感染和免疫小鼠以抵抗致死性VACV攻击，并且可这样进行而不会在初始免疫步骤期间引发任何疾病。
本发明的合成嵌合痘病毒
本发明提供功能性合成嵌合痘病毒(scPV)，其最初从化学合成的DNA复制和组装而来。可根据本发明的方法产生的病毒可以是其基因组大部分已被测序或者其天然分离物是可用的任何痘病毒。本发明的scPV可以基于天然存在的株、变体或突变体、诱变的病毒或遗传工程病毒的基因组序列。本发明的scPV的病毒基因组包含相对于所述病毒的野生型基因组或基础基因组序列的一个或多个修饰。修饰可包括一个或多个缺失、插入、取代或其组合。应理解，可以以本领域公知的许多方式引入修饰。基因组的修饰部分可源自化学合成的DNA、cDNA或基因组DNA。
当天然模板不可用于通过常规分子生物学方法进行遗传修饰、扩增或复制时，化学基因组合成是特别有用的。例如，马痘病毒(HPXV)的天然分离物不易得到来获得用于模板DNA，但已描述了HPXV(株MNR-76)的基因组序列。然而，HPXV基因组序列是不完整的。未确定末端发夹环的序列。在令人惊讶的结果中，通过使用基于VACV端粒的末端发夹环代替HPXV末端发夹环序列产生功能性合成嵌合HPXV(scHPXV)。在一些实施方案中，痘病毒属于脊椎动物痘病毒亚科。在一些实施方案中，痘病毒属于选自禽痘病毒属、山羊痘病毒属、鹿痘病毒属、Crocodylipoxvirus、兔痘病毒属、软疣痘病毒属、正痘病毒属、副痘病毒属、猪痘病毒属或亚塔痘病毒属的脊椎动物痘病毒亚科的属。在一些实施方案中，痘病毒是正痘病毒。在一些实施方案中，正痘病毒选自骆驼痘病毒(CMLV)、牛痘病毒(CPXV)、鼠痘病毒(ECTV，“鼠痘剂”)、马痘病毒(HPXV)、猴痘病毒(MPXV)、兔痘病毒(RPXV)、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦辛吉舒病病毒(Uasin Gishu virus)、痘苗病毒(VACV)、天花病毒(VARV)和田鼠痘病毒(VPV)。在一个优选的实施方案中，痘病毒是HPXV。在另一个优选实施方案中，痘病毒是VACV。在一些实施方案中，痘病毒是副痘病毒。在一些实施方案中，副痘病毒选自orf病毒(ORFV)、伪牛痘病毒(PCPV)、牛流行性口炎病毒(bovine popularstomatitits virus)(BPSV)、松鼠副痘病毒(SPPV)、马鹿副痘病毒、Ausdyk病毒、羚羊传染性脓疱病毒(Chamois contagious ecythema virus)、驯鹿副痘病毒或海豹痘病毒。在一些实施方案中，痘病毒是软疣痘病毒。在一些实施方案中，所述软疣痘病毒是传染性软疣病毒(MCV)。在一些实施方案中，痘病毒是亚塔痘病毒。在一些实施方案中，亚塔痘病毒选自塔纳痘病毒或雅巴猴肿瘤病毒(YMTV)。在一些实施方案中，痘病毒是山羊痘病毒。在一些实施方案中，山羊痘病毒选自绵羊痘病毒、山羊痘病毒或粗糙皮肤病病毒。在一些实施方案中，痘病毒是猪痘病毒。在一些实施方案中，猪痘病毒是猪痘病毒(swinepox virus)。在一些实施方案中，痘病毒是兔痘病毒。在一些实施方案中，兔痘病毒选自粘液瘤病毒、休普氏纤维瘤病毒(SFV)、松鼠纤维瘤病毒或野兔纤维瘤病毒。新的痘病毒(例如正痘病毒)仍在不断被发现。应理解，本发明的scPV可以基于这种新发现的痘病毒。
化学病毒基因组合成还开辟了对所得基因组或其特定部分引入大量有用修饰的可能性。所述修饰可以提高克隆的容易性以产生病毒，提供引入重组基因产物的位点，提高鉴定再激活的病毒克隆的容易性和/或赋予过多的其他有用特征(例如引入所需抗原、产生溶瘤病毒，等等。)。在一些实施方案中，修饰可包括一个或多个毒力因子的弱化或删除。在一些实施方案中，修饰可包括一个或多个毒力调节基因或编码调节因子的基因的添加或插入。
常规地，痘病毒的末端发夹难以克隆和测序，因此，一些公开的基因组序列(例如，VACV、ACAM 2000和HPXV MNR-76)不完整并不奇怪。公布的HPXV基因组序列同样不完整，可能从末端缺失～60bp。因此，HPXV发夹不能精确复制，并且在本发明之前，尚不知道HPXV是否可以仅基于HPXV基因组的已知部分从多核苷酸复制和组装。也不知道来自一种病毒的发夹可以在另一种病毒中起作用。在一个示例性实施方案中，使用公开的VACV端粒序列作为指导，化学合成129nt ssDNA片段，并将其连接至包含HPXV基因组的左端和右端的dsDNA片段上。在一些实施方案中，本发明的scPV的末端发夹源自VACV。在一些实施方案中，末端发夹源自CMLV、CPXV、ECTV、HPXV、MPXV、RPXV、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦辛吉舒病病毒或VPV。在一些实施方案中，末端发夹基于其基因组已被完全测序或其天然分离物可用于基因组测序的任何痘病毒的末端发夹。
在一些实施方案中，修饰可包括一个或多个限制性位点的缺失。在一些实施方案中，修饰可包括引入一个或多个限制性位点。在一些实施方案中，要从基因组中删除或添加到基因组中的限制性位点可以选自一个或多个限制性位点，例如但不限于AanI、AarI、AasI、AatI、AatII、AbaSI、AbsI、Acc65I、AccI、AccII、AccIII、AciI、AclI、AcuI、AfeI、AflII、AflIII、AgeI、AhdI、AleI、AluI、AlwI、AlwNI、ApaI、ApaLI、ApeKI、ApoI、AscI、AseI、AsiSI、AvaI、AvaII、AvrII、BaeGI、BaeI、BamHI BanI、BanII、BbsI、BbvCI、BbvI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BclI、BcoDI、BfaI、BfuAI、BfuCI、BglI、BglII、BlpI、BmgBI、BmrI、BmtI、BpmI、Bpu10I、BpuEI、BsaAI、BsaBI、BsaHI、BsaI、BsaJI、BsaWI、BsaXI、BseRI、BseYI、BsgI、BsiEI、BsiHKAI、BsiWI、BslI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BsoBI、Bsp1286I、BspCNI、BspDI、BspEI、BspHI、BspMI、BspQI、BsrBI、BsrDI、BsrFαI、BsrGI、BsrI、BssHII、BssSαI、BstAPI、BstBI、BstEII、BstNI、BstUI、BstXI、BstYI、BstZ17I、Bsu36I、BtgI、BtgZI、BtsαI、BtsCI、BtsIMutI、Cac8I、ClaI、CspCI、CviAII、CviKI-1、CviQI、DdeI、DpnI、DpnII、DraI、DrdI、EaeI、EagI、EarI、EciI、Eco53kI、EcoNI、EcoO109I、EcoP15I、EcoRI、EcoRV、FatI、FauI、Fnu4HI、FokI、FseI、FspEI、FspI、HaeII、HaeIII、HgaI、HhaI、HincII、HindIII、HinfI、HinP1I、HpaI、HpaII、HphI、Hpy166II、Hpy188I、Hpy188III、Hpy99I、HpyAV、HpyCH4III、HpyCH4IV、HpyCH4V、I-CeuI、I-SceI、KasI、KpnI、LpnPI、MboI、MboII、MfeI、MluCI、MluI、MlyI、MmeI、MnlI、MscI、MseI、MslI、MspA1I、MspI、MspJI、MwoI、NaeI、NarI、NciI、NcoI、NdeI、NgoMIV、NheI、NlaIII、NlaIV、NmeAIII、NotI、NruI、NsiI、NspI、PacI、PaeR7I、PciI、PflFI、PflMI、PleI、PluTI、PmeI、PmlI、PpuMI、PshAI、PsiI、PspGI、PspOMI、PspXI、PstI、PvuI、PvuII、RsaI、RsrII、SacI、SacII、SalI、SapI、Sau3AI、Sau96I、SbfI、ScrFI、SexAI、SfaNI、SfcI、SfiI、SfoI、SgrAI、SmaI、SmlI、SnaBI、SpeI、SphI、SrfI、SspI、StuI、StyD4I、StyI、SwaI、TaqαI、TfiI、TseI、Tsp45I、TspMI、TspRI、Tth111I、XbaI、XcmI、XhoI、XmaI、XmnI或ZraI。应当理解，可以将任何所需的限制性位点或限制性位点的组合插入基因组中或从基因组中突变和/或消除。在一些实施方案中，从病毒基因组中删除一个或多个AarI位点。在一些实施方案中，从病毒基因组中删除一个或多个BsaI位点。在一些实施方案中，从基因组中完全消除一个或多个限制性位点(例如，可以消除病毒基因组中的所有AarI位点)。在一些实施方案中，将一个或多个AvaI限制性位点引入病毒基因组中。在一些实施方案中，将一个或多个StuI位点引入病毒基因组中。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰可以包括重组工程靶标的掺入，所述重组工程靶标包括但不限于loxP或FRT位点。
在一些实施方案中，修饰可以包括荧光标记物的引入，所述荧光标记物是诸如但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、增强的GFP、黄色荧光蛋白(YFP)、青色/蓝色荧光蛋白(BFP)、红色荧光蛋白(RFP)或其变体等；选择标记物，诸如但不限于抗药性标记(例如大肠杆菌(E.coli)黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)、白黑链霉菌(Streptomycesalboniger)嘌呤霉素乙酰转移酶基因(pac)、新霉素磷酸转移酶I基因(nptI)、新霉素磷酸转移酶基因II(nptII)、潮霉素磷酸转移酶(hpt)，sh ble基因等；蛋白质或肽标签，诸如但不限于MBP(麦芽糖结合蛋白)、CBD(纤维素结合结构域)、GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、聚(His)、FLAG、V5、c-Myc、HA(血凝素)、NE-标签、CAT(氯霉素乙酰转移酶)、DHFR(二氢叶酸还原酶)、HSV(单纯疱疹病毒)、VSV-G(水泡性口炎病毒糖蛋白)、荧光素酶、蛋白A、蛋白G、链霉抗生物素蛋白、T7、硫氧还蛋白、酵母双杂交标签诸如B42、GAL4、LexA或VP16；定位标签，诸如NLS标签、SNAP标签、Myr标签等。应当理解，可以使用本领域已知的其他选择标记和/或标签。在一些实施方案中，修饰包括一个或多个选择标记，以帮助选择再激活的克隆(例如，荧光标记物诸如YFP、药物选择标记物诸如gpt等)，以帮助选择再激活的病毒克隆。在一些实施方案中，在选择步骤后从再激活的克隆中删除所述一个或多个选择标记物。
本发明的scPV可用作疫苗以保护免受致病性痘病毒感染(例如VARV、MPXV、MCV、ORFV、Ausdyk病毒、BPSV、海豹痘病毒等)，用作治疗或预防致病性痘病毒感染(例如VARV、MPXV、MCV、ORFV、Ausdyk病毒、BPSV、海豹痘病毒等)的治疗剂，用作异源基因表达的媒介物，或用作溶瘤剂。在一些实施方案中，本发明的scPV可用作疫苗以保护免受天花病毒感染。在一些实施方案中，本发明的scPV可用于治疗或预防VARV感染。
产生合成嵌合痘病毒的方法
本发明提供了用于从病毒基因组的化学合成的重叠双链DNA片段合成、再激活和分离功能性合成嵌合痘病毒(scPV)的系统和方法。病毒基因组的重叠DNA片段的重组和功能性scPV的再激活在先前用辅助病毒感染的细胞中进行。简言之，化学合成包含scPV的全部或基本上全部病毒基因组的重叠DNA片段并将其转染到辅助病毒感染的细胞中。培养转染的细胞以产生包含辅助病毒和再激活的scPV的混合病毒后代。接下来，将混合的病毒后代铺在不支持辅助病毒生长，但允许合成嵌合痘病毒生长的宿主细胞上，以消除辅助病毒并回收合成的嵌合痘病毒。在一些实施方案中，辅助病毒不感染宿主细胞。在一些实施方案中，辅助病毒可感染宿主细胞但在宿主细胞中生长不良。在一些实施方案中，与scPV相比，辅助病毒在宿主细胞中生长更慢。
在一些实施方案中，基本上所有合成嵌合痘病毒基因组均源自化学合成的DNA。在一些实施方案中，约40％、约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、超过99％或100％的合成嵌合痘病毒基因组源自化学合成的DNA。在一些实施方案中，痘病毒基因组源自化学合成的DNA与天然存在的DNA的组合。
用于本发明方法的重叠DNA片段的数量将取决于痘病毒基因组的大小。实际考虑因素诸如一方面随着片段数量的增加而重组功效下降以及另一方面随着片段数量减少而合成非常大的DNA片段变得困难也将为本发明的方法中使用的重叠片段的数量提供信息。在一些实施方案中，可将嵌合痘病毒基因组合成为单个片段。在一些实施方案中，从2-14个重叠DNA片段组装合成嵌合痘病毒基因组。在一些实施方案中，从4-12个重叠DNA片段组装合成嵌合痘病毒基因组。在一些实施方案中，从6-10个重叠DNA片段组装合成嵌合痘病毒基因组。在一些实施方案中，从8-12个重叠DNA片段组装合成嵌合痘病毒基因组。在一些实施方案中，从8-10个、10-12个或10-14个重叠DNA片段组装合成嵌合痘病毒基因组。在一些实施方案中，从2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个重叠DNA片段组装合成嵌合痘病毒基因组。在一些实施方案中，从10个重叠DNA片段组装合成嵌合痘病毒基因组。在本公开的一个示例性实施方案中，从10个化学合成重叠双链DNA片段中再激活合成嵌合马痘病毒(scHPXV)。在一些实施方案中，单独合成末端发夹环并将其连接至包含痘病毒基因组的左端和右端的片段上。在一些实施方案中，末端发夹环可源自天然存在的模板。在一些实施方案中，本发明的scPV的末端发夹源自VACV。在一些实施方案中，末端发夹源自CMLV、CPXV、ECTV、HPXV、MPXV、RPXV、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦辛吉舒病病毒或VPV。在一些实施方案中，末端发夹基于其基因组已被完全测序或其天然分离物可用于基因组测序的任何痘病毒的末端发夹。在一些实施方案中，化学合成包含痘病毒基因组的所有片段。在一些实施方案中，化学合成一个或多个片段，并且一个或多个片段源自天然存在的DNA(例如通过PCR扩增或通过已建立的重组DNA技术)。
