TW201946651A

TW201946651A - 合成之嵌合牛痘病毒

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Publication number: TW201946651A
Application number: TW108115290A
Authority: TW
Inventors: 大衛伊凡斯; 芮恩諾伊斯; 賽斯雷德曼
Original assignee: 大衛伊凡斯; 芮恩諾伊斯; 賽斯雷德曼
Priority date: 2018-05-02
Filing date: 2019-05-02
Publication date: 2019-12-16
Also published as: JP2021522784A; US20210230560A1; EP3788142A1; MX2020011586A; JP2024051112A; SG11202010272PA; CN112543806A; WO2019213452A9; WO2019213452A1; BR112020022181A2; AU2019262149A1; AR115069A1; EP3788142A4; CA3099330A1

Abstract

本發明在各種態樣中係關於一種合成之嵌合牛痘病毒或包含此類病毒之組合物，及用於產生此類合成之嵌合牛痘病毒之系統及方法的研發及使用。該合成之嵌合牛痘病毒尤其非常適合作為病毒疫苗或產生溶瘤反應及醫藥調配物。

Description

合成之嵌合牛痘病毒

與本申請案相關之序列表以正文格式藉由EFS網站以電子方式提交，且以全文引用之方式併入至本說明書中。含有序列表之正文檔案之名稱為104545-0031-WO1-SL.txt。正文檔案創建於2018年3月11日，大小為288,614位元組。

痘病毒(痘病毒科之成員)為可感染人類和動物兩者之雙鏈DNA病毒。痘病毒基於宿主範圍分為兩種子族。感染脊椎動物宿主之雛蝗科(Chordopoxviridae )子族由八個屬組成，其中四個屬(正痘病毒屬(Orthopoxvirus )、副痘病毒屬(Parapoxvirus )、軟疣痘病毒屬(Molluscipoxvirus )及亞塔痘病毒屬(Yatapoxvirus ))已知會感染人類。天花係藉由感染天花病毒(VARV)引起，該天花病毒為正痘病毒屬(OPV)之成員。OPV屬包含多個遺傳相關及形態相同之病毒，包括駱駝痘病毒(CMLV)、牛痘病毒(CPXV)、脫腳病病毒(ECTV，「鼠痘試劑」)、馬痘病毒(HPXV)、猴痘病毒(MPXV)、兔痘病毒(RPXV)、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦森伊修病病毒(Uasin Gishu disease virus)、牛痘病毒(VACV)、天花病毒(VARV)及田鼠痘病毒(VPV)。除VARV以外，已知至少三個其他OPV (包括VACV、MPXV及CPXV)感染人類。至此，用「活」VACV疫苗接種為唯一經證實之對天花之預防措施。一項積極之疫苗接種計劃導致1980年之天花的根除，且公眾之常規天花疫苗接種經停止。然而，仍然需要尋找抵禦VARV及其他OPV之新的安全且有效的個體疫苗接種方法。

VACV之多種製劑已經用作天花疫苗。此等製劑中之大部分由多個相關病毒(例如，Dryvax)組成，且一種包含單個分子純系，ACAM2000。然而，與Dryvax及其他VACV疫苗類似，甚至ACAM2000與嚴重副作用相關，包括心肌病及心包炎。為降低風險，ACAM2000疫苗與其他活疫苗類似，具有排除患有癌症、免疫缺乏症之個體，器官移植受體，患有異位性皮膚炎、濕疹、牛皮癬、心臟病之病患及免疫抑止劑病患之許多禁忌。據估計，15-50%之美國人口將屬於此等類別中之一者，證實需要研發更安全之疫苗或疫苗接種協定(Kennedy等人，2007 Kennedy R, Poland GA. 2007. T-Cell epitope discovery for variola and vaccinia viruses. Rev Med Viroll7:93-113)。因此，需要研發一種功效與Dryvax或ACAM2000™類似但更安全之疫苗。

生產安全、純淨、強力及有效之疫苗需要品質保證程序以保證疫苗生產過程之均一性及連貫性。在過去，含胚胎之雞蛋或初級雞胚胎纖維母細胞培養物已經用於培養病毒以製造抵禦黃熱病、流感、麻疹及流行性腮腺炎之疫苗。此等基質經考慮為可接受的，因為認為可感染雞之外源因子將不感染人類且不對人類致病(美國食品及藥物管理局簡報文件疫苗及相關生物產品諮詢委員會會議(FDA Briefing Document Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee Meeting)，2012年9月19日)。然而，若病毒趨向性變化，則可損害安全性。

其他基質已經用於生長產生疫苗之病毒，諸如用於天花疫苗之小牛淋巴液。在小牛接種天花後，含有白血球之淋巴液經提取且儲存於毛細管中。隨後將此用於向人們接種天花疫苗。然而，存在經牛海綿狀腦病或綿羊瘙癢病朊病毒污染之風險。儘管用於現代疫苗之法規及規範表明所有使用之材料必須來自無瘋牛病(BSE)之地區，但與無綿羊瘙癢病之地區地位無關。特別關注之事實為1980至1982年生產之天花疫苗從未藉由現代方法檢查。特定言之，此等儲備液尚未對於外源因子進行測試(Murphy及Osburn，Emerging Infectious Diseases. www.cdc.gov/eid.第11卷，第7期，2005年7月)。

因此，需要研發一種疫苗，其功效類似於現有之Dryvax或ACAM2000™疫苗，但更安全、可複製且不含殘餘細胞、殘餘DNA、朊病毒及外源因子。

本申請案提供自化學合成之DNA組裝及複製之嵌合牛痘病毒，其為安全、可複製且不含污染物。由於化學基因組合成並不依賴於天然模板，因此病毒基因組之結構性及功能性修飾之多血症為可能的。當天然模板不可用於習知分子生物學方法之遺傳複製或修飾時，化學基因組合成尤其適用。

本發明之態樣提供合成之嵌合牛痘病毒、用於產生此類病毒之方法及此類病毒之用途，舉例來說，作為免疫原、免疫原性調配物、活體外檢定、用於異源基因表現之媒劑或用作癌症治療之溶瘤製劑。本申請案之合成之嵌合牛痘病毒的特徵在於相對於野生型牛痘病毒之一或多種修飾。

在一個態樣中，本發明係基於可自牛痘病毒基因組之化學合成重疊片段產生合成之嵌合牛痘病毒(例如，scVACV)之發現。

因此，在一個態樣中，本發明係關於一種合成之嵌合牛痘病毒(例如，scVACV)，其自源自合成DNA之DNA複製及再活化，該病毒之病毒基因組因為其特徵在於一或多種修飾而不同於該病毒之野生型基因組，修飾源自包含化學合成DNA、cDNA或基因組DNA之組。

在另一態樣中，本發明係關於一種產生合成之嵌合牛痘病毒(scVACV)之方法，其包含以下步驟：(i) 化學合成對應於牛痘病毒的實質上全部病毒基因組的重疊DNA片段；(ii)將重疊DNA片段轉染至輔助病毒感染細胞中；(iii)培養該等細胞以在該等細胞中產生輔助病毒及合成之嵌合牛痘粒子之混合物；以及(iv)將混合物接種於對scVACV具有特異性之宿主細胞上以回收scVACV。.

在另一態樣中，本發明係關於藉由本發明之方法產生的合成之嵌合牛痘病毒(scVACV)。

在另一態樣中，本發明係關於包含本發明之合成之嵌合牛痘病毒(scVACV)及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。

在另一態樣中，本發明係關於一種用於誘導個體中之溶瘤反應之方法，其包含向個體投與包含本發明之scVACV之組合物。

在另一態樣中，本發明係關於一種用於在宿主細胞中表現異源蛋白之方法，其包含將異源核酸序列引入至本發明之scVACV中，用scVACV感染宿主細胞且在用於表現異源蛋白之條件下培養宿主細胞。

在另一態樣中，本發明係關於一種觸發或增強針對牛痘病毒之免疫反應之方法，其包含向對其有需要之個體投與包含本發明之scVACV的組合物。

在另一態樣中，本發明係關於一種觸發或增強針對天花病毒感染之免疫反應之方法，其包含向該個體投與包含本發明之scVACV之組合物。

在另一態樣中，本發明係關於一種觸發或增強針對猴痘病毒感染之免疫反應之方法，其包含向該個體投與包含本發明之scVACV之組合物。

在另一態樣中，本發明係關於一種使人類個體免疫以保護該個體免受天花病毒感染之方法，其包含向該個體投與包含本發明之scVACV之組合物。

在另一態樣中，本發明係關於一種治療天花病毒感染之方法，其包含向該個體投與包含本發明之scVACV之組合物。

在另一態樣中，本發明係關於一種治療個體中之癌症之方法，其包含向對其有需要之個體投與包含本發明之scVACV的組合物。

一般技術

除非本文中另外定義，否則本申請案中所使用之科學及技術術語應具有一般熟習此項技術者通常所理解之含義。一般而言，與本文所述之藥理學、細胞及組織培養、分子生物學、細胞及癌症生物學、神經生物學、神經化學、病毒學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質及核酸化學結合使用之命名法及其技術為此項技術中熟知且常用之彼等者。在有衝突之情況下，將以本說明書(包括定義)為準。

除非另外指示，否則本發明之實踐將採用在此項技術內之分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術。此類技術在文獻中經充分解釋，諸如Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等人, 1989) Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait編, 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis編, 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R.I. Freshney編, 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather及P.E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle，J.B. Griffiths及D.G. Newell編, 1993-1998) J. Wiley and Sons；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller及M.P. Calos編, 1987)；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel等人編, 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人編, 1994)；Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)；Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons，NY (2002)；Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998)；Coligan等人, Short Protocols in Protein Science, John Wiley&Sons, NY (2003)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)。

酶促反應及純化技術根據製造商之說明書進行，如此項技術中通常實行或如本文所描述。與本文所述之分析化學、生物化學、免疫學、分子生物學、合成有機化學，及醫學及醫藥化學結合使用之命名法及其實驗室程序及技術為此項技術中熟知且常用之彼等者。使用標準技術進行化學合成及化學分析。

在本說明書及實施例通篇中，措詞「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises/ comprising)」之變體應理解為暗示包括規定整數或整數群但不排除任何其他整數或整數群。

應理解在本文中任何地方之實施例皆用語言「包含」描述，或亦提供用術語「由……組成」及/或「基本上由……組成」所描述之類似實施例。

術語「包括」用於意謂「包括(但不限於)」。「包括」及「包括(但不限於)」可互換使用。

在術語「例如(e.g.)」或「舉例而言(for example)」後之任何實例並不意謂窮盡性的或限制性的。

除非另外為情形所需，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。

冠詞「一(a/an)」及「該(the)」在本文中用於指代冠詞之一個或大於一個(亦即，至少一個)之語法對象。藉助於實例，「元素」意謂一種元素或大於一種元素。本文中提及「約」某一值或參數包括(且描述)針對該值或參數本身之實施例。舉例而言，提及「約X」之描述包括「X」之描述。數值範圍包括界定範圍之數字。

儘管闡述本發明之廣泛範疇之數值範圍及參數為近似值，但儘可能精確地報導特定實例中所闡述之數值。然而，任何數值均固有地含有因其各別測試量測值中發現之標準差所必然引起之某些誤差。此外，本文中所揭示之所有範圍理解為涵蓋其中包含之任何及所有子範圍。舉例而言，「1至10」之規定範圍應經認為包括最小值1與最大值10之間(且包括最小值及最大值)之任何及所有子範圍；即所有子範圍以最小值1或更大(例如,1至6.1)開始且以最大值10或更小(例如，5.5至10)結束。

例示性方法及材料描述於本文中，但類似或等效於本文中所述之彼等的方法及材料亦可用於本申請案之實踐或測試。材料、方法及實例僅具說明性且不意欲為限制性。
定義
除非另外指示，否則以下術語應理解為具有以下含義：

如本文所用，術語「野生型病毒」、「野生型基因組」、「野生型蛋白質」或「野生型核酸」係指在某些群體(例如，特定病毒物種等)內天然存在之胺基或核酸序列。

術語「嵌合」或「經工程改造之」或「經修飾之」(例如嵌合牛痘病毒、經工程改造之多肽、經修飾之多肽、經工程改造之核酸、經修飾之核酸)或其語法變化形式在本文中可互換使用以指代已經操縱以具有相對於原生序列之一或多個變化的非原生序列。

如本文所用，「合成病毒」係指最初源自合成DNA (例如，化學合成DNA、PCR擴增之DNA、經工程改造之DNA、包含核苷類似物之聚核苷酸等或其組合)之病毒且包括其後代，且由於天然、偶然或故意之突變，後代可未必與初始親本合成病毒完全相同(在形態學或基因組DNA互補序列中)。在一些實施例中，合成病毒係指其中實質上所有病毒基因組最初源自合成DNA (例如，化學合成DNA、PCR擴增之DNA、經工程改造之DNA、包含核苷類似物之聚核苷酸等或其組合)之病毒。在一較佳實施例中，合成病毒源自化學合成DNA。

如在本文中其他地方所概述，病毒基因組之某些位置可改變。本文所使用之「位置」意謂基因組序列中之位置。對應位置一般經由與其他親本序列比對而經測定。

如本文所用，在多肽之情況下，術語「殘基」係指線性多肽鏈中之胺基酸單元。此為在由α-胺基酸(亦即,NH₂ -CHR-COOH)形成多肽中除去水後之各胺基酸之剩餘物(亦即，-NH-CHR-C-)。

如此項技術中已知，如在本文中可互換使用之「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸鏈，且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶併入鏈中之任何基質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，可在鏈組合之前或之後賦予對核苷酸結構之修飾。核苷酸之序列可間雜有非核苷酸組分。聚核苷酸可進一步在聚合之後諸如藉由與標記組分結合而修飾。其他類型之修飾包括例如「封端」，用類似物取代天然存在之核苷酸中之一或多者；核苷酸間修飾，諸如例如具有不帶電鍵(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等)及具有帶電鍵(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)之彼等；含有側鏈部分之彼等，諸如例如蛋白質(例如，核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等)；具有嵌入劑(例如，吖啶、補骨脂素等)之彼等；含有螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)之彼等；含有烷基化劑之彼等；具有經修飾之鍵(例如，α變旋異構核酸等)之彼等；以及聚核苷酸之未經修飾形式。此外，一般存在於糖中之任何羥基可例如藉由膦酸酯基、磷酸酯基替換，藉由標準保護基保護，或經活化以製備與額外核苷酸之額外鍵聯，或可結合至固體支撐物。5'及3'末端OH可經磷酸化或經具有1至20個碳原子之胺或有機封端基團部分取代。其他羥基亦可衍生成標準保護基。聚核苷酸亦可含有此項技術中一般已知之類似形式之核糖或去氧核糖，包含例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-或β-變旋異構糖、差向異構糖(諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、哌喃醣、呋喃醣、景天庚酮糖)、非環類似物及無鹼基核苷類似物(諸如甲基核糖苷)。一或多個磷酸二酯鍵可藉由替代性鍵聯基團替換。此等替代性鍵聯基團包含(但不限於)以下實施例，其中磷酸酯經P(O)S (「硫代酸酯」)、P(S)S (「二硫代酸酯」)、(O)NR₂ (「醯胺酯」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH₂ (「甲縮醛」)替換，其中各R或R'獨立地為H或視情況含有醚(-O-)鍵之取代或未取代之烷基(1-20 C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳醛基。聚核苷酸中並非所有鍵需要一致。前述描述適用於本文所提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。

術語「多肽」、「寡肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用以指代任何長度之胺基酸鏈。鏈可為直鏈或分支鏈，其可包含經修飾之胺基酸，及/或可間雜有非胺基酸。術語亦涵蓋已經天然或藉由干預修飾之胺基酸鏈；例如，雙硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或諸如與標記組分結合之任何其他操作或修飾。定義內亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括例如非天然胺基酸等)，以及此項技術中已知之其他修飾之多肽。應瞭解，多肽可作為單一鏈或相關鏈存在。

所有其語法形式及拼寫變化中之「同源」係指具有「共同進化起源」之兩種蛋白質之間的關係，包括來自相同生物體物種中之超家族的蛋白質，以及來自不同生物體物種之同源蛋白質。此類蛋白質(及其編碼核酸)具有序列同源性，如無論一致性百分比如何藉由其序列相似性或藉由存在特異性殘基或基元及保守位置所反映。「同源」亦可指代對病毒而言為天然之核酸。

然而，在常見之用法及本申請案中，當用諸如「高度」之副詞修飾時，術語「同源」可係指序列相似性，且可涉及或可不涉及共同的進化起源。

在所有其語法形式及拼寫變化中之「異源」可係指對病毒而言為非天然之DNA。其意謂源自與核酸相對於其描述為異源的生物體之核酸不同的物種或不同的病毒株。在一非限制性實例中，scVACV之病毒基因組包含異源末端髮夾環。該等異源末端髮夾環可源自不同病毒物種或源自不同VACV病毒株。

