BR112020022181A2 - vírus vaccinia quimérico sintético - Google Patents

Abstract

A invenção refere-se, em vários aspectos, a um vírus vaccinia quimérico sintético ou composições que incluam tais vírus, e o desenvolvimento e uso de sistemas e métodos para a produção desses vírus vaccinia quiméricos sintéticos. Os vírus vaccinia quiméricos sintéticos são bem adequados, entre outros, como vírus vaccinia ou para gerar uma resposta oncolítica e formulações farmacêuticas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VÍRUS VACCINIA QUIMÉRICO SINTÉTICO".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0001] Uma Listagem de Sequências associada a este pedido está sendo submetida eletronicamente via EFS-Web em formato de texto e está aqui incorporada a título de referência, em sua totalidade no rela- tório descritivo. O nome do arquivo de texto que contém a Listagem de Sequências é 104545-0031-WO-SequenceListing.txt. O arquivo de tex- to, criado em 2 de maio de 2019, tem 288.652 bytes de tamanho.

[0002] Os Poxvírus (membros da família Poxviridae) são vírus de DNA de fita dupla que podem infectar tanto humanos como animais. Os Poxvírus são divididos em duas subfamílias com base na gama de hospedeiro. A subfamília Chordopoxviridae, que infecta os hospedei- ros vertebrados, consiste em oito gêneros, dos quais quatro gêneros (Orthodoxvirus, Parapoxvirus, Molluskipoxvirus e Yatapoxvirus) são conhecidos por infectar humanos. A varíola é causada pela infecção pelo vírus da varíola (VARV), membro do gênero Orthodoxvirus (OPV). O gênero OPV compreende vários vírus geneticamente relacionados e morfologicamente idênticos, incluindo vírus da varíola de camelo (CMLV), vírus da varíola bovina (CPXV), vírus ectromelia (ECTV, agente da varíola do rato), vírus da varíola equina (HPXV), vírus da varíola de macaco (MPXV), vírus da varíola de coelho (RPXV), vírus da varíola de guaxinim, vírus da varíola de gambá, vírus da varíola Ta- terapox, vírus da doença Uasin Gishu, vírus vaccinia (VACV), vírus da varíola (VARV) e vírus da volepox (VPV). Com exceção da VARV, pelo menos três outros OPVs, incluindo VACV, MPXV e CPXV, são conhe- cidos por infectar humanos. Até agora, a vacinação com VACV "viva" é a única proteção comprovada contra a varíola. Um programa agressivo de vacinação levou à erradicação da varíola em 1980 e a vacinação rotineira contra a varíola do público foi interrompida. No entanto, resta a necessidade de encontrar novos meios seguros e eficazes para va- cinar indivíduos contra VARV e outros OPVs.

[0003] Uma variedade de preparações de VACV tem sido usada como vacinas contra a varíola. A maioria delas era composta por vá- rios vírus relacionados (por exemplo, Dryvax), e um composto por um único clone molecular, ACAM2000. Entretanto, como Dryvax e outras vacinas VACV, até mesmo ACAMZ2000 está associada a graves efeitos colaterais, incluindo cardiomiopatia e pericardite. Para reduzir os ris- cos, a vacina ACAM2000, como outras vacinas vivas, tem inúmeras contraindicações que excluem indivíduos com câncer, imunodeficiên- cias, receptores de transplante de órgãos, pacientes com dermatite atópica, eczema, psoríase, condições cardíacas e pacientes com imu- nossupressores. Estima-se que 15-50% da população norte-americana cairia em uma dessas categorias, confirmando a necessidade do de- senvolvimento de um protocolo de vacina ou vacinação mais seguro (Kennedy et al., 2007 Kennedy R, Poland GA. 2007. T-Cell epitope discovery for variola and vaccinia viruses. Rev Med Viroll7: 93-113). Portanto, há necessidade do desenvolvimento de uma vacina seme- lhante em eficácia a Dryvax ou ACAM20007Y, mas que seja mais se- gura.

[0004] A produção de vacinas seguras, puras, potentes e eficazes requer procedimentos de garantia de qualidade para garantir a unifor- midade e consistência do processo de produção de vacinas. No pas- sado, as culturas de ovos embrionados de galinhas ou culturas primá- rias de fibroblastos de embriões de galinha foram usadas para o culti- vo de vírus na produção de vacinas contra a febre amarela, a gripe, o sarampo e a caxumba. Esses substratos foram considerados aceitá- veis, uma vez que se acreditava que agentes adventícios que poderi- am infectar frangos não infectariam e seriam patogênicos para huma- nos (FDA Briefing Document Vaccines and Related Biological Products

Advisory Committee Meeting. 19 de setembro de 2012). No entanto, a segurança pode ser comprometida se o tropismo do vírus mudar.

[0005] Outros substratos têm sido usados para o crescimento do vírus para a produção de vacinas, como linfa de bezerro para vacinas contra varíola. Após a inoculação de bezerros com varíola, a linfa con- tendo leucócitos é extraída e preservada em tubos capilares. Este é então usado para vacinar as pessoas contra a varíola. No entanto, existe um risco de contaminação com encefalopatia espongiforme bo- vina ou príon scrapie. Embora os regulamentos e as diretrizes para as vacinas modernas afirmem que todos os materiais utilizados devem provir de regiões livre de BSE, não há nada sobre o estatuto regional livre de scrapie. É particularmente preocupante o fato de a vacina Dry- vax produzida em 1980-1982 nunca ter sido examinada por métodos modernos. Especificamente, esses estoques nunca foram submetidos a testes para agentes adventícios (Murphy e Osburn. Emerging Infec- tious Diseases. www.cdc.gov/eid. Vol. 11, No. 7, julho 2005).

[0006] Portanto, há necessidade do desenvolvimento de uma va- cina semelhante em eficácia às vacinas Dryvax ou ACAM2000'7Y exis- tentes, mas que seja mais segura, reprodutível e livre de células resi- duais, DNA residual, príons e agentes adventícios.

[0007] O presente pedido fornece vírus vaccinia quiméricos mon- tados e replicados a partir de DNA quimicamente sintetizado que são seguros, reprodutíveis e livres de contaminantes. Como a síntese do genoma químico não depende de um modelo natural, é possível uma infinidade de modificações estruturais e funcionais do genoma viral. À síntese química do genoma é particularmente útil quando um modelo natural não está disponível para replicação ou modificação genética através de métodos convencionais de biologia molecular.

SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO

[0008] Um aspecto da presente invenção fornece vírus vaccinia quiméricos sintéticos, métodos para a produção desses vírus e o uso desses vírus, por exemplo, como imunógenos, em formulações imu- nogênicas, em ensaios in vitro, como veículos para a expressão gêni- ca heteróloga, ou como agentes oncolíticos para o tratamento do cân- cer. Os vírus vaccinia quiméricos sintéticos do pedido são caracteriza- dos por uma ou mais modificações relativas a um vírus vaccinia de tipo selvagem.

[0009] A descrição, em um aspecto, baseia-se na constatação de que um vírus vaccinia quimérico sintético (por exemplo, scVACV) pode ser produzido a partir de fragmentos sobrepostos quimicamente sinte- tizados do genoma do vírus vaccinia.

[0010] Por conseguinte, em um aspecto, a invenção refere-se a um vírus vaccinia quimérico sintético (por exemplo, scVACV) que é replicado e reativado a partir de DNA derivado de DNA sintético, o ge- noma viral do referido vírus, que difere de um genoma selvagem do referido vírus, na medida em que se caracteriza por uma ou mais mo- dificações, sendo as modificações derivadas de um grupo compreen- dendo DNA quimicamente sintetizado, cCDNA ou DNA genômico.

[0011] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de produção de um vírus vaccinia quimérico sintético (scVACV) compre- endendo as seguintes etapas: (i) sintetizar quimicamente fragmentos de DNA sobrepostos que correspondam a praticamente todo o geno- ma viral do vírus vaccinia; (ii) transfectar os fragmentos de DNA so- brepostos em células infectadas pelo vírus auxiliar; (iii) cultivar essas células para produzir uma mistura de partículas de vírus auxiliar e de partículas de vaccinia quimérico sintético nessas células; e (iv) pla- quear a mistura em células hospedeiras específicas do scVACV para recuperar o scVACV.

[0012] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um vírus vaccinia quimérico sintético (ScVACV) gerado pelo método da descrição.

[0013] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo o vírus vaccinia quimérico sintético (SscVACV) da descrição e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0014] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de indução de uma resposta oncolítica em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma composição que compreende o scVACV da descrição.

[0015] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método de expressão de uma proteína heteróloga em uma célula hospedeira, compreendendo a introdução da sequência heteróloga de ácido nu- cleico no scVACV da descrição, infectar a célula hospedeira com o SCcVACV e cultivar as células hospedeiras em condições de expressão da proteína heteróloga.

[0016] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para desencadear ou impulsionar uma resposta imune contra o vírus vacci- nia, compreendendo administrar a um indivíduo que precisa do mesmo uma composição compreendendo o scVACV da descrição.

[0017] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para desencadear o impulsionar uma resposta imune contra a infecção do vírus da varíola, compreendendo a administração ao dito indivíduo uma composição que compreende o scVACV da descrição.

[0018] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para desencadear o impulsionar uma resposta imune contra a infeção pelo vírus da varíola de macaco, compreendendo administrar ao dito indiví- duo uma composição que compreende o scVACV da descrição.

[0019] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para imunizar um indivíduo humano para proteger o dito indivíduo da infec- ção pela varíola, compreendendo administrar ao dito indivíduo uma composição que compreende o scVACV da descrição.

[0020] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para tratar a infecção do vírus da varíola, compreendendo a administração ao dito indivíduo uma composição que compreende o scVACV da des- crição.

[0021] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para tratar o câncer em um indivíduo, compreendendo administrar a um in- divíduo que precisa do mesmo uma composição compreendendo o SscVACV da descrição.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0022] O pedido de patente contém pelo menos um desenho exe- cutado em cores. As cópias desse pedido de patente com desenhos coloridos serão fornecidas pelo Escritório mediante pedido e o paga- mento da taxa necessária.

[0023] O sumário supracitado, bem como a descrição detalhada a seguir da descrição, serão melhor compreendidos quando lidos em conjunto com os desenhos anexados. Para efeitos de ilustração da descrição, são apresentados na(s) modalidade(s) dos desenhos que são atualmente preferidos. Deve-se compreender, no entanto, que a descrição não se limita aos arranjos e instrumentalidades precisos mostrados.

[0024] Figura 1A e 1B. Representação esquemática da cepa do genoma dsDNA VACV linear ACAM2000; Genbank, nº de acesso AY313847. A Figura 1A ilustra a sequência do genoma não modifica- do do genoma VACV ACAMZ2000 com os sítios de restrição Aarl e Bsal de ocorrência natural indicados. A Figura 1B representa o geno- ma modificado VACV ACAM2Z000 que foi usado para sintetizar quimi- camente fragmentos grandes de ds DNA. Os fragmentos genômicos ScVACV ACAMZ2000 sobrepostos são representados em azul. Os sí- tios de restrição modificados Bsal que não foram silenciosamente mu- tados na repetição terminal invertida esquerda (LITR) e na repetição terminal invertida direita (RITR) também são mostrados.

[0025] Figura 2A-2C Representação esquemática detalhada do primeiro — 1500-3000 bp dos genomas publicados de (A) cepa VACV WR e (B) VACV ACAMZ2000. As regiões de repetição tandem estão indicadas nas caixas vermelha (repetição de 70 bp), azul (repetição de 125 bp) e verde (repetição de 54 bp). O ORF correspondente ao gene C23L também é indicado em cada um dos genomas. (C) Representa- ção esquemática da região de repetição direta contendo sequências de repetição de 70 bp em VACV WR. Essa sequência foi sintetizada para conter um local de restrição Sapl no terminal 5' e um local de res- trição Nhel no terminal 3' para ligar a peça em forma de grampo (hair- pin)/duplex e os fragmentos VACV ACAM2000 ITR, respectivamente.

[0026] Figura 3A e 3B. Montagem do loop em forma de grampo terminal do vírus vaccinia com DNA duplex para a primeira sequência de repetição de 70 bp. (A) São representadas as sequências de oligo- nucleotídeos fosforilados ordenadas para criar o DNA duplex WR. (B) A eletroforese em gel do DNA duplex da cepa WR (faixa 2) e o DNA do hairpin sozinho (faixa 3) e a seguinte ligação (faixa 4) estão repre- sentados. O produto ligado (seta) foi posteriormente excisado do gel e purificado, para que pudesse ser ligado a uma sequência de repetição de 70 bp para imitar a sequência da sequência wtVACV ACAMZ2000.

[0027] Figura 4. Ligação do fragmento de repetição de 70 bp dige- rido com Sapl/Nhel para o fragmento de DNA hairpin/duplex da cepa WR. O fragmento de repetição de 70 pb foi digerido com Sapl eNhel e, em seguida, purificado em gel antes da ligação com os fragmentos de DNA do hairpin/duplex a uma razão molar de 5:1 de DNA hair- pin/duplex para o fragmento de 70 pb. A mudança para cima na banda a aproximadamente 2300 bp na faixa 4 e na faixa 5 indica a adição bem-sucedida do fragmento hairpin/duplex. Essas bandas foram pos- teriormente extraídas do gel antes da ligação para os fragmentos dige- ridos VACV ACAM2000 ITR.

[0028] Figura 5. Digestão de fragmentos SCVACV ACAM2000. Os fragmentos de ITR foram digeridos com ambos Nhel/I-Scel durante 2h a 37 “C, seguidos de desfosforilação com fosfatase alcalina para re- mover o grupo fosfato e facilitar a ligação mais eficiente desse frag- mento ao fragmento de repetição tandem hairpin/duplex/70 bp termi- nal. Os outros plasmídeos de DNA scVACV ACAMZ2000 foram lineari- zados com /-Scel por 2h a 37 ºC, seguidos da inativação térmica da enzima de restrição a 65 ºC por 10 minutos.

[0029] Figura 6. Propriedades de crescimento do scVACV ACAM2000-WR DUP/HP in vitro. Cinética de crescimento em várias etapas medida nas células epiteliais dos rins de macaco (BSC-40). As células foram infectadas com uma multiplicidade de infecções 0,03, o vírus foi colhido nos momentos indicados e o vírus foi titulado em célu- las BSC-40. Os dados representam três experimentos independentes. As barras de erro indicam um erro padrão da média (SEM).