用于本发明方法的重叠片段的大小将取决于痘病毒基因组的大小。应当理解，片段大小可以有很大的变化，并且各种实际考虑因素，诸如化学合成非常大的DNA片段的能力，将为片段大小的选择提供信息。在一些实施方案中，片段的大小范围为约2,000bp至约50,000bp。在一些实施方案中，片段的大小范围为约3,000bp至约45,000bp。在一些实施方案中，片段的大小范围为约4,000bp至40,000bp。在一些实施方案中，片段的大小范围为约5,000bp至35,000bp。在一些实施方案中，最大片段为约20,000bp、21,000bp、22,000bp、23,000bp、24、000bp、25,000bp、26,000bp、27,000bp、28,000bp、29,000bp、30,000bp、31,000bp、32,000bp、33,000bp、34,000bp、35,000bp、36,000bp、37,000bp、38,000bp、39,000bp、40,000bp、41,000bp、42,000bp、43,000bp、44,000bp、45,000bp、46,000bp、47,000bp、48,000bp、49,000bp或50,000bp。在本公开的一个示例性实施方案中，从大小范围为约8,500bp至约32,000bp的10个化学合成的重叠双链DNA片段(表1)中再激活scHPXV。
辅助病毒可以是任何能够提供从转染的DNA再激活痘病毒所需的反式作用酶促机制的痘病毒。辅助病毒可以具有与待产生的scPV不同或更窄的宿主细胞范围(例如，与正痘病毒诸如痘苗病毒(VACV)或HPXV相比，休普氏纤维瘤病毒(SFV)具有非常窄的宿主范围)。与待产生的scPV相比，辅助病毒可具有不同的噬斑表型。在一些实施方案中，辅助病毒是兔痘病毒。在一些实施方案中，兔痘病毒是SFV、野兔纤维瘤病毒、兔纤维瘤病毒、松鼠纤维瘤病毒或粘液瘤病毒。在一些实施方案中，辅助病毒是SFV。在一些实施方案中，辅助病毒是正痘病毒。在一些实施方案中，正痘病毒是骆驼痘病毒(CMLV)、牛痘病毒(CPXV)，鼠痘病毒(ECTV，“鼠痘剂”)、HPXV、猴痘病毒(MPXV)、兔痘病毒(RPXV)、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦辛吉舒病病毒、VACA和田鼠痘病毒(VPV)。在一些实施方案中，辅助病毒是禽痘病毒、山羊痘病毒、鹿痘病毒、Crocodylipoxvirus、软疣痘病毒、副痘病毒、猪痘病毒或亚塔痘病毒。在一些实施方案中，辅助病毒是禽痘病毒。在一些实施方案中，辅助病毒是α昆虫痘病毒、β昆虫痘病毒或γ昆虫痘病毒。在一些实施方案中，辅助病毒是补骨脂素灭活的辅助病毒。在本公开的一个示例性实施方案中，从转染到SFV感染的BGMK细胞中的重叠DNA片段中再激活scHPXV。然后通过将混合的病毒后代铺在BSC-40细胞上来消除SFV。
技术人员将理解，用于scPV的再激活和scPV的选择和/或分离的合适宿主细胞将取决于辅助病毒与通过本发明的方法产生的嵌合痘病毒的特定组合。任何支持辅助病毒和scPV二者生长的宿主细胞都可用于再激活步骤，任何不支持辅助病毒生长的宿主细胞都可用于消除辅助病毒以及选择和/或分离scPV。在一些实施方案中，辅助病毒是兔痘病毒，并且用于再激活步骤的宿主细胞可选自兔肾细胞(例如，LLC-RK1、RK13等)、兔肺细胞(例如R9ab)、兔皮肤细胞(例如，SF1Ep、DRS、RAB-9)、兔角膜细胞(例如，SIRC)、兔癌细胞(例如，Oc4T/cc)、兔皮肤/癌细胞(例如，CTPS)、猴细胞(例如，Vero、BGMK等)或仓鼠细胞(例如，BHK-21等)。在一些实施方案中，辅助病毒是SFV。
可在任何允许病毒生长至允许使用本文所述scPV的滴度的基质中繁殖本发明的scPV。在一个实施方案中，基质允许scPV生长至与针对对应的野生型病毒所测定的滴度相当的滴度。本发明的scPV可以在易受痘病毒感染的细胞(例如禽细胞、蝙蝠细胞、牛细胞、骆驼细胞、金丝雀细胞、猫细胞、鹿细胞、马细胞、禽细胞、沙鼠细胞、山羊细胞、人细胞、猴细胞、猪细胞、兔细胞、浣熊细胞、海豹细胞、绵羊细胞、臭鼬细胞、田鼠细胞等)中生长。此类方法是本领域技术人员公知的。代表性哺乳动物细胞包括但不限于BHK、BGMK、BRL3A、BSC-40、CEF、CEK、CHO、COS、CVI、HaCaT、HEL、HeLa细胞、HEK293、人骨骨肉瘤细胞系143B、MDCK、NIH/3T3、Vero细胞等)。对于病毒分离，通常通过众所周知的澄清方法(例如，诸如梯度离心和柱色谱法)从细胞培养物中取出scPV并与细胞组分分离，并且可以使用本领域技术人员熟知的方法(例如，噬斑测定)根据需要进一步纯化。
本发明的多核苷酸
本发明提供了用于产生功能性合成嵌合痘病毒(scPV)的多核苷酸(例如双链DNA片段)。本发明提供了从合成DNA(例如化学合成的DNA、PCR扩增的DNA、工程化DNA，包含核苷类似物的多核苷酸等)产生功能性scPV的方法。在一些实施方案中，本发明提供了从病毒基因组的化学合成重叠双链DNA片段产生功能性scPV的方法。可以基于公众可获得的基因组序列设计本发明的多核苷酸。在容易获得痘病毒的天然分离物的情况下，可在选择和设计本发明的多核苷酸之前对病毒基因组进行测序。或者，在痘病毒的部分DNA序列(例如来自临床分离物、法医样品或来自与感染者相关的材料的PCR扩增DNA)可用的情况下，可以在选择和设计本发明的多核苷酸之前对部分病毒基因组进行测序。本发明的scPV以及因此本发明的多核苷酸可基于天然存在的株、变体或突变体、诱变的病毒或遗传工程化病毒的基因组序列。
本发明提供分离的多核苷酸，其包括与参考痘病毒基因组序列或其互补序列的全部或部分具有至少90％同一性(例如，至少91％、92％、93％或94％同一性)、至少95％同一性(例如，至少96％、97％、98％或99％同一性)或100％同一性的核苷酸序列。本发明的分离的多核苷酸可包括参照多核苷酸分子(例如，参照痘病毒基因组或其片段)的至少5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、7000bp、8000bp、9000bp、10000bp、15000bp、20000bp、25000bp、30000bp、35000bp、40000bp、45000bp或更多bp的连续或非连续核苷酸。本领域普通技术人员将理解，与核酸互补的核酸序列和所述核酸的变体也在本发明的范围内。在另外的实施方案中，本发明的核酸序列可以是分离的、重组的和/或与异源核苷酸序列融合，或存在于DNA文库中。
在一些方面，本发明提供用于产生scPV的多核苷酸，其中痘病毒选自禽痘病毒、山羊痘病毒、鹿痘病毒、Crocodylipoxvirus、兔痘病毒、软疣痘病毒、正痘病毒、副痘病毒、猪痘病毒或亚塔痘病毒。在一些实施方案中，痘病毒是正痘病毒。在一些实施方案中，正痘病毒选自骆驼痘病毒(CMLV)、牛痘病毒(CPXV)、鼠痘病毒(ECTV，“鼠痘剂”)、HPXV、猴痘病毒(MPXV)、免痘病毒(RPXV)、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦辛吉舒病病毒、VACA、天花病毒(VARV)和田鼠痘病毒(VPV)。在一个优选实施方案中，痘病毒是HPXV。在另一个优选实施方案中，痘病毒是VACV。在另一个优选实施方案中，痘病毒是VACV的ACAM2000克隆。在另一个优选的实施方案中，痘病毒是VACV株IOC(VACV-10C)(Genbank登录号KT184690和KT184691)。在另一个优选实施方案中，scVACV基因组基于改良的痘苗病毒Ankara(Genbank登录号U94848；Genbank登录号AY603355)。在另一个优选实施方案中，scVACV基因组基于MVA-BN(Genbank登录号DQ983238)。在一些实施方案中，痘病毒是副痘病毒。在一些实施方案中，副痘病毒选自orf病毒(ORFV)、伪牛痘病毒(PCPV)、牛流行性口炎病毒(BPSV)、松鼠副痘病毒(SPPV)、马鹿副痘病毒、Ausdyk病毒、羚羊传染性脓疱病毒、驯鹿副痘病毒或海豹痘病毒。在一些实施方案中，痘病毒是软疣病毒。在一些实施方案中，所述软疣病毒是传染性软疣病毒(MCV)。在一些实施方案中，痘病毒是亚塔痘病毒。在一些实施方案中，亚塔痘病毒选自塔纳痘病毒或雅巴猴肿瘤病毒(YMTV)。在一些实施方案中，痘病毒是羊痘病毒。在一些实施方案中，羊痘病毒选自绵羊痘病毒、山羊痘病毒或粗糙皮肤病病毒。在一些实施方案中，痘病毒是猪痘病毒。在一些实施方案中，猪痘病毒是猪痘病毒(swinepox virus)。在一些实施方案中，痘病毒是兔痘病毒。在一些实施方案中，兔痘病毒选自粘液瘤病毒、休普氏纤维瘤病毒(SFV)、松鼠纤维瘤病毒或野兔纤维瘤病毒。新的痘病毒(例如正痘病毒)仍在不断被发现。应理解，本发明的scPV可以基于这种新发现的痘病毒。
在一些方面，scPV是CMLV，其基因组基于公开的基因组序列(例如毒株CMS(Genbank登录号AY009089.1))。在一些方面，scPV是CPXV，其基因组基于公开的基因组序列(例如毒株Brighton Red(Genbank登录号AF482758)、株GRI-90(Genbank登录号X94355))。在一些方面，scPV是ECTV，其基因组基于公开的基因组序列(例如株Moscow(Genbank登录号NC_004105))。在一些方面，scPV是MPXV，其基因组基于公开的基因组序列(例如株Zaire-96-1-16(Genbank登录号AF380138))。在一些方面，scPV是RPXV，其基因组基于公开的基因组序列(例如株Utrecht(Genbank登录号AY484669))。在一些方面，scPV是沙鼠痘病毒，其基因组基于公开的基因组序列(例如株Dahomey 1968(Genbank登录号NC_008291))。
在一个方面，本发明提供了用于产生合成嵌合马痘病毒(scHPXV)的多核苷酸。在一个具体实施方案中，scHPXV基因组可基于针对HPXV株MNR-76(SEQ ID NO:49)所描述的基因组序列(Tulman ER、Delhon G、Afonso CL、Lu Z、Zsak L、Sandybaev NT等Genome ofhorsepox virus.Journal of virology.2006；80(18):9244-58)。该基因组序列不完整，似乎不包括末端发夹环的序列。此处显示来自痘苗病毒(VACV)的末端发夹环可以连接到HPXV基因组的末端以使用本发明的方法产生功能性scHPXV颗粒。HPXV基因组可以分成10个重叠片段，如本公开的工作实施例中所述的和表1中所示的。在一些实施方案中，基因组可以分为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、12个、14个或15个重叠片段。在一些实施方案中，可将完整基因组作为一个片段提供。表1中显示了示例性重叠片段的基因组位置和片段大小。表2显示了可相对于碱基序列在这些片段中进行的一些修饰。本发明的多核苷酸包含与SEQ ID NO:1-10具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含这些序列的变体，其中此类变体可包括错义突变、无义突变、重复、缺失和/或添加。SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12描述了VACV(WR株)末端发夹环的核苷酸序列。在一些实施方案中，末端发夹环包含与SEQ ID NO:11or SEQ ID NO:12具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。
本发明提供了分离的多核苷酸，其包括与参照HPXV基因组序列(例如SEQ ID NO:49)的全部或部分具有至少90％同一性(例如，至少91％、92％、93％或94％同一性)、至少95％同一性(例如，至少96％、97％、98％或99％同一性)或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含参照序列的变体，其中此类变体可包括错义突变、无义突变、重复、缺失和/或添加。本发明的分离的多核苷酸可包括参照多核苷酸分子(例如参照HPXV基因组，包括但不限于SEQ ID NO:49，或其部分)的至少5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、7000bp、8000bp、9000bp、10000bp、15000bp、20000bp、25000bp、30000bp、35000bp、40000bp、45000bp或更多bp的连续或非连续核苷酸。
另一方面，本发明提供了用于产生合成嵌合VACV(scVACV)的多核苷酸。在一个具体实施方案中，scVACV基因组基于公开的VACV基因组。在一个具体实施方案中，scVACV基因组基于株ACAM2000；Genbank登录号AY313847)。在一个具体实施方案中，scVACV基因组基于VACV-IOC(Genbank登录号KT184690和KT184691)。在一个具体实施方案中，scVACV基因组基于改良的痘苗病毒Ankara(Genbank登录号U94848；Genbank登录号AY603355)。在一个具体实施方案中，scVACV基因组基于MVA-BN(Genbank登录号DQ983238)。VACV基因组可以分为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、12个、14个或15个重叠片段。在一些实施方案中，可将完整基因组作为一个片段提供。在一个具体实施方案中，VACV基因组被分成9个重叠片段，如表7所示。本发明的多核苷酸包含与SEQ ID NO:50-58具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含这些序列的变体，其中此类变体可包括错义突变、无义突变、重复、缺失和/或添加。在其他实施方案中，scVACV基因组基于选自以下株的VACV株：Western Reserve(Genbank登录号NC 006998；Genbank登录号AY243312)、CL3(Genbank登录号AY313848)、Tian Tian(Genbank登录号AF095689.1)、Tian Tian克隆TT9(JX489136)、TP3(Genbank登录号KC207810)和TP5(Genbank登录号KC207811)、NYCBH、Wyeth、Copenhagen(Genbank登录号M35027)、Lister 107(Genbank登录号DQ121394)、Lis ter-LO(Genbank登录号AY678276)、改良的痘苗病毒Ankara(MVA)(Genbank登录号U94848；Genbank登录号AY603355)、MVA-BN(Genbank登录号DQ983238)、Lederle、Tashkent克隆TKT3(Genbank登录号KM044309)和TKT4(KM044310)、USSR、Evans、Praha、LIVP、Ikeda、IHD-W(Genbank登录号KJ125439)、LC16m8(AY678275)、EM-63、IC、Malbran、Duke(Genbank登录号DQ439815)、3737(Genbank登录号DQ377945)、CV-1、Connaught Laboratories、CVA(Genbank登录号AM501482)、Serro 2病毒(Genbank登录号KF179385)、Cantaglo病毒分离株CM-01(Genba登录号KT013210)、Dryvax克隆DPP15(Genbank登录号JN654981)、DPP20(Genbank登录号JN654985)、DPP13(Genbank登录号JN654980)、DPP17(Genbank登录号JN654983)、DPP21(Genbank登录号JN654986)。VACV基因组可以分为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、12个、14个或15个重叠片段。在一些实施方案中，可将完整基因组作为一个片段提供。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，其包括与参照基因组序列或其互补序列(例如，VACV)的全部或部分具有至少90％同一性(例如，至少91％、92％、93％或94％同一性)、至少95％同一性(例如，至少96％、97％、98％或99％同一性)或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含参照序列的变体，其中此类变体可包括错义突变、无义突变、重复、缺失和/或添加。本发明的分离的多核苷酸可包括参照基因组或其部分的至少5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、7000bp、8000bp、9000bp、10000bp、15000bp、20000bp、25000bp、30000bp、35000bp、40000bp、45000bp或更多bp的连续或非连续核苷酸。