其全部語法形式中之術語「序列相似性」係指核酸或胺基酸序列之間的一致性或對應性的程度，其可共用或可不共用共同的進化起源。

關於參考多肽(或核苷酸)序列之「序列一致性百分比(%)」或「等同於之序列%」經定義為候選序列中與參考多肽(核苷酸)序列中之胺基酸殘基(或核酸)一致之胺基酸殘基(或核酸)之百分比，視需要為獲得最大序列一致性百分比，在比對序列且引入間隙之後，且未將任何保守性取代考慮作為序列一致性之部分。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以在熟習此項技術者內之各種方式達成，例如使用公開可用之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可測定用於比對序列之適當參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需之任何算法。

如本文所用，「宿主細胞」包括可為或已為本發明之病毒之受體的單個細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單個宿主細胞之後代，且後代可由於天然、偶然或故意突變而不一定與初始親本細胞完全一致(在形態學中或在基因組DNA互補序列中)。宿主細胞包括用本發明之痘病毒活體內轉染及/或轉型之細胞。

如本文所用，「載體」意謂能夠在宿主細胞中遞送且較佳地表現一或多個所關注之基因或序列的構築體。載體之實例包括(但不限於)病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑結合之DNA或RNA表現載體、囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體，及某些真核細胞，諸如生產細胞。

如本文所用，「經分離之分子」 (其中分子為例如多肽、聚核苷酸或其片段)為以下分子：藉助於其起源或衍生來源(1)與其原生狀態中伴隨其之一或多種天然相關組分不相關，(2)實質上不含來自相同物種之一或多種其他分子，(3)藉由來自不同物種之細胞表現，或(4)在自然界中不存在。因此，經化學合成或表現於與天然來源之細胞不同的細胞系統中之分子將自其天然相關組分「分離」。使用此項技術中熟知之純化技術，藉由分離亦可使分子實質上不含天然相關之組分。可藉由此項技術中熟知之多種方法分析分子純度或均質性。舉例而言，多肽樣品之純度可使用聚丙烯醯胺凝膠電泳及凝膠染色以使用此項技術中熟知之技術使多肽可見來分析。出於某些目的，可藉由使用HPLC或此項技術中用於純化之其他熟知方法來提供更高解析度。

如本文所用，在病毒之情況下，術語「分離」係指源自單一親本病毒之病毒。可使用熟習此項技術者已知之常規方法分離病毒，包括(但不限於)基於溶菌斑純化及限制稀釋法之方法。

如本文所用，片語「感染倍率」或「MOI」為每一感染細胞之平均病毒數。MOI藉由所添加之病毒數(添加之毫升×形成溶菌斑單元(PFU))除以所添加之細胞數(添加之毫升×細胞/毫升)來測定。

如本文所用，「純化」及其語法變化形式係指自含有多肽及一或多種雜質之混合物中完全或部分除去至少一種雜質，由此提高組合物中之多肽之純度水平(亦即，藉由降低組合物中之雜質量(ppm))。如本文所用，在病毒之情況下，「純化」係指實質上不含來自衍生病毒之細胞或組織源之細胞材料及培養基的病毒。語言「實質上不含細胞材料」包括病毒製劑，其中病毒與細胞之細胞組分分離，該病毒係自該細胞分離或以重組方式產生。因此，實質上不含細胞材料之病毒包括具有小於約30%、20%、10%或5%(乾重)之細胞蛋白質(在本文中亦稱作「污染蛋白質」)之蛋白質製劑。病毒亦實質上不含培養基，亦即，培養基相當於小於約20%、10%或5%之病毒製劑體積。可使用熟習此項技術者已知之常規方法純化病毒，包括(但不限於)層析法及離心。

如本文所用，「基本上純」係指至少50%純(亦即，無污染物)、更佳地至少90%純、更佳地至少95%純、又更佳地至少98%純、且最佳地至少99%純之物質。

術語「患者」、「個體(subject)」及「個體(individual)」在本文中可互換使用且係指人類或非人類動物。此等術語包括哺乳動物，諸如人類、靈長類動物、家畜動物(包括牛、豬、駱駝等)、伴侶動物(例如，犬科動物、貓科動物等)及嚙齒動物(例如，小鼠及大鼠)。

如本文所用，術語「預防（prevent/preventing/prevention）」係指由於投與療法(例如，預防劑或治療劑)從而延緩個體中之疾病(例如痘病毒感染)之一或多種症狀之復發或發作，或減輕該等症狀。舉例而言，在針對感染向個體投與療法之情況中，「預防（prevent/preventing/prevention）」係指因投與療法(例如，預防劑或治療劑)或投與療法組合(例如，預防劑或治療劑之組合)而抑制或減少個體中之感染(例如，痘病毒感染或與其相關之病況)之發展或發作，或預防感染(例如，痘病毒感染或與其相關之病況)的一或多種症狀之復發、發作或發展。

如本文所用，術語「治療(treat/treating/treatment)」係指治療病況或患者且係指採取步驟以獲得有益或所需之結果，包括臨床結果。關於感染(例如，痘病毒感染或天花病毒感染)，治療係指因投與一或多種療法(包括(但不限於)投與一或多種預防劑或治療劑)而根除或控制感染劑(例如，痘病毒或天花病毒)之複製，減小感染劑之數量(例如減小病毒之效價)，降低或減輕感染(例如，痘病毒/痘瘡感染或與其關聯之病況或症狀)之進展、嚴重度及/或持續時間或減輕一或多種症狀。就癌症而言，治療係指因投與本發明之一或多種治療劑而根除、移除、修飾或控制原發、局部或轉移性癌組織。在某些實施例中，此類術語係指因向患有此類疾病之個體投與本發明之一或多種治療劑而最小化或延緩癌症擴散。在其他實施例中，此類術語係指消除致病細胞。

可使用熟習此項技術者已知之多種方法中之一者向個體進行「投與(Administering/administration of)」物質、化合物或試劑。舉例而言，可藉由舌下或鼻內、吸入至肺部或經直腸投與化合物或試劑。投與亦可執行例如一次、複數次及/或歷經一或多個延長之週期。在一些態樣中，投與包括直接投與(包括自我投與)及間接投與(包括開具藥物之處方的操作)。舉例而言，如本文所用，指導患者自我投與藥物或藉由另一人投與藥物及/或向患者提供藥物處方之醫師為向患者投與藥物。

本文所述之各實施例可單獨地或與本文所述之任何其他實施例組合使用。
概述

痘病毒為在經感染之細胞之細胞質中複製的大(約200 kbp) DNA病毒。正痘病毒(OPV)屬包含其感染不同宿主之能力大大變化之許多痘病毒。舉例而言，牛痘病毒(VACV)可感染廣泛之宿主群，而天花之病原體天花病毒(VARV)僅感染人類。許多(若非全部)痘病毒之共同特徵為其在宿主內之非遺傳性「再活化」之能力。非遺傳再活化係指其中藉由一種痘病毒感染之細胞可促進本身不具有傳染性之第二「死亡」病毒(例如，藉由加熱不活化之病毒)之恢復的過程。

經純化之痘病毒DNA不具傳染性，因為病毒生命週期需要經由封裝在病毒粒子中之病毒編碼之RNA聚合酶轉錄早期基因。然而，若將病毒DNA轉染至先前感染輔助痘病毒之細胞中，提供反式轉錄、複製及封裝經轉染之基因組所需的必需因子，則可克服此缺陷(Sam CK, Dumbell KR. Expression of poxvirus DNA in coinfected cells and marker rescue of thermosensitive mutants by subgenomic fragments of DNA. Ann Virol (Inst Past). 1981;132:135-50)。儘管此產生混合病毒後代，但藉由在支持兩種病毒傳播之細胞株中進行再活化反應，且隨後藉由將病毒之混合物接種至不支持輔助病毒生長之細胞上以消除輔助病毒可克服該問題(Scheiflinger F, Dorner F, Falkner FG. Construction of chimeric vaccinia viruses by molecular cloning and packaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992;89(21):9977-81)。

先前，Yao及Evans描述一種藉由兔痘病毒(Leporipoxvirus )、休普氏纖維瘤病毒(Shope fibroma virus，SFV)催化之高頻重組及複製反應物可與經SFV催化之再活化反應物偶合以使用病毒DNA之多個重疊片段以迅速地彙編重組牛痘病毒株之方法(Yao XD, Evans DH. High-frequency genetic recombination and reactivation of orthopoxviruses from DNA fragments transfected into leporipoxvirus-infected cells. Journal of Virology. 2003;77(13):7281-90)。首次，描述使用化學合成之重疊雙鏈DNA片段之功能性合成之嵌合牛痘病毒[scVACV]的再活化及表徵。
本發明之合成之嵌合牛痘病毒

在一個態樣中，本發明提供功能性合成之嵌合牛痘病毒(scVACV)，其最初由化學合成之DNA複製及組裝。根據本發明之方法可產生之病毒可為基因組已測序或可大部分測序或可獲得天然分離物之任何牛痘病毒。各種實施例之scVACV可基於天然存在之病毒株、變異體或突變體、突變誘發之病毒或經基因工程改造之病毒的基因組序列。在一些實施例中，scVACV之病毒基因組包含相對於該病毒之野生型基因組或基礎基因組序列之一或多種修飾。修飾可包括一或多種缺失、插入、取代或其組合。在一個實施例中，修飾可包括插入或一或多個多選殖位點，使得可插入外源性DNA。應瞭解，可以此項技術中通常已知之多種方式引入修飾。基因組之經修飾部分可源自化學合成之DNA、cDNA或基因組DNA。在另一個實施例中，本發明之scVACV之病毒基因組包含一或多種修飾以添加或修復一或多個獨特的限制位點。添加或修復一或多個限制位點之修飾可在經消除以促進純系選擇之限制位點上進行。

當天然模板不可用於藉由習知分子生物學方法遺傳修飾、擴增或複製時，化學基因組合成尤其適用。wtVACV (病毒株NYCBH，純系ACAM2000)之基因組序列已經描述並公佈，儘管其並不完整。未測定末端髮夾環之序列，僅四個54 bp重複序列經識別。在測序之後，在VACV ACAM2000之野生型分離物中證實70bp、125bp及54bp串連型重複序列之存在，從而指示ACAM2000之當前公佈序列為不完整的。本發明者產生一種功能性合成嵌合VACV (scVACV)。具體言之，本發明者藉由使用基於不同病毒株之wtVACV端粒之末端髮夾環代替VACV自身之末端髮夾環序列成功地產生功能性scVACV病毒株NYCBH、純系ACAM2000。在一些實施例中，VACV病毒之病毒基因組為選自以下之群的病毒株：Western Reserve、純系3、Tian Tian、Tian Tian純系TP5、Tian Tian純系TP3、NYCBH、NYCBH純系Acambis 2000、Wyeth、Copenhagen、Lister、Lister 107、Lister-LO、Lister GL-ONC1、Lister GL-ONC2、Lister GL-ONC3、Lister GL-ONC4、Lister CTC1、Lister IMG2 (Turbo FP635)、IHD-W、LC16m18、Lederle、Tashkent純系TKT3、Tashkent純系TKT4、USSR、Evans、Praha、L-IVP、V-VET1或LIVP 6.1.1、Ikeda、EM-63、Malbran、Duke、3737、CV-1、康諾特實驗室(Connaught Laboratories)、Serro 2、CM-01、NYCBH Dryvax純系DPP13、NYCBH Dryvax純系DPP15、NYCBH Dryvax純系DPP20、NYCBH Dryvax純系DPP17、NYCBH Dryvax純系DPP21、VACV-IOC、安卡拉絨毛膜尿囊牛痘病毒(CVA)、經修飾之安卡拉牛痘(MVA)及MVA-BN。在一較佳實施例中，病毒基因組係基於NYCBH病毒株。更佳地，病毒基因組源自NYCBH病毒株，純系Acambis 2000或ACAM2000。仍不斷地發現新型VACV病毒株。應瞭解，本發明之scVACV可基於此類新發現之VACV病毒株。

Dryvax® 源自紐約市健康委員會牛痘病毒病毒株(Wyeth Laboratories, Marietta, PA)，且生長在小牛皮膚上，且隨後經基本凍乾用於儲存。

VACV ACAM2000病毒株、天花(牛痘)疫苗、活體為源自Dryvax®之溶菌斑純化選殖之活牛痘病毒，且生長在非洲綠猴腎臟(Vero)細胞中，且經測試不含外源因子(Osborne JD等人，Vaccine.2007; 25(52):8807-32)。

V-VET1或LIVP 6.1.1由Genelux研發。其自牛痘病毒之Lister病毒株(Lister病毒株，病毒製劑研究所(LIVP)，Moscow，Russia)之野生型儲備液中分離，且表示「天然」(不進行遺傳操作)。LIVP 6.1.1病毒之胸苷激酶(tk)基因為不活化的(Shvalov AN等人，Genome Announc. 2016年5月-6月；4(3): e00372-16)。

GLV-1h68 (經產生用於臨床研究之命名為GL-ONC1)係藉由Genelux自Lister病毒株中藉由將編碼海腎螢光素酶-水母綠螢光蛋白融合(Ruc-GFP)、LacZ及β-葡糖苷酸酶之三個表現卡匣分別插入至病毒基因組之F14.5L、J2R (胸苷激酶)及A56R (紅血球凝集素)位點而研發的(Zhang Q等人，Cancer Res.2007; 67(20):10038-46.)。

化學病毒基因組合成亦開拓向所得基因組或其特異性部分引入大量適用修飾之可能性。修飾可提高選殖產生病毒之便利性、提供用於引入重組基因產物之位點、提高識別再活化病毒純系之便利性及/或賦予過多其他有用特徵(例如，引入所需抗原，產生溶瘤病毒等)。在一些實施例中，修飾可包括一或多種毒性因子之減毒或缺失。在一些實施例中，修飾可包括添加或插入一或多種毒性調節基因或基因編碼調節因子。

傳統地，痘病毒之末端髮夾難以選殖且測序，因此，一些公佈之基因組序列(例如，VACV、ACAM 2000及HPXV MNR-76)不完整並不出乎意料。具體言之，用於wtVACV、病毒株NYCBH、純系ACAM2000之基因組序列已經描述且公佈，儘管其並不完整。未測定末端髮夾環之序列，僅四個54 bp重複序列經識別。由於wtVACV病毒株NYCBH、純系ACAM2000基因組之公佈序列為不完整的，髮夾不可精確地複製且在此應用之前，尚未知曉是否可僅基於wtVACV基因組之已知部分自聚核苷酸複製及組裝VACV。亦不知道來自一個病毒株病毒之髮夾將在另一病毒株中有效。本發明者藉由使用基於不同病毒株之wtVACV端粒之末端髮夾環代替VACV自身之末端髮夾環序列來產生功能性合成嵌合VACV (scVACV) ACAM2000。在一例示性實施例中，ssDNA片段係使用VACV WR病毒株端粒之公佈序列作為引導而經化學合成且經接合至包含VACV病毒株NYCBH之左端及右端的dsDNA片段上。在一些實施例中，末端髮夾係基於任何VACV病毒株之末端髮夾，其基因組已完全測序或其天然分離物可用於基因組測序。在一些實施例中，末端髮夾環係基於選自以下之群的病毒株：Western Reserve、純系3、Tian Tian、Tian Tian純系TP5、Tian Tian純系TP3、NYCBH、NYCBH純系Acambis 2000、Wyeth、Copenhagen、Lister、Lister 107、Lister-LO、Lister GL-ONC1、Lister GL-ONC2、Lister GL-ONC3、Lister GL-ONC4、Lister CTC1、Lister IMG2 (Turbo FP635)、IHD-W、LC16m18、Lederle、Tashkent純系TKT3、Tashkent純系TKT4、USSR、Evans、Praha、L-IVP、V-VET1或LIVP 6.1.1、Ikeda、EM-63、Malbran、Duke、3737、CV-1、康諾特實驗室(Connaught Laboratories)、Serro 2、CM-01、NYCBH Dryvax純系DPP13、NYCBH Dryvax純系DPP15、NYCBH Dryvax純系DPP20、NYCBH Dryvax純系DPP17、NYCBH Dryvax純系DPP21、VACV-IOC、安卡拉絨毛膜尿囊牛痘病毒(CVA)、經修飾之安卡拉牛痘(MVA)及MVA-BN。在一較佳實施例中，末端髮夾環係基於VACV之Western Reserve病毒株(WR病毒株)。仍不斷地發現新型VACV病毒株。應瞭解，本發明之scVACV可基於此類新發現之VACV病毒株。

在另一實施例中，本發明之scVACV之病毒基因組包含同源或異源末端髮夾環及位於髮夾環之下游的串連型重複區域(70 bp、125 bp及54 bp串連型重複)，其中串連型重複區域包含與wtVACV (亦即，天然存在之病毒)不同數目之重複。VACV病毒(病毒株WR)中發現之70 bp、125 bp及54 bp串連型重複之重複數目分別為22、2及8。在另一實施例中，串連型重複區域之數目在不同痘病毒、不同牛痘病毒及不同牛痘病毒病毒株中為不同的。術語同源末端髮夾環意謂該等末端髮夾環來自相同病毒物種/相同病毒株，而術語異源末端髮夾環意謂該等末端髮夾環來自不同病毒物種/不同病毒株。