[0030] Figura 7. Propriedades de crescimento do scVACV ACAM2000-WR DUP/HP e do seVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP in vitro, em comparação com o seVACV ACAM2000-WR DUP/HP e o ScVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP, em que o marcador YFP- gpt foi substituído pela sequência do gene J2R (VAC WRAJ2R) e wtVACV ACAMZ2000. Cinética de crescimento em várias etapas medi- da nas células epiteliais dos rins de macaco (BSC-40). As células fo- ram infectadas com uma multiplicidade de infecções 0,03, o vírus foi colhido nos momentos indicados e o vírus foi titulado em células BSC-

40. As barras de erro indicam um erro padrão da média (SEM).

[0031] Figura 8. Mapeamento de endonuclease de restrição de clones reativados de scVACV ACAM2000-WR DUP/HP. Análise ele- troforética em gel de campo pulsado. Dois clones independentes scVACV ACAM2000-WR DUP/HP mais um controle VACV WR onde o marcador YFP-gpt foi substituído pela sequência do gene J2R

(VAC WRAJ2R) e um controle WiIVACV ACAM2000 (VAC ACAMZ2Z000) foram purificados e, em seguida, deixados não digeridos, digeridos com Bsal, Hindlll, ou Notl e Pvul. A ausência esperada de quase todos os Sítios Bsal nos clones seVACV ACAMZ200O0 foi aparente. Foram obser- vadas pequenas diferenças no DNA genômico sevVACV ACAM2000 digerido com Hindlll comparado ao VAC WRAJ2R e VACV ACAMZ2000. O DNA genômico digerido com Notl e Pvul excisa os fragmentos de re- petição do tandem 70bp encontrados nas sequências de ITR esquerda e direita. Em VAC WRAJ2R o tamanho - das repetições de 70 bp é próximo de 3,6 kbp. Curiosamente, nos dois clones independentes scVACV ACAMZ2000 foram observadas duas bandas de tamanho dife- rente correspondentes à repetição tandem de 70bp (marcadas com um *), mesmo que um elemento de repetição tandem de 70bp de compri- mento total tenha sido ligado aos fragmentos de ITR. Quando o DNA genômico ACAMZ2000 foi digerido com Notl e Pvul, observou-se uma banda a — 4,7 kbp, o que pode indicar o tamanho das repetições de 7Obp no ACAM2000.

[0032] Figura 9. Variações de sequência de nucleotídeos entre as sequências da cepa VACV. A Figura 9A representa as variações da sequência de nucleotídeos VACV dentro das regiões duplex nos ITRs (SEQ ID NOs: 15-18). A Figura 9B representa os hairpin loops secun- dários de VACV ACAM2000 que estão covalentemente ligados às ex- tremidades terminais dos genomas lineares dsDNA do ACAM2000 (forma S SEQ ID NO: 19 e forma F SEQ ID NO: 20). A sequência de loop terminal é destacada em verde.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA DESCRIÇÃO Técnicas gerais

[0033] Exceto onde especificado em contrário aqui, os termos ci- entíficos e técnicos usados nesse pedido terão os significados que são comumente compreendidos pelos versados na técnica. Geralmente, a nomenclatura utilizada em relação à, e técnica de, farmacologia, cultu- ra de células e tecidos, biologia molecular, biologia de células e cân- cer, neurobiologia, neuroquímica, virologia, imunologia, microbiologia, genética e química de proteínas e ácidos nucleicos, descritas aqui, são as conhecidas e comumente usadas na técnica. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo as definições, irá controlar.

[0034] A prática da presente descrição vai empregar, salvo indica- ção ao contrário, as técnicas convencionais de biologia molecular (in- cluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bio- química e imunologia, que estão dentro da especialidade da técnica. Tais técnicas são explicadas por completo na literatura, como em Mo- lecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.l. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Meth- ods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Pro- tocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); POR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); Co- ligan et al., Short Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY (2003); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999).

[0035] As reações enzimáticas e as técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como co- mumente realizadas na técnica ou conforme descrito aqui. As nomen- claturas usadas em conexão com, e os procedimentos e técnicas labo- ratoriais de, química analítica, bioquímica, imunologia, biologia mole- cular, química orgânica sintética, e química medicinal e farmacêutica descritas aqui são as bem conhecidas e comumente usadas na técni- ca. Técnicas padrão são usadas para sínteses químicas e análises químicas.

[0036] Em todo este relatório descritivo e modalidades, a palavra "compreende", ou variações como "compreender" e "compreendendo", será entendida como implicando a inclusão de um número inteiro de- clarado ou grupo de números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros.

[0037] Entende-se que, onde quer que as modalidades sejam des- critas aqui com a linguagem "compreendendo", aspectos análogos descritos em termos de "consistindo em" e/ou "consistindo essencial- mente em" também são fornecidos.

[0038] O termo "incluindo" é usado para significar "incluindo, mas não se limitando a". "Incluindo" e "incluindo, mas não limitado a" são usados de forma intercambiável.

[0039] Qualquer (quaisquer) exemplo(s) a seguir ao termo "p.ex." ou "por exemplo" não se destina a ser exaustivo ou limitado.

[0040] A menos que de outra forma exigido pelo contexto, os ter- mos singulares devem incluir pluralidades e termos no plural devem incluir o singular.

[0041] Os artigos "o/a" e "um/uma" são usados aqui para se referir a um ou a mais de um (ou seja, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais de um elemento. Referência a "cerca de" um valor ou parâmetro aqui inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas para aquele valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição referente a "cerca de X" (sobre X) inclui a descrição de "X". As faixas numéricas incluem os números que definem a faixa.

[0042] Todavia, as faixas numéricas e os parâmetros que estabe- lecem o amplo escopo da descrição são aproximações, os valores numéricos estabelecidos nos exemplos específicos são relatados tão precisamente quanto possível. Entretanto, qualquer valor numérico contém inerentemente certos erros que necessariamente resultam do desvio padrão encontrado em suas respectivas medições de teste. Além disso, todas as faixas descritas na presente invenção devem ser entendidas para abranger todas e quaisquer sub-faixas nelas incluí- das. Por exemplo, um intervalo indicado de "1 a 10" deve ser conside- rado como incluindo qualquer e todas as subfaixas entre (e inclusive) o valor mínimo de 1 e o valor máximo de 10; ou seja, todas as subfaixas começando com um valor mínimo de 1 ou mais, p.ex., 1 a 6,1, e termi- nando com um valor máximo de 10 ou menos, p.ex., 5,5 a 10.

[0043] Métodos e materiais exemplificadores são descritos aqui, embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descri- tos aqui possam ser utilizados na prática ou no teste do presente pedi- do. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes. Definições

[0044] Os seguintes termos, salvo indicação em contrário, devem ser compreendidos como tendo os seguintes significados:

[0045] Como usado aqui, os termos "vírus do tipo selvagem", "ge- noma do tipo selvagem", "proteína do tipo selvagem" ou "ácido nuclei- co do tipo selvagem" referem-se a uma sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos que ocorre naturalmente em uma determinada popu- lação (por exemplo, uma espécie viral específica, etc).

[0046] Os termos "quiméricos" ou "modificados" ou "mutados" (por exemplo, vacinia quimérico, polipeptídeo modificado, polipeptídeo mu- tado, ácido nucleico modificado, ácido nucleico mutado) ou suas varia- ções gramaticais são usados de forma intercambiável aqui para se re- ferir a uma sequência não nativa que foi manipulada para ter uma ou mais mudanças relativas a uma sequência nativa.

[0047] Como usado aqui, "vírus sintético" refere-se a um vírus ini- cialmente derivado do DNA sintético (por exemplo, DNA quimicamente sintetizado, DNA amplificado por PCR, DNA modificado, polinucleotí- deos compreendendo análogos nucleosídeos, etc, ou suas combina- ções) e inclui a sua progênie, e a progênie pode não ser necessaria- mente completamente idêntica (em morfologia ou em complemento de DNA genômico) ao vírus sintético original devido à mutação natural, acidental ou deliberada. Em algumas modalidades, o vírus sintético refere-se a um vírus em que praticamente todo o genoma viral é deri- vado inicialmente do DNA sintético (por exemplo, DNA quimicamente sintetizado, DNA amplificado por PCR, DNA modificado, polinucleotí- deos compreendendo análogos nucleosídeos, etc, ou suas combina- ções). Em uma modalidade preferida, o vírus sintético é derivado do DNA quimicamente sintetizado.

[0048] Tal como descrito aqui, algumas posições do genoma viral podem ser alteradas. Por "posição", conforme usado aqui, significa uma localização na sequência do genoma. As posições corresponden- tes são geralmente determinadas através do alinhamento com outras sequências originais.

[0049] Conforme usado aqui, o termo "resíduo" no contexto de um polipeptídeo refere-se a uma unidade de aminoácido na cadeia poli- peptídica linear. É o que resta de cada aminoácido, isto é, -NH-CHR- C-, depois que a água é removida na formação do polipeptídeo de a- aminoácidos, ou seja, NH2-CHR-COOH.

[0050] Tal como é conhecido na técnica, "polinucleotídeo" ou "ácido nucleico", como usado aqui de forma intercambiável, referem-se a cadeias de nucleotídeos de qualquer comprimento e incluem DNA e RNA.

Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleo- tídeos, nucleotídeos modificados ou bases, e/ou os seus análogos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado em uma cadeia pelo DNA ou RNA polimerase.

Um polinucleotídeo pode incluir nucleotídeos modificados, como nucleotídeos metilados e seus análogos.

Se pre- sente, a modificação da estrutura do nucleotídeo pode ser conferida antes ou depois da montagem da cadeia.

A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos.

Um polinu- cleotídeo pode ser modificado ainda após a polimerização, como por conjugação com um componente de rotulagem.

Outros tipos de modi- ficações incluem, por exemplo, "caps", substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente por um análogo; modificações de internucleotídeos, como, por exemplo, os que têm ligações não car- regadas (por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosfoami- dos, carbamatos, etc) e com ligações carregadas (por exemplo, fosfo- rotioatos, fosforoditioatos, etc); as que contêm propriedades penden- tes, como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinalização, poli-L-lisina, etc); as que têm in- tercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno, etc); as que contêm queladores (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxi- dativos, etc); as contendo alquiladores; as com ligações modificadas (p.ex., ácidos nucleicos anoméricos alfa, etc); bem como formas não modificadas do(s) polinucleotídeo(s). Além disso, qualquer um dos grupos hidroxila normalmente presente nos açúcares pode ser substi- tuído, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protetores padrão, ou ativados para preparar ligações adi- cionais a nucleotídeos adicionais, ou pode ser conjugado a suportes sólidos. O terminal OH 5' e 3' podem ser fosforilados ou substituídos por porções aminas ou grupos orgânicos capping de 1 a 20 átomos de carbono. Outras hidroxilas também podem ser derivadas de grupos protetores padrão. Os polinucleotídeos também podem conter formas análogas de açúcares ribose ou desoxirribose que são geralmente co- nhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil, 2"- fluoro- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares alfa ou beta-anoméricos, açúcares epiméricos, como arabinose, xilo- ses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedoheptulo- ses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeos abásicos, como metil ribosídeo. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substitu- ídas por grupos de ligação alternativos. Esses grupos de ligação alter- nativos incluem, mas não se limitam a, modalidades nas quais o fosfa- to é substituído por P(O)S("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR>2 ("amida- to"), P(O)R, P(O0)JOR', CO ou CH> ("formacetal"), nas quais cada R ou R' é independentemente H ou alquila (1-20 C) substituída ou não subs- tituída, opcionalmente contendo uma ligação de éter (-O-), arila, al- quenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo têm de ser idênticas. A descrição anterior apli- ca-se a todos os polinucleotídeos referidos aqui, incluindo RNA e DNA.

[0051] Os termos "polipeptídeo", "oligopeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são utilizados de forma intercambiável para se referir a ca- deias de aminoácidos de qualquer comprimento. A cadeia pode ser linear ou ramificada, pode incluir aminoácidos modificados e/ou pode ser interrompida por não aminoácidos. Os termos incluem também uma cadeia de aminoácidos que foi modificada naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, como conjugação com um componente de rotulagem. Também incluídos na definição estão, por exemplo, polipeptídeos que contêm um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exem- plo, aminoácidos não naturais, etc), bem como outras modificações conhecidas na técnica. Entende-se que os polipeptídeos podem ocor- rer como cadeias únicas ou cadeias associadas.

[0052] "Homólogo", em todas as suas formas gramaticais e varia- ções ortográficas, refere-se à relação entre duas proteínas que possu- em uma "origem evolutiva comum", incluindo proteínas de superfamí- lias na mesma espécie de organismo, bem como proteínas homólogas de diferentes espécies de organismos. Tais proteínas (e seus ácidos nucleicos codificantes) têm homologia de sequência, como refletido pela sua semelhança de sequência, seja em termos de identidade per- centual ou pela presença de resíduos ou motivos específicos e posi- ções conservadas. "Homólogo" também pode referir-se a um ácido nu- cleico nativo do vírus.

[0053] No entanto, no uso comum e na aplicação imediata, o ter- mo "homólogo", quando modificado com um advérbio como "altamen- te", pode referir-se à similaridade de sequência e pode ou não estar relacionado com uma origem evolutiva comum.

[0054] "Heteróloga", em todas as suas formas gramaticais e varia- ções ortográficas, pode referir-se a um ácido nucleico não nativo do vírus. Significa derivado de uma espécie diferente ou de uma cepa di- ferente do ácido nucleico do organismo ao qual o ácido nucleico é descrito como heterólogo em relação a. Em um exemplo não limitante, o genoma viral do SsecVACV compreende hairpin loops heterólogos ter- minais. Os ditos hairpin loops heterólogos terminais podem ser deriva- dos de uma espécie de vírus diferente ou de uma cepa VACV diferen- te.

[0055] O termo "similaridade de sequência", em todas as suas formas gramaticais, refere-se ao grau de identidade ou correspondên- cia entre sequências de ácido nucleico ou aminoácidos que podem ou não compartilhar uma origem evolutiva comum.

[0056] A "porcentagem (%) de identidade de sequência" ou "% de sequência idêntica a" em relação a uma sequência de referência de polipeptídeo (ou nucleotídeo) é definida como a percentagem de resí- duos de aminoácidos (ou ácidos nucleicos) em uma sequência candi- data que é idêntica com os resíduos de aminoácidos (ou ácidos nu- cleicos) na sequência de referência de polipeptídeo (nucleotídeo), de- pois do alinhamento das sequências e introdução de gaps, se neces- sário, para obter a porcentagem máxima de identidade de sequência e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. O alinhamento para efeitos de determina- ção da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro da especialidade na técnica, por exemplo, BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os versados na técnica podem determinar parâmetros adequados para o alinhamento de sequências, incluindo quaisquer al- goritmos necessários para alcançar o máximo alinhamento ao longo de todo o comprimento das sequências a serem comparadas.