与本文公开的任何多核苷酸序列互补的多核苷酸也包括在本发明中。多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA分子(基因组或合成的)或RNA分子。RNA分子包括mRNA分子。另外的编码或非编码序列可以但不必存在于本发明的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必与其他分子和/或支持材料连接。
如果两个序列中的核苷酸或氨基酸的序列在如下所述进行最大对应性比对时是相同的，则称两个多核苷酸或多肽序列是“相同的”。通常通过在比较窗口上比较序列来进行两个序列的比较，以鉴定和比较局部区域的序列相似性。如本文中所用，“比较窗口”是指至少约20个连续位置，通常为30至约75个连续位置，或40至约50个连续位置的区段，其中在将两个序列最佳对齐后，可将序列与具有相同数目的连续位置的参照序列进行比较。多核苷酸或变体也可以或可选地与本文提供的多核苷酸基本上同源。此类多核苷酸变体能够在中等严格条件下与本发明的多核苷酸(或其互补序列)杂交。
合适的“中等严格条件”包括在5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-65℃、5X SSC中杂交过夜；然后在65℃下用含有0.1％SDS的2X、0.5X和0.2XSSC的每一种洗涤2次，每次20分钟。
如本文中所用，“高度严格条件”或“高严格性条件”是以下那些条件：(1)使用低离子强度和高温进行洗涤，例如在50℃下使用0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交过程中在42℃下使用变性剂，诸如甲酰胺，例如含有0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5以及750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠的50％(v/v)甲酰胺；或(3)在42℃下使用50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt溶液、超声处理的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，在42℃下于0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤以及在55℃下于50％甲酰胺中洗涤，然后进行由55℃下的含有EDTA的0.1x SSC组成的高严格性洗涤。本领域技术人员将认识到如何根据需要调节温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
可以使用化学合成、重组方法或PCR获得本发明的多核苷酸。化学多核苷酸合成的方法是本领域熟知的，不需要在本文中详细描述。本领域技术人员可使用本文提供的序列和商业DNA合成仪来产生所需的DNA序列。
为了使用重组方法制备多核苷酸，可将包含所需序列的多核苷酸插入合适的载体中，然后可将载体导入合适的宿主细胞中用于复制和扩增，如本文进一步论述的。可通过本领域已知的任何方法将多核苷酸插入宿主细胞中。通过直接摄取、内吞作用、转染、F-接合或电穿孔引入外源多核苷酸来转化细胞。一旦引入，外源多核苷酸就可作为非整合载体(诸如质粒)保持在细胞内或整合到宿主细胞基因组中。可通过本领域熟知的方法从宿主细胞中分离如此扩增的多核苷酸。参见，例如，Sambrook等，1989。
或者，PCR允许复制DNA序列。PCR技术是本领域熟知的，并描述于美国专利第4,683,195号、第4,800,159号、第4,754,065号和第4,683,202号以及PCR:The PolymeraseChain Reaction,Mullis等，编辑，Birkauswer Press,Boston,1994中。
可通过在合适的载体中使用分离的DNA并将其插入合适的宿主细胞来获得RNA。当细胞复制并且DNA被转录成RNA时，然后可使用本领域技术人员熟知的方法分离RNA，例如如Sambrook等，1989(同上)中所述的。
在其他实施方案中，本发明的核酸还包括在高度严格条件下与SEQ ID NO:1-10或50-58中所示的核苷酸序列或与其互补的序列杂交的核苷酸序列。本领域普通技术人员将容易理解，可以改变促进DNA杂交的适当严格性条件。例如，可以在约45℃下在6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)下进行杂交，然后在50℃下用2.0x SSC进行洗涤。例如，洗涤步骤中的盐浓度可选自在50℃下约2.0x SSC的低严格性至在50℃下的约0.2x SSC的高严格性。另外，洗涤步骤中的温度可以从室温(约22℃)下的低严格性条件增加至约65℃下的高严格性条件。温度和盐都可以变化，或者温度或盐浓度可保持恒定而另一个变量变化。在一个实施方案中，本发明提供了核酸，其在室温下的6x SSC的低严格性条件下杂交，然后在室温下在2xSSC中洗涤。
由于遗传密码中的简并性而不同的分离的核酸也在本发明的范围内。例如，许多氨基酸由不止一个三联体指定。指定同一氨基酸的密码子或同义密码子(例如，CAU和CAC是组氨酸的同义密码子)可以导致“沉默”突变，其不影响蛋白质的氨基酸序列。本领域技术人员将理解，由于天然等位基因变异，编码特定蛋白质的核酸的一个或多个核苷酸(高达约3-5％的核苷酸)的这些变异可存在于给定物种的成员中。任何和所有此类核苷酸变异和所得氨基酸多态性都在本发明的范围内。
本发明还提供了可用于克隆本发明的多核苷酸的重组克隆载体和表达载体。本发明还提供了包含本发明的多核苷酸分子或重组载体的转化宿主细胞，以及源自其的新型毒株或细胞系。
宿主细胞可以是细菌细胞、酵母细胞、丝状真菌细胞、藻类细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。已经开发了专门用于这些宿主细胞中的每一种的多种不同的载体，包括噬菌体、高拷贝数质粒、低拷贝数质粒和穿梭载体等，并且这些载体中的任一种都可用于实施本发明。
合适的克隆载体可以根据标准技术构建，或者可选自本领域可获得的大量克隆性载体。虽然选择的克隆载体可根据预期使用的宿主细胞而变化，但有用的克隆载体通常具有自我复制的能力，可具有特定限制性内切核酸酶的单个靶标，和/或可携带用于选择含有所述载体的克隆的标记的基因。合适的实例包括质粒和细菌病毒，例如pBAD18、pUC18、pUC19、Bluescript(例如，pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA和穿梭载体诸如pSA3和pAT28。这些和许多其他克隆性载体可从商业供应商诸如BioRad、Strategene和Invitrogen获得。
为了帮助选择用本发明的克隆性载体转化或转染的宿主细胞，可将载体工程化以进一步包含报告基因产物或其他选择标记的编码序列。如上所述，这种编码序列优选与调控元件编码序列有效关联。可用于本发明的报告基因在本领域中是公知的，包括编码绿色荧光蛋白、萤光素酶、xylE和酪氨酸酶等的那些基因。编码选择标记的核苷酸序列是本领域熟知的，包括编码赋予抗生素或抗代谢物抗性或提供营养缺陷需求的基因产物的核苷酸序列。此类序列的实例包括编码对氨苄青霉素、红霉素、硫链丝菌肽或卡那霉素等的抗性的序列。
含有目标多核苷酸的载体和/或多核苷酸本身可以通过许多适当的方法引入宿主细胞，所述方法包括电穿孔、使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染；微粒轰击；脂转染；和感染(例如，其中载体是传染性因子诸如痘苗病毒)。引入载体或多核苷酸的选择通常取决于宿主细胞的特征。
本发明还提供了包含本发明的多核苷酸分子或重组载体的转化宿主细胞，以及源自其的新型菌株或细胞系。在一些实施方案中，可用于实施本发明的宿主细胞是大肠杆菌细胞。通常可以使用大肠杆菌菌株，诸如大肠杆菌TOP10，或大肠杆菌BL21(DE3)，DH5α等，其可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)、10801University Blvd.、Manassas、Va.20110、USA和商业来源获得。在一些实施方案中，可使用其他原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是选自以下的属的成员：梭菌属Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺菌属(Shigella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱菌属(Alcaligenes)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、子囊菌酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、念珠菌属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)或酵母菌属(Saccharomyces)。此类转化的宿主细胞通常包括但不限于微生物，诸如用重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA载体转化的细菌，或用重组载体转化的酵母等。优选的真核宿主细胞包括酵母细胞，尽管也可以有效地利用哺乳动物细胞或昆虫细胞。合适的宿主细胞包括原核生物(诸如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtillis)、变青链霉菌(S.lividans)或谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum))和酵母(诸如酿酒酵母(S.cerevisae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)或乳酸克鲁维酵母(K.lactis))。
在一个方面，本发明还包括scPV的基因组、其重组体或其功能部分。病毒基因组的功能部分可以是编码蛋白质或其部分(例如结构域，表位等)的基因组的一部分，包含调节元件或调节元件(诸如启动子、增强子、顺式或反式元件等)的组分的部分。此类病毒序列可用于鉴定或分离病毒或其重组体，例如通过使用PCR、杂交技术或通过建立的ELISA测定。
示例性用途
预防或治疗致病性痘病毒感染
本发明的合成嵌合痘病毒(scPV)可用于免疫受试者以抵抗致病性痘病毒感染。本发明的scPV可用于预防、控制或治疗受试者中的一种或多种致病性痘病毒感染。在一些实施方案中，致病性痘病毒是正痘病毒(例如，骆驼痘病毒(CMLV)、牛痘病毒(CPXV)、鼠痘病毒(ECTV，“鼠痘剂”)、HPXV、猴痘病毒(MPXV)、兔痘病毒(RPXV)、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦辛吉舒病病毒、痘苗病毒(VACV)、天花病毒(VARV)和田鼠痘病毒(VPV)。在一些实施方案中，致病性痘病毒是副痘病毒(例如，orf病毒(ORFV)、伪牛痘病毒(PCPV)、牛流行性口炎病毒(BPSV)、松鼠副痘病毒(SPPV)、马鹿副痘病毒、Ausdyk病毒、羚羊传染性脓疱病毒、驯鹿副痘病毒或海豹痘病毒。在一些实施方案中，致病性痘病毒是软疣痘病毒(例如，传染性软疣病毒(MCV))。在一些实施方案中，致病性痘病毒是亚塔痘病毒(例如，塔纳痘病毒或雅巴猴肿瘤病毒(YMTV))。在一些实施方案中，致病性痘病毒是山羊痘病毒(例如，绵羊痘病毒、山羊痘病毒或粗糙皮肤病病毒)。在一些实施方案中，痘病毒是猪痘病毒(例如，猪痘病毒(swinepox virus))。在一些实施方案中，致病性痘病毒是兔痘病毒(例如粘液瘤病毒、休普氏纤维瘤病毒(SFV)、松鼠纤维瘤病毒或野兔纤维瘤病毒)。在一些实施方案中，致病性痘病毒是VARV。在一些实施方案中，致病性痘病毒是MPXV。在一些实施方案中，致病性痘病毒是MCV。在一些实施方案中，致病性痘病毒是ORFV。在一些实施方案中，致病性痘病毒是CPXV。致病性痘病毒可以是痘病毒假型或嵌合体。在一些实施方案中，受试者是人受试者。在一些实施方案中，受试者是动物受试者。新的痘病毒(例如正痘病毒)仍在不断被发现。应当理解，本发明的scPV可用于免疫受试者以抵抗新发现的致病性痘病毒或用于预防、控制或治疗新发现的致病性痘病毒的感染。
本发明的scPV可用于免疫原性制剂，例如疫苗制剂。该制剂可用于预防、控制、中和、治疗和/或改善致病性痘病毒感染。免疫原性制剂可包含活的或灭活的本发明的scPV。scPV可通过本领域技术人员熟知的方法灭活。常用方法使用福尔马林和加热灭活。在一些实施方案中，免疫原性制剂包含活疫苗。这种活免疫原性制剂的生产可以使用常规方法完成，所述方法包括将scPV在细胞培养物中繁殖，然后纯化。例如，可以在BHK、BGMK、BRL3A、BSC-40、CEF、CEK、CHO、COS、CVI、HaCaT、HEL、HeLa细胞、HEK293、人骨骨肉瘤细胞系143B、MDCK、NIH/3T3、Vero细胞等中培养scPV，这可由技术人员确定。
在一个方面，本发明的scPV可用于预防、控制或治疗天花。本发明的scPV(例如合成嵌合HPXV(scHPXV)或合成嵌合VACV(scVACV))可用作在已暴露于天花、可能暴露于天花或有暴露于天花的风险的个体或群体中预防天花的疫苗。本发明的scPV可用于产生新的天花疫苗(例如本发明的scHPXV或scVACV)的国家储备。在一些实施方案中，可以向国防腐人员、第一响应者等预防性地施用本发明的scPV。