在一些實施例中，修飾可包括一或多個限制位點之缺失。在一些實施例中，修飾可包括一或多個限制位點之引入。在一些實施例中，將自基因組缺失或添加至基因組之限制位點可選自以下限制位點中之一或多者：諸如(但不限於)AanI 、 AarI 、 AasI 、 AatI 、 AatII 、 AbaSI 、 AbsI 、 Acc65I 、 AccI 、 AccII 、 AccIII 、 AciI 、 AclI 、 AcuI 、 AfeI 、 AflII 、 AflIII 、 AgeI 、 AhdI 、 AleI 、 AluI 、 AlwI 、 AlwNI 、 ApaI 、 ApaLI 、 ApeKI 、 ApoI 、 AscI 、 AseI 、 AsiSI 、 AvaI 、 AvaII 、 AvrII 、 BaeGI 、 BaeI 、 BamHI BanI 、 BanII 、 BbsI 、 BbvCI 、 BbvI 、 BccI 、 BceAI 、 BcgI 、 BciVI 、 BclI 、 BcoDI 、 BfaI 、 BfuAI 、 BfuCI 、 BglI 、 BglII 、 BlpI 、 BmgBI 、 BmrI 、 BmtI 、 BpmI 、 Bpu10I 、 BpuEI 、 BsaAI 、 BsaBI 、 BsaHI 、 BsaI 、 BsaJI 、 BsaWI 、 BsaXI 、 BseRI 、 BseYI 、 BsgI 、 BsiEI 、 BsiHKAI 、 BsiWI 、 BslI 、 BsmAI 、 BsmBI 、 BsmFI 、 BsmI 、 BsoBI 、 Bsp1286I 、 BspCNI 、 BspDI 、 BspEI 、 BspHI 、 BspMI 、 BspQI 、 BsrBI 、 BsrDI 、 BsrFαI 、 BsrGI 、 BsrI 、 BssHII 、 BssSαI 、 BstAPI 、 BstBI 、 BstEII 、 BstNI 、 BstUI 、 BstXI 、 BstYI 、 BstZ17I 、 Bsu36I 、 BtgI 、 BtgZI 、 BtsαI 、 BtsCI 、 BtsIMutI 、 Cac8I 、 ClaI 、 CspCI 、 CviAII 、 CviKI-1 、 CviQI 、 DdeI 、 DpnI 、 DpnII 、 DraI 、 DrdI 、 EaeI 、 EagI 、 EarI 、 EciI 、 Eco53kI 、 EcoNI 、 EcoO109I 、 EcoP15I 、 EcoRI 、 EcoRV 、 FatI 、 FauI 、 Fnu4HI 、 FokI 、 FseI 、 FspEI 、 FspI 、 HaeII 、 HaeIII 、 HgaI 、 HhaI 、 HincII 、 HindIII 、 HinfI 、 HinP1I 、 HpaI 、 HpaII 、 HphI 、 Hpy166II 、 Hpy188I 、 Hpy188III 、 Hpy99I 、 HpyAV 、 HpyCH4III 、 HpyCH4IV 、 HpyCH4V 、 I-CeuI 、 I-SceI 、 KasI 、 KpnI 、 LpnPI 、 MboI 、 MboII 、 MfeI 、 MluCI 、 MluI 、 MlyI 、 MmeI 、 MnlI 、 MscI 、 MseI 、 MslI 、 MspA1I 、 MspI 、 MspJI 、 MwoI 、 NaeI 、 NarI 、 NciI 、 NcoI 、 NdeI 、 NgoMIV 、 NheI 、 NlaIII 、 NlaIV 、 NmeAIII 、 NotI 、 NruI 、 NsiI 、 NspI 、 PacI 、 PaeR7I 、 PciI 、 PflFI 、 PflMI 、 PleI 、 PluTI 、 PmeI 、 PmlI 、 PpuMI 、 PshAI 、 PsiI 、 PspGI 、 PspOMI 、 PspXI 、 PstI 、 PvuI 、 PvuII 、 RsaI 、 RsrII 、 SacI 、 SacII 、 SalI 、 SapI 、 Sau3AI 、 Sau96I 、 SbfI 、 ScrFI 、 SexAI 、 SfaNI 、 SfcI 、 SfiI 、 SfoI 、 SgrAI 、 SmaI 、 SmlI 、 SnaBI 、 SpeI 、 SphI 、 SrfI 、 SspI 、 StuI 、 StyD4I 、 StyI 、 SwaI 、 TaqαI 、 TfiI 、 TseI 、 Tsp45I 、 TspMI 、 TspRI 、 Tth111I 、 XbaI 、 XcmI 、 XhoI 、 XmaI 、 XmnI 或ZraI 。應瞭解，可將任何期望之限制位點或限制位點組合插入至基因組中或自基因組中突變及/或消除。在一些實施例中，一或多個Aar I位點自病毒基因組缺失。在一些實施例中，一或多個Bsa I位點自病毒基因組缺失。在一些實施例中，一或多個限制位點自基因組完全地消除(例如，可消除病毒基因組中之所有Aar I位點)。在一些實施例中，一或多個Ava I限制位點經引入至病毒基因組中。在一些實施例中，一或多個Stu I位點經引入至病毒基因組中。在一些實施例中，一或多種修飾可包括併入重組工程改造靶標，包括(但不限於)lox P或FRT位點。

在一些實施例中，修飾可包括引入螢光標記物，諸如(但不限於)綠色螢光蛋白(GFP)、增強之GFP、黃色螢光蛋白(YFP)、青色/藍色螢光蛋白(BFP)、紅色螢光蛋白(RFP)或其變異體等；可選標記物，諸如(但不限於)抗藥性標記物(例如，大腸桿菌(E. coli )黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因(gpt )、白褐鏈黴菌嘌呤黴素乙醯基轉移酶基因(pac )、新黴素磷酸轉移酶I基因(nptI )、新黴素磷酸轉移酶基因II (nptII )、潮黴素磷酸轉移酶(hpt )、shble 基因等)；蛋白質或肽標記物，諸如(但不限於) MBP (麥芽糖結合蛋白)、纖維素結合結構域(CBD)、麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、聚(His)、FLAG、V5、c-Myc、紅血球凝集素(HA)、NE標記物、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、單純疱疹病毒(HSV)、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)、螢光素酶、蛋白質A、蛋白質G、抗生蛋白鏈菌素、T7、硫化還原蛋白、酵母2-雜交標記物，諸如B42、GAL4、LexA或VP16；局部化標記物，諸如NLS標記物、SNAP標記物、Myr標記物等。應瞭解，可使用此項技術中已知之其他可選標記物(marker)及/或標記物(tag)。在一些實施例中，修飾包括一或多個可選標記物以幫助選擇經再活化之純系(例如螢光標記物，諸如YFP；藥物選擇標記物，諸如gpt 等)，進而幫助選擇經再活化之病毒純系。在一些實施例中，在選擇步驟之後，自再活化之純系缺失一或多個可選標記物。

在一個態樣中，本發明之scVACV可用作保護免受病原性痘病毒感染(例如VARV、MPXV、MCV、ORFV、Ausdyk病毒、BPSV、海豹痘病毒等)之疫苗、用作治療或預防病原性痘病毒感染(例如VARV、MPXV、MCV、ORFV、Ausdyk病毒、BPSV、海豹痘病毒等)之治療劑、用作異源基因表現之媒劑或用作溶瘤劑。在一些實施例中，scVACV可用作疫苗以保護免受VARV感染。在一些實施例中，scVACV可用於治療或預防VARV感染。
產生合成嵌合 VACV 之方法

在一個態樣中，本發明提供用於自病毒基因組之化學合成之重疊雙鏈DNA片段合成、再活化及分離功能性合成嵌合VACV (scVACV)的系統及方法。在先前感染輔助病毒之細胞中進行病毒基因組之重疊DNA片段的重組及功能性scVACV之再活化。簡言之，涵蓋scVACN之全部或實質上全部病毒基因組之重疊DNA片段經化學合成且轉染至輔助病毒感染之細胞中。培養經轉染之細胞以產生包含輔助病毒及再活化之scVACV的混合病毒後代。接著，將混合之病毒後代接種於不支持輔助病毒生長但容許合成之嵌合牛痘病毒生長之宿主細胞上，以消除輔助病毒且回收合成之嵌合牛痘病毒。在一些實施例中，輔助病毒不感染宿主細胞。在一些實施例中，輔助病毒可感染宿主細胞但在宿主細胞中生長不良。在一些實施例中，相較於scVACV，輔助病毒在宿主細胞中生長更緩慢。

在一些實施例中，實質上全部合成之嵌合牛痘病毒基因組源自經化學合成之DNA。在一些實施例中，約40%、約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、超過99%或100%合成之嵌合牛痘病毒基因組源自經化學合成之DNA。在一些實施例中，牛痘病毒基因組源自化學合成之DNA及天然存在之DNA的組合。在一些實施例中，涵蓋牛痘病毒基因組之所有片段為化學合成的。在一些實施例中，一或多個片段為化學合成的且一或多個片段源自天然存在之DNA (例如，藉由PCR擴增或藉由公認之重組DNA技術)。

本發明之方法中使用之重疊DNA片段的數目將視牛痘病毒基因組之大小而定。諸如一方面重組效率隨片段數目增加而降低，及另一方面隨著片段數目減少合成極大DNA片段的困難之實際考慮因素亦將告知本發明之方法中所使用的重疊片段之數目。在一些實施例中，合成之嵌合牛痘病毒基因組可經合成為單一片段。在一些實施例中，合成之嵌合牛痘病毒基因組由2-14個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成之嵌合牛痘病毒基因組由4-12個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成之嵌合牛痘病毒基因組由6-12個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成之嵌合牛痘病毒基因組由8-11個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成之嵌合牛痘病毒基因組由8-10、10-12或10-14個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成之嵌合牛痘病毒基因組由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個重疊DNA片段組裝。在較佳實施例中，合成之嵌合牛痘病毒基因組由9個重疊DNA片段組裝。在本發明之一例示性實施例中，合成之嵌合牛痘病毒(scVACV)係由9個經化學合成之重疊雙鏈DNA片段再活化。在一些實施例中，末端髮夾環經單獨合成且接合至包含牛痘病毒基因組之左端及右端之片段上。在一些實施例中，末端髮夾環可來源於天然存在之模板。在一些實施例中，scVACV之末端髮夾源自wtVACV。在一些實施例中，末端髮夾源自不同病毒株之wtVACV末端髮夾代替VACV自身末端髮夾環序列。在一些實施例中，末端髮夾基於任何wtVACV之末端髮夾，其基因組已完全測序或其天然分離物可用於基因組測序。

本發明之方法之各種態樣中使用的重疊片段之大小將視牛痘病毒基因組之大小而定。應瞭解，片段大小可廣泛變化，且諸如化學合成極大DNA片段之能力的各種實際考慮因素將告知片段大小的選擇。在一些實施例中，片段大小範圍為約2,000 bp至約50,000 bp。在一些實施例中，片段大小範圍為約3,000 bp至約45,000 bp。在一些實施例中，片段大小範圍為約4,000 bp至40,000 bp。在一些實施例中，片段大小範圍為約5,000 bp至35,000 bp。在一些實施例中，最大片段為約18,000 bp、20,000 bp、21,000 bp、22,000 bp、23,000 bp、24,000 bp、25,000 bp、26,000 bp、27,000 bp、28,000 bp、29,000 bp、30,000 bp、31,000 bp、32,000 bp、33,000 bp、34,000 bp、35,000 bp、36,000 bp、37,000 bp、38,000 bp、39,000 bp、40,000 bp、41,000 bp、42,000 bp、43,000 bp、44,000 bp、45,000 bp、46,000 bp、47,000 bp、48,000 bp、49,000 bp或50,000 bp。在本發明之一例示性實施例中，scVACV係由大小介於約10,000 bp至約32,000 bp (表1)之範圍的9個化學合成之重疊雙鏈DNA片段再活化。

輔助病毒可為可提供自轉染DNA再活化痘病毒所需之反式作用酶促機制的任何痘病毒。輔助病毒可具有與待產生之scVACV不同或更窄之宿主細胞範圍(例如，相較於諸如牛痘病毒(VACV)或HPXV之正痘病毒，休普氏纖維瘤病毒(SFV)具有極窄之宿主範圍)。輔助病毒可具有相較於待產生之scVACV不同之溶菌斑表現型。在一些實施例中，輔助病毒為兔痘病毒。在一些實施例中，兔痘病毒為SFV、野兔纖維瘤病毒、家兔纖維瘤病毒、松鼠纖維瘤病毒或黏液瘤病毒。在一較佳實施例中，輔助病毒為SFV。在一些實施例中，輔助病毒為正痘病毒 。在一些實施例中，正痘病毒為駱駝痘病毒(CMLV)、牛痘病毒(CPXV)、脫腳病病毒(ECTV，「鼠痘劑」)、HPXV、猴痘病毒(MPXV)、兔痘病毒(RPXV)、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦森伊修病病毒、VACV及田鼠痘病毒(VPV)。在一些實施例中，輔助病毒為禽痘病毒、羊痘病毒、鹿痘病毒、鱷魚痘病毒、軟疣痘病毒、副痘病毒、豬痘病毒或亞塔痘病毒。在一些實施例中，輔助病毒為鳥痘病毒。在一些實施例中，輔助病毒為α昆蟲痘病毒、β昆蟲痘病毒或γ昆蟲痘病毒。在一些實施例中，輔助病毒為補骨脂素不活化之輔助病毒。在本發明之一例示性實施例中，scVACV自轉染至SFV感染之BGMK細胞中之重疊DNA片段再活化。隨後藉由將混合病毒後代接種至BSC-40細胞上來消除SFV。

熟習此項技術者將瞭解適合之宿主細胞將用於scVACV之再活化，且scVACV之選擇及/或分離將視藉由本發明之方法之各種態樣所產生的輔助病毒及嵌合痘病毒之特定組合而定。支持輔助病毒及scVACV兩者生長之任何宿主細胞可用於再活化步驟，且不支持輔助病毒生長之任何宿主細胞可用於消除輔助病毒且選擇及/或分離scVACV。在一些實施例中，輔助病毒為兔痘病毒且用於再活化步驟之宿主細胞可選自兔腎細胞(例如，LLC-RK1、RK13等)、兔肺細胞(例如，R9ab)、兔表皮細胞(例如，SF1Ep、DRS、RAB-9)、兔角膜細胞(例如，SIRC)、兔癌瘤細胞(例如，Oc4T/cc)、兔表皮/癌瘤細胞(例如，CTPS)、猴細胞(例如，Vero、BGMK等)或倉鼠細胞(例如，BHK-21等)。在一較佳實施例中，宿主細胞為BGMK細胞。

在一些實施例中，scVACV可在容許病毒生長至允許使用本文所述之scVACV之效價的任何基質中繁殖。在一個實施例中，基質容許scVACV生長至與針對相應野生型病毒所測定之彼等相當之效價。在一些實施例中，scVACV可在易感染VACV之細胞(例如鳥細胞、蝙蝠細胞、牛細胞、駱駝細胞、金絲雀細胞、貓細胞、鹿細胞、馬細胞、家禽細胞、沙鼠細胞、山羊細胞、人類細胞、猴細胞、豬細胞、兔細胞、浣熊細胞、海豹細胞、綿羊細胞、臭鼬細胞、田鼠細胞等)中生長。此類方法為熟習此項技術者所熟知。代表性哺乳動物細胞包括(但不限於) BHK、BGMK、BRL3A、BSC-40、CEF、CEK、CHO、COS、CVI、HaCaT、HEL、HeLa細胞、HEK293、人類骨骼骨肉瘤細胞株143B、MDCK、NIH/3T3及Vero細胞。對於病毒分離，通常地藉由熟知澄清程序(例如，諸如梯度離心及管柱層析)將scVACV自細胞培養物中移除且與細胞組分分離，且可視需要使用熟習此項技術者熟知之程序(諸如溶菌斑分析)進一步純化。

在本發明之另一態樣中，產生合成之嵌合牛痘病毒(scVACV)之方法包含以下步驟：(i)化學合成對應於牛痘病毒之實質上所有病毒基因組之重疊DNA片段，且自另一牛痘病毒之病毒株化學合成末端髮夾環；(ii)將重疊DNA片段轉染至輔助病毒感染細胞；(iii)培養該等細胞以在該等細胞中產生輔助病毒及合成之嵌合牛痘病毒粒子的混合物；以及(iv)將混合物接種於對scVACV具有特異性之宿主細胞上以回收scVACV。在一些實施例中，本發明方法之scVACV源自病毒株NYCBH、純系Acambis 2000且末端髮夾環源自牛痘病毒之Western Reserve病毒株。
本發明之聚核苷酸