[0057] Conforme usado aqui, uma "célula hospedeira" inclui uma cultura de células ou células individuais que pode ser ou foi um recipi- ente do vírus da descrição. Células do hospedeiro incluem a progênie de uma única célula hospedeira, e a progênie pode não ser necessari- amente completamente idêntica (em morfologia ou em complemento do DNA genômico) para a célula-mãe original devido à mutação natu- ral, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células trans- fectadas e/ou transformadas in vivo com um poxvírus dessa descrição.

[0058] Como usado aqui, "vetor" significa uma construção, que é capaz de fornecer, e, de preferência, expressar, um ou mais gene(s) ou sequência(s) de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a, vetores virais, vectores de expressão de DNA ou RNA inativo, plasmídeo, vetores de cosmídeos ou de fagos, vetores de expressão do DNA ou RNA associados com agentes de condensação catiônicos, vetores de expressão de DNA ou RNA encapsulados em lipossomas, e algumas células eucarióticas, como células produtoras.

[0059] Como usado aqui, "molécula isolada" (onde a molécula é, por exemplo, um polipeptídeo, um polinucleotídeo, ou seu fragmento) é uma molécula que, em virtude da sua origem ou origem de derivação (1), não está associada a um ou mais componentes naturalmente as- sociados que o acompanham no seu estado nativo, (2) está substanci- almente livre de uma ou mais outras moléculas da mesma espécie (3) é expressada por uma célula de uma espécie diferente, ou (4) não ocorre na natureza. Assim, uma molécula que é quimicamente sinteti- zada, ou expressada em um sistema celular diferente da célula de que se origina naturalmente, será "isolada" de seus componentes natural- mente associados. Uma molécula também pode ser substancialmente livre de componentes naturalmente associados pelo isolamento, utili- zando técnicas de purificação bem conhecidas na técnica. A pureza ou homogeneidade das moléculas pode ser determinada por vários meios bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a pureza de uma amostra de polipeptídeo pode ser analisada usando eletroforese em gel de po- liacrilamida e coloração do gel para visualizar o polipeptídeo usando técnicas bem conhecidas na técnica. Para determinados fins, pode ser fornecida uma resolução mais elevada utilizando HPLC ou outros mei- os bem conhecidos na técnica de purificação.

[0060] Conforme usado aqui, o termo "isolado", no contexto de ví- rus, refere-se a um vírus derivado de um único vírus parental. Um ví- rus pode ser isolado usando métodos de rotina conhecidos por uma dos versados na técnica, incluindo, mas não se limitando a, os basea- dos na purificação da placa e na diluição limitativa.

[0061] Como usado aqui, a frase "multiplicidade de infecção" ou "MOI" é o número médio de vírus por célula infectada. Determina-se o MOI dividindo o número de vírus adicionado (ml adicionados x unida- des formadoras de placa (UFP)) pelo número de células adicionadas (ml adicionados * células/ml).

[0062] Como usado aqui, "purificar" e suas variações gramaticais, refere-se à remoção, total ou parcial, de pelo menos uma impureza de uma mistura contendo o polipeptídeo e uma ou mais impurezas, que melhora, assim, o nível de pureza do polipeptídeo na composição (ou seja, diminuindo a quantidade (ppm) de impureza(s) na composição). Como usado aqui, "purificado" no contexto dos vírus refere-se a um vírus que está substancialmente livre de material celular e meios de cultura da fonte de célula ou de tecido a partir dos quais o vírus é deri- vado. A linguagem "substancialmente livre de material celular" inclui preparações de vírus em que o vírus é separado dos componentes celulares das células a partir das quais é isolado ou produzido de for- ma recombinante. Assim, um vírus substancialmente isento de materi- al celular inclui preparações de proteínas com menos de 30%, 20%, 10% ou 5% (em peso seco) de proteínas celulares (também referidas aqui como "proteína contaminante"). O vírus também está substanci- almente livre de meio de cultura, ou seja, o meio de cultura representa menos de 20%, 10% ou 5% do volume da preparação do vírus. Um vírus pode ser purificado usando métodos de rotina conhecidos por uma dos versados na técnica, incluindo, mas não se limitando a, cro- matografia e centrifugação.

[0063] Como usado aqui, "substancialmente puro" refere-se a ma- teriais com um grau de pureza de, pelo menos, 50% (ou seja, livres de contaminantes), mais preferivelmente, pelo menos 90% de pureza, de preferência, 95% de pureza, ainda com mais preferência pelo menos 98% de pureza e, de com mais preferência pelo menos 99 % de pure-

za.

[0064] Os termos "paciente", "sujeito" ou "indivíduo" são aqui utili- zados de forma intercambiável e referem-se a um animal humano ou não humano. Estes termos incluem mamíferos, como seres humanos, primatas, animais de criação (incluindo bovinos, suínos, camelos, etc), animais de estimação (por exemplo, caninos, felinos, etc) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos).

[0065] Como usado aqui, os termos "prevenir", "prevenindo" e "prevenção" referem-se ao atraso da recorrência ou do início de, ou uma redução de um ou mais sintomas de uma doença (por exemplo, uma infecção poxviral) em um indivíduo como resultado da administra- ção de uma terapia (por exemplo, um agente profiláctico ou terapêuti- co). Por exemplo, no contexto da administração de uma terapia a um indivíduo para uma infecção, "prevenir", "prevenindo" e "prevenção" referem-se à inibição ou redução do desenvolvimento ou início de uma infecção (por exemplo, uma infecção poxviral ou uma condição asso- ciada a ela), ou a prevenção da recorrência, do início ou do desenvol- vimento de um ou mais sintomas de uma infecção (por exemplo, uma infecção poxviral ou uma condição associada a ela), em um indivíduo resultante da administração de uma terapia (por exemplo, um agente profiláctico ou terapêutico), ou a administração de uma combinação de terapias (por exemplo, uma combinação de agentes profiláticos ou te- rapêuticos).

[0066] Conforme usado aqui, os termos "tratar", "tratando" ou "tra- tamento" referem-se ao tratamento de uma condição ou paciente e re- ferem-se a tomar medidas para obter resultados benéficos ou deseja- dos, incluindo resultados clínicos. No que diz respeito às infecções (por exemplo, uma infecção poxviral ou uma infecção pelo vírus da va- ríola), o tratamento refere-se à erradicação ou controle da replicação de um agente infeccioso (por exemplo, o poxvírus ou o vírus da vario-

la), à redução do número de um agente infeccioso (por exemplo, a re- dução do titulação do vírus), a redução ou a melhoria da progressão, gravidade e/ou duração de uma infecção (por exemplo, uma infecção poxviral/varíola ou uma condição ou sintomas associados), ou a me- lhora de um ou mais sintomas resultantes da administração de uma ou mais terapias (incluindo, mas não se limitando a, a administração de um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos). No que diz respeito ao câncer, o tratamento refere-se à erradicação, remoção, modificação ou controle do tecido cancerígeno primário, regional ou metastático que resulta da administração de um ou mais agentes terapêuticos da descrição. Em determinadas modalidades, tais termos referem-se a minimizar ou retardar a propagação do câncer resultante da adminis- tração de um ou mais agentes terapêuticos da descrição a um indiví- duo com tal doença. Em outras modalidades, tais termos se referem à eliminação de células causadoras de doenças.

[0067] "Administrando" ou "administração" de uma substância, de um composto ou de um agente a um indivíduo pode ser realizada usando um dos vários métodos conhecidos por versados na técnica. Por exemplo, um composto ou um agente pode ser administrado sub- lingual ou intranasalmente, por inalação no pulmão ou retalmente. À administração também pode ser realizada, por exemplo, uma vez, uma pluralidade de vezes, e/ou através de um ou mais períodos prolonga- dos. Em alguns aspectos, a administração inclui tanto a administração direta, incluindo a autoadministração, como a administração indireta, incluindo o ato de prescrever um medicamento. Por exemplo, como usado aqui, um médico que instrua um paciente a autoadministrar um medicamento ou a administrar o medicamento por outro e/ou que for- neça uma prescrição para um medicamento a um paciente está admi- nistrando o medicamento ao paciente.

[0068] Cada modalidade descrita aqui pode ser usada individual-

mente ou em combinação com qualquer outra modalidade descrita aqui. Visão geral

[0069] Os Poxvírus são vírus grandes de DNA (- 200 kbp) que se replicam no citoplasma de células infectadas. O gênero Orthopoxvirus (OPV) compreende um número de poxvírus que variam muito na sua capacidade de infectar diferentes hospedeiros. O vírus vaccinia (VACV), por exemplo, pode infectar um amplo grupo de hospedeiros, enquanto o vírus da varíola (VARV), o agente causador da varíola, infecta so- mente humanos. Uma característica comum a muitos, se não a todos os poxvírus, é a sua capacidade de se "reativar" não geneticamente dentro de um hospedeiro. A reativação não genética refere-se a um processo em que as células infectadas por um poxvírus podem pro- mover a recuperação de um segundo vírus "morto" (por exemplo, uma inativado pelo calor) que seria não infeccioso por si só.

[0070] O DNA purificado de poxvírus não é infeccioso, uma vez que o ciclo de vida do vírus requer a transcrição de genes precoces através das polimerases de RNA codificadas por vírus, que são emba- ladas em vírions. Entretanto, essa deficiência pode ser superada se o DNA do vírus for transfectado em células previamente infectadas com um poxvírus auxiliar, fornecendo os fatores necessários para transcre- ver, replicar e empacotar o genoma transfectado em trans (Sam CK, Dumbell KR. Expression of poxvirus DNA in coinfected cells and mark- er rescue of thermosensitive mutants by subgenomic fragments of DNA. Ann Virol (Inst Past). 1981; 132:135-50). Embora isso produza progênie viral mista, o problema pode ser superado pela realização da reação de reativação em uma linhagem celular que suporta a propa- gação de ambos os vírus, e, em seguida, elimina o vírus auxiliar atra- vés do revestimento da mistura de vírus em células que não suportam o crescimento do vírus auxiliar (Scheiflinger F, Dorner F, Falkner FG.

Construction of chimeric vaccinia viruses by molecular cloning and packaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992;89(21):9977-81).

[0071] Anteriormente, Yao e Evans descreveram um método no qual a recombinação de alta frequência e as reações de replicação catalisadas por Leporipoxvirus, o vírus do fibroma de Shope (SFV), podem ser acopladas a uma reação de reativação catalisada por SFV, para montar rapidamente cepas recombinantes de vaccinia usando múltiplos fragmentos sobrepostos de DNA viral (Yao XD, Evans DH. High-frequency genetic recombination and reactivation of orthopox- viruses from DNA fragments transfected into leporipoxvirus-infected cells. Revista de Virologia. 2003;77(13):7281-90). Pela primeira vez, descreve-se a reativação e caracterização de um vírus vaccinia quimé- rico sintético funcional [scVACV], utilizando fragmentos sobrepostos de DNA de fita dupla quimicamente sintetizados.

Vírus vaccinia quiméricos sintéticos da descrição

[0072] Em um aspecto, a invenção fornece vírus vaccinia quiméri- cos sintéticos funcionais (scVACV) que são inicialmente replicados e montados a partir de DNA quimicamente sintetizado. Os vírus que po- dem ser produzidos de acordo com os métodos de descrição podem ser qualquer vírus vaccinia cujo genoma tenha sido sequenciado ou possa ser sequenciado em grande parte ou para o qual esteja disponí- vel um isolado natural. Um scVACV das várias modalidades pode ba- sear-se nas sequências genômicas de cepas, variantes ou mutantes de ocorrência natural, vírus mutagenizados ou vírus geneticamente modificados. Em algumas modalidades, o genoma viral de um scVACV compreende uma ou mais modificações relativas ao genoma do tipo selvagem ou à sequência do genoma da base desse vírus. As modifi- cações podem incluir uma ou mais deleções, inserções, substituições ou combinações das mesmas. Em uma modalidade, a modificação pode incluir a inserção ou um ou mais sítios múltiplos de clonagem, de modo que o DNA exógeno possa ser inserido. Entende-se que as mo- dificações podem ser introduzidas em qualquer número de maneiras comumente conhecidas na técnica. As porções modificadas do geno- ma podem ser derivadas de DNA quimicamente sintetizado, cDNA ou DNA genômico. Em outra modalidade, o genoma viral do scVACV da descrição compreende uma ou mais modificações para adicionar ou reparar um ou mais sítios de restrição únicos. As modificações para adicionar ou reparar um ou mais sítios de restrição podem ser realiza- das nos sítios de restrição que foram eliminados para facilitar a sele- ção de clones.

[0073] A síntese química do genoma é particularmente útil quando um modelo natural não está disponível para a modificação genética, amplificação ou replicação através de métodos convencionais de bio- logia molecular. A sequência do genoma para wtVACV (cepa NYCBH, clone ACAM2000) foi descrita e publicada, embora não tenha sido completa. Não foi determinada a sequência dos hairpin loops termi- nais, apenas quatro sequências de repetição de 54 bp foram identifi- cadas. A presença das sequências de repetição tandem 70bp, 125bp e 54bp foi confirmada em um isolado do tipo selvagem do VACV ACAMZ2000 após o sequenciamento, indicando que a sequência publi- cada atual do ACAM2000 estava incompleta. Os inventores geraram um VACV quimérico sintético funcional (scVACV). Especificamente, os inventores geraram com sucesso uma cepa funcional de scVACV NYCBH, clone ACAM2000, usando hairpin loops terminais baseados em telômeros wtVACV de uma cepa diferente em vez das sequências de hairpin loop terminal do próprio VACV. Em algumas modalidades, o genoma viral do vírus VACV é uma cepa selecionada do grupo de: Western Reserve, Clone 3, Tian Tian, Tian Tian clone TP5, Tian Tian clone TP3, NYCBH, NYCBH clone Acambis 2000, Wyeth, Copenha-

gen, Lister, Lister 107, Lister-LO, Lister GL-ONC1, Lister GL-ONC?2, Lister GL-ONC3, Lister GL-ONCA4, Lister CTC1, Lister IMG2 (Turbo FP635), IHD-W, LC16m18, Lederle, Tashkent clone TKT3, Tashkent clone TKT4, USSR, Evans, Praha, L-IVP, V-VET1 ou LIVP 6.1.1, lke- da, EM-63, Malbran, Duke, 3737, CV-1, Connaught Laboratories, Serro 2, CM-01, NYCBH Dryvax clone DPP13, NYCBH Dryvax clone DPP15, NYCBH Dryvax clone DPP20, NYCBH Dryvax clone DPP17, NYCBH Dryvax clone DPP21, VACV-IOC, Chorioallantois Vaccinia vírus Anka- ra (CVA), vaccinia Ankara modificada (MVA) e MVA-BN. Em uma mo- dalidade preferida, o genoma viral é baseado na cepa NYCBH. De pre- ferência, o genoma viral é derivado da cepa NYCBH, do clone Acam- bis 2000 ou ACAM2000. Novas cepas de VACV ainda estão sendo constantemente descobertas. Entende-se que um scVACV da descri- ção pode ser baseado em cepas VACV recém-descobertas.