在一个实施方案中，包含本发明的scHPXV的组合物用作天花疫苗。此处显示，根据本发明的方法产生的scHPXV具有小的噬斑表型。通常，小的噬斑表型被认为反映弱化。因此，根据本发明方法产生的scHPXV为现有的天花疫苗提供了安全的替代方案。在一些实施方案中，疫苗对于向免疫被抑制的受试者(例如，HIV患者、正在接受化学疗法的患者、正在接受癌症、风湿病症或自身免疫性疾病治疗的患者、正在接受或已接受器官或组织移植的患者、患有免疫缺陷的患者、儿童、孕妇、患有特应性皮炎、湿疹、银屑病、心脏病的患者和免疫被抑制剂的患者等)的施用是安全的，所述患者可患有来自现有天花疫苗的严重并发症，因此对现有的天花疫苗是禁忌的。在一些实施方案中，可将疫苗与一种或多种抗病毒治疗组合使用以抑制病毒复制。在一些实施方案中，可将疫苗与马立克妥地(brincidofovir)治疗组合使用以抑制病毒复制。在一些实施方案中，可将疫苗与替韦立马/SIGA-246治疗组合使用以抑制病毒复制。在一些实施方案中，可将疫苗可以与无环核苷膦酸盐(西多福韦)、无环核苷的口服烷氧基烷基前药或膦酸盐(brincidofovir或CMX001)组合使用。在一些实施方案中，可将疫苗与痘苗病毒免疫球蛋白(VIG)组合使用。在一些实施方案中，疫苗可用于先前已经用源自VACV、VARV或HPXV的肽或蛋白质抗原免疫的受试者。在一些实施方案中，疫苗可用于先前已用杀死或灭活的VACV免疫的受试者。在一些实施方案中，疫苗可用于先前已用复制缺陷/缺陷型VACV病毒株MVA(改良的病毒Ankara)免疫的受试者。包含本发明的scHPXV的疫苗制剂可包含活的或灭活的scHPXV。
在一个实施方案中，包含本发明的scVACV的组合物用作天花疫苗。scVACV可以基于选自以下株的VACV株：Western Reserve(Genbank登录号NC 006998；Genbank登录号AY243312)、CL3(Genbank登录号AY313848)、Tian Tian(Genbank登录号AF095689.1)、TianTian克隆TT9(JX489136)、TP3(Genbank登录号KC207810)和TP5(Genbank登录号KC207811)、NYCBH、Wyeth、Copenhagen(Genbank登录号M35027)、Lister 107(Genbank登录号DQ121394)、Lister-LO(Genbank登录号AY678276)、改良的痘苗病毒Ankara(MVA)(Genbank登录号U94848；Genbank登录号AY603355)、MVA-BN(Genbank登录号DQ983238)、Lederle、Tashkent克隆TKT3(Genbank登录号KM044309)和TKT4(KM044310)、USSR、Evans、Praha、LIVP、Ikeda、IHD-W(Genbank登录号KJ125439)、LC16m8(AY678275)、EM-63、IC、Malbran、Duke(Genbank登录号DQ439815)、3737(Genbank登录号DQ377945)、CV-1、ConnaughtLaboratories、CVA(Genbank登录号AM501482)、Serro 2病毒(Genbank登录号KF179385)、Cantaglo病毒分离株CM-01(Genba登录号KT013210)、Dryvax克隆DPP15(Genbank登录号JN654981)、DPP20(Genbank登录号JN654985)、DPP13(Genbank登录号JN654980)、DPP17(Genbank登录号JN654983)、DPP21(Genbank登录号JN654986)和IOC(Genbank登录号KT184690和KT184691)。在一个实施方案中，用作天花疫苗的scVACV基于毒株ACAM2000(Genbank登录号AY313847)。在一个实施方案中，用作天花疫苗的scVACV基于毒株VACV-10C(Genbank登录号KT184690和KT184691)。在一个实施方案中，用作天花疫苗的scVAVC基于毒株MVA(Genbank登录号U94848；Genbank登录号AY603355)。在一个实施方案中，用作天花疫苗的scVACV基于毒株MVA-BN(Genbank登录号DQ983238)。包含本发明的scPV的疫苗制剂可包含活的或灭活的scVACV。
在一些实施方案中，包含本发明的scPV(例如scHPXV或scVACV)的组合物用作针对VACV感染、MPXV感染或CPXV感染的疫苗。
在一些实施方案中，本发明的scPV可被设计来表达异源抗原或表位，并且可用作针对此类抗原和/或表位的来源生物的疫苗。
本发明的免疫原性制剂(例如疫苗)包含有效量的本发明的scPV和药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物，更特别地人。术语“载体”是指与药物组合物(例如，免疫原性或疫苗制剂)一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐水溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。合适的药物载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。所述制剂应适合施用方式。具体的制剂还可取决于scPV是活的还是灭活的。可将本发明的纯化scPV冻干用于以后使用，或者可将其立即在药物溶液中制备。还可将scPV在佐剂或载体存在或不存在的情况下于生理学上可接受的溶液诸如无菌盐水中稀释。
可通过划痕向患者施用本发明的免疫原性制剂(例如疫苗)。还可通过任何其他标准施用途径施用疫苗。许多方法可用于引入免疫原性制剂(例如，疫苗)，这些方法包括但不限于鼻内、气管内、口腔、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、结膜和皮下途径。在鸟类中，该方法还可包括后鼻孔接种。作为肠胃外施用的替代方案，本发明还包括用于农业目的的大规模施用途径，诸如通过饮用水或于喷雾剂中。或者，优选通过其天然感染途径引入本发明的scPV。在一些实施方案中，可将本发明的免疫原性制剂作为可注射液体、表达疫苗的可消费转基因植物、持续释放凝胶或可植入包封组合物、固体植入物或核酸施用。还可将免疫原性制剂在乳膏、洗液、软膏、皮肤贴剂、锭剂或口服液体诸如悬浮液、溶液和乳液(水包油或油包水)中施用。
在某些实施方案中，本发明的免疫原性制剂(例如，疫苗)不能完全保护免受感染，但与未处理受试者相比，导致较低的滴度或减少的病原体(例如，致病性痘病毒)数量。在某些实施方案中，施用本发明的免疫原性制剂导致相对于未处理受试者病原体滴度下降0.5倍、1倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍或1,000倍或更多倍。病原体滴度、数量或总负荷下降的益处包括但不限于感染症状的严重性降低以及与感染相关的疾病或病况的长度缩短。
在某些实施方案中，本发明的免疫原性制剂(例如，疫苗)不能完全保护免受感染，但导致与未处理受试者相比症状数量减少或症状强度降低，或发病率降低或死亡率降低。
在各种实施方案中，可向受试者施用本发明的免疫原性制剂(例如，疫苗)或由本发明的scPV产生的抗体与一种或多种其它疗法(例如抗病毒或免疫调节疗法)的组合以预防感染(例如致病性痘病毒感染)。在其他实施方案中，向受试者施用本发明的免疫原性制剂或由本发明的scPV产生的抗体与一种或多种其他疗法(例如抗病毒或免疫调节疗法)的组合以治疗感染(例如致病性痘病毒感染)。在其他实施方案中，向受试者施用本发明的免疫原性制剂或由本发明的scPV产生的抗体与一种或多种其他疗法(例如抗病毒或免疫调节疗法)的组合，以管理和/或改善感染(例如致病性痘病毒感染)。在具体实施方案中，可向受试者施用本发明的免疫原性制剂或由本发明的scPV产生的抗体与一种或多种其他疗法(例如抗病毒或免疫调节疗法)的组合以预防天花。在另一个具体实施方案中，可向受试者施用本发明的免疫原性制剂或由本发明的scPV产生的抗体与一种或多种其他疗法(例如抗病毒或免疫调节疗法)的组合以治疗天花。在一些实施方案中，可将疫苗与一种或多种抗病毒治疗组合使用以抑制病毒复制。在一些实施方案中，可将疫苗与马立克妥地治疗组合使用以抑制病毒复制。在一些实施方案中，可将疫苗与替韦立马/SIGA-246治疗组合使用以抑制病毒复制。在一些实施方案中，可将疫苗与无环核苷膦酸盐(西多福韦)、无环核苷的口服烷氧基烷基前药或膦酸盐(马立克妥地或CMX001)组合使用。在一些实施方案中，可将疫苗与痘苗病毒免疫球蛋白(VIG)组合使用。在一些实施方案中，可将疫苗用于先前已用源自VACV、VARV或HPXV的肽或蛋白质抗原免疫的受试者。在一些实施方案中，可将疫苗用于先前已用杀死或灭活的VACV免疫的受试者。在一些实施方案中，可将疫苗用于先前已用复制缺陷/缺陷型VACV病毒株MVA(改良的病毒Ankara)免疫的受试者。
本领域技术人员熟知的任何抗病毒剂均可用于本发明的制剂(例如，疫苗制剂)和方法中。抗病毒剂的非限制性实例包括蛋白质、多肽、肽、融合蛋白抗体、核酸分子、有机分子、无机分子和抑制和/或减少病毒至其受体的附着、病毒至细胞中的内化、病毒复制或病毒从细胞中释放的小分子。特别地，抗病毒剂包括但不限于阻断细胞外病毒成熟的抗病毒剂(替韦立马/SIGA-246)、无环核苷膦酸盐(西多福韦)、无环核苷膦酸盐的口服烷氧基烷基前药(马立克妥地或CMX001)或痘苗病毒免疫球蛋白(VIG)。在一些实施方案中，抗病毒剂包括但不限于核苷类似物(例如，齐多夫定、阿昔洛韦、更昔洛韦、阿维拉滨、碘苷、曲氟尿苷和利巴韦林)、膦甲酸、金刚烷胺、金刚乙胺、沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦、α-干扰素和其他干扰素，以及AZT。
剂量和给药方案可由本领域技术人员根据待治疗的受试者的需要来确定。技术人员可以考虑诸如受试者的年龄或体重、所治疗的疾病或病况的严重度以及受试者对治疗的反应等因素。本发明的组合物可以例如根据需要施用或每天施用。给药可以在不同的时间段内进行。例如，给药方案可持续1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周或更长。在一些实施方案中，给药方案将持续1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长。
本发明的scPV还可用于产生可用于被动免疫疗法、诊断或预后免疫测定等的抗体。产生抗体的方法是本领域熟知的。在用于免疫疗法之前，可以进一步修饰抗体(例如，嵌合、人源化等)。
溶瘤剂
本发明的合成嵌合痘病毒(scPV)可用作在癌细胞中选择性复制并杀死癌细胞的溶瘤剂。快速分裂的细胞，诸如癌细胞，通常比非分裂细胞更容许痘病毒感染。痘病毒的许多特征，诸如在人中的安全性、高滴度原液生产的容易性、病毒制剂的稳定性以及在肿瘤细胞中复制后诱导抗肿瘤免疫的能力使得痘病毒成为理想的溶瘤剂。根据本发明的方法产生的scPV可包含一个或多个使其适合于治疗癌症的修饰。因此，在一个方面，本公开提供了诱导癌细胞的死亡的方法，该方法包括使细胞与分离的scPV或包含本发明的scPV的药物组合物接触。在一个方面，本公开提供了治疗癌症的方法，该方法包括向有此需要的患者给予治疗有效量的本发明的scPV。另一方面包括使用本文所述的scPV或组合物诱导肿瘤性疾病细胞(诸如癌细胞)的死亡或治疗肿瘤性疾病(诸如癌症)。在一些实施方案中，将痘病毒溶瘤疗法与一种或多种常规癌症疗法(例如，手术、化学疗法、放射疗法、热疗法和生物学/免疫学疗法)组合施用。在具体实施方案中，溶瘤病毒是本发明的合成嵌合VACV(scVACV)。在一些实施方案中，溶瘤病毒是本发明的合成嵌合粘液瘤病毒。在一些实施方案中，溶瘤病毒是本发明的合成嵌合HPXV(scHPXV)。在一些实施方案中，溶瘤病毒是本发明的合成嵌合浣熊痘病毒。在一些实施方案中，溶瘤病毒是本发明的合成嵌合亚巴样疾病病毒。
使用本发明的方法，可以容易地引入一个或多个所需基因，并且可以从合成嵌合痘病毒基因组中容易地删除一个或多个不需要的基因。在一些实施方案中，用作溶瘤剂的本发明的scPV被设计为表达转基因以增强其免疫反应性、抗肿瘤靶向性和/或效力、细胞间扩散和/或癌症特异性。在一些实施方案中，设计或工程化本发明的scPV以表达免疫调节基因(例如，GM-CSF，或阻断TNF功能的病毒基因)。在一些实施方案中，本发明的scPV被设计为包括表达减弱毒力的因子的基因。在一些实施方案中，本发明的scPV被设计或工程化为表达治疗剂(例如hEPO、BMP-4、针对特定肿瘤抗原或其部分的抗体等)。在一些实施方案中，本发明的scPV已被改良以用于减毒。在一些实施方案中，本发明的scPV被设计或工程化为缺乏病毒TK基因。在一些实施方案中，本发明的scVACV被设计或工程化为缺乏痘苗生长因子基因。在一些实施方案中，本发明的scVACV被设计或工程化为缺乏血凝素基因。
本发明的scPV可用于治疗多种肿瘤性疾病和/或癌症。在一些实施方案中，癌症类型包括但不限于骨癌、乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、结直肠癌、食道癌、神经胶质瘤、胃癌、胃肠癌、头颈癌、肝癌诸如肝细胞癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌诸如黑素瘤、睾丸癌等，或可以治疗的任何其他肿瘤或瘤前病变。
在另一个实施方案中，该方法还包括检测施用的scPV在肿瘤性疾病或癌细胞中和/或来自施用了本文所述的分离的或重组的病毒或组合物的受试者的样品中的存在。例如，可在施用本文所述的scPV或组合物之前和/或之后测试受试者以评估例如感染的进展。在一些实施方案中，本公开的scPV包含检测盒并且检测施用的嵌合痘病毒的存在包括检测检测盒编码的蛋白质。例如，其中检测盒编码荧光蛋白，使用荧光可视化方法对受试者或样品成像。
本发明的溶瘤制剂包含有效量的本发明的scPV和药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物，更特别地人。术语“载体”是指与药物组合物(例如，溶瘤制剂)一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐水溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。合适的药物载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington's PharmaceuticalSciences”中。所述制剂应适合施用方式。
用于重组基因表达的病毒载体
本发明的合成嵌合痘病毒(scPV)可被工程化为携带异源序列。异源序列可来自不同的痘病毒种或来自任何非痘病毒来源。在一个方面，异源序列是选自任何非痘病毒来源的抗原表位。在一些实施方案中，重组病毒可以表达来自非痘病毒来源(包括但不限于恶性疟原虫，分枝杆菌，炭疽芽孢杆菌，霍乱弧菌，MRSA，弹状病毒，流感病毒，黄病毒科的病毒，副粘病毒，肝炎病毒，人免疫缺陷病毒)或来自引起出血热的病毒(诸如汉坦病毒或丝状病毒，即埃博拉或马尔堡病毒)的一种或多种抗原表位。另一方面，异源序列是来自不同痘病毒种的抗原表位。这些病毒序列可用于修饰scPV的宿主谱或免疫原性。
在一些实施方案中，本发明的scPV可编码表达治疗性核酸(例如反义核酸)或治疗性肽(例如具有所需生物活性的肽或蛋白质)的异源基因/核酸。