在一個態樣中，本發明提供用於產生功能性合成之嵌合痘病毒(scVACV)之聚核苷酸(例如，雙鏈DNA片段)。在一些實施例中，本發明提供自合成DNA (例如，化學合成之DNA、PCR擴增之DNA、經工程改造之DNA、包含核苷類似物之聚核苷酸等)產生功能性scVACV的方法。在一些實施例中，本發明提供自病毒基因組之化學合成之重疊雙鏈DNA片段產生功能性scVACV的方法。本發明之各種態樣之聚核苷酸可基於公開之可用基因組序列設計。當牛痘病毒之天然分離物容易獲得時，可在選擇及設計本發明之聚核苷酸之前對病毒基因組進行測序。或者，當牛痘病毒之部分DNA序列(例如自臨床分離物、自法醫樣品或自與感染個體有關之材料的PCR擴增DNA)可獲得時，可在選擇及設計本發明之聚核苷酸之前對部分病毒基因組進行測序。在一個態樣中，因此，本發明之scVACV及本發明之聚核苷酸可基於天然存在之病毒株、變異體或突變體、突變誘發之病毒或經基因工程改造之病毒的基因組序列。

在一個態樣中，本發明提供經分離之聚核苷酸，包括與參考VACV基因組序列或其互補序列之全部或一部分至少90%一致(例如，至少91%、92%、93%或94%一致)、至少95%一致(例如，至少96%、97%、98%或99%一致)或100%一致之核苷酸序列。本發明之經分離之聚核苷酸可包括參考聚核苷酸分子(例如，參考VACV基因組或其片段)之至少5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000 bp或更多連續或非連續核苷酸。一般熟習此項技術者中之一者將瞭解與核酸互補之核酸序列及核酸之變異體亦在此申請案之範疇內。在其他實施例中，本發明之核酸序列可與異源核苷酸序列分離、重組及/或融合，或在DNA庫中。

在一些態樣中，本發明提供用於產生scVACV之聚核苷酸，其中VACV係選自以下病毒株：Western Reserve、純系3、Tian Tian、Tian Tian純系TP5、Tian Tian純系TP3、NYCBH、NYCBH純系Acambis 2000、Wyeth、Copenhagen、Lister、Lister 107、Lister-LO、Lister GL-ONC1、Lister GL-ONC2、Lister GL-ONC3、Lister GL-ONC4、Lister CTC1、Lister IMG2 (Turbo FP635)、IHD-W、LC16m18、Lederle、Tashkent純系TKT3、Tashkent純系TKT4、USSR、Evans、Praha、L-IVP、V-VET1或LIVP 6.1.1、Ikeda、EM-63、Malbran、Duke、3737、CV-1、康諾特實驗室(Connaught Laboratories)、Serro 2、CM-01、NYCBH Dryvax純系DPP13、NYCBH Dryvax純系DPP15、NYCBH Dryvax純系DPP20、NYCBH Dryvax純系DPP17、NYCBH Dryvax純系DPP21、VACV-IOC、安卡拉絨毛膜尿囊牛痘病毒(CVA)、經修飾之安卡拉牛痘(MVA)及MVA-BN。在一較佳實施例中，scVACV源自病毒株NYCBH純系Acambis 2000或ACAM2000。

在一個態樣中，本發明提供用於產生合成之嵌合牛痘病毒(scVACV)之聚核苷酸。在一特定實施例中，scVACV基因組可基於針對VACV病毒株NYCBH純系ACAM2000 (GenBank寄存號AY313847；Osborne JD等人. Vaccine. 2007; 25(52):8807-32)所描述之公佈基因組序列。在本發明之各種態樣中展示可使用本發明之方法，將來自牛痘病毒(VACV)病毒株WR之末端髮夾環接合至VACV基因組病毒株NYCBH純系ACAM2000之端部上以產生功能性scVACV粒子。在一些實施例中，可使用本發明之方法將來自牛痘病毒(VACV)病毒株ACAM2000之末端髮夾環接合至VACV基因組病毒株NYCBH純系ACAM2000之端部上以產生功能性scVACV粒子。可將scVACV基因組劃分成9個重疊片段，如本發明之工作實例中所描述且展示於表1中。在一些實施例中，可將VACV基因組劃分成2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個重疊片段。在一些實施例中，全部基因組可作為一個片段提供。片段大小展示於表1中。本發明之各種態樣之聚核苷酸包含與SEQ ID NOs: 1-9至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，本發明之經分離之聚核苷酸包含此等序列之變異體，其中此類變異體可包括錯義突變、無義突變、複製、缺失及/或添加。SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 14描繪VACV (WR病毒株)末端髮夾環之核苷酸序列。SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 20描繪VACV (ACAM2000病毒株)末端髮夾環之核苷酸序列。在一些實施例中，末端髮夾環包含與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，末端髮夾環包含與SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。

在其他實施例中，scVACV基因組係基於選自以下之VACV病毒株所選擇的病毒株：Western Reserve (Genbank寄存號NC 006998；Genbank寄存號AY243312)、CL3 (Genbank寄存號AY313848)、Tian Tian (GenBank寄存號AF095689.1)、Tian Tian純系TP5 (JX489136)、TP3 (GenBank寄存號KC207810)及TP5 (GenBank寄存號KC207811)、NYCBH、Wyeth、Copenhagen (Genbank寄存號M35027)、NYCBH純系Acambis 2000 (GenBank寄存號AY313847)、Lister 107 (Genbank寄存號DQ121394)、Lister-LO (Genbank寄存號AY678276)、經修飾之安卡拉牛痘病毒 (MVA)(GenBank寄存號U94848；Genbank寄存號AY603355)、MVA-BN (Genbank寄存號DQ983238)、Lederle、Tashkent純系TKT3 (GenBank寄存號KM044309)及TKT4 (KM044310)、USSR、Evans、Praha、LIVP、Ikeda、IHD-W (GenBank寄存號KJ125439)、LC16m8 (AY678275)、EM-63、IC、Malbran、Duke (Genbank寄存號DQ439815)、3737 (GenBank寄存號DQ377945)、VACV-IOC (Genbank寄存號KT184690及KT184691)、CV-1、康諾特實驗室(Connaught Laboratories)、CVA (GenBank寄存號AM501482)、Serro 2病毒(GenBank寄存號KF179385)、Cantaglo病毒分離物CM-01 (GenBank寄存號KT013210)、Dryvax純系DPP15 (GenBank寄存號JN654981)、DPP20 (GenBank寄存號JN654985)、DPP13 (GenBank寄存號JN654980)、DPP17 (GenBank寄存號JN654983)、DPP21 (GenBank寄存號JN654986)。

在一個態樣中，本發明提供經分離之聚核苷酸，其包括與參考wtVACV基因組序列之全部或一部分至少90%一致(例如至少91%、92%、93%或94%一致)、至少95%一致(例如至少96%、97%、98%或99%一致)或100%一致的核苷酸序列。在一些實施例中，本發明之經分離之聚核苷酸包含參考序列之變異體，其中此類變異體可包括錯義突變、無義突變、複製、缺失及/或添加。在一些實施例中，本發明之經分離之聚核苷酸可包括參考聚核苷酸分子(例如，參考wtVACV基因組)之至少5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000 bp或更多連續或非連續核苷酸。

本申請案亦涵蓋與本文揭示之聚核苷酸序列中之任一者互補的聚核苷酸。聚核苷酸可為單鏈(編碼或反義)或雙鏈，且可為DNA (基因組或合成)或RNA分子。RNA分子包括mRNA分子。額外編碼或非編碼序列可(但未必)存在於本發明之聚核苷酸內，且聚核苷酸可(但未必)連接於其他分子及/或支撐材料。

在如下文所描述之最大對應比對時，若兩個序列中之核苷酸或胺基酸序列相同，則兩個聚核苷酸或多肽序列稱為「一致」。兩個序列之間的比較通常藉由在比較窗口上比較序列以識別且比較具有序列相似性之局部區域來進行。如本文中所用之「比較窗口」係指至少約20個鄰近位置，通常30至約75，或40至約50個之片段，其中在兩個序列經最佳比對之後，序列可與具有相同數目之鄰接位置的參考序列相比較。聚核苷酸或變異體亦可或替代地與本文提供之聚核苷酸實質上同源。此類聚核苷酸變異體能夠在適度嚴格條件下與本發明之聚核苷酸(或其互補序列)雜交。

適合之「適度嚴格條件」包括在5 × SSC、0.5% SDS、1.0 mM EDTA (pH 8.0)之溶液中預洗滌；在50℃-65℃、5 × SSC下雜交隔夜；接著在65℃下用含有0.1% SDS之2×、0.5×及0.2 × SSC中之每一者洗滌兩次，歷時20分鐘。

如本文中所使用，「高度嚴格條件(highly stringent conditions/high stringency conditions)」如下：(1)使用低離子強度及高溫用於洗滌，例如在50℃下0.015 M氯化鈉/0.0015 M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉；(2)在雜交期間使用變性劑，諸如甲醯胺，例如在42℃下具有0.1%牛血清白蛋白之50% (v/v)甲醯胺/0.1%菲科爾(Ficoll)/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/具有750 mM氯化鈉、75 mM檸檬酸鈉之pH 6.5之50 mM磷酸鈉緩衝液；或(3)在42℃下使用50%甲醯胺、5 × SSC (0.75 M NaCl，0.075 M檸檬酸鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5 × Denhardt氏溶液、音波處理之鮭魚精子DNA (50 μg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，其中在42℃下在0.2 × SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)中及在55℃下在50%甲醯胺中洗滌，接著在55℃下用由含EDTA之0.1 × SSC組成之較高嚴格度洗液洗滌。熟習此項技術者將知道如何視需要調節溫度、離子強度等以適應諸如探針長度及其類似者之因素。

本發明之聚核苷酸可使用化學合成、重組方法或PCR獲得。化學聚核苷酸合成之方法在此項技術中熟知且無需詳細描述於本文中。熟習此項技術者可使用本文所提供之序列及商購DNA合成器供應商以產生所需DNA序列。

為使用重組方法製備聚核苷酸，包含所需序列之聚核苷酸可插入至適合載體中，且繼而可將載體引入至適合之宿主細胞中進行複製及擴增，如本文中進一步論述。聚核苷酸可藉由此項技術中已知任何方法插入宿主細胞中。藉由直接吸收、內吞作用、轉染、F-配對或電穿孔引入外源性聚核苷酸以轉型細胞。一旦引入，外源性聚核苷酸可作為非整合載體(諸如質體)維持在細胞內或整合至宿主細胞基因組中。如此擴增之聚核苷酸可藉由此項技術中熟知之方法自宿主細胞分離。參看例如Sambrook等人，1989。

替代地，PCR允許DNA序列之複製。PCR技術在此項技術中熟知且描述於美國專利第4,683,195號、第4,800,159號、第4,754,065號及第4,683,202號以及PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis等人編，Birkauswer Press, Boston, 1994中。

RNA可藉由使用適當載體中之經分離之DNA且將其插入至適合宿主細胞中來獲得。當細胞複製且DNA轉錄至RNA時，可隨後使用熟習此項技術者熟知之方法來分離RNA，例如，如Sambrook等人，1989同前文獻中所闡述。

在其他實施例中，本發明之核酸亦包括在高度嚴格條件下與SEQ ID NOs: 1-9中所闡述之核苷酸序列或其互補之序列雜交的核苷酸序列。一般熟習此項技術者將容易理解可改變促進DNA雜交之合適嚴格度條件。舉例而言，吾人可在約45℃下在6.0 ×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)下進行雜交，隨後在50℃下由2.0 × SSC洗滌。舉例而言，洗滌步驟中之鹽濃度可選自50℃下約2.0 × SSC之低嚴格度至50℃下約0.2 × SSC之高嚴格度。另外，洗滌步驟中之溫度可自室溫(約22℃)之低嚴格度條件增加至約65℃之高嚴格度條件。可改變溫度及鹽兩者，或溫度或鹽濃度可保持恆定而改變另一變數。在一個實施例中，本發明提供在室溫下在6 × SSC下之低嚴格度條件下雜交，隨後在室溫下在2 × SSC下洗滌的核酸。

由於遺傳密碼中之簡並性而不同的分離核酸亦在本發明之一些態樣之範疇內。舉例而言，多種胺基酸藉由超過一種三重峰來指定。指定相同胺基酸或同義語(例如，CAU及CAC為組胺酸之同義語)之密碼子可引起不影響蛋白質之胺基酸序列之「沉默」突變。熟習此項技術者應瞭解，由於天然等位基因變異，編碼特定蛋白質之核酸的一或多個核苷酸(至多約3-5%之核苷酸)中之此等變異可存在於既定物種之成員中。任何及全部此類核苷酸變異及所產生之胺基酸多形現象在此申請案之範疇內。

本發明之一個態樣進一步提供適用於選殖本發明之聚核苷酸的重組選殖載體及表現載體。本發明之一個態樣進一步提供包含聚核苷酸分子或重組型載體之轉型宿主細胞，及自其衍生之新型病毒株或細胞株。

宿主細胞可為細菌細胞、酵母細胞、絲狀真菌細胞、藻類細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。在一些實施例中，宿主細胞為大腸桿菌。已研發出多種不同載體用於此等宿主細胞中之各者中之特定用途，包括噬菌體、高複本數質體、低複本數質體及穿梭載體以及其他，且此等載體之任一者可用於實踐本發明。

適合之選殖載體可根據標準技術構築，或可選自此項技術中可供使用之大量選殖載體。雖然所選擇之選殖載體可根據意欲使用之宿主細胞變化，但適用之選殖載體將一般具有自我複製之能力，可具有特定限制核酸內切酶之單一靶標，及/或可載有可用於選擇含有載體之純系的標記物之基因。適合之實例包括質體及細菌病毒，例如，pBAD18、pUC18、pUC19、Bluescript (例如，pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體(諸如pSA3及pAT28)。此等及許多其他選殖載體可購自諸如BioRad、Strategene及Invitrogen之商業供應商。

為幫助選擇用本發明之選殖載體轉型或轉染之宿主細胞，載體可經工程改造以進一步包含用於報導基因產物或其他可選標記物之編碼序列。如上文所述，此類編碼序列較佳與調節元件編碼序列可操作關聯。用於本發明之一些態樣之報導基因為此項技術中所熟知，且包括編碼綠色螢光蛋白、螢光素酶、xylE及酪胺酸酶以及其他的彼等。編碼可選標記物之核苷酸序列為此項技術中所熟知，且包括編碼賦予抗生素或抗代謝物耐藥性之基因產物，或提供營養缺陷需要的彼等。此類序列之實例包括編碼對安比西林(ampicillin)、紅黴素、硫鏈絲菌素或卡那黴素以及其他之耐藥性的彼等。

含有所關注之聚核苷酸之載體及/或聚核苷酸本身可藉由多種適當方法中之任一者引入至宿主細胞中，包括電穿孔、使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-聚葡萄糖或其他物質轉染；微彈轟擊；脂質體轉染；及感染(例如，其中載體為諸如牛痘病毒之感染物)。引入載體或聚核苷酸之選擇將通常視宿主細胞之特徵而定。

本發明之一個態樣進一步提供包含聚核苷酸分子或重組型載體之轉型的宿主細胞，及自其衍生之新型病毒株或細胞株。在一些實施例中，適用於實踐本發明之宿主細胞為大腸桿菌細胞。通常可使用大腸桿菌病毒株，諸如例如購自美國典型培養物保藏中心(ATCC), 10801University Blvd., Manassas, Va. 20110, USA及商業來源的大腸桿菌TOP10或大腸桿菌BL21 (DE3)、DH5α等。在一些實施例中，可使用其他原核細胞或真核細胞。在一些實施例中，宿主細胞為選自以下之屬的成員：梭菌屬(Clostridium )、醱酵單孢菌屬(Zymomonas )、埃希氏桿菌屬(Escherichia )、沙門氏菌屬(Salmonella )、沙雷菌屬(Serratia )、歐文菌屬(Erwinia )、克雷伯氏菌屬(Klebsiella )、志賀桿菌屬(Shigella )、赤球菌屬(Rhodococcus )、假單胞菌屬(Pseudomonas )、芽孢桿菌屬(Bacillus )、乳桿菌屬(Lactobacillus )、腸球菌屬(Enterococcus )、產鹼桿菌屬(Alcaligenes )、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus )、節桿菌屬(Arthrobacter )、棒狀桿菌屬(Corynebacterium )、短桿菌屬(Brevibacterium )、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces )、克魯維酵母屬(Kluyveromyces )、耶氏酵母屬(Yarrowia )、畢赤酵母屬(Pichia )、假絲酵母屬(Candida )、畢赤酵母屬(Pichia )或酵母屬(Saccharomyces )。此類經轉型宿主細胞通常包括(但不限於)微生物，諸如用重組噬菌體DNA轉型之細菌、質體DNA或黏質體DNA載體，或用重組載體轉型之酵母，以及其他。較佳真核宿主細胞包括酵母細胞，但亦可有效地利用哺乳動物細胞或昆蟲細胞。適合之宿主細胞包括原核生物(諸如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(B. subtillis )、變鉛青鏈球菌(S. lividans )或麩胺酸棒狀桿菌(C. glutamicum ))及酵母(諸如釀酒酵母(S. cerevisae )、粟酒裂殖酵母(S. pombe )、巴斯德畢赤酵母(P. pastoris )或乳酸克魯維酵母(K. lactis ))。