[0074] DryvaxO é derivado do New York City Board of Health Strain do vírus vaccinia (Wyeth Laboratories, Marietta, PA) e foi culti- vado na pele de bezerros e, em seguida, essencialmente liofilizado para armazenamento.

[0075] A cepa de VACV ACAMZ2000, vacina contra varíola (Vacci- nia), viva, é um vírus vivo de vaccinia derivado da clonagem de purifi- cação de placa de DryvaxO e cultivado em células do rim do macaco verde africano (Vero) e testada para estar livre de agentes adventícios (Osborne JD et al. Vaccine. 2007; 25(52):8807-32).

[0076] V-VET1 ou LIVP 6.1.1 foi desenvolvido por Genelux. Foi isolado de um estoque do tipo selvagem da cepa Lister do vírus vacci- nia (cepa Lister, Institute of Viral Preparations (LIVP), Moscou, Rússia) e representa um vírus "nativo" (não foram realizadas manipulações genéticas). O gene da timidina quinase (tk) do vírus LIVP 6.1.1 está inativo (Shvalov AN et al. Genome Announc. 2016 maio-Jun; 4(3): e00372-16).

[0077] O GLV-1h68 (denominado GL-ONC1 como produzido para investigação clínica) foi desenvolvido por Genelux da cepa Lister, inse- rindo três cassetes de expressão que codificam a fusão de Renilla luci- ferase — proteína verde fluorescente Aequorea (Ruc-GFP), LacZ e B- glucuronidase nos loci F14.5L, J2R (timidina quinase) e ASSGR (hema- glutinina) do genoma viral, respectivamente (Zhang Q et al. Cancer Res. 2007; 67(20):10038-46).

[0078] A síntese química do genoma viral também abre a possibi- lidade de introduzir um grande número de modificações úteis ao ge- noma resultante ou a partes específicas do mesmo. As modificações podem melhorar a facilidade de clonagem para gerar o vírus, fornece sítios para a introdução de produtos de genes recombinantes, melho- rar a facilidade de identificação de clones virais reativados e/ou confe- rir uma infinidade de outras características úteis (por exemplo, introdu- zir um antígeno desejado, produzir um vírus oncolítico, etc). Em algu- mas modalidades, as modificações podem incluir a atenuação ou de- leção de um ou mais fatores de virulência. Em algumas modalidades, as modificações podem incluir a adição ou inserção de um ou mais genes reguladores de virulência ou fatores reguladores de codificação genética.

[0079] Tradicionalmente, os hairpins terminais de poxvírus têm si- do difíceis de clonar e sequenciar, portanto, não é de surpreender que algumas das sequências de genoma publicadas (por exemplo, VACV, ACAMZ2000 e HPXV MNR-76) estejam incompletas. Especificamente, a sequência do genoma para WwiVACV, cepa NYCBH, clone ACAMZ2O0O0O, foi descrita e publicada, embora não tenha sido completa. Não foi determinada a sequência dos hairpin loops terminais, apenas quatro sequências de repetição de 54 bp foram identificadas. Uma vez que a sequência publicada do genoma do wtVACV cepa NYCBH, clo- ne ACAMZ2000 está incompleta, os hairpins não podem ser replicados com precisão e, antes desse pedido, não se sabia se o VACV poderia ser replicado e montado a partir de polinucleotídeos baseados apenas na porção conhecida do genoma do wiVACV.

Também não se sabia que os hairpins de um vírus de cepa estariam operáveis em outra ce- pa.

Os inventores geraram um VACV (scVACV) ACAM2000 quimérico sintético funcional, usando hairpin loops terminais baseados em telô- meros wtVACV de uma cepa diferente em vez das sequências de hairpin loop terminal do próprio VACV.

Em uma modalidade exemplar, fragmentos de ssDNA foram quimicamente sintetizados pela sequên- cia publicada dos telômeros da cepa VACV WR como guia e ligados aos fragmentos de dsDNA compreendendo as extremidades esquerda e direita da cepa de VACV NYCBH.

Em algumas modalidades, os hairpins terminais baseados nos hairpins terminais de qualquer cepa VACV cujo genoma foi completamente sequenciado ou cujo isolado natural está disponível para sequenciamento do genoma.

Em algumas modalidades, os hairpin loops terminais são baseados em uma cepa selecionada do grupo de: Western Reserve, Clone 3, Tian Tian, Tian Tian clone TP5, Tian Tian clone TP3, NYXCBH, NYCBH clone Acambis 2000, Wyeth, Copenhagen, Lister, Lister 107, Lister-LO, Lister GL- ONC1, Lister GL-ONC?2, Lister GL-ONC3, Lister GL-ONCA4, Lister CTC1, Lister IMG2 (Turbo FP635), IHD-W, LC16m18, Lederle, Tash- kent clone TKT3, Tashkent clone TKT4, USSR, Evans, Praha, L-IVP, V-VET1 ou LIVP 6.1.1, Ikeda, EM-63, Malbran, Duke, 3737, CV-1, Connaught Laboratories, Serro 2, CM-01, NYCBH Dryvax clone DPP13, NYCBH Dryvax clone DPP15, NYCBH Dryvax clone DPP20, NYCBH Dryvax clone DPP17, NYCBH Dryvax clone DPP21, VACV- IOC, Chorioallantois vírus vaccinia Ankara (CVA), vaccinia Ankara mo- dificada (MVA) e MVA-BN.

Em uma modalidade preferida, os hairpin loops terminais são baseados na cepa Western Reserve (cepa WR) de VACV.

Novas cepas de VACV ainda estão sendo constantemente descobertas. Entende-se que um scVACV da descrição pode ser ba- seado em cepas VACV recém-descobertas.

[0080] Em outra modalidade, o genoma viral do scVACV da pre- sente descrição compreende hairpin loops terminais homólogos ou he- terólogos e as regiões de repetição tandem (as repetições tandem de 70 pb, 125 pb e 54 pb) localizadas a jusante dos hairpin loops, em que as regiões de repetição tandem compreendem um número diferente de repetições do que o wtVACV (ou seja, o vírus presente na natureza). O número de repetições das repetições em tandem de 70 pb, 125 pp e 54 pb encontradas no vírus VACV, cepa WR foi de 22, 2 e 8, respecti- vamente. Em outra modalidade, o número de regiões de repetição em tandem é variável em diferentes poxvírus, em diferentes vírus vaccinia e em diferentes cepas de vírus vaccinia. O termo hairpin loops termi- nais homólogos significa que os hairpin loops terminais são provenien- tes da mesma espécie de vírus/da mesma cepa, enquanto o termo hairpin loops terminais heterólogos significa que os hairpin loops ter- minais são provenientes de diferentes espécies de vírus/diferentes ce- pas.

[0081] Em algumas modalidades, as modificações podem incluir a deleção de um ou mais sítios de restrição. Em algumas modalidades, as modificações podem incluir a introdução de um ou mais sítios de restrição. Em algumas modalidades, os sítios de restrição a serem de- letados do genoma ou adicionados ao genoma podem ser seleciona- dos a partir de um ou mais sítios de restrição, como Aanl, Aarl, Aasl, Aatl, Aatll, AbaSI, Absl, Acc651I , Accl, Accll, Acclll, Acil, Acll, Acul, Afel, Afill, Afil!l, Agel, Ahadl, Alel, Alul, Alwl, AlwNI, Apal, ApaLI, ApeKl, Apol, Ascl, Asel, AsiSl, Aval, Avall, Avrll, BaeGl, Bael, BamHlI Banl, Banll, Bbsl, BbvCI, Bbvl, Bccl, BceAl, Begl, BciVl, Bell, BcoDI, Bfal, BfuAl, BfuCl, Bgll, Bgalll, Blpl, BmgBl, Bmrl, Bmtl, Boml, Bpu1Ol, Bpu- El, BsaAal, BsaBl, BsaHI, Bsal, BsaJl, BsaWl, BsaXl, BseRI, BseY],

Bsgl, BsiEl, BsiHKAI, BsiWl, Bsll, BSmAI, BsmBlI, BsmFI, Bsml, BsoBl, Bsp12861I, BSspCNI, BspDI, BspEl, BspHI, BspMI, BspQI, BsrBl, BsrDI, BsrFal, BsrGI, Bsrl, BssHII, BssSal, BstAPI, BstBl, BstEll, BstNI, BstUI, BstXl, BstYl, BstZ171, Bsu36I, Btgl, BtgZl, Btsal, BtsCl, Bts/Mu- tl, Cac8l, Clal, CspCl, CviAIl, CviKI-1, CviQI, Ddel, Dpnl, Dpnil, Dral, Drdl, Eael, Eagl, Earl, Ecil, Eco53kl, EcoNI, EcoO109I, EcoP15I, Eco- RI, EcoRV, Fatl, Faul, Fnu4HIl, Fokl, Fsel, FSpEI, Fspl, Haell, Haelll, Hgal, Hhal, Hincll, Hindlll, Hinfl, HinP11, Hpal, Hpall, Hphl, Hpy166II, Hpy1881l, Hpy188Ill, Hpy991l, HpyAV, HpyCH4lll HpyCHA4lV, HpyCHA4V, I-Ceul, I-Scel, Kasl, Kpnl, LonPl, Mbol, Mboll, Mfel, MIuCI, Mlul, Mlyl, Mmel, Mnll, Mscl, Msel, Msll, MSpA1I, Mspl, MspJl, Mwol, Nael, Narl, Ncil, Ncol, Ndel, NgoMIV, Nhel, Nlalll, NlalV, NMeAlIII, No- tl, Nrul, Nsil, Nspl, Pacl, PaeR7I, Pcil, PfIFI, PfIMI, Plel, PluTI, Pmel, Pmll, PpuMI, PsShAI, Psil, PspGl, PSpOMI, PspXI, Pstl, Pvul, Pvull, Rsal, Rerll, Sacl, Sacll, Sall, Sapl, Sau3AI, Sau961, Sbfl, ScrFl, SexAl, SfaNI, Sfcl, Sfil, Sfol, SgrAIl, Smal, Smll, SnaBl, Spel, Sphl, Srfl, Sspl, Stul, StyD4I, Styl, Swal, Tagal, Tfil, Tsel, Tsp45l, TspMI, TspRI, Tth1111, Xbal, Xcml, Xhol, Xmal, Xmnl, ou Zral.

Entende-se que qual- quer sítio(s) de restrição desejado(s) ou combinação de sítios de res- trição pode(m) ser inserido(s) no genoma ou mutado(s) e/ou elimina- do(s) do genoma.

Em algumas modalidades, um ou mais sítios Aarl são deletados do genoma viral.

Em algumas modalidades, um ou mais sítios Bsal são deletados do genoma viral.

Em algumas modalidades, um ou mais sítios de restrição são completamente eliminados do ge- noma (por exemplo, todos os sítios Aarl no genoma viral podem ser eliminados). Em algumas modalidades, um ou mais sítios de restrição Aval são introduzidos no genoma viral.

Em algumas modalidades, um ou mais sítios Stul são introduzidos no genoma viral.

Em algumas mo- dalidades, uma ou mais modificações podem incluir a incorporação de alvos de recombinação, incluindo, mas não se limitando a, sítios loxP ou FRT.

[0082] Em algumas modalidades, as modificações podem incluir a introdução de marcadores de fluorescência, como, mas não se limi- tando a, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente ama- rela (YFP), proteína fluorescente ciano/azul (BFP), proteína fluores- cente vermelha (RFP), ou suas variantes, etc; marcadores selecioná- veis, como, entre outros, os marcadores de resistência a fármacos (por exemplo, o gene da E.coli xantina-guanina fosforibosil transferase (gpt), o gene da Streptomyces alboniger puromicina-acetiltransferase (pac), o gene da neomicina-fosfotranferase | (nptl), o gene da neomici- na-fosfotransferase Il (nptll), higromicina fosfotransferase (hpt), gene sh ble, etc; etiquetas de proteína ou de peptídeo, como, mas não se limitando a MBP (proteína de ligação à maltose), CBD (domínio de |li- gação à celulose), GST (glutationa-S-transferase), poli (His), FLAG, V5, c-Myc, HA (hemaglutinina), NE-tag, CAT (cloranfenicol acetil trans- ferase), DHFR (diidrofolato redutase), HSV (vírus Herpes simplex), VSV-G (glicoproteína do vírus da estomatite vesicular), luciferase, pro- teína A, proteína G, estreptavidina, T7, tiorredoxina, etiquetas 2 híbri- das de levedura, como B42, GALA, LexA ou VP16; etiquetas de locali- zação, como uma etiqueta NLS, etiqueta SNAP, etiqueta Myr, etc. É entendido que outros marcadores selecionáveis e/ou etiquetas conhe- cidas na técnica podem ser usados. Em algumas modalidades, as mo- dificações incluem um ou mais marcadores selecionáveis para auxiliar na seleção de clones reativados (por exemplo, um marcador de fluo- rescência como YFP, um marcador de seleção de fármaco como gpt, etc.) para auxiliar na seleção de clones virais reativados. Em algumas modalidades, um ou mais marcadores selecionáveis são deletados dos clones reativados após a etapa de seleção.

[0083] Em um aspecto, os scVACVs da invenção podem ser usa- dos como vacinas para proteger contra infecções poxvirais patogêni-

cas (por exemplo, VARV, MPXV, MCV, ORFV, vírus Ausdyk, BPSV, vírus da varíola de foca, etc), como agentes terapêuticos para tratar ou prevenir infecções poxvirais patogênicas (por exemplo, VARV, MPXV, MCV, ORFV, vírus Ausdyk, BPSV, vírus da varíola de foca, etc), como veículos para a expressão genética heteróloga, ou como agentes on- colíticos. Em algumas modalidades, os scVACVs podem ser usados como vacinas para proteger contra a infecção por VARV. Em algumas modalidades, os scVACVs podem ser usados para tratar ou prevenir uma infecção por VARV. Métodos para produzir VACV quimérico sintético

[0084] Em um aspecto, a invenção fornece sistemas e métodos para sintetizar, reativar e isolar VACVs quiméricos sintéticos funcionais (scVACVs) a partir de fragmentos de DNA de fita dupla sobrepostos quimicamente sintetizados do genoma viral. A recombinação de frag- mentos de DNA sobrepostos do genoma viral e a reativação dos SCcVACVs funcionais são realizadas em células previamente infectadas com um vírus auxiliar. Em resumo, os fragmentos de DNA sobrepostos que englobam todo ou substancialmente todo o genoma viral dos ScVACVs são quimicamente sintetizados e transfectados em células infectadas pelo vírus auxiliar. As células transfectadas são cultivadas para produzir progênie viral mista compreendendo o vírus auxiliar e os ScVACVs reativados. Em seguida, a progênie viral mista é revestida em células hospedeiras que não suportam o crescimento do vírus au- xiliar, mas permitem que o vírus vaccinia sintético quimérico cresça, a fim de eliminar o vírus auxiliar e recuperar o vírus vaccinia sintético quimérico. Em algumas modalidades, o vírus auxiliar não infecta as células hospedeiras. Em algumas modalidades, o vírus auxiliar pode infectar as células hospedeiras, mas cresce mal nas células hospedei- ras. Em algumas modalidades, o vírus auxiliar cresce mais lentamente nas células hospedeiras em comparação com os scVACVs.