在一些实施方案中，异源核酸序列的表达优选但非排他地在痘病毒启动子的转录控制下。在一些实施方案中，异源核酸序列优选插入病毒基因组的非必需区域。将异源序列插入痘病毒基因组的方法是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，通过化学合成引入异源核酸。在示例性实施方案中，可将异源核酸克隆到本发明的scHPXV的HPXV095/J2R或HPXV044基因座中。
本发明的scPV可用于将异源核酸序列引入靶细胞中，所述序列与靶细胞同源或异源。将异源核酸序列引入靶细胞可用于产生体外异源肽或多肽，和/或由该序列编码的完整病毒。该方法包括用scPV感染宿主细胞；在合适的条件下培养感染的宿主细胞；以及分离和/或富集宿主细胞产生的肽、蛋白质和/或病毒。
应该理解，已经描述的本发明的实施方案仅仅是对本发明原理的一些应用的说明。基于本文给出的教导，本领域技术人员可以在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下进行许多修改。
以下实施例被列为代表本发明。这些实施例不应解释为限制本发明的范围，因为鉴于本公开内容、附图和所附实施方案，这些和其它等同实施方案将是显而易见的。
实施例
实施例1.病毒基因组的重叠片段的选择和设计
材料和方法
合成的嵌合HPXV(scHPXV)基因组的设计
scHPXV基因组的设计基于先前描述的HPXV(毒株MNR-76；图1A)的基因组序列[GenBank登录号DQ792504](Tulman ER,Delhon G,Afonso CL,Lu Z,Zsak L,Sandybaev NT等，Genome of horsepox virus.Journal of virology.2006；80(18):9244-58)。将212,633bp的基因组分成10个重叠片段(图1B)。这些片段被设计为使得它们与每个相邻片段共享至少1.0kbp的重叠序列(即同源性)，以提供同源重组将驱动全长基因组装配的位点(表1)。这些重叠序列将提供足够的同源性以准确地进行共转染片段之间的重组(Yao XD,Evans DH.High-frequency genetic recombination and reactivation oforthopoxviruses from DNA fragments transfected into leporipoxvirus-infectedcells.Journal of virology.2003；77(13):7281-90)。较短或较长的重叠有可能达到类似的目的。来自HPXV基因组序列的末端40bp(5’-TTTATTAAATTTTACTATTTATTTAGTGTCTAGAAAAAAA-3’)(SEQ ID NO:59)不包括在合成的反向末端重复序列(ITR)片段中。相反，SapI限制性位点被添加在ITR片段的5'-末端(GA_LITR)和3'-末端(GA_RITR)，接着是TGT序列。这些SapI限制性位点用于将VACV末端发夹连接到ITR片段上(如下所述)。
化学合成每个片段并使用每个片段上的末端SfiI限制性位点将其亚克隆到质粒中。为了帮助亚克隆这些片段，除这两个ITR-编码片段外，AarI和BsaI限制性位点在所有片段中被沉默突变(表2)。如果这些区域含有对高效DNA复制和串联体分辨重要的核苷酸序列特异性识别位点，则两个ITR编码片段中的BsaI限制性位点不被突变。
将在痘病毒早晚期启动子控制下的yfp/gpt盒引入GA_Fragment_3内的HPXV095/J2R基因座中，使得HPXV(scHPXV YFP-gpt::095)的再激活在荧光显微镜下易于可视化。gpt基因座还提供了使用药物选择来选择再激活的病毒的潜在工具。HPXV095编码非必需VACVJ2R基因的HPXV同源物，并通过将Fragment_3和其他HPXV克隆与VACV DNA一起共转染到SFV感染的BGMK细胞中，回收多种杂交病毒，验证选择策略(图13A和13B)。还将沉默突变引入HPXV044(VACVWRF4L)序列(GA_Fragment_2)，以在GA_Fragment_2中产生两个独特的限制性位点(表3)。在一些实施方案中，这些独特的限制性位点可用于在再激活HPXV之前将重组基因产物(诸如但不限于选择标记、荧光蛋白、抗原等)快速引入GA_Fragment_2。
表1：本研究中使用的HPXV基因组片段。指示了HPXV基因组内每个片段的大小和位置。
表2：在scHPXV YFP-gpt::095片段中产生的沉默突变，以从HPXV基因组中去除AarI和BsaI限制性位点。
表3：将沉默核苷酸突变引入HPXV044(VACV F4L)基因中以在GA_Fragment_2中产生独特的限制性内切核酸酶位点。
来自VACV(株WR)的末端发夹环的慢速(S)和快速(F)形式的合成
将自VACV(株WR)的末端发夹环的慢速(S)和快速(F)形式合成为157nt ssDNA片段(Integrated DNA Technologies；图2B)。通过DNA合成，在每个发夹的末端留下由三个核苷酸组成的5'悬突(5'-ACA；图2C)。也在末端发夹环中合成来自HPXV序列[DQ792504]的串联体分辨位点(图2B)。
scHPXV YFP-gpt::095片段的消化和纯化
将合成HPXV片段在50℃下用SfiI消化过夜。将scHPXV ITR片段用SapI(ThermoFisher Scientific)单独消化1小时，在65℃下灭活10分钟，然后在50℃下用SfiI消化过夜。将约1U的FastAP碱性磷酸酶添加到scHPXV YFP-gpt::095ITR消化物中，并在37℃下再孵育1小时。随后使用QiaexII DNA cleanup试剂盒(Qiagen)纯化所有scHPXV YFP-gpt::095片段。将所有scHPXV YFP-gpt::095片段从10mM Tris-HCl中的QiaexII悬浮液中洗脱。使用NanoDrop(ThermoFisher Scientific)估计DNA浓度。
结果
痘病毒催化非常高频的同源重组反应，所述同源重组反应与病毒复制过程密不可分。在本文中，证明了可使用病毒催化的重组和复制反应连接化学合成的HPXV双链体DNA的大片段以形成功能性scHPXV基因组。
使用公开的HPXV(株WNR-76)基因组序列，将212,633bp基因组分成10个重叠片段(图2)。除了ITR外的每个片段中的所有BsaI和AarI位点都被突变，以防该区域内的序列特异性位点在不知不觉中被需要来进行高效基因组复制和串联体分辨。如上所述，为了便于将来自VACA的末端发夹环结构添加到ITR的末端，分别在LITR和RITR片段的左侧末端和右侧末端旁边包含SapI识别位点(图2A)。将这些SapI位点嵌入侧翼载体序列中，并且SapI酶在位点下游、识别序列的外部和HPXV DNA中切割。因此，当用SapI切割DNA时，其在从HPXV序列复制的DNA中留下粘性末端，从而允许组装精确的序列拷贝(通过随后的连接)，不含有外来限制性位点。LITR和RITR片段的另一端(相对于基因组图谱的内部末端)各自由SfiI识别位点限定，其余HPXV片段的两端也是如此。所有这些DNA都以质粒形式提供，以便于扩增。为了制备用于转染到SFV感染的细胞中的内部片段，用SfiI消化这些质粒以从每个scHPXVYFP-gpt::095片段释放质粒(关于如何处理LITR和RITR片段,参见下文)。消化后，纯化每个反应物以除去任何污染酶，但不从消化物中除去质粒，并将所述质粒与每种scHPXV YFP-gpt::095片段一起共转染。这不会干扰反应，并且可被进行来最大限度地减少DNA操作的量和这些大DNA片段的可能的片段化。
虽然反应效率可受转染片段数量影响，但在本发明的方法中可使用多于或少于10个重叠片段。不受理论束缚，～15个片段可能代表实际上限而无需进一步优化再激活反应。理想的下限可以是单个基因组片段，但实际上端粒最容易被操作为更适度大小的片段(例如～10kb)。
实施例2.将VACV F-和S-末端发夹环连接到scHPXV YFP-gpt::095左侧和右侧ITR片段上
材料和方法
将末端发夹环的S型和F型连接到scHPXV YFP-gpt::095ITR片段上
将约1微克的每种末端VACV发夹环在95℃孵育5分钟，然后在冰上“快速”冷却以形成发夹结构。随后在连接之前将发夹环在其5'末端磷酸化。简言之，将分开的含有1μg VACVF-发夹或VACV S-发夹、2μl 10x T4多核苷酸激酶缓冲液(ThermoFisher Scientific)、1mMATP和10个单位的T4多核苷酸激酶的20μl反应物(ThermoFisher Scientific)在37℃下孵育1小时。通过在75℃下加热灭活终止反应。
在5％PEG-4000和5个单位的T4DNA连接酶存在的情况下，在16℃下将约1微克的左侧ITR或右侧ITR分别与20倍摩尔浓度过量的每种末端发夹一起孵育。将每个连接反应在65℃下热灭活10分钟，然后在冰上孵育直至准备转染到细胞中。
结果
正痘病毒编码在基因组的每个末端携带可变长度的反向末端重复序列(ITR)的线性dsDNA基因组。双链体基因组的两条链通过发夹环连接以形成共价连续的多核苷酸链。环富含A+T，不能形成完全碱基配对的结构，并且以两种形式存在，所述两种形式在序列上是反向和互补的(Baroudy BM,Venkatesan S,Moss B.Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genomeinto one uninterrupted polynucleotide chain.Cell.1982；28(2):315-24)(图2B)。它们基于它们的电泳特性被称为慢速[S]和快速[F]形式，并且可能折叠成部分双链发夹结构，所述结构封闭线性dsDNA基因组的末端(图2C)。已公开的HPXV基因组序列不完整，可能从末端缺失～60bp，因此使得不可能精确复制HPXV发夹。相反，使用公开的VACV端粒序列作为指导，并在每个发夹末端留下由3个核苷酸组成的5'悬突(5'-ACA；图2C)来化学合成157nt ssDNA片段(Baroudy BM,Venkatesan S,Moss B.Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genomeinto one uninterrupted polynucleotide chain.Cell.1982；28(2):315-24)。该悬突与通过用SapI切割克隆的LITR和RITR片段产生的末端互补。
基于表明HPXV与VACV之间的紧密共同祖先的数据，使用源自VACV的序列。使用来自其他痘病毒的其他末端发夹可以是可能的，因为在不同的Chordopoxviruses的发夹末端之间存在通常保守的序列特征。例如，发夹末端中的分辨位点在序列和功能性上都是高度保守的(它们类似于晚期启动子)。
将这些单链寡核苷酸加热至95℃，然后在冰上快速冷却，以形成不完全碱基配对的末端发夹(图2C)。然后，将每种寡核苷酸磷酸化并分别以20倍摩尔浓度过量与预先用SapI和SfiI消化的左侧或右侧ITR片段连接。用这些酶消化ITR在每个ITR的5'末端产生5'-TGT悬突，其与末端发夹环结构中的5'-ACA悬突互补。这产生了每个ITR的以发夹终止的拷贝。
为了证实以发夹终止的结构被添加到两个ITR片段上，用PvuII进行ITR片段的限制性消化。由于不可能通过凝胶电泳显现～70kb末端发夹在～10kb ITR末端的添加，因此用PvuII消化少量的每种连接。如果末端发夹未与ITR连接，则用PvuII消化产生1472bp的产物(图3A和3B，泳道2和5)。然而，如果末端发夹环被成功地添加到HPXV ITR中，则在琼脂糖凝胶上观察到ITR片段大小的增加(图3B，比较泳道2与3和4；比较泳道5与6和7)。这些数据表明，在这些条件下，几乎所有HPXV ITR都在片段的一个末端含有末端发夹环。
实施例3.从化学合成的dsDNA片段再激活scHPXV YFP-gpt::095
材料和方法
病毒和细胞培养
SFV株Kasza和BSC-40最初获自美国典型培养物保藏中心。水牛绿猴肾(BGMK)细胞获自G.McFadden(University of Florida)。将BSC-40和BGMK细胞在37℃，5％CO2中在最低必需培养基(MEM)中增殖，所述培养基补充有L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠、抗生素和抗真菌剂，以及5％胎牛血清(FCS；ThermoFisher Scientific)。
在休普氏纤维瘤病毒感染的细胞中再激活scHPXV YFP-gpt::095
将水牛绿猴肾(BGMK)细胞在含有MEM的60mm组织培养皿中培养，直至它们达到约80％的汇合。在无血清MEM中以0.5的MOI用休普氏纤维瘤病毒(SFV)在37℃下感染细胞1小时。用3ml含有5％FCS的温热MEM替换接种物，并将其返回培养箱中再进行1小时。同时，如下设置转染反应。通过将1ml Opti-MEM中的约5μg总合成HPXV DNA片段与在1ml Opti-MEM中以3:1(Lipofectamine2000对总DNA)的比率稀释的Lipofectamine2000混合来制备Lipofectamine复合物。测定每种HPXV片段的相对量的样品计算示于表4中。将复合物在室温下孵育10分钟，然后滴加到先前用SFV感染的BGMK细胞中。感染后约16小时，用含有5％FCS的新鲜MEM替换培养基。将细胞在37℃下再培养4天(总共5天)。通过将感染的细胞刮到细胞培养基中并进行三个冷冻和解冻循环来回收病毒颗粒。将粗提取物在无血清MEM中稀释10-2，并将4ml接种物涂布在BSC-40细胞的9-16个150mm组织培养板上，以回收再激活的scHPXV YFP-gpt::095。感染后1小时，用含有5％FCS和0.9％Noble琼脂的MEM替换接种物。在倒置显微镜下观察黄色荧光噬斑，挑选各个噬斑用于进一步分析。将ScHPXV YFP-gpt::095噬斑用黄色荧光选择进行噬斑纯化三次。
表4：转染到SFV感染的BGMK细胞中的每种GA_HPXV片段的量的样品计算。
结果
先前已描述了组装重组痘苗病毒的正痘病毒DNA的SFV催化的重组和再激活(YaoXD,Evans DH.High-frequency genetic recombination and reactivation oforthopoxviruses from DNA fragments transfected into leporipoxvirus-infectedcells.Journal of virology.2003；77(13):7281-90；和Yao XD,Evans DH.Constructionof recombinant vaccinia viruses using leporipoxvirus-catalyzed recombinationand reactivation of orthopoxvirus DNA.Methods Mol Biol.2004；269:51-64)。几个生物特征使其成为有吸引力的模型系统。首先，SFV具有狭窄的宿主范围，有效地感染兔细胞和某些猴细胞系，如BGMK。其可以感染像BSC-40的细胞，但在其上生长不良。其次，与正痘病毒相比，其生长得更慢，花费约4-5天在单层细胞中形成转化的“病灶”，这一特征与正痘病毒非常不同，后者在培养的1-2天内产生噬斑。兔痘病毒与正痘病毒之间的这种生长差异允许通过在BGMK细胞中进行再激活测定并将后代涂布在BSC-40细胞上来区分这些病毒。在一些实施方案中，可以使用其他辅助病毒(例如但不限于禽痘病毒)。在一些实施方案中，可使用不同的细胞组合。