在一個態樣中，本發明亦包括scVACV、其重組體或其功能性部分之基因組。病毒基因組之功能性部分可為編碼蛋白質或其部分(例如，結構域、抗原決定基等)之基因組的部分，包含調節元件或調節元件之組件(諸如，啟動子、強化子、順式或反式作用元件等)。此類病毒序列可用於例如藉由使用PCR、雜交技術或藉由建立ELISA分析來識別或分離病毒或其重組體。
本發明之醫藥組合物

在一個態樣中，本發明係關於包含本發明之scVACV之醫藥組合物及醫藥學上可接受之載劑。

術語「醫藥學上可接受」意謂經聯邦政府或州政府之監管機構批准或在美國藥典或其他一般公認之藥典中列出以適用於動物，且更特定言之適用於人類。術語「載劑」係指與醫藥組合物(例如，免疫原性或疫苗調配物)一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。亦可使用生理鹽水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液作為液體載劑，尤其用於可注射溶液。適合之賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻穀、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇及其類似物。適合之醫藥載劑之實例描述於E. W. Martin之「雷明頓氏醫藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)」中。調配物應適於投與模式。

在一些實施例中，可藉由標準投與途徑投與本發明之醫藥組合物。許多方法可用於將調配物引入至個體中，此等包括(但不限於)鼻內、氣管內、經口、皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、結膜及皮下途徑。
例示性用途
預防或治療病原性痘病毒感染

在一些實施例中，本發明之合成之嵌合牛痘病毒(scVACV)可用於免疫接種或觸發或增強個體對病原性痘病毒感染之免疫反應。在另一個實施例中，scVACV可用於觸發或增強對牛痘病毒之免疫反應。在另一個實施例中，scVACV可用於觸發或增強對天花病毒之免疫反應。在另一個實施例中，scVACV可用於觸發或增強對猴痘病毒之免疫反應。在另一個實施例中，scVACV可用於預防、控制或治療個體中之一或多個病原性痘病毒感染，諸如用於治療天花病毒感染。在一些實施例中，scVACV係選自以下牛痘病毒之病毒株：Western Reserve、純系3、Tian Tian、Tian Tian純系TP5、Tian Tian純系TP3、NYCBH、NYCBH純系Acambis 2000、Wyeth、Copenhagen、Lister、Lister 107、Lister-LO、Lister GL-ONC1、Lister GL-ONC2、Lister GL-ONC3、Lister GL-ONC4、Lister CTC1、Lister IMG2 (Turbo FP635)、IHD-W、LC16m18、Lederle、Tashkent純系TKT3、Tashkent純系TKT4、USSR、Evans、Praha、L-IVP、V-VET1或LIVP 6.1.1、Ikeda、EM-63、Malbran、Duke、3737、CV-1、康諾特實驗室(Connaught Laboratories)、Serro 2、CM-01、NYCBH Dryvax純系DPP13、NYCBH Dryvax純系DPP15、NYCBH Dryvax純系DPP20、NYCBH Dryvax純系DPP17、NYCBH Dryvax純系DPP21、VACV-IOC、安卡拉絨毛膜尿囊牛痘病毒(CVA)、經修飾之安卡拉牛痘(MVA)及MVA-BN。在一較佳實施例中，scVACV源自病毒株NYCBH純系Acambis 2000或ACAM2000。

在一個態樣中，本發明之scVACV可用於免疫原性調配物，例如疫苗調配物。調配物可用於預防、控制、中和、治療及/或改善病原性痘病毒感染。免疫原性調配物可包含活scVACV或不活化scVACV。 scVACV可藉由熟習此項技術者熟知之方法不活化。常見方法使用福馬林及加熱進行不活化。在一些實施例中，免疫原性調配物包含活疫苗。可使用涉及在細胞培養物中繁殖scVACV隨後純化之習知方法以實現此類活免疫原性調配物之產生。舉例而言，如熟習此項技術者可測定，scVACV可在BHK、BGMK、BRL3A、BSC-40、CEF、CEK、CHO、COS、CVI、HaCaT、HEL、HeLa細胞、HEK293、人類骨骼骨肉瘤細胞株143B、MDCK、NIH/3T3、Vero細胞等中培養。

在一個態樣中，本發明之scVACV可用於預防、控制或治療天花。在另一態樣中，本發明之scVACV可用作用於預防已暴露、潛在地暴露或處於暴露於天花風險下之個體或人群中之天花的疫苗。本發明之各種態樣之scVACV可用於創建新的天花疫苗之國內備。在一些實施例中，本發明之scVACV可預防性地投與防衛人員，急救人員等。

在一個實施例中，包含本發明之scVACV的組合物用作天花疫苗。在一個態樣中，根據本發明之方法產生的本發明之scVACV將具有小溶菌斑表現型。大體而言，認為小溶菌斑表現型反映減毒。因此，根據本發明之各種方法產生的scVACV提供現有天花疫苗之安全替代物。在一些實施例中，疫苗對於免疫抑制個體(例如，HIV患者，正在進行化療之患者，正在進行癌症、風濕病症或自體免疫病症治療之患者，正在接受或已接受器官或組織移植之患者，患有免疫缺陷之患者、兒童、妊娠期婦女，患有異位性皮炎、濕疹、牛皮癬、心臟病況之患者及使用免疫抑制劑之患者等)可安全投與，該等個體可能經歷現有天花疫苗之嚴重併發症，且因此禁用現有天花疫苗。在一些實施例中，疫苗可與一或多種抗病毒治療組合使用以抑制病毒複製。在一些實施例中，疫苗可與波林福韋(brincidofovir)治療組合使用以抑制病毒複製。在一些實施例中，疫苗可與特考韋瑞/SIGA-246治療組合使用以抑制病毒複製。在一些實施例中，疫苗可與非環狀核苷膦酸酯(西多福韋(cidofovir))、非環狀核苷或膦酸酯之口服烷氧基烷基前藥(波林福韋(brincidofovir)或CMX001)組合使用。在一些實施例中，疫苗可與牛痘免疫球蛋白(VIG)組合使用。在一些實施例中，疫苗可用於先前已用源自VACV、VARV或HPXV之肽或蛋白質抗原免疫之個體中。在一些實施例中，疫苗可用於先前已用殺死或不活化之VACV免疫之個體中。在一些實施例中，疫苗可用於先前已用複製缺陷型/缺陷型VACV病毒病毒株MVA (經修飾之安卡拉病毒)免疫之個體中。在一些實施例中，包含本發明之scVACV之疫苗調配物可包含活scVACV或不活化scVACV。

在一個實施例中，包含本發明之scVACV的組合物用作天花疫苗。scVACV係基於選自以下之VACV病毒株：ACAM2000 (Genbank寄存號AY313847)、Western Reserve (Genbank寄存號NC 006998；Genbank寄存號AY243312)、CL3 (Genbank寄存號AY313848)、Tian Tian (GenBank寄存號AF095689.1)、Tian Tian純系TP5 (JX489136)、TP3 (GenBank寄存號KC207810)及TP5 (GenBank寄存號KC207811)、NYCBH、Wyeth、Copenhagen (Genbank寄存號M35027)、NYCBH純系Acambis 2000 (GenBank寄存號AY313847)、Lister 107 (Genbank寄存號DQ121394)、Lister-LO (Genbank寄存號AY678276)、經修飾之安卡拉牛痘病毒(MVA) (GenBank寄存號U94848；Genbank寄存號AY603355)、MVA-BN (Genbank寄存號DQ983238)、Lederle、Tashkent純系TKT3 (GenBank寄存號KM044309)及TKT4 (KM044310)、USSR、Evans、Praha、LIVP、Ikeda、IHD-W (GenBank寄存號KJ125439)、LC16m8 (AY678275)、EM-63、IC、Malbran、Duke (Genbank寄存號DQ439815)、3737 (GenBank寄存號DQ377945)、CV-1、康諾特實驗室(Connaught Laboratories)、CVA (GenBank寄存號AM501482)、Serro 2病毒(GenBank寄存號KF179385)、Cantaglo病毒分離物CM-01 (GenBank寄存號KT013210)、Dryvax純系DPP15 (GenBank寄存號JN654981)、DPP20 (GenBank寄存號JN654985)、DPP13 (GenBank寄存號JN654980)、DPP17 (GenBank寄存號JN654983)、DPP21 (GenBank寄存號JN654986)及IOC (Genbank寄存號KT184690及KT184691)。在一個實施例中，待用作天花疫苗之scVACV係基於病毒株ACAM2000 (Genbank寄存號AY313847)。在一個實施例中，待用作天花疫苗之scVACV係基於病毒株VACV-IOC (GenBank寄存號KT184690及KT184691)。在一個實施例中，待用作天花疫苗之scVACV係基於病毒株MVA (Genbank寄存號U94848；Genbank寄存號AY603355)。在一個實施例中，待用作天花疫苗之scVACV係基於病毒株MVA-BN (Genbank寄存號DQ983238)。在一些實施例中，包含本發明之scVACV之疫苗調配物可包含活scVACV或不活化scVACV。

在一些實施例中，包含本發明之scVACV之組合物用作針對VACV感染、MPXV感染或CPXV感染的疫苗。

在一些實施例中，本發明之scVACV可經設計成表現異源抗原或抗原決定基且可用作針對此類抗原及/或抗原決定基之來源生物體之疫苗。

本發明之免疫原性調配物(例如，疫苗)包含有效量之scVACV及醫藥學上可接受之載劑。術語「醫藥學上可接受」意謂經聯邦政府或州政府之監管機構批准或在美國藥典或其他一般公認之藥典中列出適用於動物，且更特定言之適用於人類。術語「載劑」係指與醫藥組合物(例如，免疫原性或疫苗調配物)一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。亦可使用生理鹽水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液作為液體載劑，尤其用於可注射溶液。適合之賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻穀、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇及其類似物。適合之醫藥載劑之實例描述於E. W. Martin之「雷明頓氏醫藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)」中。調配物應適於投與模式。特定調配物亦可視scVACV是否為活的或不活化的而定。在一些實施例中，本發明之經純化scVACV可凍乾以便後續使用或可在醫藥溶液中立即製備。scVACV亦可在具有或不具佐劑或載劑之生理學可接受之溶液(諸如無菌生理鹽水)中稀釋。

在一個態樣中，本發明之免疫原性調配物(例如疫苗)可藉由劃痕向患者投與。疫苗亦可藉由任何其他標準投與途徑投與。許多方法可用於引入免疫原性調配物(例如疫苗)，此等包括(但不限於)鼻內、氣管內、經口、皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、結膜及皮下途徑。在鳥類中，方法可進一步包括後鼻孔接種。作為非經腸投與之替代方式，本發明之態樣亦涵蓋用於農業目的之大規模投與途徑，諸如藉由飲用水或噴霧。替代地，較佳的可經由其天然感染途徑引入本發明之scVACV。在一些實施例中，本發明之免疫原性調配物作為可注射液體、表現疫苗之可消耗轉基因植物、持續釋放凝膠或可植入囊封組合物、固體植入物或核酸投與。免疫原性調配物亦可在乳霜、乳液、軟膏、皮膚貼片、口含錠或口服液體(諸如懸浮液、溶液及乳液(水包油或油包水))中投與。用於活性複製天花疫苗之可接受投與途徑為經皮劃痕，其在疫苗接種位點處產生持續數天之病毒排出病變。病變為疫苗接觸傳播至個體之潛在來源，該個體可經禁止接受活疫苗。因此，免疫原性調配物之肌內投與可提供優勢。在一較佳實施例中，scVACV ACAM2000之投與為肌內投與。在另一個較佳實施例中，投與為藉由經皮劃痕。肌內投與亦可用於其他合成之嵌合正痘病毒屬，諸如合成之嵌合馬痘病毒(scHPXV)。就肌內投與而言，重要的係使用具有正確長度之針頭到達肌肉塊，且不滲至皮下組織。當投與肌內注射時，針頭應以90°角插入。

在某些實施例中，相較於未經治療之個體，本發明之免疫原性調配物(例如，疫苗)不導致完全免受感染，而導致病原體(例如，病原性痘病毒)之效價較低或數目減少。在某些實施例中，投與本發明之免疫原性調配物導致病原體之效價相對於未經治療之個體降低0.5倍、1倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍或1,000倍或更多。降低病原體之效價、數目或總負荷之益處包括(但不限於)感染症狀之嚴重程度降低及與感染有關之疾病或病況的持續時間減短。

在某些實施例中，本發明之免疫原性調配物(例如，疫苗)不導致完全免受感染，但與未經治療之個體相比，導致症狀之數目減少或症狀之強度降低，或發病率降低或死亡率降低。

在各種實施例中，將本發明之免疫原性調配物(例如，疫苗)或藉由本發明之scVACV產生之抗體與用於預防感染(例如，病原性痘病毒感染)的一或多種其他療法(例如，抗病毒或免疫調節療法)組合向個體投與。在其他實施例中，將藉由本發明之scVACV產生之免疫原性調配物或抗體與用於治療感染(例如，病原性痘病毒感染)的一或多種其他療法(例如，抗病毒或免疫調節療法)組合向個體投與。在另外其他實施例中，將藉由本發明之scVACV產生之免疫原性調配物或抗體與用於控制及/或減緩感染(例如，病原性痘病毒感染)的一或多種其他療法(例如，抗病毒或免疫調節療法)組合向個體投與。在一特定實施例中，將藉由本發明之scVACV產生之免疫原性調配物或抗體與用於預防天花的一或多種其他療法(例如，抗病毒或免疫調節療法)組合向個體投與。在另一個特定實施例中，將藉由本發明之scVACV產生之免疫原性調配物或抗體與用於治療天花的一或多種其他療法(例如，抗病毒或免疫調節療法)組合向個體投與。在一些實施例中，疫苗可與一或多種抗病毒治療組合使用以抑制病毒複製。在一些實施例中，疫苗可與波林福韋(brincidofovir)治療組合使用以抑制病毒複製。在一些實施例中，疫苗可與特考韋瑞/SIGA-246治療組合使用以抑制病毒複製。在一些實施例中，疫苗可與非環狀核苷膦酸酯(西多福韋(cidofovir))、非環狀核苷或膦酸酯之口服烷氧基烷基前藥(波林福韋(brincidofovir)或CMX001)組合使用。在一些實施例中，疫苗可與牛痘免疫球蛋白(VIG)組合使用。在一些實施例中，疫苗可用於先前已用源自VACV、VARV或HPXV之肽或蛋白質抗原免疫之個體中。在一些實施例中，疫苗可用於先前已用殺死或不活化之VACV免疫之個體中。在一些實施例中，疫苗可用於先前已用複製缺陷型/缺陷型VACV病毒病毒株MVA (經修飾之安卡拉病毒)免疫之個體中。

熟習此項技術者熟知之任何抗病毒試劑可用於本發明之各種態樣之調配物(例如，疫苗調配物)及方法中。抗病毒劑之非限制性實例包括抑制及/或減少病毒與其受體之連接、病毒至細胞中之內化、病毒複製或病毒自細胞之釋放的蛋白質、多肽、肽、融合蛋白抗體、核酸分子、有機分子、無機分子及小分子。特定言之，抗病毒劑包括(但不限於)阻斷細胞外病毒成熟之抗病毒劑(特考韋瑞/SIGA-246)、非環狀核苷膦酸酯(西多福韋(cidofovir))、非環狀核苷膦酸酯之口服烷氧基烷基前藥(波林福韋(brincidofovir)或CMX001)或牛痘免疫球蛋白(VIG)。在一些實施例中，抗病毒劑包括(但不限於)核苷類似物(例如齊多夫定(zidovudine)、阿昔洛韋(acyclovir)、更昔洛韋(gangcyclovir)、阿糖腺苷(vidarabine)、碘苷(idoxuridine)、曲氟尿苷(trifluridine)及利巴韋林(ribavirin))、膦甲酸(foscarnet)、金剛胺、金剛乙胺、沙奎那韋(saquinavir)、茚地那韋(indinavir)、利托那韋(ritonavir)、α-干擾素及其他干擾素及AZT。

劑量及給藥方案可由熟習此項技術者根據將治療之個體的需要來決定。熟習此項技術者可考慮諸如個體之年齡或體重、所治療疾病或病況之嚴重程度及個體對治療之反應的因素。在一些實施例中，舉例而言，可根據需要或每天投與本發明之組合物。可經不同時間段進行給藥。舉例而言，給藥方案可持續1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週或更久。在一些實施例中，給藥方案將持續1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月或更久。