[0085] Em algumas modalidades, substancialmente todo o geno- ma quimérico sintéticado do vírus vaccinia é derivado do DNA quimi- camente sintetizado. Em algumas modalidades, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, mais de 99%, ou 100% do genoma quimérico sintético do vírus vaccinia é derivado do DNA quimicamente sintetizado. Em algumas modalidades, o genoma do vírus vaccinia é derivado de uma combinação de DNA quimicamente sintetizado e DNA de ocorrência natural. Em algumas modalidades, todos os frag- mentos que abrangem o genoma do vírus vaccinia são quimicamente sintetizados. Em algumas modalidades, um ou mais fragmentos são quimicamente sintetizados e um ou mais fragmentos são derivados do DNA de ocorrência natural (por exemplo, por amplificação de PCR ou por técnicas de DNA recombinante bem estabelecidas).

[0086] O número de fragmentos de DNA sobrepostos usados nos métodos da presente descrição dependerá do tamanho do genoma do vírus vaccinia. Considerações práticas, como a redução da eficiência de recombinação à medida que o número de fragmentos aumenta, por um lado, e as dificuldades em sintetizar fragmentos de DNA muito grandes à medida que o número de fragmentos diminui, por outro lado, também informam o número de fragmentos sobrepostos usados nos métodos de descrição. Em algumas modalidades, o genoma quimérico sintético do vírus vaccinia pode ser sintetizado como um único frag- mento. Em algumas modalidades, o genoma quimérico sintético do vírus vaccinia é montado a partir de 2-14 fragmentos de DNA sobre- postos. Em algumas modalidades, o genoma quimérico sintético do vírus vaccinia é montado a partir de 4-12 fragmentos de DNA sobre- postos. Em algumas modalidades, o genoma quimérico sintético do vírus vaccinia é montado a partir de 6-12 fragmentos de DNA sobre-

postos. Em algumas modalidades, o genoma quimérico sintético do vírus vaccinia é montado a partir de 8-11 fragmentos de DNA sobre- postos. Em algumas modalidades, o genoma quimérico sintético do vírus vaccinia é montado a partir de 8-10, 10-12 ou 10-14 fragmentos de DNA sobrepostos. Em algumas modalidades, o genoma quimérico sintético do vírus vaccinia é montado a partir de 2, 3, 4, 5, 6,7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 fragmentos de DNA sobrepostos. Em uma modalidade preferencial, o genoma quimérico sintético do vírus vacci- nia é montado a partir de 9 fragmentos de DNA sobrepostos. Em uma modalidade exemplificadora da descrição, um vírus vaccinia sintético (scVACV) é reativado a partir de 9 fragmentos de DNA de fita dupla sobrepostos quimicamente sintetizados. Em algumas modalidades, os hairpin loops terminais são sintetizados separadamente e ligados aos fragmentos compreendendo as extremidades esquerda e direita do genoma do vírus vaccinia. Em algumas modalidades, os hairpin loops terminais podem ser derivados de um modelo que ocorre naturalmen- te. Em algumas modalidades, os hairpins terminais do scVACV são derivados do wtVACV. Em algumas modalidades, os hairpins terminais são derivados de hairpins terminais de wtVACV de uma cepa diferente em vez das sequências de loop hairpin terminais do próprio VACV. Em algumas modalidades, os hairpins terminais são baseados nos hair- pins terminais de qualquer wtVACV cujo genoma foi completamente sequenciado ou cujo isolado natural está disponível para sequencia- mento do genoma.

[0087] O tamanho dos fragmentos sobrepostos usados nos vários aspectos dos métodos da invenção dependerá do tamanho do genoma do vírus vaccinia. Entende-se que podem existir grandes variações nos tamanhos dos fragmentos e várias considerações práticas, como a capacidade de sintetizar quimicamente fragmentos de DNA muito grandes, irão informar a escolha dos tamanhos dos fragmentos. Em algumas modalidades, os fragmentos variam em tamanho de cerca de

2.000 bp a cerca de 50.000 bp. Em algumas modalidades, os fragmen- tos variam em tamanho de cerca de 3.000 bp a cerca de 45.000 bp. Em algumas modalidades, os fragmentos variam em tamanho de cer- ca de 4.000 bp a 40.000 bp. Em algumas modalidades, os fragmentos variam em tamanho de cerca de 5.000 bp a 35.000 bp. Em algumas modalidades, os maiores fragmentos são cerca de 18.000 bp, 20.000 bp, 21.000 bp, 22.000 bp, 23.000 bp, 24.000 bp, 25.000 bp, 26.000 bp,

27.000 bp, 28.000 bp, 29.000 bp, 30.000 bp, 31.000 bp, 32.000 bp,

33.000 bp, 34.000 bp, 35.000 bp, 36.000 bp, 37.000 bp, 38.000 bp,

39.000 bp, 40.000 bp, 41.000 bp, 42.000 bp, 43.000 bp, 44.000 bp,

45.000 bp, 46.000 bp, 47.000 bp, 48.000 bp, 49.000 bp ou 50.000 bp. Em uma modalidade exemplar da descrição, um scVACV é reativado a partir de 9 fragmentos de DNA de fita dupla sobrepostos quimicamente sintetizados, variando em tamanho de cerca de 10.000 pb a cerca de

32.000 pb (Tabela 1).

[0088] O vírus auxiliar pode ser qualquer poxvírus que possa for- necer o maquinário enzimático de trans-ação necessário para reativar um poxvírus do DNA transfectado. O vírus auxiliar pode ter uma varie- dade de células hospedeiras diferentes ou mais estreita do que um ScVACV a ser produzido (por exemplo, o vírus do fibroma de Shope (SFV) tem uma variedade de hospedeiros muito estreita em compara- ção com Ortopoxvírus como o vírus vaccinia (VACV) ou HPXV). O ví- rus auxiliar pode ter um fenótipo de placa diferente em comparação com o scVACV a ser produzido. Em algumas modalidades, o vírus au- xiliar é um Leporipoxvírus. Em algumas modalidades, o Leporipoxvírus é um SFV, vírus do fibroma de lebre, vírus do fibroma do coelho, vírus do fibroma do esquilo, ou vírus do mixoma. Em uma modalidade prefe- rida, o vírus auxiliar é um SFV. Em algumas modalidades, o vírus auxi- liar é um Ortopoxvírus. Em algumas modalidades, o Ortopoxvírus é um vírus da varíola de camelo (CMLV), vírus da varíola bovina (CPXV), vírus ectromélia (ECTV, agente da varíola do rato), HPXV, vírus da varíola de macaco (MPXV), vírus da varíola de coelho (RPXV), vírus da varíola de guaxinim, vírus da varíola de gambá, vírus da varíola Ta- terapoxi, vírus da doença Uasin Gishu e vírus da volepox (VPV). Em algumas modalidades, o vírus auxiliar é um Avipoxvírus, Capripoxvi- rus, Cervidpoxvirus, Crocodylipoxvirus, Molluskipoxvirus, Parapoxvirus, Suipoxvirus ou Yatapoxvirus. Em algumas modalidades, o vírus auxili- ar é um vírus da bolba aviária. Em algumas modalidades, o vírus auxi- liar é um Alphaentomopoxvirus, Betaentomopoxvirus ou Gammaento- mopoxvirus. Em algumas modalidades, o vírus auxiliar é um vírus auxi- liar ativado por psoraleno. Em uma modalidade exemplar da descrição, um scVACV é reativado a partir de fragmentos de DNA sobrepostos transfectados para células BGMK infectadas pelo SFV. O SFV é então eliminado através do revestimento da progênie viral mista em células BSC-40.

[0089] O trabalhador qualificado compreenderá que as células hospedeiras apropriadas serão usadas para a reativação do scVACV e a seleção e/ou isolamento do scVACV dependerá da combinação par- ticular do vírus auxiliar e do poxvírus quimérico produzido pelos vários aspectos dos métodos da descrição. Qualquer célula hospedeira que suporte o crescimento do vírus auxiliar e do seVACV pode ser usada para a etapa de reativação e qualquer célula hospedeira que não su- porte o crescimento do vírus auxiliar pode ser usada para eliminar o vírus auxiliar e selecionar e/ou isolar o scVACV. Em algumas modali- dade, o vírus auxiliar é um Leporipoxviruse as células hospedeiras usadas para a etapa de reativação podem ser selecionadas a partir de células renais de coelho (por exemplo, LLC-RK1, RK13, etc), células pulmonares de coelho (por exemplo, R9ab), células de pele de coelho (por exemplo, SF1Ep, DRS, RAB-9), células da córnea de coelho (por exemplo, SIRC), células de carcinoma de coelho (Por exemplo, Oc4T/cc), células de pele/carcinoma de coelho (por exemplo, CTPS), células de macaco (por exemplo, Vero, BGMK, etc) ou células de hamster (por exemplo, BHK-21, etc). Em uma modalidade preferida, as células hospedeiras são células BGMK.

[0090] Em algumas modalidades, os scVACVs podem ser propa- gados em qualquer substrato que permita que o vírus cresça para titu- lações que permitam o uso dos scVACVs descritos aqui. Em uma mo- dalidade, o substrato permite que os scVACVs cresçam para titulações comparáveis aos determinados para os vírus do tipo selvagem corres- pondentes. Em algumas modalidades, os scVACVs podem ser cultiva- dos em células (por exemplo, células aviárias, células de morcegos, células de bovinos, células de camelo, células de canários, células de gatos, células de veados, células de equinos, células de galinhas, cé- lulas de gerbil, células de cabra, células de humanos, células de ma- caco, células de porco, células de coelho, células de guaxinim, células de foca, células de ovelha, células de gambá, células de ratazanas, etc) que são suscetíveis à infecção pelo VACV. Tais métodos são bem conhecidos por um versado na técnica. As células representativas de mamíferos incluem, entre outras, BHK, BGMK, BRL3A, BSC-40, CEF, CEK, CHO, COS, CVI, HaCaT, HEL, células HeLa, HEK293, linhagem celular de osteossarcoma ósseo humano 143B, MDCK, NIH/3T3 e cé- lulas Vero. Para o isolamento do vírus, o scVACV é removido da cultu- ra de células e separado dos componentes celulares, normalmente através de procedimentos de clarificação bem conhecidos, como, por exemplo, centrifugação em gradiente e cromatografia em coluna, e pode ser ainda mais purificado conforme pretendido, usando procedi- mentos bem conhecidos dos versados na técnica, como ensaios em placa.

[0091] Em outro aspecto da presente invenção o método para pro-

dução de um vírus vaccinia quimérico sintético (ScCVACV) compreende a etapa de: (i) sintetizar quimicamente fragmentos de DNA sobrepos- tos que correspondam a praticamente todo o genoma viral do vírus vaccinia e sintetizar quimicamente os hairpin loops terminais de outra cepa de vírus vaccinia; (ii) transfectar os fragmentos de DNA sobre- postos em células infectadas pelo vírus auxiliar; (ili) cultivar essas célu- las para produzir uma mistura de partículas de vírus auxiliar e de partí- culas de vírus vaccinia quimérico sintético nessas células; e (iv) pla- quear a mistura em células hospedeiras específicas do scVACV para recuperar o SscVACV. Em algumas modalidades, o scVACV do presen- te método deriva da cepa NYCBH, do clone Acambis 2000 e os hairpin loops terminais derivam da cepa Western Reserve do vírus vaccinia. Polinucleotídeos da descrição

[0092] Em um aspecto, a invenção fornece polinucleotídeos (por exemplo, fragmentos de DNA de fita dupla) para a produção de poxví- rus quiméricos sintéticos funcionais (scVACVs). Em algumas modali- dades, a invenção fornece métodos para produzir secVACVs funcionais a partir de DNA sintético (por exemplo, DNA quimicamente sintetizado, DNA amplificado por PCR, DNA modificado, polinucleotídeos compre- endendo análogos de nucleosídeos, etc). Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para produzir scVACVs funcionais a partir de fragmentos de DNA de fita dupla sobrepostos quimicamente sinteti- zados do genoma viral. Os polinucleotídeos dos vários aspectos da invenção podem ser desenhados com base em sequências de geno- ma publicamente disponíveis. Quando isolados naturais de um vírus vaccinia estão prontamente disponíveis, o genoma viral pode ser se- quenciado antes de selecionar e desenhar os polinucleotídeos da des- crição. Alternativamente, quando estão disponíveis sequências parci- ais de DNA de um vírus vaccinia, por exemplo, a partir de um isolado clínico, a partir de uma amostra forense ou de DNA amplificado por

PCR a partir de material associado a uma pessoa infectada, o genoma viral parcial pode ser sequenciado antes de selecionar e desenhar os polinucleotídeos da descrição. Em um aspecto, um scVACV da inven- ção, e dessa forma, os polinucleotídeos da presente descrição, pode basear-se nas sequências genômicas de cepas, variantes ou mutantes de ocorrência natural, vírus mutagenizados ou vírus geneticamente modificados.

[0093] Em um aspecto, a invenção fornece polinucleotídeos isola- dos, incluindo uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93% ou 94% idêntica), pelo menos 95% idêntica (por exemplo, pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica), ou 100 % idêntica à totalidade ou a uma parte de uma sequência de genoma VACV de referência ou do seu comple- mento. Os polinucleotídeos isolados da divulgação podem incluir pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000 bp ou mais nucleotídeos contíguos ou não contíguos de uma molécula de polinucleotídeo de referência (por exemplo, um genoma VACV de referência ou um fragmento do mesmo). Um versado na téc- nica irá apreciar que as sequências de ácidos nucleicos complementa- res aos ácidos nucleicos e as variantes dos ácidos nucleicos também estão no escopo desta aplicação. Em outras modalidades, as sequên- cias de ácidos nucleicos da descrição podem ser isoladas, recombi- nantes e/ou fundidas com uma sequência de nucleotídeos heterólo- gos, ou em uma biblioteca de DNA.