用SFV以0.5的MOI感染BGMK细胞，然后在2小时后用5μg消化的GA_HPXV片段(表4)转染所述细胞。转染后5天，通过细胞裂解回收所有感染性颗粒并将其重新涂布在BSC-40细胞上，所述BSC-40细胞仅高效地支持HPXV(或其他正痘病毒)的生长。在荧光显微镜下使所得的再激活的scHPXV YFP-gpt::095噬斑可视化。Frag_3内的HPXV095/J2R基因座中的yfp/gpt选择标记使得能够进行可视化(图2A)。在转染48小时内在BSC-40单层中检测到病毒噬斑。恢复scHPXV YFP-gpt::095的效率取决于许多因素，包括DNA转染效率(但范围高达数个PFU/μg的转染的DNA)。
实施例4.通过PCR和限制性片段分析确认scHPXV YFP-gpt::095基因组序列
材料和方法
scHPXV的PCR和限制性消化分析
为了快速确认在再激活的噬斑挑选中存在scHPXV YFP-gpt::095，PCR引物被设计为侧接在scHPXV中被突变的各个BsaI位点(表5)。从用scHPXV YFP-gpt::095感染的BSC-40细胞中分离基因组scHPXV YFP-gpt::095DNA并用作模板。将来自VACV感染的BSC-40细胞的基因组DNA用作对照以确认BsaI位点存在于每种PCR产物中。PCR扩增后，随后用BsaI在37℃下消化反应物1小时。在含有安全染料的1％琼脂糖凝胶上分离PCR反应物，以使DNA条带可视化。
通过限制性消化，然后通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)对使用蔗糖梯度纯化分离的基因组DNA进行scHPXV YFP-gpt::095基因组的进一步分析(Yao XD,Evans DH.Constructionof recombinant vaccinia viruses using leporipoxvirus-catalyzed recombinationand reactivation of orthopoxvirus DNA.Methods Mol Biol.2004；269:51-64)。简言之，将100ng纯化的病毒基因组DNA用5U BsaI或HindIII在37℃消化2小时。将消化的DNA在1％Seakem Gold琼脂糖凝胶铸件上运行，并在0.5X tris-硼酸盐-EDTA电泳(TBE)缓冲液[110mM tris；90mM硼酸盐；2.5mM EDTA]运行。使用1至10秒的切换时间梯度、线性斜坡因子和120°的角，在14℃下以5.7V/cm在CHEF DR-III装置(BioRad)上分离DNA，持续9.5小时。该程序允许分辨1kbp至>200kbp的DNA种类。为了分离75bp至5kbp的片段，在1.5％琼脂糖凝胶铸件上进行电泳，并在室温下在115V下于1.0X TBE中运行2小时。用金染料使DNA可视化。将消化的scHPXV YFP-gpt::095DNA片段的大小与对照VACV基因组DNA进行比较。
表5：在该研究中用于扩增围绕在GA_Fragment_1A、GA_Fragment_1B、GA_Fragment_2、GA_Fragment_3、GA_Fragment_4、GA_Fragment_5、GA_Fragment_6和GA_Fragment_7内发现的BsaI限制位点的VACV和HPXV内的区域的引物。
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结果
通过PCR、限制性消化和全基因组测序确认从再激活测定中生长的噬斑中分离的病毒的基因组序列。PCR分析基于除ITR HPXV片段外的所有片段内的突变的BsaI位点。引物组被设计为侧接scHPXV YFP-gpt::095中的每个BsaI位点(表5)。确认了这些引物组也扩增VACV WR内的类似区域。在PCR扩增围绕scHPXV YFP-gpt::095内的这些突变的BsaI位点的约1kb区域后，用BsaI消化每个反应，并通过凝胶电泳分析所得的DNA片段。由于在VACV(wt)中没有BsaI位点突变，因此酶促消化成功地消化了每种PCR产物，产生较小的DNA片段(图4A，VACV)。从scHPXV YFP-gpt::095基因组DNA产生的PCR产物对BsaI消化具有抗性，表明BsaI识别位点在这些基因组中被成功突变(图4A，scHPXV YFP-gpt::095(PP1)和scHPXVYFP-gpt::095(PP3))。引物组7C的引物产物不导致scHPXV YFP-gpt::095PP1和PP3样品中的DNA的任何扩增。为了确认该引物组是否是无功能的，或者片段7的该区域是否组装到所得的scHPXV YFP-gpt::095基因组中，对原始GA_Frag_7质粒DNA进行PCR，并且该反应在扩增产物中也是不成功的。
接着从蔗糖梯度纯化的scHPXV YFP-gpt::095基因组中分离基因组DNA，用BsaI或HindIII消化，并通过琼脂糖凝胶电泳分离以证实scHPXV YFP-gpt::095中的大多数BsaI位点被成功突变。有趣的是，与VACV相比，来自3种不同scHPXV YFP-gpt::095克隆的未消化的基因组DNA在凝胶上运行明显更慢，证实scHPXV YFP-gpt::095的基因组(213,305bp)大于VACV-WR(194,711bp)(图4B，将泳道2-4与泳道5进行比较)。scHPXV YFP-gpt::095克隆对BsaI消化具有抗性，在通过PFGE分离后产生一个大的DNA片段(～198000bp)和约4000bp的较小DNA片段(图4A，泳道7-9)。这与VACV-WR基因组形成对比，所述VACV-WR基因组在用BsaI消化时导致在凝胶上分离出许多DNA片段(图4B，泳道10)。由于用BsaI消化scHPXV YFP-gpt::095基因组后预期的DNA大小相对较小(表6)，因此通过常规琼脂糖凝胶电泳分离这些消化产物，并证实了scHPXV YFP-gpt::095产生适当大小的片段(图4C，泳道2-4)。还证实了scHPXV YFP-gpt::095在HindIII消化后产生正确大小的DNA片段，表明这些识别在合成大的DNA片段期间得以保持(表6；图4B，泳道12-14；图4C，泳道6-8)。总体而言，scHPXV YFP-gpt::095基因组的体外分析表明，来自化学合成的DNA片段的HPXV的再激活是成功的。
表6：用BsaI或HindIII消化的scHPXV YFP-gpt::095DNA片段的预期大小。
由于HPXV095编码非必需VACV J2R基因的HPXV同源物，通过将Fragment_3和其他HPXV克隆与VACV DNA一起共转染到SFV感染的BGMK细胞中，可以回收多种杂交病毒，验证了选择策略(图13A和13B)。通过将VACV DNA与HPXV Frag_3(图1)共转染到SFV感染的细胞中获得第一杂交病毒(“VACV/HPXV+片段3”)。绿色标记的插入物编码YPF-gpt选择标记。通过从该第一杂交基因组中纯化DNA并将其与HPXV片段2、4、5和7一起再次转染到SFV感染的细胞中，获得克隆1-3。PCR引物被设计为靶向HPXV和VACV(表5)，用于扩增跨越scHPXV克隆中突变的BsaI位点的DNA区段。PCR扩增后，用BsaI消化产物以区分VACV序列(其切割)与HPXV(其不切割)。VACV/HPXV杂交体表现出BsaI敏感和抗性位点的混合，而再激活的scHPXVYFP-gpt::095克隆是完全BsaI抗性的。
实施例5.通过全基因组序列分析确认scHPXV YFP-gpt::095基因组序列
材料和方法
病毒DNA的分离和测序
制备HPXV YFP-gpt::095克隆(噬斑挑选[PP]1.1、PP 2.1和PP3.1])的原液，并将其在蔗糖梯度上纯化。使用蛋白酶K消化，然后通过酚-氯仿提取，从每种纯化的病毒制备物中提取病毒DNA。使用Qubit dsDNA HS测定试剂盒(ThermoFisher Scientific)测定dsDNA的量。在University of Alberta的分子生物学设施(MBSU)对每种病毒基因组进行测序。使用Nextera Tagmentation系统(Epicenter Biotechnologies)生成测序文库。使用Illumina MiSeq平台对约50ng的每个样品进行剪切，并制备文库以进行配对末端测序(2x300bp)，其中基因组中的平均读取深度为3,100个读数·nt-1，F-发夹和S-发夹中的平均读取深度为～190个读数·nt-1。
序列组装、分析和注释
使用CLC Genomics Workbench 8.5软件修剪具有低质量序列得分的原始测序读数并将其初步映射至HPXV参照序列[GenBank登录号DQ792504]。针对HPXV参照序列验证scHPXV YFP-gpt::095序列内的所有核苷酸插入、缺失和取代。将基因组注释转移实用程序(Genome Annotation Transfer Utility)(Tcherepanov V,Ehlers A,Upton C.GenomeAnnotation Transfer Utility(GATU):rapid annotation of viral genomes using aclosely related reference genome.BMC Genomics.2006；7:150.Epub 2006/06/15)用于将参考注释转移到scHPXV基因组序列。
结果
使用多重方法和Illumina MiSeq测序仪对纯化的scHPXV YFP-gpt::095基因组进行测序。将序列读数映射至野生型HPXV(DQ792504)和scHPXV YFP-gpt::095参照序列上，以证实scHPXV YFP-gpt::095基因组中存在特异性修饰。为了确认VACV末端重复序列被正确连接到左侧ITR的末端，分析了该基因组区域中的测序读数。将一串C添加到scHPXV YFP-gpt::095基因组参照序列的起始处，以捕获映射在该区域中的所有序列读数(图5A和5B)。这样做是因为用于组装序列读数的程序将以其他方式在scHPXV YFP-gpt::095基因组参照序列结束的点处截断序列的展示。
从映射的读数清楚地看出，尽管SapI识别位点存在于scHPXV YFP-gpt::095参考基因组中，但所有测序读数都缺少该序列。这证实了本文所述的方法在将合成发夹连接到ITR末端的位点处产生真正的HPXV序列。还成功地获得了VACV WR末端发夹环的完整序列，证明了所述序列与连接到TIR末端上的合成ssDNA的序列相同。总体而言，这些数据表明VACV-WR末端发夹环被成功地连接到HPXV ITR序列上并在传染性病毒中得以回收。此外，五种病毒中的每种病毒的F-读数和S-读数的1:1分布表明两个末端都需要用来产生病毒(图5B)
接下来，证实沉默突变BsaI位点的每个核苷酸取代已被正确地掺入scHPXV YFP-gpt::095基因组中(图6)。将测序读数映射到HPXV(DQ792504)参照序列。scHPXV YFP-gpt::095中来自区域96,050至96,500的整体Illumina测序读数覆盖度示于图6A中。从此处可以清楚地看出，该区域存在两个与参照HPXV无法正确对齐的矛盾(图6A，蓝色和黄色垂直线)。放大这些区域后，很明显的是在scHPXV YFP-gpt::095基因组中，在位置96,239处存在T至C的取代(图6B)，然后在位置96,437处存在A至G的取代(图6C)。证实了在scHPXV YFP-gpt::095基因组中产生了为了突变选择的BsaI和AarI识别位点而引入的所有核苷酸取代(表2)。
最后，确定HPXV044中被设计为在GA_Frag_2中产生独特限制性位点的核苷酸取代也掺入到scHPXV YFP-gpt::095基因组中。映射到HPXV044(区域44,400至45,100)的测序读数示于图7A中。在该区域内，存在两个区域，其中测序读数与HPXV YFP-gpt::095参照序列中的序列的读数矛盾(图7A，黄色垂直线)。放大这些区域后，很明显的是两个和至G的取代在位置44,512和45,061处被引入HPXV044的非编码链，从而在Frag_2中产生AvaI和StuI限制性位点(图7B和7C)。总体而言，测序数据证实了体外基因组分析数据，并证实scHPXVYFP-gpt::095在SFV感染的细胞中被成功地再激活。
实施例6.与其他痘病毒相比，ScHPXV YFP-gpt::095在HeLa细胞中复制更慢
材料和方法
BSC-40、HeLa和HEL成纤维细胞最初获自美国典型培养物保藏中心。将BSC-40细胞在37℃，5％CO2中于最低必需培养基(MEM)中增殖，所述培养基补充有L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠、抗生素和抗真菌剂，以及5％胎牛血清(FCS；ThermoFisherScientific)。将HeLa和HEL细胞在补充有L-谷氨酰胺、抗生素和抗真菌剂以及10％FCS的Dulbecco改良Eagle培养基中于37℃，5％CO2中增殖。
结果
使用多步生长曲线和噬斑大小测量来评估scHPXV YFP-gpt::095是否类似于其他正痘病毒在体外复制和扩散。由于无法获得天然HPXV分离株，因此将scHPXV YFP-gpt::095的生长与原型痘病毒VACV(株WR)、牛痘病毒(CPX)、一种与HPXV密切相关的痘病毒和Dryvax病毒克隆DPP15进行比较。以低MOI用VACV WR、CPX、DPP15或scHPXV YFP-gpt::095感染猴肾上皮细胞(BSC-40)、Vero细胞、人癌细胞系(HeLa)和原代人成纤维细胞(HEL)，并在72小时的时间过程中收获感染的细胞。在BSC-40细胞中，病毒复制和扩散的速率在所有测试的病毒中是相当的(图8A)。重要的是，scHPXV YFP-gpt::095以及任何另外的测试的痘病毒复制。病毒在HEL细胞和Vero细胞上生长至略低的滴度，在HeLa细胞上滴度最低。在HeLa细胞中，与其他正痘病毒相比，病毒产量降低高达1.5-log。
接下来，测量在BSC-40细胞中生长的scHPXV YFP-gpt::095的噬斑大小。与VACVWR和甚至牛痘病毒(图8B)相比，观察到scHPXV YFP-gpt::095的噬斑大小的统计学显著降低。有趣的是，在BSC-40细胞中，当与所有其他测试的正痘病毒相比时，scHPXV YFP-gpt::095产生最小的噬斑(图8C)。而且，虽然不同的VACV株产生形成较小的二级噬斑的细胞外病毒，但这些不是由scHPXV YFP-gpt::095产生的(图8C)。总体而言，这些数据表明，当与其他正痘病毒相比时，使用本文所述系统再激活scHPXV YFP-gpt::095不会在病毒体外复制和扩散中引入任何明显缺陷。此外，scHPXV YFP-gpt::095的噬斑大小与牛痘病毒(CPXV)的噬斑大小相似，表明合成病毒再激活对先前对于其他HPXV样克隆观察到的小噬斑表型没有任何有害影响(Medaglia ML,Moussatche N,Nitsche A,Dabrowski PW,Li Y,Damon IK等Genomic Analysis,Phenotype,and Virulence of the Historical Brazilian SmallpoxVaccine Strain IOC:Implications for the Origins and EvolutionaryRelationships of Vaccinia Virus.Journal of virology.2015；89(23):11909-25)。