在一些態樣中，本發明之scVACV亦可用於產生適用於被動免疫療法、診斷或預後免疫分析等之抗體。產生抗體之方法為此項技術中熟知的。抗體在用於免疫療法中之前可經進一步修飾(例如，嵌合、人類化等)。
溶瘤劑

本發明中使用之「溶瘤病毒」或「溶瘤劑」經視為通常能夠藉由感染該腫瘤細胞殺死腫瘤細胞(非抗性)之任何病毒。

在一個態樣中，本發明之合成之嵌合痘病毒(scVACV)可用作在癌細胞中選擇性複製且殺死癌細胞之溶瘤劑。在另一態樣中，本發明係關於一種用於誘導個體中之溶瘤反應之方法，其包含向個體投與包含本發明之scVACV之組合物。快速分裂之細胞(諸如癌細胞)通常比未分裂細胞更容易感染痘病毒。痘病毒之許多特徵，諸如在人體內之安全性、容易製造高效價儲備液、病毒製劑之穩定性以及在腫瘤細胞中複製之後誘導抗腫瘤免疫性之能力使痘病毒成為理想溶瘤劑。根據本發明之各種方法產生之scVACV可包含致使其適用於癌症治療之一或多個修飾。因此，在一個態樣中，本發明提供一種誘導癌細胞死亡之方法，該方法包含將細胞與分離之scVACV或包含本發明之scVACV之醫藥組合物接觸。在一個態樣中，本發明提供一種治療癌症之方法，該方法包含向有需要之患者投與治療有效量之本發明之scVACV。另一態樣包括本文所述之用於治療癌症或誘導贅生性病症死亡之scVACV或組合物。另一態樣包括使用scVACV或本文所述之組合物以誘導贅生性病症細胞(諸如癌細胞)之死亡或治療贅生性病症(諸如癌症)。在一些實施例中，痘病毒溶瘤療法與一或多種習知癌症療法(例如手術、化學療法、放射療法、熱療法及生物/免疫療法)組合投與。在特定實施例中，溶瘤病毒為scVACV NYCBH病毒株，純系Acambis 2000或ACAM2000。

使用本申請案之方法，可易於引入一或多個合乎需要之基因且一或多個不合需要之基因可易於自scVACV基因組缺失。在一些實施例中，用作溶瘤劑之本發明之scVACV經設計以表現轉基因來增強其免疫反應性、抗腫瘤靶標及/或效能、細胞至細胞擴散及/或癌症特異性。在一些實施例中，本發明之scVACV經設計或經工程改造以表現免疫調節基因(例如，GM-CSF或阻斷TNF功能之病毒基因)。在一些實施例中，本發明之scVACV經設計以包括表現減弱毒性之因子之基因。在一些實施例中，本發明之scVACV經設計或經工程改造以表現治療劑(例如hEPO、BMP-4、特定腫瘤抗原或其部分之抗體等)。在一些實施例中，本發明之scVACV已經設計或經工程改造以包含gmCSF基因。在一些實施例中，本發明之scVACV已經修飾而減弱。在一些實施例中，本發明之scVACV經設計或經工程改造以缺乏病毒胸苷激酶(TK)基因。在一些實施例中，本發明之scVACV經設計或經工程改造以缺乏核糖核苷酸還原酶基因。在一些實施例中，本發明之scVACV經設計或經工程改造以缺乏牛痘成長因子基因。在一些實施例中，本發明之scVACV經設計或經工程改造以缺乏紅血球凝集素基因。

在一個態樣中，本發明之scVACV適用於治療多種贅生性病症及/或癌症。在一些實施例中，癌症類型包括(但不限於)骨癌、乳癌、膀胱癌、宮頸癌、結腸直腸癌、食管癌、神經膠質瘤、胃癌、胃腸癌、頭頸癌、肝癌(諸如肝細胞癌)、白血病、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、皮膚癌(諸如黑素瘤)、睾丸癌等，或可治療之任何其他腫瘤或贅生前病變。

在另一個實施例中，方法進一步包含偵測投與之scVACV在贅生性病症或癌細胞中及/或在投與本文所描述之分離或重組病毒或組合物的個體之樣品中之存在。舉例而言，可在本文所描述之scVACV或組合物投與之前及/或投與之後測試個體以分析例如感染之進展。在一些實施例中，本發明之scVACV包含偵測卡匣且偵測所投與之嵌合VACV的存在包含對偵測卡匣編碼之蛋白質進行偵測。舉例而言，其中偵測卡匣編碼螢光蛋白，個體或樣品使用觀察螢光之方法成像。

在一個態樣中，本發明之溶瘤調配物包含有效量之本發明之scVACV及醫藥學上可接受之載劑。術語「醫藥學上可接受」已經在以上前述部分中解釋。

在一些實施例中，本發明之組合物在痘病毒治療設施中投與。在某些態樣中，痘病毒治療設施為如下設施，其中需要用本發明之組合物或方法進行免疫接種或治療之個體可在環境中免疫或治療，使得其與不意欲免疫或治療或可由經治療之個體(例如看護者及家庭成員)潛在感染之其他個體隔離。在一些實施例中，不意欲由經治療之個體免疫或潛在感染之個體包括HIV患者，進行化療之患者，進行針對癌症、風濕病症或自身免疫病症之治療之患者，正在接受或已接受器官或組織移植的患者，患有免疫缺陷之患者、兒童、妊娠期婦女，患有異位性皮炎、濕疹、牛皮癬、心臟病況之患者及使用免疫抑制劑之患者等。在一些實施例中，痘病毒治療設施為正痘病毒治療設施。在一些實施例中，痘病毒治療設施為天花治療設施。

在一些實施例中，包含scVACV之本發明之組合物在天花不良事件中係由專家來投與。在一些實施例中，天花不良事件包括(但不限於)疫苗性濕疹、進行性牛痘、疫苗接種後腦炎、心肌炎及擴張型心肌症。
用於重組基因表現之病毒載體

在一個態樣中，本發明之合成之嵌合痘病毒(scVACV)可經工程改造以攜載異源序列。異源序列可來自不同痘病毒物種或任何非痘病毒來源。在一個態樣中，異源序列為選自任何非痘病毒來源之抗原性抗原決定基。如在本申請案中所使用之非痘病毒來源係指與痘病毒不同之生物體。在一些實施例中，重組病毒可表現來自非痘病毒來源之一或多個抗原性抗原決定基，包括(但不限於)惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum )、分枝桿菌、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis )、霍亂弧菌(Vibrio cholerae )、MRSA、棒狀病毒、流感病毒、黃病毒科之病毒、副黏液病毒、肝炎病毒、人類免疫缺乏病毒，或來自致使出血熱之病毒(諸如漢他病毒或絲狀病毒，亦即埃博拉(Ebola)或馬堡(Marburg)病毒)。在另一態樣中，異源序列為來自不同痘病毒物種之抗原性抗原決定基。此等病毒序列可用於修飾scVACV之宿主範圍或免疫原性。

在一些實施例中，本發明之scVACV可編碼用於表現治療性核酸(例如，反義核酸)或治療性肽(例如，具有所需生物活性之肽或蛋白質)之異源基因/核酸。

在一些實施例中，異源核酸序列之表現較佳但非排他地處於痘病毒啟動子之轉錄控制下。在一些實施例中，異源核酸序列較佳地插入至病毒基因組之非必需區域中。熟習此項技術者已知向痘病毒基因組中插入異源序列之方法。在一些實施例中，藉由化學合成引入異源核酸。在一例示性實施例中，異源核酸可選殖至本發明之scVACV之VACV105/J2R基因座中。

本發明之一個態樣之scVACV可用於將異源核酸序列引入至靶細胞中，該序列與靶細胞同源或異源。將異源核酸序列引入至靶細胞中可用於活體外產生異源肽或多肽，及/或藉由序列編碼之完整病毒。在一個實施例中，此方法包含用本發明之scVACV感染宿主細胞；在適合之條件下培養感染之宿主細胞；且分離及/或富集藉由宿主細胞產生之肽、蛋白質及/或病毒。為表現異源肽或多肽，用於培養scVACV感染之宿主細胞之適合條件為此項技術中所熟知，且根據所使用之宿主細胞而變化(參見例如，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989))。

應瞭解，已描述之本申請案之實施例僅僅為本申請案之原理的一些應用之說明。熟習此項技術者基於本文提出之教示可做出許多修改而不背離本申請案之真實精神及範疇。

以下實例作為本申請案之代表經闡述。此等實例並不應理解為限制本發明之範疇，因為此等及其他等效實施例鑒於本發明、圖式及所附實施例將顯而易知。
實例
實例 1. 病毒基因組之重疊片段的選擇及設計
含有 VACV WR 病毒株髮夾及雙螺旋序列 之 合成之嵌合 VACV ACAM2000 (scVACV ACAM2000-WR DUP/HP)

scVACV 基因組之設計係基於VACV ACAM2000 [GenBank寄存號AY313847]之前述基因組序列(Osborne JD等人. Vaccine. 2007; 25(52):8807-32)。基因組經劃分成9個重疊片段(圖1)。此等片段經設計使得其與各鄰接片段共用至少1.0 kbp重疊序列(亦即同源性)，以提供同源重組將驅動全長基因組之組裝的位點(表1)。此等重疊序列提供足夠的同源性以在共轉染片段之間精確地進行重組(Yao XD, Evans DH. Journal of Virology. 2003;77(13):7281-90)。
表 1 ：用於此研究之VACV ACAM2000基因組片段。描述VACV ACAM2000基因組[GenBank寄存號AY313847]內之大小及序列。

為輔助次選殖此等片段，Aar I及Bsa I限制位點在所有片段(除兩個ITR編碼片段以外)中沉默地突變。在此等區域含有對於高效DNA複製及多聯體解析度至關重要之核苷酸序列特異性識別位點的情況下，兩個ITR編碼片段中之Bsa I限制位點未突變。

在痘病毒早期晚期啟動子控制下之YFP/gpt卡匣經引入至胸苷激酶基因座中，使得在螢光顯微鏡下容易觀測到VACV ACAM2000 (VACV ACAM2000 YFP-gpt::105)之再活化。gpt基因座亦提供使用藥物選擇以選擇經再活化病毒之可能工具。

傳統地，終端髮夾已難以選殖及測序，因此VACV ACAM2000基因組之公佈序列不完整並不出人意料。在檢測經公佈VACV ACAM2000病毒株之極末端區域之後，ACAM2000與極佳表徵之VACV WR病毒株(GenBank寄存號AY243312)之間似乎存在一些差異(圖2)。在WR病毒株中，存在緊接共價閉合之髮夾環之下游的70bp串連型重複序列，該髮夾環位於VACV基因組之末端5'及3'端處。此等接著兩個125bp重複序列及八個54bp重複序列(圖2A)。然而，在經公佈之VACV ACAM2000序列中，僅識別四個54bp重複序列(圖2B)。在測序之後，在VACV ACAM2000之野生型分離物中證實70bp、125bp及54bp重複序列之存在，從而指示ACAM2000之當前公佈序列為不完整的。由於依魯米那(Illumina)讀數之較短讀數長度(＜ 300個核苷酸)，因此本發明者不能精確地判定哪一實際ACAM2000基因組序列呈此約3 kbp形式。替代地，本發明者決定重建自末端髮夾至僅C23L基因之終止密碼子前具有與VACV WR類似序列之VACV ACAM2000病毒(圖2)。此包括125bp及54bp串連型重複序列兩者，儘管該等序列未包括於經公佈之ACAM2000序列中，但在執行wtVACV ACAM2000之新一代依魯米那測序時，偵測到該等序列。在經修飾之VACV ACAM2000左及右ITR片段之5'端處，亦包括NheI限制位點，彼將容許將70bp串連型重複序列直接地附接至ITR端部(如實例2中所論述)。wtVACV ACAM2000之F及S末端髮夾環序列分別展示於圖9及SEQ ID NO: 20及19中。
含有 VACV ACAM2000 病毒株髮夾及雙螺旋序列 之 合成之嵌合 VACV ACAM2000 (scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP)

scVACV 基因組之設計係基於VACV ACAM2000 [GenBank寄存號AY313847]之前述基因組序列(Osborne JD等人. Vaccine. 2007; 25(52):8807-32)。基因組經劃分成9個重疊片段(圖1)。此等片段經設計使得其與各鄰接片段共用至少1.0 kbp重疊序列(亦即同源性)，以提供同源重組將驅動全長基因組之組裝的位點(表1)。此等重疊序列提供足夠的同源性以在共轉染片段之間精確地進行重組(Yao XD, Evans DH. Journal of Virology. 2003;77(13):7281-90)。

wtVACV ACAM2000之F及S末端髮夾環序列分別展示於圖9及SEQ ID NO: 20及19中。
實例 2.
將 VACV WR F 及 S 末端髮夾環接合至 VACV ACAM2000 右及左 ITR 片段上

合成與VACV WR病毒株一致之70bp重複片段(圖2C；SEQ ID NO: 10)。Sap I及Nhe I限制位點包括於70bp串連型重複片段之5'及3'末端處以便於分別接合至VACV WR髮夾序列及VACV ACAM2000右及左ITR片段上。在VACV WR末端髮夾環可經接合至70bp串連型重複片段上之前，必須使用藉由IDT技術合成之雙螺旋序列將環延長額外58bp (圖3A)。此係由於額外序列緊接多聯體解析度位點之下游，隨後在VACV病毒株WR中發現第一70bp重複序列。雙螺旋序列藉由合成兩個單鏈DNA分子來產生，該兩個單鏈DNA分子在黏接在一起時將產生具有5'端處之5'-TGT懸垂物及3'端處之5'-GGT懸垂物之雙螺旋DNA分子(圖3A；SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12)。由於VACV WR F及S末端髮夾環在其末端環處產生3'-ACA懸垂物，因此58bp雙螺旋經接合至髮夾以產生與VACV WR病毒株中發現之序列看起來一致之約130bp末端髮夾環直至70bp重複序列之開端(圖3B)。此髮夾/雙螺旋片段經凝膠純化且隨後相繼地接合至70bp重複片段之經Sap I消化的端部上。用Sap I消化70bp串連型重複片段形成三基懸垂物(5'-CCA)，其與末端髮夾/雙螺旋結構中之5'GGT懸垂物互補。在存在DNA接合酶之情況下，70bp串連型重複以相對於70bp串連型重複片段之約5倍莫耳過量與F末端髮夾/雙螺旋結構(圖4，色帶4)或S末端髮夾/雙螺旋結構(圖4，色帶5)混合。相較於僅70bp反應(圖4，色帶3)，此在DNA電泳凝膠中產生上移，從而指示末端髮夾/雙螺旋經成功地接合至70bp串連型重複片段上(圖4)。

此末端髮夾/雙螺旋/70bp串連型重複片段經相繼地接合至先前在其末端端部處經修飾以包括Nhe I限制位點之70bp ACAM2000左或右ITR片段上。當此片段經消化時，5'-CTAG懸垂物保留在其5'端處。在70bp串連型重複片段之3'末端處，Nhe I位點用於將此片段直接地接合至VACV ACAM2000 DNA片段之LITR及RITR區域。在VACV ACAM2000左及右ITR片段之消化之後，，S末端髮夾/雙螺旋/70bp串連型重複片段或F末端髮夾/雙螺旋/70bp串連型重複片段在16℃下以1:1莫耳比使用DNA接合酶分別接合至左或右ITR片段隔夜。DNA接合酶隨後在65℃下經加熱不活化，隨後經轉染至感染休普氏纖維瘤病毒(SFV)之BGMK細胞中。
將 VACV ACAM2000 F 及 S 末端髮夾環接合至 VACV ACAM2000 右及左 ITR 片段上

合成與VACV ACAM2000病毒株一致之70bp重複片段。Sap I及Nhe I限制位點包括於70bp串連型重複片段之5'及3'末端處以便於分別接合至VACV ACAM2000髮夾序列及VACV ACAM2000右及左ITR片段上。在VACV ACAM2000末端髮夾環可接合至70bp串連型重複片段上之前，必須使用藉由IDT技術合成之雙螺旋序列將環延長額外58bp。此係由於額外序列緊接多聯體解析度位點之下游，隨後在VACV病毒株ACAM2000中發現第一70bp重複序列。雙螺旋序列藉由合成兩個單鏈DNA分子來產生，該兩個單鏈DNA分子在黏接在一起時將產生具有5'端處之5'-TGT懸垂物及3'端處之5'-GGT懸垂物之雙螺旋DNA分子(SEQ ID NO:21及SEQ ID NO: 22)。由於VACV ACAM2000 F及S末端髮夾環在其末端環處產生3'-ACA懸垂物，因此58bp雙螺旋經接合至髮夾以產生約130bp末端髮夾環。此髮夾/雙螺旋片段經凝膠純化且隨後相繼地接合至70bp重複片段之經Sap I消化的端部上。用Sap I消化70bp串連型重複片段形成三基懸垂物(5'-CCA)，其與末端髮夾/雙螺旋結構中之5'GGT懸垂物互補。在存在DNA接合酶之情況下，70bp串連型重複以相對於70bp串連型重複片段之約5倍莫耳過量與F末端髮夾/雙螺旋結構或S末端髮夾/雙螺旋結構混合。相較於僅70bp反應，此在DNA電泳凝膠中產生上移，從而指示末端髮夾/雙螺旋成功地接合至70bp串連型重複片段上。