[0094] Em alguns aspectos, a invenção fornece polinucleotídeos para a produção de scVACVs, onde o VACV é selecionado a partir das seguintes cepas: Western Reserve, Clone 3, Tian Tian, Tian Tian clo- ne TP5, Tian Tian clone TP3, NYCBH, NYCBH clone Acambis 2000,

Wyeth, Copenhagen, Lister, Lister 107, Lister-LO, Lister GL-ONC1, Lister GL-ONC?2, Lister GL-ONC3, Lister GL-ONCA4, Lister CTC1, Lister IMG2 (Turbo FP635), IHD-W, LC16m18, Lederle, Tashkent clone TKT3, Tashkent clone TKT4, USSR, Evans, Praha, L-IVP, V-VET1 ou LIVP 6.1.1, Ikeda, EM-63, Malbran, Duke, 3737, CV-1, Connaught La- boratories, Serro 2, CM-01, NYCBH Dryvax clone DPP13, NYCBH Dryvax clone DPP15, NYCBH Dryvax clone DPP20, NYCBH Dryvax clone DPP17, NYCBH Dryvax clone DPP21, VACV-IOC, Chorioallan- tois Vaccinia vírus Ankara (CVA), vaccinia Ankara modificada (MVA) e MVA-BN. Em modalidade preferencial, o s0VACV é derivado da cepa NYCBH clone Acambis 2000 ou ACAM2000.

[0095] Em um aspecto, a invenção fornece polinucleotídeos para produzir um vírus vaccinia quimérico sintético (SCVACV). Em uma mo- dalidade específica, o genoma do scVACV pode ser baseado na se- quência de genoma publicada descrita para a cepa de VACV NYCBH clone ACAM2000 (Genbank, nº de acesso AY313847; Osborne JD et al. Vaccine. 2007; 25(52):8807-32). É mostrado nos vários aspectos da presente invenção que os hairpin loops terminais do vírus vaccinia (VACV) cepa WR podem ser ligados às extremidades da cepa do ge- noma de VACV NYCBH clone ACAM2000 para produzir partículas SscVACV funcionais usando os métodos da descrição. Em algumas modalidades, os hairpin loops terminais da cepa do vírus vaccinia (VACV) ACAM2000 podem ser ligados às extremidades da cepa do genoma de VACV NYCBH clone ACAM2000 para produzir partículas de scVACV funcionais usando os métodos de descrição. O genoma do SscVACV pode ser dividido em 9 fragmentos sobrepostos, conforme descrito nos exemplos de trabalho da descrição e mostrado na Tabela

1. Em algumas modalidades, o genoma de VACV pode ser dividido em 2,3,4,5,6,7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 fragmentos sobrepostos. Em algumas modalidades, todo o genoma pode ser fornecido como um fragmento. Os tamanhos do fragmento são mostrados na Tabela 1. Em algumas modalidades, o genoma de VACV pode ser dividido em 2, 3,4,5,6,7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 fragmentos sobrepostos. Em algumas modalidades, todo o genoma pode ser fornecido como um fragmento. Os tamanhos do fragmento são mostrados na Tabela 1. Os polinucleotídeos dos vários aspectos da invenção compreendem se- quências de ácidos nucleicos que são pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas com as SEQ ID NOs: 1-9. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo isolado da invenção compreende uma variante destas sequências, em que tais variantes podem incluir mutações de sentido trocado, mutações sem sentido, duplicações, deleções e/ou adições. SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14 representam as sequências nucleotídicas dos hairpin loops terminais VACV (cepa WR). SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20 representam as sequências de nucleotídeos dos hairpin loops terminais de VACV (cepa ACAM2000). Em algumas modalidades, os hairpin loops terminais compreendem sequências de ácidos nucleicos que são pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas com a SEQ ID NO: 13 ou com a SEQ ID NO: 14. Em algumas modali- dades, os hairpin loops terminais compreendem sequências de ácidos nucleicos que são pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas com a SEQ ID NO: 19 ou com a SEQ ID NO: 20.

[0096] Em outras modalidades, o genoma do scVACV é baseado em uma cepa selecionada de uma cepa VACV selecionada de Wes- tern Reserve (Genbank, nº de acesso NC 006998; Genbank, nº de acesso AY243312), CL3 (Genbank, nº de acesso AY313848), Tian Ti- an (Genbank, nº de acesso AFO95689.1), clones de Tian Tian TP5 (JX489136), TP3 (Genbank, nº de acesso KC207810) e TP5 (Gen-

bank, nº de acesso KC207811), NYCBH, Wyeth, Copenhagen (Gen- bank, nº de acesso M35027), NYCBH clone Acambis 2000 (Genbank, nº de acesso AY313847), Lister 107 (Genbank, nº de acesso DQ121394) Lister-LO (Genbank, nº de acesso AY678276), vírus vac- cinia modificado Ankara (MVA) (Genbank, nº de acesso U94848; Gen- bank, nº de acesso AY603355), MVA-BN (Genbank, nº de acesso DQ983238), Lederle, Tashkent clones TKT3 (Genbank, nº de acesso KMO44309) e TKT4 (KMO044310), USSR, Evans, Praha, LIVP, Ikeda, IHD-W (Genbank, nº de acesso KJ125439), LC16m8 (AY678275), EM- 63, IC, Malbran, Duke (Genbank, nº de acesso DQ439815), 3737 (Genbank, nº de acesso DQ377945), VACV-IOC (Genbank, nº de acesso KT184690 e KT184691), CV-1, Connaught Laboratories, CVA (Genbank, nº de acesso AM501482), vírus Serro 2 (Genbank, nº de acesso KF179385), isolado do vírus Cantaglo CM-01 (Genbank, nº de acesso KT013210), Dryvax clones DPP15 (Genbank, nº de acesso JN654981), DPP20 (Genbank, nº de acesso JN654985), DPP13 (Gen- bank, nº de acesso JN654980), DPP17(Genbank, nº de acesso JN654983), DPP21 (Genbank, nº de acesso JN654986).

[0097] Em um aspecto, a invenção fornece polinucleotídeos isola- dos, incluindo uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica (por exemplo, pelo menos 91%, 92%, 93% ou 94% idêntica), pelo menos 95% idêntica (por exemplo, pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica), ou 100 % idêntica à totalidade ou a uma parte de uma sequência de genoma de wtVACV de referência. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo isolado da descrição compreende uma variante das sequências de referência, em que tais variantes po- dem incluir mutações de sentido trocado, mutações sem sentido, du- plicações, deleções e/ou adições. Em algumas modalidades, os poli- nucleotídeos isolados da descrição podem incluir pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600,

700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000 bp ou mais nucleotídeos contíguos ou não contíguos de uma molécula de polinu- cleotídeo de referência (por exemplo, um genoma de wtVACV de refe- rência).

[0098] Os polinucleotídeos complementares a quaisquer umas das sequências de polinucleotídeos são também abrangidos pelo presente pedido. Os polinucleotídeos podem ser de fita simples (codificação ou antisenso) ou de fita dupla, e podem ser moléculas de DNA (genômico ou sintético) ou de RNA. As moléculas de RNA incluem moléculas MRNA. Codificação adicional ou sequências não codificantes podem, mas não precisam estar presentes, dentro de um polinucleotídeo da presente descrição, e um polinucleotídeo pode, mas não precisa, ser ligado a outras moléculas e/ou materiais de apoio.

[0099] Duas sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeo são ditas como sendo "idênticas" se a sequência de nucleotídeos ou ami- noácidos nas duas sequências for a mesma quando alinhadas para a máxima correspondência como descrito abaixo. Comparações entre duas sequências são tipicamente realizadas comparando as sequên- cias sobre uma janela de comparação para identificar e comparar as regiões locais de similaridade de sequência. Uma "janela de compara- ção" como utilizada aqui se refere a um segmento de pelo menos cer- ca de 20 posições contíguas, normalmente 30 para cerca de 75 ou 40 para cerca de 50, em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas de- pois que as duas sequências estão perfeitamente alinhadas. Os poli- nucleotídeos ou variantes podem também, ou alternativamente, ser substancialmente homólogos de um polinucleotídeo fornecido aqui. Tais variantes de polinucleotídeos são capazes de hibridizar em condi- ções moderadamente rigorosas a um polinucleotídeo da descrição (ou seu complemento).

[00100] "Condições de estringência moderada" adequadas incluem pré-lavagem em uma solução de 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hibridização a 50 ºC - 65 ºC, 5X SSC, durante a noite; segui- do por lavagem duas vezes a 65ºC por 20 minutos com cada um de 2X, 0,5X e 0,2X SSC contendo 0,1% SDS.

[00101] Como usado aqui, "condições altamente estringentes" ou "condições de alta estringência" são aquelas que: (1) empregam força iônica baixa e alta temperatura para lavar, por exemplo, 0,015 M clore- to de sódio / 0,0015M citrato de sódio/0,1% dodecil sulfato a 50 ºC; (2) empregam durante a hibridação agentes de desnaturação como for- mamida, por exemplo, 50% (v/v) formamida com 0,1% albumina sérica bovina/0,1% Ficoll/ 0,1% polivinilpirrolidona/ 50 mM tampão fosfato de sódio, pH 6,5 com 750 mM cloreto de sódio, 75 mM citrato de sódio a 42 ºC; ou (3) empregam 50% formamida, 5X SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citrato de sódio), 50 mM fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% pirofosfato de sódio, 5X solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão soni- cado (50 ug/ml), 0,1% SDS e 10% sulfato de dextrano a 42 ºC, com lavagens a 42 ºC em 0,2X SSC (cloreto de sódio/ citrato de sódio) e 50% formamida a 55 ºC, seguida de uma lavagem de alta estringência consistindo de 0,1X SSC contendo EDTA a 55 ºC. O versado na técni- ca irá reconhecer como ajustar a temperatura, força iônica, etc. con- forme necessário para acomodar fatores como comprimento da sonda e similares.

[00102] Os polinucleotídeos dessa descrição podem ser obtidos usando síntese química, métodos recombinantes, ou PCR. Métodos de síntese de polinucleotídeos químicos são bem conhecidos na técni- ca e não precisam ser descritos em detalhes aqui. Um profissional versado na técnica pode usar as sequências fornecidas aqui e um pro- vedor de sintetizador de DNA comercial para produzir uma sequência de DNA desejada.

[00103] Para preparar polinucleotídeos utilizando métodos recombi- nantes, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência desejada pode ser inserido em um vetor, e o vetor, por sua vez, pode ser intro- duzido em uma célula hospedeira para replicação e amplificação, co- mo discutido aqui. Os polinucleotídeos podem ser inseridos em células hospedeiras por qualquer meio conhecido na técnica. As células são transformadas pela introdução de um polinucleotídeo exógeno por ab- sorção direta, endocitose, transfecção, acasalamento F ou eletropora- ção. Uma vez introduzida, o polinucleotídeo exógeno pode ser mantido dentro da célula como um vetor não integrado (como um plasmídeo) ou integrado no genoma da célula hospedeira. O polinucleotídeo am- plificado desse modo pode ser isolado a partir da célula hospedeira por métodos bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989.

[00104] Alternativamente, a POR permite a reprodução de sequên- cias de DNA. A tecnologia de PCR é bem conhecida na técnica e é descrita na Patente US Nº 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 e

4.683.202, bem como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.

[00105] O RNA pode ser obtido usando o DNA isolado em um vetor apropriado e inserindo ele em uma célula hospedeira adequada. Quando a célula se replica e o DNA é transcrito em RNA, o RNA pode, então, ser isolado usando métodos bem conhecidos pelos versados na técnica, conforme estabelecido em Sambrook et al., 1989, supra, por exemplo.

[00106] Em outras modalidades, os ácidos nucleicos da invenção também incluem sequências de nucleotídeos que hibridizam sob con- dições altamente rigorosas para as sequências de nucleotídeos esta- belecidas nas SEQ ID NOs: 1-9, ou suas sequências complementares.

Um versado na técnica compreenderá prontamente que as condições apropriadas da estringência que promovem hibridação do DNA podem ser variadas. Por exemplo, pode-se realizar a hibridização a 6,0 x clo- reto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 ºC, seguida de uma lavagem de 2,0 x SSC a 50 ºC. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma baixa estringência de cerca de 2,0 x SSC a 50 ºC para uma elevada estringência de cerca de 0,2 x SSC a 50 ºC. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de condições de baixa estringência à temperatura ambiente, cerca de 22 ºC, para condições de alta estringência a cerca de 65 ºC. Tanto a temperatura como o sal podem ser variados, ou a temperatura ou a concentração de sal podem ser mantidas constantes enquanto a outra variável é alterada. Em uma modalidade, a invenção fornece ácidos nucleicos que hibridizam em condições de baixa estrin- gência de 6 x SSC à temperatura ambiente, seguido de uma lavagem a 2 x SSC à temperatura ambiente.

[00107] Os ácidos nucleicos isolados, que diferem devido à degene- rescência do código genético, estão também no escopo de alguns as- pectos da invenção. Por exemplo, vários aminoácidos são designados por mais de um tripleto. Os códons que especificam o mesmo aminoá- cido, ou sinônimos (por exemplo, CAU e CAC são sinônimos de histi- dina) podem resultar em mutações "silenciosas" que não afetam a se- quência de aminoácidos da proteína. Um versado na técnica compre- enderá que estas variações em um ou mais nucleotídeos (até cerca de 3-5% dos nucleotídeos) dos ácidos nucleicos que codificam uma de- terminada proteína podem existir entre os membros de uma determi- nada espécie devido à variação alélica natural. Todas e quaisquer va- riações de nucleotídeos e polimorfismos de aminoácidos resultantes estão dentro do escopo deste pedido.

[00108] Um aspecto da presente invenção fornece ainda vetores recombinantes de clonagem e vetores de expressão que são úteis na clonagem de um polinucleotídeo da presente descrição. Um aspecto da presente invenção fornece ainda células hospedeiras transforma- das, compreendendo uma molécula de polinucleotídeo ou um vetor recombinante, e novas linhagens ou linhagens celulares derivadas de- la.

[00109] Uma célula hospedeira pode ser uma célula bacteriana, uma célula de levedura, uma célula fúngica filamentosa, uma célula de algas, uma célula de inseto ou uma célula de mamíferos. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é E. coli. Uma variedade de vetores diferentes foi desenvolvida para uso específico em cada uma dessas células hospedeiras, incluindo fago, plasmídeos de número de cópias altas, plasmídeos de número de cópias baixas e vetores de transporte, entre outros, e qualquer um deles pode ser usado para praticar a pre- sente descrição.