实施例7.除去yfp/gpt选择标记
在再激活scHPXV YFP-gpt::095后，除去HPXV095基因座中的yfp/gpt选择标记。为此，合成对应于HPXV(DQ792504)中的核苷酸位置91573至92921的1349bp序列区域(ThermoFisher Scientific)(SEQ ID NO:60)。该片段包含位于wt HPXV095/J2R基因两侧的约400bp的同源性。将该DNA序列克隆到GeneArt提供的商业载体中。为了用HPXV095基因序列替换yfp/gpt盒，以0.5的MOI用scHPXV YFP-gpt::095感染BSC-40细胞，然后在2小时后使用Lipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific)，用2μg含有wtHPXV095序列的线性化质粒转染其。感染后48小时收获病毒重组体，并在琼脂下使用三轮非荧光噬斑纯化分离重组病毒(scHPXV(wt))。将PCR用于使用位于HPXV095基因座两侧的引物来确认scHPXV(wt)的身份。用于确认HPXV095基因的正确替换的引物是HPXV095_check-FWD 5’-CCTATTAGATACATAGATCCTCGTCG-3’(SEQ ID NO:61)和HPXV095_check-REV 5’-CGGTTTATCTAACGACACAACATC-3’(SEQ ID NO:62)。
实施例8.scHPXV(wt)对比scHPXV YFP-gpt::095的生长特性
在如上文实施例6中所述进行的实验中，scHPXV(wt)在体外显示出与scHPXV YFP-gpt::095无显著差异的生长特性(图14A-C)。与VACV WR相比，观察到scHPXV(wt)的噬斑大小的统计学显著减小(图14A)。与scHPXV YFP-gpt::095一样，scHPXV(wt)不产生细胞外病毒(图14B)，并且scHPXV(wt)和scHPXV YFP-gpt::095在BSC-40细胞、HEL细胞、HeLA细胞和Vero细胞上的生长没有显著差异(图14C)。鉴于该性质影响毒力，scHPXV(wt)不产生细胞外病毒的发现具有相关性。
实施例9.在鼠鼻内模型中测定scHPXV(wt)的毒力
在该研究中测定scHPXV(wt)的毒性作用。对于该实验，向6组Balb/c小鼠施用3个不同剂量的实施例1-7中描述的scHPXV(△HPXV_095/J2R)或scHPXV(wt)，并与PBS对照组以及VACV(WR)对照组和VACV(Dryvax株DPP15)对照组(总共9个处理组)进行比较。在该实验中包括另外3只小鼠，其在研究期间未接受任何治疗。在整个实验中，在预定点对所有小鼠进行血液取样，并将另外的小鼠作为血清分析的基线。
在接种Balb/c小鼠之前，将所有病毒株在BSC-40细胞(非洲绿猴肾)中生长，将其通过胰蛋白酶消化收获，在PBS中洗涤，通过杜恩斯匀浆从细胞中提取，通过超速离心经过36％蔗糖垫纯化，重悬于PBS中，并进行滴定，使得最终浓度为：1)VACV(WR)–5x 105PFU/ml；2)VACV(DPP15)–109PFU/ml；3)scHPXV(△HPXV_095/J2R)–107PFU/ml,108PFU/ml和109PFU/ml以及4)scHPXV(wt)-107PFU/ml,108PFU/ml和109PFU/ml。
选定用于该研究的scHPXV剂量(105PFU/剂量、106PFU/剂量和107PFU/剂量)是基于使用已知的VACV疫苗株(包括Dryvax和IOC)的先前研究(Medaglia ML,Moussatche N,Nitsche A,Dabrowski PW,Li Y,Damon IK等Genomic Analysis,Phenotype,andVirulence of the Historical Brazilian Smallpox Vaccine Strain IOC:Implications for the Origins and Evolutionary Relationships of VacciniaVirus.Journal of virology.2015；89(23):11909-25；Qin L,Favis N,Famulski J,EvansDH.Evolution of and evolutionary relationships between extant vaccinia virusstrains.Journal of virology.2015；89(3):1809-24)。
由于将体重减轻用作小鼠中的毒力量度，因此以5x 103PFU的剂量鼻内施用VACV(株WR)，这导致约20-30％的体重减轻。VACV Dryvax克隆DPP15也以107PFU/剂量鼻内施用，使得这种公知的天花疫苗的毒力可以直接与scHPXV(wt)进行比较。小鼠购自CharlesRiver实验室并且一旦接收，在病毒施用之前使其适应环境至少一周。
每只小鼠在麻醉下接受通过鼻内注射施用的单剂量的病毒(～10ul)。每天监测小鼠的感染迹象，诸如肿胀、排出(discharge)或其他异常，持续30天的时期。在病毒施用后每天特别监测每只小鼠的体重减轻。根据我们在University of Alberta的动物卫生保健机构协议(animal health care facility protocols)，将除了其他发病因素以外还体重减轻超过25％的小鼠经历安乐死。
即使在测试的最高剂量的scHPXV下，在Balb/c小鼠中也可能没有明显的疾病迹象。与scHPXV最密切相关的VACV毒株，旧南美病毒,在一些情况下在107PFU下没有产生疾病(Medaglia ML,Moussatche N,Nitsche A,Dabrowski PW,Li Y,Damon IK等GenomicAnalysis,Phenotype,and Virulence of the Historical Brazilian Smallpox VaccineStrain IOC:Implications for the Origins and Evolutionary Relationships ofVaccinia Virus.Journal of virology.2015；89(23):11909-25)。由于难以制备滴度超过109PFU/mL的纯化的原液，因此测试比此高得多的剂量是不切实际的。
实施例10.确定scHPXV是否赋予针对致死性VACV-WR攻击的免疫保护
在整个实验过程中，似乎不受实施例9中所述的初始病毒施用影响的小鼠通常继续增重。病毒接种后30天，随后通过鼻内接种用致死剂量的VACV-WR(106PFU/剂量)攻击小鼠。如上所述密切监测小鼠的感染迹象。每天对小鼠称重，并且将除了其他发病因素以外还体重减轻超过25％的小鼠实施安乐死。我们预期在施用致死剂量的VACV-WR之前用PBS接种的小鼠在接种后7-10天内显示出显著的体重减轻和其他发病因素的迹象。在用VACV-WR致死攻击后大约14天，对所有小鼠实施安乐死并收集血液以通过标准噬斑减少测定确认血清中存在VACV特异性中和抗体。
实施例11.使用SFV催化的重组和再激活反应构建合成嵌合VACV(株ACAM2000)(scACAM2000)
VACV(ACAM2000)基因组的重叠片段的设计
使用公开的VACV(株ACAM2000；Genbank登录号AY313847)的基因组序列，将基因组分成9个重叠片段(图9)，其长度范围为15,979bp至28,795bp(表7)。这些片段被设计为使得它们与每个相邻片段共享至少1.0kbp的重叠序列同源性，以提供同源重组可以驱动全长基因组组装的位点(表7)。这些重叠应足以支持共转染片段之间的准确和高效的重组。
为了成功合成和亚克隆这些大片段，将VACV_ACAM2000片段1至7中的每个BsaI和AarI位点沉默突变。与scHPXV的产生一样，未对两个ITR编码片段中的BsaI限制性位点进行突变，以防其中存在对高效DNA复制和串联体分辨重要的DNA序列特征。
对于初始再激活，用yfp/gpt盒替换VACV(ACAM2000)中的胸苷激酶以帮助回收新近再激活的VACV颗粒。
表7：本研究中使用的VACV ACAM2000基因组片段。描述了VACV ACAM2000基因组[GenBank登录号AY313847]内的大小、位置以及与相邻片段的重叠
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将末端环(来自VACV株ACAM2000)的S和F形式连接到VACV ITR的左端和右端
为了制备待转染到SFV感染的细胞中的VACV ITR片段，使用用于将VACV发夹连接到所述HPXV端粒的相同方法将末端发夹环连接至左侧和右侧ITR片段。简言之，通过DNA合成，在每个发夹的末端留下由三个核苷酸组成的5'悬突(5'-ACA；如实施例1和2中所述)。同时，编码左侧和右侧VACV ITR片段的质粒克隆被设计为编码紧邻编码VACV基因组起始的第一核苷酸的SapI识别位点。用SapI消化ITR克隆产生三碱基悬突(5'-TGT)，其与末端发夹环结构中的5'-ACA悬突互补。将左侧或右侧ITR片段与～20倍摩尔浓度过量的末端环混合并连接。这产生了每个ITR的发夹终止拷贝。
兔痘病毒催化的scACAM2000的重组和再激活
在VACV基因组DNA片段的消化和DNA清除后，将它们转染到SFV感染的BGMK细胞中。如前所述，SFV辅助病毒将催化共享侧翼同源序列的片段之间的重组，导致可以从细胞包装和释放的全长VACV基因组的产生。在该测定中不太可能产生杂交病毒。4天后，收获BGMK细胞，并通过冻融释放再激活的VACV病毒颗粒，然后将其涂布在易感BSC-40细胞上。再激活的VACV(ACAM2000)噬斑是在BSC-40细胞上形成噬斑的唯一病毒。挑选噬斑以产生克隆病毒原液，然后通过nextGen Illumina测序分离待测序的基因组DNA，以确认回收的病毒的完整性并鉴定scACAM2000是否被成功地再激活。
实施例12.scHPXV在小动物模型中的安全性和免疫原性
材料和方法
scHPXV感染的小鼠鼻内模型。六至八周龄的BALB/c小鼠购自Charles RiverLaboratories。用10μl PBS中的5×103PFU VACV(株WR)、1×107VACV(Dryvax DPP15)或1×105PFU、1×106PFU或1×107PFU的scHPXVYFP-gpt::095(在实施例1-6中描述的)或scHPXV(wt)(实施例7和8中描述的)鼻内感染(或模拟感染)5只小鼠的组。将小鼠每天称重，持续28天，并对以下临床体征进行评分：褶皱的皮毛、呼吸困难、活动减少和痘病变。对失去25％初始体重的小鼠实施安乐死。随后用1×106PFU VACV(株WR)鼻内攻击这些接种疫苗的小鼠，每天称重并监测如上所述的疾病的临床体征，持续13天。按照当地动物护理和使用委员会批准的方案，对失去25％初始体重的小鼠实施安乐死。
结果
scHPXV株在痘病毒感染的鼻内小鼠模型中不会引起体重减轻
在痘病毒感染的鼻内小鼠模型中检查scHPXVYFP-095或scHPXV(wt)的毒性作用。用指定剂量的scHPXV(wt)鼻内接种小鼠，并在28天的时间内监测它们的重量。在28天期间接种了任何剂量的scHPXVYFP-gpt::095或scHPXV(wt)的小鼠中没有明显的体重减轻(图10)。这与接种了Dryvax DPP15(107PFU)或VACV WR(5x 103PFU)的动物形成对比，后者分别平均损失其初始重量的15％和10％。这些数据表明，即使在测试的最高剂量的scHPXV(wt)和scHPXV YFP-gpt::095(107PFU)下，也没有观察到有害效应。然而，对于已知的天花疫苗株DPP15，在接种后～7天在小鼠中检测到短暂的体重减轻，尽管这些小鼠在接种后～10天恢复到其初始体重。
scHPXVYFP-gpt::095(106&107PFU)和scHPXV(wt)(105,106,107PFU)在BALB/c小鼠中赋予针对致死性VACV WR攻击的免疫保护
在用指定株的scHPXV YFP-gpt::095、scHPXV(wt)、DPP15和VACV WR对BALB/c小鼠进行28天免疫后(图10)，随后用致死鼻内剂量的VACV WR(106PFU)攻击小鼠以评估scHPXV(wt)或scHPXV YFP-gpt::095在小鼠中的保护功效。最初用PBS处理的所有小鼠都死于感染，而最初暴露于107PFU的Dryvax(DPP15)或5x 103PFU VACV WR的动物未显示体重减轻(图11A)和疾病迹象(图11B)。用两种较低剂量的scHPXV YFP-gpt::095接种的动物显示体重减轻(图11A)和基于临床得分的严重疾病迹象(图11B)，并且还观察到最低scHPXV YFP-gpt::095剂量中的两只动物死于感染(图12)。最终观察到scHPXV YFP-gpt::095的这些低剂量组中剩余的动物从感染中恢复，但其重量仍然低于其余组中的平均重量。先前暴露于105至107PFU的scHPXV(wt)的动物在痘病毒攻击后的最初几天仅显示出轻微的短暂体重减轻(图11A)，并且没有疾病的临床迹像(图11B)。这些数据显示scHPXV可以感染和免疫小鼠以抵抗致死性VACV攻击，并且可以这样进行而不会在初始免疫步骤期间引发疾病。

Claims (51)

1.一种合成的嵌合正痘病毒(scOPV)，其中所述scOPV由源自化学合成DNA的DNA进行复制和再激活而来，其中所述化学合成DNA基本上对应于野生型正痘病毒(OPV)的DNA，所述scOPV与相应野生型OPV的差异在于，所述scOPV具有衍生自化学合成DNA的左末端发夹环和右末端发夹环，其中末端发夹环之一或者两者对于相应的野生型OPV而言是异源的。
2.权利要求1的scOPV，其中所述相应野生型OPV选自以下的组：骆驼痘(CMLV)病毒、牛痘病毒(CPXV)、鼠痘病毒(ECTV)、马痘病毒(HPXV)、猴痘病毒(MPXV)、痘苗病毒(VACV)、天花病毒(VARV)、兔痘病毒(RPXV)、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦辛吉舒病病毒和田鼠痘病毒。
3.权利要求2的scOPV，其中所述相应野生型OPV是VACV。
4.权利要求3的scOPV，其中所述相应野生型OPV是VACV株ACAM2000。
5.权利要求3的scOPV，其中所述相应野生型OPV是VACV株IOC。
6.权利要求3的scOPV，其中所述相应野生型OPV是VACV株MVA。
7.权利要求3的scOPV，其中所述相应野生型OPV是VACV株MVA-BN。