此末端髮夾/雙螺旋/70bp串連型重複片段經相繼地接合至先前在其末端端部處經修飾以包括Nhe I限制位點之ACAM2000左或右ITR片段上。當此左或右ITR片段經消化時，5'-CTAG懸垂物保留在其5'端處。在70bp串連型重複片段之3'末端處，NheI位點用於將此片段直接地接合至VACV ACAM2000 DNA片段之LITR及RITR區域。在VACV ACAM2000左及右ITR片段之消化之後，，S末端髮夾/雙螺旋/70bp串連型重複片段或F末端髮夾/雙螺旋/70bp串連型重複片段在16℃下以1:1莫耳比使用DNA接合酶分別接合至左或右ITR片段隔夜。DNA接合酶隨後在65℃下經加熱不活化，隨後經轉染至感染休普氏纖維瘤病毒(SFV)之BGMK細胞中。
實例 3. 製備 VACV ACAM2000 重疊 DNA 片段

使用限制酶I-Sce I將表1中之VACV ACAM2000重疊DNA片段中之各者選殖至由基因技術(GeneArt)提供之質體中。在將此等合成DNA片段轉染至BGMK細胞中之前，用I-Sce I消化質體且使產物在凝膠上運行以證實DNA片段經成功地線性化(圖5)。在37℃下消化2小時之後，相繼地在65℃下加熱不活化反應物。樣品經儲存於冰上或4℃下直至形成末端髮夾/雙螺旋/70bp串連型重複/ITR片段(如上文所描述)。
實例 4. 自化學合成之 dsDNA 片段中再活化

SFV病毒株Kasza及BSC-40最初獲自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)。水牛綠猴腎(BGMK)細胞獲自G. McFadden (University of Florida)。BSC-40及BGMK細胞在37℃下在補充有L-麩醯胺酸、非必需胺基酸、丙酮酸鈉、抗生素及抗黴劑以及5%胎牛血清(FCS；ThermoFisher Scientific)之含5%CO₂ 之最低基本培養基(MEM)中繁殖。
感染休普氏纖維瘤病毒之細胞中之 scVACV ACAM2000-WR DUP/HP 或 scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP 之 再活化

水牛綠猴腎(BGMK)細胞在含有MEM之60 mm組織培養皿中生長直至其達至大約80%融合度為止。細胞在37℃下以0.5 MOI經含休普氏纖維瘤病毒(SFV)之無血清MEM感染持續1 h。接種體經含有5% FCS之3ml溫熱MEM替換，且返回至培育箱保持額外一小時。同時，如下設置轉染反應。在37℃下保持大約2h後，線性化VACV ACAM2000片段基於包含VACV ACAM2000基因組之各片段的長度以莫耳當量經轉染(使用脂染胺(Lipofectamine) 2000)至感染SFV之BGMK細胞中。嘗試不同量之總DNA且5、6及7.5 µg DNA能夠成功地再活化來自此等重疊DNA片段之ACAM2000。錯合物在室溫下培育10分鐘，且隨後逐滴添加至先前感染SFV之BGMK細胞。感染後大約24小時，培養基經含有5% FCS之新製MEM替換。在37℃下，將細胞培養額外3-4天(總計4-5天)。
藉由將經感染細胞刮削至細胞培養基中且執行三次冷凍及解凍循環以回收病毒粒子。粗萃取物在無血清MEM中稀釋10^-2 倍且將4ml接種體接種於BSC-40細胞之9-16個150mm組織培養盤上以回收再活化之scVACV ACAM2000 YFP-gpt::105。感染後一小時，接種體經含有5% FCS及0.9%諾布爾瓊脂(Noble Agar)之MEM替換。在倒置顯微鏡下觀測到黃色螢光溶菌斑，且選取個別溶菌斑用於進一步分析。scVACV ACAM2000 YFP-gpt::105溶菌斑為用黃色螢光選擇純化三次之溶菌斑。
4天後，含有SFV及VACV ACAM2000純系兩者之感染盤經採集，繼之以三個凍融循環以釋放病毒，且隨後連續稀釋且接種至BSC-40細胞上，相較於SFV病毒，其較佳地促進VACV ACAM2000病毒生長。執行三個輪次之溶菌斑純化隨後於10-150 mm組織培養盤中擴增病毒儲備液。病毒自此等細胞相繼地裂解且在36%蔗糖緩衝上間隔開，隨後以24%-40%蔗糖密度梯度進一步純化。基因組DNA自此等純化基因組分離且執行新一代依魯米那測序以證實合成病毒基因組之序列。
實例 4. 相較於野生型 ACAM2000 病毒之生長特性

在猴腎上皮(BSC-40)細胞中執行經分離之合成嵌合VACV ACAM2000-WR DUP/HP、scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP及野生型VACV ACAM2000病毒之活體外多步驟生長曲線。細胞係以感染倍率0.03經感染，在指示時間(3h、6h、12h、21h、48h及72h)採集病毒，及將病毒滴定於BSC-40細胞上。圖6中展示之資料代表三個獨立實驗。如圖6中所展示，在72h時段內，scVACV ACAM2000-WR DUP/HP及wtVACV ACAM2000病毒以不可區分之生長動力生長。

scVACV ACAM2000-WR DUP/HP (YFP-gpt標記物)、scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP (YFP-gpt標記物)、scVACV ACAM2000-WR DUP/HP (無標記物) (經J2R基因序列置換之YFP-gpt標記物)、scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP (無標記物) (經J2R基因序列置換之YFP-gpt標記物)及wtVACV ACAM2000之生長曲線之間的比較展示此等病毒之生長特性與wtACAM2000 VACV相比較在統計學上無差異(圖7)。
實例 5. 藉由 PCR 及 限制片段分析證實 scVACV ACAM2000-WR DUP/HP YFP-gpt::105 基因組序列

在使用蔗糖梯度純化分離之基因組DNA上進行藉由限制消化隨後以脈衝場凝膠電泳(PFGE)進一步分析scVACV ACAM2000 YFP-gpt::105基因組(Yao XD, Evans DH. Methods Mol Biol. 2004;269:51-64)。兩個獨立scVACV ACAM2000-WR DUP/HP純系加上VACV_WRΔJ2R對照(其中J2R基因序列已經YFP-gpt標記物置換)及wtVACV ACAM2000對照(VAC_ACAM2000)經純化且隨後保持不消化，或用Bsa I、Hind III或Not I及Pvu I消化。來自scVACV ACAM2000-WR DUP/HP及wtVACV ACAM2000兩者之經分離基因組DNA用Bsa I及Hind III消化。由於scVACV ACAM2000基因組中之大部分Bsa I位點已經沉默地突變，因此在Bsa I消化之後觀測到大部分完整的約200kbp片段(圖8，色帶8及9)。此不同於wtVACV ACAM2000及wtVACV WR對照(VAC_WRΔJ2R)基因組，當用Bsa I處理時，該等基因組已經充分消化(圖8，色帶6及7)。為證實scVACV ACAM2000-WR DUP/HP基因組仍可用另一酶消化，用Hind III消化此等基因組，其產生來自scVACVACAM2000 WR DUP/HP純系之諸多條帶(圖8，色帶12及13)。為證實ITR區域內存在70bp串連型重複元素，用Not I及Pvu I消化基因組DNA (圖8，色帶14至17)。
在wtVACV WR對照(VAC_WRΔJ2R)樣品中，偵測到約3.6 kbp之條帶(用星號標記)，其涵蓋VAC之WR病毒株中之所有70bp串連型重複。鑒於VACV WR病毒株用作設計ITR重複元素之合成的模板，期望在經Not I/Pvu I處理之scVACVACAM2000純系中偵測到與病毒株WR中見到的接近相同大小之一些條帶。當兩個scVACV ACAM2000-WR DUP/HP純系經比較，觀測到此區域之大小的差異，從而表明並非所有70bp重複經併入至各重建構基因組中(圖7，色帶16及17)。鑒於其他已顯示此等重複元素可在細胞培養物中在選擇性壓力下擴張及收縮，因此此並非出人意料的(Paez及Esteban (1988). Virology;163(1):145-54)。

總體而言，scVACV ACAM2000-WR DUP/HP YFP-gpt::105基因組之活體外分析表明利用化學合成之DNA片段再活化VACV ACAM2000-WR DUP/HP係成功的且scVACV ACAM2000-WR DUP/HP病毒活體外表現類似於wtVACV ACAM2000病毒。
實例 6. 藉由全基因組序列分析證實 scVACV ACAM2000 YFP-gpt::105 基因組序列

兩個scVACV ACAM2000-WR DUP/HP純系及兩個scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP純系經測序。使用具有字長35或61之CLC基因組學工作台(版本11)重新組裝依魯米那讀數。隨後將組裝之重疊組(contig)導入至Snapgene軟體中且基於藉由基因技術提供之合成片段比對至預期scACAM2000序列之參考序列上。

對於scVACV ACAM2000-WR DUP/HP之純系1，重疊組1為16,317 bp，且對應於大部分ITR區域(除串連型重複序列以外)。重疊組2為167,020 bp，且與基因組之中心保留區域(核苷酸位置19,467至186,486)比對。對於scVACV ACAM2000-WR DUP/HP之純系2，重疊組3為16,322 bp，且對應於大部分ITR區域(除串連型重複序列以外)。重疊組1為167,020 bp，且與基因組之中心保留區域(核苷酸位置19,467至186,486)比對。在純系2之重疊組之核苷酸位置136791處存在單核苷酸取代基(C至A)。此對應於scACAM2000基因組序列中之核苷酸位置156,256且產生VAC_ACAM2000_177 (A41L)中之自Asp至Tyr之胺基酸變化。

對於scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP之純系1，重疊組1為167,020 bp，且與基因組之中心保留區域(核苷酸位置19,469至186,488)比對。重疊組2為16,150 bp且對應於大部分ITR區域(除串連型重複序列以外)。當此重疊組經映射至Snapgene中之參考基因組時，在位置2633至3417處及核苷酸位置15,175至15220處觀測到序列間隙。第一間隙區域對應於54bp重複區域且最可能由於使用重新組裝工具而不能精確地組裝此等區域。將原始依魯米那讀數直接地映射至參考基因組並不在任一區域內產生任何間隙。對於scVACV ACAM2000-ACAM2000DUP/HP之純系2，重疊組1為16,075 bp，且對應於大部分ITR區域(除串連型重複序列以外)。重疊組2為167,078 bp，且與基因組之中心保留區域(核苷酸位置19,469至186,546)比對。在核苷酸位置15,176至15,220之重疊組2中觀測到間隙。然而，將原始依魯米那讀數直接地映射至參考基因組並不在此區域內產生任何間隙。scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP之測序純系皆不在基因組內之任何位置處展現任何其他核苷酸突變。

依魯米那讀數亦經映射至CLC基因組學中之參考圖譜。依魯米那讀數以分別針對scVACV ACAM2000-WR DUP/HP之純系1及2之平均覆蓋度1925及2533，以及分別針對scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP之純系1及2之平均覆蓋度2195及1602來覆蓋參考序列全長。

總體而言，測序資料證實活體外基因組分析資料且證實scVACV ACAM20000-WR DUP/HP及scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP在SFV感染之細胞中成功地再活化。
實例 7. 移除 YFP /gpt 選擇標記物

在再活化scVACV ACAM2000 YFP-gpt::105之後，可移除胸苷激酶基因座中之yfp/gpt選擇標記物。
實例 8. 末端髮夾及 ITR 中之 雙螺旋區域內之各種 VACV 病毒株之間的核苷酸序列變化

圖9展示VACV WR病毒株、ACAM 2000、Dryvax及Copenhagen病毒株中直接在多聯體解析位點之下游之「雙螺旋」區域中的核苷酸序列變化。相較於WR病毒株，可見到序列變化為wtACAM2000、Dryvax DPP15、TianTan及Copenhagen病毒株之間的4個核苷酸取代及3個核苷酸缺失。
實例 9. 在鼠鼻內模型中或藉由尾部劃痕法測定毒性

在此研究中測定scVACV ACAM20000-WR DUP/HP及scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP之毒性效應。對於此實驗，向6組Balb/c小鼠投與實例1-7中描述且與PBS對照組以及wtVACV (WR)對照組及wtVACV ACAM2000對照組(總共12個治療組)相比較3種不同劑量之scVACV ACAM20000-WR DUP/HP及scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP。此實驗中包括在研究持續期間未接受任何治療之3隻額外小鼠。在整個實驗中，在預定點對所有小鼠進行血液取樣，且將額外小鼠用作血清分析之基線值。

在接種Balb/c小鼠之前，所有病毒病毒株在BSC-40細胞(非洲綠猴腎臟)中生長，藉由胰蛋白酶消化採集，在PBS中洗滌，藉由杜恩斯(dounce)均質化自細胞提取，藉由超速離心經由36%蔗糖緩衝純化，在PBS中再懸浮且滴定使得最終濃度在10⁷ PFU/ml及10⁹ PFU/ml之間。

基於使用已知VACV疫苗病毒株(包括Dryvax及IOC)之先前研究選擇用於此研究之劑量(10⁵ PFU/劑量、10⁶ PFU/劑量及10⁷ PFU/劑量)(Medaglia ML, Moussatche N, Nitsche A, Dabrowski PW, Li Y, Damon IK等人, Genomic Analysis, Phenotype, and Virulence of the Historical Brazilian Smallpox Vaccine Strain IOC: Implications for the Origins and Evolutionary Relationships of Vaccinia Virus. Journal of virology. 2015;89(23):11909-25；Qin L, Favis N, Famulski J, Evans DH. Evolution of and evolutionary relationships between extant vaccinia virus strains. Journal of virology. 2015;89(3):1809-24)。

病毒經鼻內或藉由尾部劃痕法投與。參見以下實例10及11之細節。
實例 10. 判定藉由鼻內接種投與之 scVACV 是否賦予針對致死性 VACV-WR 攻擊之 免疫保護

由於體重減輕經用作對小鼠毒性之量測，因此wtVACV (病毒株WR)以劑量5 × 10³ PFU經鼻內投與，其導致大約20-30%體重減輕。VACV Dryvax純系DPP15亦以10⁷ PFU/劑量經鼻內投與，使得此公認之天花疫苗之毒性可直接地與合成版本scVACV ACAM20000-WR DUP/HP及scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP相比較。小鼠購自Charles River Laboratories，且在收到之後在病毒投與之前適應其環境至少一週。

各小鼠在麻醉下同時接受經鼻內注射投與之病毒(約10μl)之單次給藥。每天監測小鼠之感染跡象(諸如腫脹、排泄或其他異常情況)持續30天之時間段。在投與病毒之後每天專門監測各小鼠之體重減輕。根據艾伯塔大學(University of Alberta)之動物衛生保健設施協定，對除了其他發病因素外之其體重減輕超過25%之小鼠實施安樂死。

即使在測試最高劑量之scVACV ACAM20000-WR DUP/HP及scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP，Balb/c小鼠可無明顯之疾病跡象。VACV病毒株(巴西天花疫苗病毒株IOC)中之一者，在一些情況下，在10⁷ PFU下不產生疾病(Medaglia ML, Moussatche N, Nitsche A, Dabrowski PW, Li Y, Damon IK等人，Genomic Analysis, Phenotype, and Virulence of the Historical Brazilian Smallpox Vaccine Strain IOC: Implications for the Origins and Evolutionary Relationships of Vaccinia Virus. Journal of Virology. 2015;89(23):11909-25)。由於難以製備效價超過10⁹ PFU/mL之經純化儲備液，因此測試比其更高之劑量為不切實際的。

病毒接種後三十天，隨後用經鼻內接種致死劑量之VACV-WR (10⁶ PFU/劑量)攻擊小鼠。如上所述密切監測小鼠之感染跡象。每天對小鼠進行稱重，且對除其他發病因素外之其體重減輕超過25%之小鼠實施安樂死。預期在投與致死劑量之VACV-WR之前，接種PBS之小鼠在接種後7-10天內顯示明顯之體重減輕及其他發病因素的跡象。用VACV-WR致死性攻擊後約14天，對全部小鼠實施安樂死，且收集血液以藉由標準溶菌斑減少分析法證實血清中之VACV特異性中和抗體之存在。
實例 11. 判定藉由尾部劃痕法投與之 scVACV 是否賦予針對致死性 VACV-WR 攻擊之 免疫保護