[00110] Vetores de clonagem adequados podem ser construídos de acordo com as técnicas padrão, ou podem ser selecionados a partir de um grande número de vetores de clonagem disponível na técnica. En- quanto o vetor de clonagem selecionado pode variar de acordo com a célula hospedeira destinada a ser usada, os vetores de clonagem úteis geralmente terão a capacidade de se autorreplicar, pode possuir um único alvo para uma determinada endonuclease de restrição, e/ou po- de transportar genes para um marcador que pode ser usado na sele- ção de clones contendo o vetor. Os exemplos adequados incluem plasmídeos e vírus bacterianos, como, por exemplo, pBAD18, pUC18, PUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK+) e seus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, DNAs de fago e vetores de transporte, como pSA3 e pAT28. Estes e muitos outros vetores de clo- nagem estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais como BioRad, Stratagene e Invitrogen.

[00111] Para auxiliar na seleção de células hospedeiras transfor- madas ou transfectadas com vetores de clonagem da presente descri- ção, o vetor pode ser modificado para incluir ainda uma sequência de codificação para um produto do gene repórter ou outro marcador sele- cionável. Tal sequência de codificação está, de preferência, em asso- ciação operacional com as sequências de codificação dos elementos regulatórios, conforme descrito acima. Genes repórter que são úteis em alguns aspectos da presente invenção são bem conhecidos na técnica e incluem aqueles que codificam a proteína verde fluorescente, a luciferase, xylE e tirosinase, entre outros. As sequências de nucleo- tídeos que codificam marcadores selecionáveis são bem conhecidas na técnica e incluem aquelas que codificam produtos gênicos que con- ferem resistência a antibióticos ou anti-metabólitos, ou que fornecem um requisito auxotrófico. Exemplos dessas sequências incluem aque- las que codificam a resistência à ampicilina, eritromicina, tiostreptona ou canamicina, entre muitos outros.

[00112] Os vetores contendo os polinucleotídeos de interesse e/ou os próprios polinucleotídeos podem ser introduzidos na célula hospe- deira por qualquer um de uma série de meios adequados, incluindo eletroporação, transfecção empregando cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, ou outras substâncias; bombardeio de microprojéteis; lipofecção; e infecção (por exemplo, em que o vetor é um agente infeccioso, como vírus vaccinia). A escolha da introdução de vetores ou polinucleotídeos dependerá frequentemente nas características da célula hospedeira.

[00113] Um aspecto da presente invenção fornece ainda células hospedeiras transformadas, compreendendo uma molécula de polinu- cleotídeo ou um vetor recombinante, e novas linhagens ou linhagens celulares derivadas dela. Em algumas modalidades, as células hospe- deiras úteis na prática da invenção são células de E. coli. Normalmen-

te, pode ser usada uma cepa de E. coli, como, por exemplo, E. coli TOP10 ou E. coli BL21 (DE3), DH5a, etc, disponível na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, Va., 20110, EUA e a partir de fontes comerciais. Em algumas modalidades, outras células procarióticas ou células eucarióticas podem ser usadas. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é um membro de um gênero selecionado dentre: Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Serratia, Erwinia, Klebsiella, Shigella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Pa- enibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Schizo- saccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia, Pichia, Candida, Pichia, ou Saccharomyces. Essas células hospedeiras transformadas normal- mente incluem, mas não se limitam a, microorganismos, como bacté- rias transformadas com DNA de bacteriofago recombinante, DNA de plasmídeo ou vetores de DNA de cosmídeo, ou levedura transformada com vetores recombinantes, entre outros. As células hospedeiras eu- carióticas preferidas incluem células de levedura, embora células de mamíferos ou células de insetos também possam ser usadas de forma eficaz. As células hospedeiras adequadas incluem procariotas (como E. coli, B. subtillis, S. lividans ou C. glutamicum) e leveduras (como S. cerevisae, S. pombe, P. pastoris ou K. lactis).

[00114] Em um aspecto, a invenção também inclui o genoma do SCVACV, suas partes recombinantes ou funcionais do mesmo. Uma parte funcional do genoma viral pode ser uma parte do genoma que codifica uma proteína ou uma porção da mesma (por exemplo, domí- nio, epitopo, etc), uma porção que inclui elementos regulatórios ou componentes de elementos regulatórios, como um promotor, um po- tenciador, elementos de ação cis ou trans, etc. Estas sequências virais podem ser usadas para identificar ou isolar o vírus ou as suas recom- binantes, por exemplo, através da utilização de PCR, tecnologias de hibridação ou através da determinação de ensaios ELISA. Composição farmacêutica da descrição

[00115] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo o scVACV da descrição e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00116] O termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na farmacopeia dos EUA ou outras farmacopeias geralmente reconhe- cidas para uso em animais, e, mais particularmente, em seres huma- nos. O termo "carreador" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual é administrada a composição farmacêutica (por exemplo, a formulação imunogênica ou a formulação da vacina). As soluções salinas e dextrose aquosa e soluções de glicerol também po- dem ser empregadas como carreadores de líquidos, especialmente para soluções injetáveis. Excipientes adequados incluem, por exem- plo, amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, talco, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e similares. Exemplos de carreadores farmaceuticamente adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin. A formulação deve ser adaptada ao modo de adminis- tração.

[00117] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica da invenção pode ser administrada por vias padrão de administração. Muitos métodos podem ser usados para introduzir as formulações em um indivíduo, incluindo, entre outros, vias intranasais, intratraqueais, orais, intradérmicas, intramusculares, intraperitoneais, intravenosas, conjuntivais e subcutâneas. Usos exemplificadores

[00118] Prevenção ou tratamento de infecções poxvirais patogêni-

cas

[00119] Em algumas modalidades, os vírus vaccinia quiméricos sin- téticos (scVACVs) da invenção podem ser usados na imunização ou para desencadear ou impulsionar uma resposta imune de um indivíduo contra uma infecção patogênica poxviral. Em outra modalidade, os SCVACVs podem ser usados para desencadear ou impulsionar uma resposta imune contra um vírus vaccinia. Em outra modalidade, os SCVACVs podem ser usados para desencadear ou impulsionar uma resposta imune contra um vírus da varíola. Em outra modalidade, os SCVACVs podem ser usados para desencadear ou impulsionar uma resposta imune contra um vírus da varíola de macaco. Em outra moda- lidade, os secVACVs podem ser usados para prevenir, gerenciar ou tra- tar uma ou mais infecções poxvirais patogênicas em um indivíduo, como para tratar uma infecção pelo vírus da varíola. Em algumas mo- dalidades, os scVACVs são selecionados a partir das seguintes cepas de vírus vaccinia: Western Reserve, Clone 3, Tian Tian, Tian Tian clo- ne TP5, Tian Tian clone TP3, NYCBH, NYCBH clone Acambis 2000, Wyeth, Copenhagen, Lister, Lister 107, Lister-LO, Lister GL-ONC1, Lister GL-ONC?2, Lister GL-ONC3, Lister GL-ONCA4, Lister CTC1, Lister IMG2 (Turbo FP635), IHD-W, LC16m18, Lederle, Tashkent clone TKT3, Tashkent clone TKT4, USSR, Evans, Praha, L-IVP, V-VET1 ou LIVP 6.1.1, Ikeda, EM-63, Malbran, Duke, 3737, CV-1, Connaught La- boratories, Serro 2, CM-01, NYCBH Dryvax clone DPP13, NYCBH Dryvax clone DPP15, NYCBH Dryvax clone DPP20, NYCBH Dryvax clone DPP17, NYCBH Dryvax clone DPP21, VACV-IOC, Chorioallan- tois Vaccinia vírus Ankara (CVA), vaccinia Ankara modificada (MVA) e MVA-BN. Em modalidade preferencial, o s0VACV é derivado da cepa NYCBH clone Acambis 2000 ou ACAM2000.

[00120] Em um aspecto, os scVACVs da invenção podem ser usa- dos em formulações imunogênicas, por exemplo, formulações de vaci-

nas. As formulações podem ser usadas para prevenir, gerenciar, neu- tralizar, tratar e/ou amenizar uma infecção poxviral patogênica. As formulações imunogênicas podem incluir um scVACV vivo ou inativa- do. O scVACV pode ser inativado por métodos bem conhecidos para o versado na técnica. Os métodos comuns usam formalina e calor para inativação. Em algumas modalidades, a formulação imunogênica com- preende uma vacina viva. A produção dessas formulações imunogêni- cas vivas pode ser realizada usando métodos convencionais que en- volvem a propagação dos scVACVs na cultura de células, seguida de purificação. Por exemplo, os scVACVs podem ser cultivados em BHK, BGMK, BRL3A, BSC-40, CEF, CEK, CHO, COS, IVC, HaCT, HEL, cé- lulas HeLa, HEK293, linhagem celular de osteossarcoma ósseo huma- no 143B, MDCK, NIH/3T3, células Vero, etc, conforme determinado pelo trabalhador habilitado.

[00121] Em um aspecto, os scVACVs da invenção podem ser usa- dos para prevenir, gerenciar ou tratar a varíola. Em outro aspecto, os SscVACVs da invenção podem ser usados como uma vacina para a prevenção da varíola em indivíduos ou populações que tenham sido expostos, potencialmente expostos ou que estejam em risco de expo- sição à varíola. Os scVACVs dos vários aspectos da invenção podem ser usados para criar um novo estoque nacional de vacinas contra a varíola. Em algumas modalidades, os scVACVs da invenção podem ser administrados profilaticamente ao pessoal de defesa, primeiros a responder, etc.

[00122] Em uma modalidade, uma composição compreendendo um SscVACV da invenção é usada como uma vacina contra a varíola. Em um aspecto, o scVACV da invenção produzido de acordo com os mé- todos da descrição terá um fenótipo pequeno da placa. Em geral, um fenótipo pequeno de placa é considerado como reflexo da atenuação. Assim, um scVACV produzido de acordo com os vários métodos da invenção fornece uma alternativa segura às vacinas existentes para a varíola.

Em algumas modalidades, a vacina pode ser segura para a administração de indivíduos imunossuprimidos (por exemplo, pacien- tes com VIH, pacientes submetidos a quimioterapia, pacientes subme- tidos a tratamento por câncer, doenças reumatológicas, ou doenças autoimunes, pacientes que estão ou receberam transplante de órgãos ou tecidos, pacientes com deficiências imunológicas, crianças, gestan- tes, pacientes com dermatite atópica, eczema, psoríase, condições cardíacas e pacientes com imunossupressores, etc), quem pode sofrer de complicações graves de uma vacina contra a varíola existente e, portanto, está contraindicado para uma vacina contra a varíola existen- te.

Em algumas modalidades, a vacina pode ser usada em combina- ção com um ou mais tratamentos antivirais para suprimir a replicação viral.

Em algumas modalidades, a vacina pode ser usada em combina- ção com o tratamento com brincidofovir para suprimir a replicação vi- ral.

Em algumas modalidades, a vacina pode ser usada em combina- ção com o tratamento com tecovirimat/SIGA-246 para suprimir a repli- cação viral.

Em algumas modalidades, a vacina pode ser usada em combinação com fosfonatos nucleosídeos acíclicos (cidofovir), profár- macos aloxialquílicos orais de nucleosídeos acíclicos ou fosfonatos (brincidofovir ou CMX001). Em algumas modalidades, a vacina pode ser usada em combinação com Vaccinia Immune Globulin (VIG). Em algumas modalidades, a vacina pode ser usada em indivíduos previa- mente imunizados com peptídeos ou antígenos proteicos derivados de VACV, VARV ou HPXV.

Em algumas modalidades, a vacina pode ser usada em indivíduos previamente imunizados com VACV morto ou inativado.

Em algumas modalidades, a vacina pode ser usada em indi- víduos previamente imunizados com a cepa do vírus VACV defeituo- so/deficiente de replicação, MVA (vírus Ankara modificado). Em algu- mas modalidades, uma formulação da vacina compreendendo um scVACV da invenção pode incluir um scVACV vivo ou inativado.

[00123] Em uma modalidade, uma composição compreendendo um ScVACV da descrição é usada como uma vacina contra a varíola. O SCcVACV pode ser baseado em uma cepa de VACV selecionada de ACAMZ2Z000 (Genbank, nº de acesso AY313847), Western Reserve (Genbank, nº de acesso NC 006998; Genbank, nº de acesso AY243312), CL3 (Genbank, nº de acesso AY313848), Tian Tian (Gen- bank, nº de acesso AFO95689.1), clones de Tian Tian TP5 (JX489136), TP3 (Genbank, nº de acesso KC207810) e TP5 (Gen- bank, nº de acesso KC207811), NYCBH, Wyeth, Copenhagen (Gen- bank, nº de acesso M35027), NYCBH clone Acambis 2000 (Genbank, nº de acesso AY313847), Lister 107 (Genbank, nº de acesso DQ121394) Lister-LO (Genbank, nº de acesso AY678276), vírus vac- cinia modificado Ankara (MVA) (Genbank, nº de acesso U94848; Gen- bank, nº de acesso AY603355), MVA-BN (Genbank, nº de acesso DQ983238), Lederle, Tashkent clones TKT3 (Genbank, nº de acesso KMO44309) e TKT4 (KMO044310), USSR, Evans, Praha, LIVP, Ikeda, IHD-W (Genbank, nº de acesso KJ125439), LC16m8 (AY678275), EM- 63, IC, Malbran, Duke (Genbank, nº de acesso DQ439815), 3737 (Genbank, nº de acesso DQ377945), CV-1, Connaught Laboratories, CVA (Genbank, nº de acesso AM501482), vírus Serro 2 (Genbank, nº de acesso KF179385), isolado do vírus Cantaglo CM-01 (Genbank, nº de acesso KT013210), Dryvax clones DPP15 (Genbank, nº de acesso JN654981), DPP20 (Genbank, nº de acesso JN654985), DPP13 (Gen- bank, nº de acesso JN654980), DPP17(Genbank, nº de acesso JN654983), DPP21 (Genbank, nº de acesso JN654986) e IOC (Gen- bank, nº de acesso KT184690 e KT184691) Em uma modalidade, o SCcVACV a ser usado como uma vacina contra varíola é baseado na cepa ACAM2000 (Genbank, nº de acesso AY313847). Em uma moda- lidade, o SscVACV a ser usado como vacina contra varíola é baseado na cepa VACV-IOC (Genbank, nº de acesso KT184690 e KT184691). Em uma modalidade, o scVACV a ser usado como uma vacina contra a varíola é baseado na cepa MVA (Genbank, nº de acesso U94848; Genbank, nº de acesso AY603355). Em uma modalidade, o scVACV a ser usado como uma vacina contra varíola é baseado na cepa MVA- BN (Genbank, nº de acesso DQ983238). Em algumas modalidades, uma formulação da vacina compreendendo um scVACV da descrição pode incluir um scVACV vivo ou inativado.

[00124] Em algumas modalidades, uma composição compreenden- do um scVACV da invenção é usada como uma vacina contra uma in- fecção por VACV, uma infecção por MPXV ou uma infecção por CPXV.