8.权利要求2的scOPV，其中所述VACV选自下组中：Wes tern Reserve、克隆3、TianTian、Tian Tian克隆TT9、Tian Tian克隆TP3、NYCBH、Wyeth、Copenhagen、Lister 107、Lister-LO、IHD-W、LC16m18、Lederle、Tashkent克隆TKT3、Tashkent克隆TKT4、USSR、Evans、Praha、LIVP、Ikeda、EM-63、Malbran、Duke、3737、CV-1、Connaught Laboratories、Serro 2、CM-01、Dryvax克隆DPP13、Dryvax克隆DPP15、Dryvax克隆DPP20、Dryvax克隆DPP17、Dryvax克隆DPP21以及绒毛膜尿囊痘苗病毒Ankara。
9.权利要求1-8中任一项的scOPV，其中所述scOPV与相应的野生型OPV相比还包含一个或多个修饰，所述一个或多个修饰包含一个或多个缺失、插入、取代或其组合。
10.权利要求1-8中任一项所述的scOPV，其中所述一个或多个修饰包含引入一个或多个独特限制性位点的一个或多个修饰。
11.权利要求1-8中任一项的scOPV，其中所述一个或多个修饰包含消除一个或多个限制性位点的一个或多个修饰。
12.权利要求11的scOPV，其中所述一个或多个修饰包含消除一个或多个AarI限制性位点的一个或多个修饰。
13.权利要求11的scOPV，其中所述一个或多个修饰包含消除一个或多个BsaI限制性位点的一个或多个修饰。
14.权利要求1-8中任一项的scOPV，其中至少一个所述末端发夹环源自VACV。
15.权利要求14的scOPV，其中所述左末端发夹环和右末端发夹环包含a)分别包含所述VACV末端发夹环的慢速形式和快速形式，或b)分别包含所述VACV末端发夹环的快速形式和慢速形式。
16.权利要求15的scOPV，其中所述慢速形式包含与SEQ ID NO:11的序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，并且所述快速形式包含与SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。
17.权利要求15的scOPV，其中所述慢速形式包含与SEQ ID NO:11的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列，并且所述快速形式包含与SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列。
18.权利要求15的scOPV，其中所述慢速形式由SEQ ID NO:11的核苷酸序列组成，并且所述快速形式由SEQ ID NO:12的核苷酸序列组成。
19.权利要求1-8中任一项的scOPV，其中所述scOPV从重叠的化学合成DNA片段复制和再激活而来，所述DNA片段一起对应于基本上整个的相应野生型OPV。
20.权利要求19的scOPV，其中所述scOPV从2-14个重叠片段复制和再激活而来。
21.权利要求19的scOPV，其中所述scOPV从8-12个重叠片段复制和再激活而来。
22.权利要求19的scOPV，其中所述scOPV从10个重叠片段复制和再激活而来。
23.权利要求1-8中任一项的scOPV，其中使用兔痘病毒催化的重组和再激活来再激活所述scOPV。
24.权利要求23的scOPV，其中所述兔痘病毒选自：休普氏纤维瘤病毒(SFV)、野兔纤维瘤病毒、兔纤维瘤病毒、松鼠纤维瘤病毒和粘液瘤病毒。
25.权利要求1-8中任一项所述的scOPV，其中所述scOPV是合成的嵌合马痘病毒(scHPXV)，其中所述化学合成的DNA基本上对应于野生型马痘病毒(HPXV)的DNA，所述scHPXV与相应野生型HPXV的差异在于，所述scHPXV的特征在于衍生自化学合成DNA的左末端发夹环和右末端发夹环，这两个末端发夹环之一或者二者对于该相应的野生型HPXV而言是异源的。
26.权利要求25的scOPV，其中所述相应的HPXV是HPXV株MNR-76。
27.权利要求25的scOPV，其中所述一个或多个修饰存在于HPXV044基因座或HPXV095基因座中。
28.权利要求25的scOPV，其中所述一个或多个修饰包含表3中所列的一个或多个突变。
29.权利要求25的scOPV，其中所述一个或多个修饰包含表2中所列的一个或多个突变。
30.权利要求1-8中任一项的scOPV，其中所述末端发夹环中的至少一个衍生自骆驼痘病毒、牛痘病毒、鼠痘病毒、猴痘病毒、天花病毒、兔痘病毒、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦辛吉舒病病毒或田鼠痘病毒。
31.一种产生合成的嵌合正痘病毒(scOPV)的方法，其包括以下步骤：
(i)化学合成对应于基本上整个相应野生型正痘病毒(OPV)的重叠DNA片段；
(ii)化学合成独立地选自OPV的末端发夹环，其中所述末端发夹环中至少一个对于相应的OPV而言是异源的，并将所述末端发夹环连接至衍生自化学合成DNA的重叠DNA片段，所述化学合成DNA包含所述化学合成的重叠DNA片段的左和右末端；
(iii)将衍生自步骤(i)和(ii)的重叠的化学合成DNA片段的重叠DNA片段转染到辅助病毒感染的细胞中；
(iv)培养所述细胞以在所述细胞中产生辅助病毒和scOPV颗粒的混合物；以及
(v)将混合物铺板在OPV特异性宿主细胞上以回收所述scOPV。
32.权利要求31的方法，其中所述辅助病毒是兔痘病毒。
33.权利要求32的方法，其中所述兔痘病毒选自：休普氏纤维瘤病毒(SFV)、野兔纤维瘤病毒、兔纤维瘤病毒、松鼠纤维瘤病毒和粘液瘤病毒。
34.权利要求33的方法，其中所述兔痘病毒是SFV。
35.权利要求31的方法，其中所述辅助病毒是禽痘病毒。
36.权利要求31的方法，其中所述辅助病毒是补骨脂素灭活的辅助病毒。
37.权利要求31-34中任一项的方法，其中所述辅助病毒感染的细胞是BGMK细胞。
38.权利要求31-34中任一项的方法，其中所述OPV特异性宿主细胞是BSC-40细胞。
39.权利要求31-34中任一项的方法，其中相应的野生型OPV选自：骆驼痘病毒、牛痘病毒、鼠痘病毒、马痘病毒、猴痘病毒、痘苗病毒、天花病毒、兔痘病毒、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦辛吉舒病病毒和田鼠痘病毒。
40.权利要求39的方法，其中所述scOPV的相应野生型OPV是马痘病毒。
41.权利要求31-34和40中任一项的方法，其中所述scOPV是合成的嵌合马痘病毒(scHPXV)，所述scHPXV与相应的野生型HPXV的不同之处在于，所述scHPXV的特征在于衍生自化学合成DNA的左末端发夹环和右末端发夹环，所述末端发夹环之一或两者对于所述相应的野外型HPXV而言是异源的。
42.一种合成的嵌合正痘病毒(scOPV)，其通过权利要求31-41中任一项的方法产生。
43.一种组合物，其包含药学上可接受的载体以及权利要求1-30和42中任一项的scOPV。
44.权利要求1-30和42中任一项的scOPV在制备用于在有此需要的受试者中触发或加强针对天花病毒的免疫应答的药物中的用途。
45.权利要求1-30和42中任一项的scOPV在制备用于在有此需要的受试者中触发或加强针对痘苗病毒的免疫应答的药物中的用途。
46.权利要求1-30和42中任一项的scOPV在制备用于在有此需要的受试者中触发或加强针对猴痘病毒的免疫应答的药物中的用途。
47.权利要求1-30和42中任一项的scOPV在制备用于免疫人受试者以保护所述受试者免受天花病毒感染的药物中的用途。
48.权利要求1-30和42中任一项的scOPV在制备用于在有此需要的受试者中治疗天花病毒感染的药物中的用途。
49.权利要求44-48中任一项的用途，其中所述组合物在一个或多个天花不良事件期间施用。
50.权利要求49的用途，其中所述天花不良事件选自：牛痘性湿疹、进行性痘疹、接种后脑炎、心肌炎和扩张型心肌病。
51.一种试剂盒，其包含含有权利要求1-30和42中任一项的scOPV的组合物及其使用说明书。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3535389A4 (en) 2016-11-02 2020-06-03 David Evans SYNTHETIC CHIMERIC POCKET VIRUS
WO2018148710A1 (en) * 2017-02-13 2018-08-16 Excision Biotherapeutics, Inc. Visualizing viral reservoirs and dissemination in vivo
TW201946651A (zh) * 2018-05-02 2019-12-16 大衛 伊凡斯 合成之嵌合牛痘病毒
AU2021226592A1 (en) 2020-02-26 2022-09-22 The Governors Of The University Of Alberta Recombinant poxvirus based vaccine against SARS-CoV-2 virus
WO2023168286A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Tonix Pharmaceuticals Holding Corp. Recombinant poxvirus based vaccine against the omicron strain of sars-cov-2 virus and variants thereof

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2787577A (en) 1953-12-01 1957-04-02 Lilly Co Eli Stable smallpox vaccine
US4754065A (en) 1984-12-18 1988-06-28 Cetus Corporation Precursor to nucleic acid probe
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US6723325B1 (en) 2001-04-23 2004-04-20 Acambis, Inc. Smallpox vaccine
CA2431349A1 (en) * 2002-06-06 2003-12-06 Xiao-Dan Yao Method of producing a recombinant virus
EP1678292A4 (en) 2003-09-18 2008-05-07 Univ Emory IMPROVED MVA VACCINES
CN101020055B (zh) 2006-02-16 2012-08-08 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心 基于复制型痘苗病毒载体的sars疫苗
FI20115914L (fi) 2011-09-16 2013-03-17 Oncos Therapeutics Ltd Muunnettu onkolyyttinen virus
WO2014160475A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Aboody Karen S Tropic cell based virotherapy for the treatment of cancer
EP3045181B1 (en) 2015-01-19 2018-11-14 Ludwig-Maximilians-Universität München A novel vaccine against the middle east respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV)
EA201800148A1 (ru) 2015-08-11 2019-01-31 Калиди Биотерапьютикс, Инк. Оспенная вакцина для лечения рака
EP3515419A4 (en) 2016-09-21 2020-06-10 Stephen H. Thorne HIGH MOBILITY GROUP 1 BOX MUTANT
EP3535389A4 (en) 2016-11-02 2020-06-03 David Evans SYNTHETIC CHIMERIC POCKET VIRUS
ES2702618B2 (es) 2017-09-04 2019-10-31 Inst De Salud Carlos Iii Producto de combinación que comprende una célula madre mesenquimatosa modificada y una sustancia antigénica.
TW201946651A (zh) 2018-05-02 2019-12-16 大衛 伊凡斯 合成之嵌合牛痘病毒
JP2021522789A (ja) 2018-05-02 2021-09-02 トニックス ファーマ ホールディングス リミテッド 合成キメラワクシニアウイルスを含む幹細胞およびそれらを使用する方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Construction of Recombinant Vaccinia Viruses Using Leporipoxvirus-Catalyzed Recombination and Reactivation ofOrthopoxvirus DNA;YAO, X.-D. et al.;《Methods in Molecular Biology》;20041231;第269卷;Materials; Methods *
High-Frequency Genetic Recombination and Reactivation ofOrthopoxviruses from DNA Fragments Transfected into Leporipoxvirus-Infected Cells;YAO, X.-D. et al.;《Journal of Virology》;20031231;第77卷(第13期);Abstract; page 7281, column 2; Materials and Methods *
Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain;BARO UDY B M ET AL;CELL;第28卷(第2期);全文 *
Vaccinia virus DNA replication: Two hundred base pairs of telomeric sequence confer optimal replication efficiency on minichromosome templates;Du Shan ET AL;Proc. Natl. Acad. Sci;第93卷;全文 *

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