免疫勝任之Balb/C動物在尾部劃痕法步驟之開始前進行麻醉。在尾部之底部處，使用25號針頭之尖端在超過1-2 cm長度處作出一連串15-20個刮痕/刺破。將3-5µL容積之不同病毒施加至劃痕位點。

將小鼠麻醉直至病毒有機會吸收至劃痕位點。歷經28天時間段每天監測小鼠之體重減輕跡象。劃痕後約8-10天在尾部劃痕位點處形成膿皰(經稱為「獲取」)。

病毒接種後二十八天，隨後藉由鼻內接種致死劑量之VACV-WR (10⁶ PFU/劑量)攻擊小鼠。如上所述密切監測小鼠之感染跡象。每天對小鼠進行稱重，且對除其他發病因素外之其體重減輕超過25%之小鼠實施安樂死。預期在投與致死劑量之VACV-WR之前，接種PBS之小鼠在接種後7-10天內顯示明顯之體重減輕及其他發病因素的跡象。用VACV-WR致死性攻擊後約14天，對全部小鼠實施安樂死，且收集血液以藉由標準溶菌斑減少分析法證實血清中之VACV特異性中和抗體之存在。

所有未接種疫苗之動物在病毒攻擊後7天內因此致命劑量之VACV WR而死亡。

本專利申請案含有至少一個彩製圖示。本專利申請案之彩色圖示之複本將藉由局所根據需要提供及支付必要之費用。

當結合隨附圖式閱讀時，將更好地理解本發明之前述發明內容以及以下實施方式。出於說明本發明之目的，在圖式中展示當前較佳之實施例。然而，應理解本發明並不限於所展示之精確配置及工具。

圖 1A 及圖 1B .直鏈dsDNA VACV基因組病毒株ACAM2000；Genbank寄存號AY313847之示意圖。圖 1A 說明具有指定天然存在之Aar I及Bsa I限制位點之VACV ACAM2000基因組的未經修飾之基因組序列。圖 1B 描繪用於化學合成較大dsDNA片段之經修飾之VACV ACAM2000基因組。重疊scVACV ACAM2000基因組片段以藍色描繪。亦展示未在左側反向末端重複(LITR)及右側反向末端重複(RITR)中沉默突變之經工程改造之Bsa I限制位點。

圖 2A 至 2C .(A) VACV WR病毒株及(B) VACV ACAM2000之公佈的基因組之第一個約1500-3000 bp之詳細示意圖。串疊型重複區域用紅色(70 bp重複)、藍色(125 bp重複)及綠色(54 bp重複)方塊指示。對應於基因C23L之ORF亦在各基因組中指示。(C) VACV WR中含有70 bp重複序列之直接重複區域之示意圖。此序列經合成以含有5'端之Sap I限制位點及3'端之Nhe I限制位點以分別接合髮夾/雙螺旋片段及VACV ACAM2000 ITR片段。

圖 3A 及圖 3B .將牛痘病毒末端髮夾環與雙螺旋DNA組裝至第一個70 bp重複序列。(A) 描繪有序產生WR雙螺旋DNA之磷酸化寡核苷酸序列。(B) 描繪WR病毒株雙螺旋DNA (色帶2)及單獨髮夾DNA (色帶3)及接合後(色帶4)之凝膠電泳。接合產物(箭頭)隨後自凝膠切除且純化，使得其可接合至70 bp重複序列以模擬wtVACV ACAM2000序列之序列。

圖 4 .Sap I/Nhe I消化之70 bp重複片段與WR病毒株髮夾/雙螺旋DNA片段之接合。用Sap I及Nhe I消化70 bp重複片段，且隨後在用髮夾/雙螺旋DNA片段與70 bp片段之莫耳比為5:1之髮夾/雙螺旋DNA接合前凝膠純化。在色帶4及色帶5中大約2300 bp之條帶中向上移位指示髮夾/雙螺旋片段的成功添加。此等條帶隨後在接合至所消化之VACV ACAM2000 ITR片段前自凝膠中凝膠提取。

圖 5 . scVACV ACAM2000片段之消化。ITR片段在37℃下用Nhe I/I-Sce I兩者消化2小時，接著藉由用鹼性磷酸酶去磷酸化以除去磷酸酯基團，且促進此片段與末端髮夾環/雙螺旋/70 bp串連型重複片段之更高效接合。其他scVACV ACAM2000 DNA質體在37℃下用I-Sce I線性化2小時，接著藉由在65℃下使限制酶熱不活化10分鐘。

圖 6 . scVACV ACAM2000-WR DUP/HP活體外之生長特性。在猴腎臟上皮細胞(BSC-40)中量測多步驟生長動力學。細胞以感染倍率0.03經感染，在指示時間採集病毒，且將病毒滴定在BSC-40細胞上。資料表示三個獨立之實驗。誤差條指示平均值之標準誤差(SEM)。

圖 7 .相較於YFP-gpt標記物已經J2R基因序列(VAC_WRΔJ2R)及wtVACV ACAM2000置換之scVACV ACAM2000-WR DUP/HP及scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP，scVACV ACAM2000-WR DUP/HP及scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP活體外之生長特性。在猴腎臟上皮細胞(BSC-40)中量測多步驟生長動力學。細胞以感染倍率0.03經感染，在指示時間採集病毒，且將病毒滴定在BSC-40細胞上。誤差條指示平均值之標準誤差(SEM)。

圖 8 .再活化scVACV ACAM2000-WR DUP/HP純系之限制性核酸內切酶映射。脈衝場凝膠電泳分析。兩個獨立scVACV ACAM2000-WR DUP/HP純系加上VACV WR對照(其中YFP-gpt標記物已經J2R基因序列(VAC_WRΔJ2R)置換)及wtVACV ACAM2000對照(VAC_ACAM2000)經純化且隨後保持不消化，或用Bsa I、Hind III或Not I及Pvu I消化。在scVACV ACAM2000純系中之近乎全部Bsa I位點之經預期缺失為明顯的。觀測到經Hind III消化之scVACV ACAM2000基因組DNA相較於VAC_WRΔJ2R及VACV_ACAM2000之較小差異。經Not I及Pvu I消化之基因組DNA切割在左側及右側ITR序列處發現之70bp串連型重複片段。在VAC_WRΔJ2R中，70bp重複之近似大小接近3.6 kbp。引起關注地，在兩個獨立scVACV ACAM2000純系中，觀測到對應於70bp串連型重複之兩個不同大小之條帶(藉由*標記)，即使全長70bp串連型重複元素經接合至ITR片段。當ACAM2000基因組DNA經Not I及Pvu I消化時，觀測到約4.7 kbp之條帶，其可指示ACAM2000中之70bp重複的大小。

圖 9 . VACV病毒株序列之間的核苷酸序列變化。圖 9A 描繪ITR (SEQ ID NOs: 15-18)中之雙螺旋區域內之VACV核苷酸序列變化。圖 9B 描繪共價附接至ACAM2000 (S型SEQ ID NO: 19及F型SEQ ID NO: 20)之線性dsDNA基因組之末端的VACV ACAM2000二級髮夾環。末端環序列以綠色突出顯示。

Claims

一種合成之嵌合牛痘病毒(scVACV)，其自源自合成DNA之DNA中複製及再活化，該病毒之該病毒基因組因為其特徵在於一或多種修飾而不同於該病毒之野生型基因組。
如請求項1之scVACV，其中該合成DNA係選自以下中之一或多者：化學合成之DNA、PCR擴增之DNA、經工程改造之DNA及包含核苷類似物之聚核苷酸。
如請求項1之scVACV，其中該合成DNA為化學合成之DNA。
如請求項1至3中任一項之scVACV，其中該一或多種修飾包含一或多個缺失、插入、取代或其組合。
如請求項1至3中任一項之scVACV，其中該一或多種修飾包含消除一或多個獨特的限制位點之一或多種修飾。
如請求項1至3中任一項之scVACV，其中該一或多種修飾包含添加或修復一或多個獨特的限制位點之一或多種修飾。
如請求項1至3中任一項之scVACV，其中該一或多種修飾包含消除一或多個Aar I限制位點之一或多種修飾。
如請求項1至3中任一項之scVACV，其中該一或多種修飾包含消除全部Aar I限制位點之一或多種修飾。
如請求項1至3中任一項之scVACV，其中該一或多種修飾包含消除一或多個Bsa I限制位點之一或多種修飾。
如請求項1至3中任一項之scVACV，其中該病毒基因組包含異源末端髮夾環。
如請求項1至3中任一項之scVACV，其中該病毒基因組包含源自不同牛痘病毒株之末端髮夾環。
如請求項1至3中任一項之scVACV，其中該病毒基因組包含源自VACV WR病毒株之末端髮夾環。
如請求項1至3中任一項之scVACV，其中該病毒基因組包含同源或異源末端髮夾環且其中該串連型重複區域包含與wtVACV不同數目之重複。
如請求項1至3中任一項之scVACV，其中該病毒基因組係選自由以下組成之群之VACV病毒株的基因組：Western Reserve、純系3、Tian Tian、Tian Tian純系TP5、Tian Tian純系TP3、NYCBH、NYCBH純系Acambis 2000、Wyeth、Copenhagen、Lister、Lister 107、Lister-LO、Lister GL-ONC1、Lister GL-ONC2、Lister GL-ONC3、Lister GL-ONC4、Lister CTC1、Lister IMG2 (Turbo FP635)、IHD-W、LC16m18、Lederle、Tashkent純系TKT3、Tashkent純系TKT4、USSR、Evans、Praha、L-IVP、V-VET1或LIVP 6.1.1、Ikeda、EM-63、Malbran、Duke、3737、CV-1、康諾特實驗室(Connaught Laboratories)、Serro 2、CM-01、NYCBH Dryvax純系DPP13、NYCBH Dryvax純系DPP15、NYCBH Dryvax純系DPP20、NYCBH Dryvax純系DPP17、NYCBH Dryvax純系DPP21、VACV-IOC、安卡拉絨毛膜尿囊牛痘病毒(CVA)、經修飾之安卡拉牛痘病毒(MVA)及MVA-BN。
如請求項14之scVACV，其中該scVACV之該病毒基因組係基於該NYCBH病毒株、純系Acambis 2000之基因組。
如請求項14之scVACV，其中該scVACV之該病毒基因組係基於該NYCBH病毒株、純系Dryvax之基因組。
如請求項14之scVACV，其中該scVACV之該病毒基因組係基於該Lister病毒株、V-VET1之該基因組。
如請求項14之scVACV，其中該scVACV之該病毒基因組係基於該經修飾之安卡拉病毒(MVA)病毒株之基因組。
如請求項14之scVACV，其中該scVACV之該病毒基因組係基於MVA-BN病毒株之基因組。
如請求項14之scVACV，其中該scVACV之該病毒基因組係基於IOC病毒株之基因組。
如請求項1至3中任一項之scVACV，其中該等左端及右端髮夾環a)分別包含該牛痘病毒末端髮夾環之慢速形式及快速形式，b)分別包含該牛痘病毒末端髮夾環之快速形式及慢速形式，c)皆包含該牛痘病毒末端髮夾環之慢速形式，或d)皆包含該牛痘病毒末端環之快速形式。
如請求項21之scVACV，其中慢速形式包含與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列至少85%一致之核苷酸序列且快速形式包含與SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 20之核苷酸序列至少85%一致之核苷酸序列。
如請求項22之scVACV，其中慢速形式包含與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 19之序列至少90%一致之核苷酸序列且快速形式包含與SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 20之核苷酸序列至少90%一致之核苷酸序列。
如請求項23之scVACV，其中慢速形式包含與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列至少95%一致之核苷酸序列且快速形式包含與SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 20之核苷酸序列至少95%一致之核苷酸序列。
如請求項24之scVACV，其中慢速形式由SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列組成且快速形式由SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 20之核苷酸序列組成。
如請求項1至3中任一項之scVACV，其中該病毒自重疊之化學合成之對應於該scVACV之基本上全部病毒基因組的DNA片段中複製及再活化。
如請求項26之scVACV，其中該病毒自2-14個重疊片段中複製及再活化。
如請求項27之scVACV，其中該病毒自6-12個重疊片段中複製及再活化。
如請求項28之scVACV，其中該病毒自9個重疊片段中複製及再活化。
如請求項1至3中任一項之scVACV，其中該病毒使用兔痘病毒催化之重組及再活化進行再活化。
如請求項30之scVACV，其中該兔痘病毒係選自由以下組成之群：休普氏纖維瘤病毒(Shope fibroma virus，SFV)、野兔纖維瘤病毒、家兔纖維瘤病毒、松鼠纖維瘤病毒及黏液瘤病毒。
一種產生合成之嵌合牛痘病毒(scVACV)之方法，其包含以下步驟： (i) 化學合成對應於該牛痘病毒之基本上所有病毒基因組之重疊DNA片段； (ii) 將該等重疊DNA片段轉染至輔助病毒感染之細胞； (iii) 培養該等細胞以在該等細胞中產生輔助病毒與合成之嵌合牛痘病毒粒子之混合物；及 (iv) 將該混合物接種於對該scVACV具有特異性之宿主細胞上以回收該scVACV。
如請求項32之方法，其中該輔助病毒係選自由以下組成之群：兔痘病毒、鳥痘病毒及補骨脂素不活化輔助病毒。
如請求項33之方法，其中該兔痘病毒係選自由以下組成之群：休普氏纖維瘤病毒(SFV)、野兔纖維瘤病毒、家兔纖維瘤病毒、松鼠纖維瘤病毒及黏液瘤病毒。
如請求項34之方法，其中該兔痘病毒為SFV。
如請求項32至35中任一項之方法，其中該等輔助病毒感染之細胞為BGMK細胞。
如請求項32至35中任一項之方法，其中步驟(i)進一步包含自另一VACV病毒株化學合成末端髮夾環且將其接合至包含病毒基因組之左端及右端之該等片段上。
如請求項32至35中任一項之方法，其中該等重疊DNA片段包含： (i) 與SEQ ID NOs: 1-9之序列至少85%一致之核苷酸序列； (ii) 與SEQ ID NOs: 1-9之序列至少90%一致之核苷酸序列； (iii) 與SEQ ID NOs: 1-9之序列至少95%一致之核苷酸序列；或 (iv) 由SEQ ID NOs : 1-9之序列組成之核苷酸序列。
一種合成之嵌合牛痘病毒(scVACV)，其藉由如請求項32至38中任一項之方法產生。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至31中任一項之scVACV及醫藥學上可接受之載劑。
如請求項40之醫藥組合物，其中該scVACV為不活化。
如請求項41之醫藥組合物，其中該不活化藉由加熱、UV或福馬林來執行。
一種包含如請求項1至31中任一項之scVACV之組合物或如請求項40至42中任一項之醫藥組合物在製造藥劑中之用途，其中該藥劑用於誘導個體中之溶瘤反應。
一種用於在宿主細胞中表現異源蛋白之方法，其包含將該異源核酸序列引入至如請求項1至31中任一項之scVACV，用該scVACV感染該宿主細胞且在用於表現該異源蛋白之條件下培養該宿主細胞。
如請求項44之方法，其中該異源核酸序列源自不同痘病毒物種或源自任何非痘病毒來源。
一種包含如請求項1至31中任一項之scVACV之組合物或如請求項40至42中任一項之醫藥組合物在製造藥劑中之用途，其中該藥劑用於觸發或增強個體中對牛痘病毒之免疫反應。
一種包含如請求項1至31中任一項之scVACV之組合物或如請求項40至42中任一項之醫藥組合物在製造藥劑中之用途，其中該藥劑用於觸發或增強個體中對天花病毒之免疫反應。
一種包含如請求項1至31中任一項之scVACV之組合物或如請求項40至42中任一項之醫藥組合物在製造藥劑中之用途，其中該藥劑用於觸發或增強個體中對猴痘病毒之免疫反應。
一種包含如請求項1至31中任一項之scVACV之組合物或如請求項40至42中任一項之醫藥組合物在製造藥劑中之用途，其中該藥劑用於使人類個體免疫以保護該個體免受天花病毒感染。
一種包含如請求項1至31中任一項之scVACV之組合物或如請求項40至42中任一項之醫藥組合物在製造藥劑中之用途，其中該藥劑用於治療個體中之天花病毒感染。
一種包含如請求項1至31中任一項之scVACV之組合物或如請求項40至42中任一項之醫藥組合物在製造藥劑中之用途，其中該藥劑用於治療個體中之癌症。
如請求項43或46至51中任一項之用途，其中該組合物藉由選自經皮劃痕、肌內或靜脈內投與之方法投與。
如請求項43或46至51中任一項之用途，其中該組合物在痘病毒治療設施中投與。
如請求項43或46至51中任一項之用途，其中該組合物在天花不良事件中係由專家投與。
如請求項54之用途，其中該天花不良事件係選自：疫苗性濕疹、進行性牛痘、疫苗接種後腦炎(postvaccinal encephalitis)、心肌炎及擴張型心肌症。