[00125] Em algumas modalidades, um scVACV da invenção pode ser desenhado para expressar antígenos ou epitopos heterólogos e pode ser usado como vacinas contra os organismos de origem desses antígenos e/ou epitopos.

[00126] As formulações imunogênicas da presente descrição (por exemplo, vacinas) compreendem uma quantidade eficaz do scVACV e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agên- cia reguladora do governo federal ou estadual ou listado na farmaco- peia dos EUA ou outras farmacopeias geralmente reconhecidas para uso em animais, e, mais particularmente, em seres humanos. O termo "carreador" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual é administrada a composição farmacêutica (por exemplo, a formulação imunogênica ou a formulação da vacina). As soluções sali- nas e dextrose aquosa e soluções de glicerol também podem ser em- pregadas como carreadores de líquidos, especialmente para soluções injetáveis. Excipientes adequados incluem, por exemplo, amido, glico- se, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, talco, sílica gel,

estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e simila- res. Exemplos de carreadores farmaceuticamente adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin. A formulação deve ser adaptada ao modo de administração. A formu- lação específica pode também depender do fato de o scVACV estar vivo ou não ativado. Em algumas modalidades, os scVACVs purifica- dos da invenção podem ser liofilizados para uso posterior ou podem ser imediatamente preparados em uma solução farmacêutica. Os scVACVs também podem ser diluídos em uma solução fisiologicamen- te aceitável, como solução salina, com ou sem adjuvante ou carreador.

[00127] Em um aspecto, as formulações imunogênicas (por exem- plo, vacinas) da invenção podem ser administradas aos pacientes por escarificação. As vacinas também podem ser administradas por qual- quer outra via padrão de administração. Muitos métodos podem ser usados para introduzir as formulações imunogênicas (p.ex., vacinas), essas incluindo, entre outros, vias intranasais, intratraqueais, orais, intradérmicas, intramusculares, intraperitoneais, intravenosas, conjun- tivais e subcutâneas. Em aves, os métodos podem incluir ainda inocu- lação de coanal. Como alternativa à administração parenteral, um as- pecto da invenção também abrange vias de administração de massa para fins agrícolas, como via água potável ou em spray. Alternativa- mente, pode ser preferível introduzir um scVACV da descrição através da sua via natural de infecção. Em algumas modalidades, as formula- ções imunogênicas da invenção são administradas como um líquido injetável, uma planta transgênica consumível que expressa a vacina, um gel de liberação sustentada ou uma composição encapsulada im- plantável, um implante sólido ou um ácido nucleico. A formulação imu- nogênica também pode ser administrada em um creme, loção, poma- da, remendo cutâneo, losango ou líquido oral, como uma suspensão,

solução e emulsão (óleo em água ou água no óleo). A via de adminis- tração aceita para a replicação viva da vacina contra a varíola é a es- carificação dérmica, que gera uma lesão de derramamento de vírus que persiste por vários dias no local da vacinação. A lesão é uma fonte potencial de transmissão de contato da vacina para indivíduos que possam estar contraindicados para receber a vacina viva. Portanto, a administração intramuscular da formulação imunogênica pode propor- cionar uma vantagem. Em uma modalidade preferencial, a administra- ção do scVACV ACAMZ2000 é intramuscular. Em outra modalidade preferida, a administração é por escarificação dérmica. A administra- ção intramuscular também pode ser usada para outros ortopoxvírus quiméricos sintéticos, como o vírus quimérico sintético da varíola equi- na (scHPXV). No caso da administração intramuscular, é importante usar uma agulha com o comprimento correto para atingir a massa muscular e não penetrar no tecido subcutâneo. Ao administrar injeções intramusculares, a agulha deve ser inserida em um ângulo de 90º.

[00128] Em certas modalidades, uma formulação imunogênica da descrição (por exemplo, vacina) não resulta em uma proteção comple- ta contra uma infecção, mas resulta em uma titulação mais baixa ou em um número reduzido do agente patogênico (por exemplo, poxvírus patogênico) em comparação com um indivíduo não tratado. Em certas modalidades, a administração das formulações imunogênicas da des- crição resulta em 0,5 vezes, | vez, 2 vezes, 4 vezes, 6 vezes, 8 vezes, vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 75 vezes, 100 ve- zes, 125 vezes, 150 vezes, 175 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 ve- zes, 500 vezes, 750 vezes ou 1.000 vezes ou maior redução na titula- ção do agente patogênico em relação a um indivíduo não tratado. Os benefícios de uma redução na titulação, número ou carga total do pa- tógeno incluem, mas não se limitam a, menos gravidade dos sintomas da infecção e uma redução no comprimento da doença ou condição associada à infecção.

[00129] Em certas modalidades, uma formulação imunogênica da descrição (por exemplo, vacina) não resulta em uma proteção comple- ta contra uma infecção, mas resulta em número mais baixo de sinto- mas ou uma diminuição da intensidade dos sintomas, ou uma diminui- ção da morbidade ou uma diminuição da mortalidade em comparação com um indivíduo não tratado.

[00130] Em várias modalidades, as formulações imunogênicas da invenção (por exemplo, vacinas) ou os anticorpos gerados pelos ScVACVs da descrição são administrados a um indivíduo em combina- ção com uma ou mais outras terapias (por exemplo, terapias antivirais ou imunomodulatórias) para a prevenção de uma infecção (por exem- plo, uma infecção patogênica poxviral). Em outras modalidades, as formulações imunogênicas ou anticorpos gerados pelos scVACVs da invenção são administrados a um indivíduo em combinação com uma ou mais outras terapias (por exemplo, terapias antivirais ou imunomo- dulatórias) para o tratamento de uma infecção (por exemplo, uma in- fecção patogênica poxviral). Em ainda outras modalidades, as formu- lações imunogênicas ou anticorpos gerados pelos scVACVs da inven- ção são administrados a um indivíduo em combinação com uma ou mais outras terapias (por exemplo, terapias antivirais ou imunomodu- ladoras) para o manejo e/ou melhora de uma infecção (por exemplo, uma infecção patogênica poxviral). Em uma modalidade específica, as formulações imunogênicas ou anticorpos gerados pelos scVACVs da invenção são administrados a um indivíduo em combinação com uma ou mais outras terapias (por exemplo, terapias antivirais ou imunomo- duladoras) para a prevenção de varíola. Em outra modalidade especí- fica, as formulações imunogênicas ou anticorpos gerados pelos SscVACVs da invenção são administrados a um indivíduo em combina- ção com uma ou mais outras terapias (por exemplo, terapias antivirais ou imunomoduladoras) para o tratamento de varíola. Em algumas mo- dalidades, a vacina pode ser usada em combinação com um ou mais tratamentos antivirais para suprimir a replicação viral. Em algumas modalidades, a vacina pode ser usada em combinação com o trata- mento com brincidofovir para suprimir a replicação viral. Em algumas modalidades, a vacina pode ser usada em combinação com o trata- mento com tecovirimat/SIGA-246 para suprimir a replicação viral. Em algumas modalidades, a vacina pode ser usada em combinação com fosfonatos nucleosídeos acíclicos (cidofovir), profármacos aloxialquíli- cos orais de nucleosídeos acíclicos ou fosfonatos (brincidofovir ou CMX001). Em algumas modalidades, a vacina pode ser usada em combinação com Vaccinia Immune Globulin (VIG). Em algumas moda- lidades, a vacina pode ser usada em indivíduos previamente imuniza- dos com peptídeo ou antígenos proteicos derivados de VACV, VARV ou HPXV. Em algumas modalidades, a vacina pode ser usada em in- divíduos previamente imunizados com VACV morto ou inativado. Em algumas modalidades, a vacina pode ser usada em indivíduos previa- mente imunizados com a cepa do vírus VACV defeituoso/deficiente de replicação, MVA (vírus Ankara modificado).

[00131] Qualquer agente antiviral bem conhecido por um versado na técnica pode ser usado nas formulações (por exemplo, formulações de vacinas) e nos métodos dos vários aspectos da invenção. Exem- plos não limitantes de agentes antivirais incluem proteínas, polipeptí- deos, peptídeos, anticorpos de proteínas de fusão, moléculas de ácido nucleico, moléculas orgânicas, moléculas inorgânicas e pequenas mo- léculas que inibem e/ou reduzem a fixação de um vírus ao seu recep- tor, a internalização de um vírus em uma célula, a replicação de um vírus, ou liberação de vírus de uma célula. Em particular, os agentes antivirais incluem, entre outros, antivirais que bloqueiam a maturação do vírus extracelular (tecovirimat/SIMA-246), os fosfonatos nucleosí-

deos acíclicos (cidofovir), os pró-fármacos aloxialquil orais dos fosfo- natos nucleosídeos acíclicos (brincidofovir ou CMX001) ou Vaccinia imune Globulin (VIG). Em algumas modalidades, os agentes anti-virais incluem, mas não se limitam a, análogos de nucleosídeos (por exem- plo, zidovudina, aciclovir, gangciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridi- na e ribavirina), foscarnet, amantadina, rimantadina, saquinavir, indi- navir, ritonavir, interferões alfa e outros interferões e AZT.

[00132] “Doses e regimes de dosagem podem ser determinados por um versado na técnica de acordo com as necessidades de um indiví- duo a ser tratado. O trabalhador qualificado pode levar em considera- ção fatores como a idade ou o peso do indivíduo, a gravidade da do- ença ou da condição sendo tratada e a resposta do indivíduo ao trata- mento. Em algumas modalidades, uma composição da invenção pode ser administrada, por exemplo, conforme necessário ou diariamente. À dosagem pode ocorrer durante períodos de tempo variáveis. Por exemplo, um regime de dosagem pode durar 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas ou mais. Em al- gumas modalidades, um regime de dosagem durará 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou mais.

[00133] Em alguns aspectos, os scVACVs da invenção também po- dem ser usados para produzir anticorpos úteis para imunoterapia pas- siva, imunoensaios diagnósticos ou prognósticos, etc. Os métodos de produção de anticorpos são bem conhecidos na técnica. Os anticorpos podem ser modificados posteriormente (por exemplo, quimerização, humanização, etc) antes de serem usados na imunoterapia. Agentes oncolíticos

[00134] Um "vírus oncolítico" ou "agente oncolítico", conforme usa- do na presente descrição, é considerado qualquer vírus que normal-

mente seja capaz de matar uma célula tumoral (não resistente) infec- tando a dita célula tumoral.

[00135] Em um aspecto, os poxvírus quiméricos sintéticos (scVACVs) da invenção podem ser usados como agentes oncolíticos que replicam seletivamente e matam células cancerosas. Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de indução de uma res- posta oncolítica em um indivíduo compreendendo administrar ao indi- víduo uma composição que compreende o scVACV da descrição. As células que estão se dividindo rapidamente, como as células cancero- sas, são geralmente mais permissivas para a infecção poxviral do que as células não divisórias. Muitas características dos poxvírus, como a segurança em humanos, a facilidade de produção de estoques de alta titulação, a estabilidade de preparações virais, e a capacidade de in- duzir a imunidade antitumoral após a replicação em células tumorais fazem com que os poxvírus sejam agentes oncolíticos desejáveis. Os scVACVs produzidos de acordo com os vários métodos da invenção podem incluir uma ou modificações que os tornem adequados para o tratamento do câncer. Por conseguinte, em um aspecto, a descrição fornece um método para induzir a morte em células cancerosas, o mé- todo compreendendo colocar as células em contato com um scVACV isolado ou com uma composição farmacêutica compreendendo um SscVACV da descrição. Em um aspecto, a descrição fornece um méto- do de tratamento de câncer, o método compreendendo a administra- ção a um paciente em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz de um scVACV da descrição. Outro aspecto inclui o SseVACV ou uma composição descrita aqui para uso no tratamento do câncer ou na in- dução de morte em uma doença neoplásica. Outro aspecto inclui o uso de um scVACV ou uma composição descrita aqui para induzir a morte em uma célula de distúrbio neoplásico, como uma célula cancerígena ou para tratar um distúrbio neoplásico, como o câncer. Em algumas modalidades, a terapia oncolítica de poxvírus é administrada em com- binação com uma ou mais terapias de câncer convencionais (por exemplo, cirurgia, quimioterapia, radioterapia, terapia térmica e terapia biológica/imunológica). Em modalidades específicas, o vírus oncolítico é uma cepa do scVACV NYCBH, clone Acambis 2000 ou ACAM2000.

[00136] Utilizando os métodos deste pedido, um ou mais genes de- sejáveis podem ser facilmente introduzidos e um ou mais genes inde- sejáveis podem ser facilmente deletados do genoma da scVACV. Em algumas modalidades, os scVACVs da invenção para uso como agen- tes oncolíticos são desenhados para expressar transgenes para au- mentar sua imunorreatividade, alvos antitumorais e/ou potência, pro- pagação célula-a-célula e/ou especificidade do câncer. Em algumas modalidades, um scVACV da invenção é desenhado ou modificado para expressar um gene imunomodulatório (por exemplo, GM-CSF, ou um gene viral que bloqueia a função TNF). Em algumas modalidades, um scVACV da invenção foi desenhado para incluir um gene que ex- pressa um fator que atenua a virulência. Em algumas modalidades, um SscVACV da invenção é desenhado ou modificado para expressar um agente terapêutico (por exemplo, hEPO, BMP-A4, anticorpos para antí- genos tumorais específicos ou porções dele, etc). Em algumas moda- lidades, os scVACVs da invenção foram desenhados ou modificados para compreender o gene gmCSF. Em algumas modalidades, os SscVACVs da invenção foram modificados para atenuação. Em algu- mas modalidades, o scVACV da invenção foi desenhado ou modifica- do para não ter o gene da timidina quinase viral (TK). Em algumas modalidades, o scVACV da invenção foi desenhado ou modificado pa- ra não ter o gene do ribonucleotídeo redutase. Em algumas modalida- des, um scVACV da invenção é desenhado ou modificado para não ter o gene do fator de crescimento da vaccinia. Em algumas modalidades, um scVACV da invenção foi desenhado ou modificado para não ter o gene da hemaglutinina.

[00137] Em um aspecto, os scVACVs da invenção são úteis para tratar uma variedade de distúrbios neoplásicos e/ou cânceres. Em al- gumas modalidades, o tipo de câncer inclui, mas não se limita a, cân- cer do osso, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer do colo do útero, câncer colorretal, câncer do esófago, gliomas, câncer gástrico, câncer gastrointestinal, câncer de cabeça e pescoço, câncer do fígado, como o carcinoma hepatocelular, leucemia, cancro de pulmão, linfo- mas, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer da próstata, câncer renal, câncer de pele, como melanoma, câncer testicular, etc, ou quaisquer outros tumores ou lesões pré-neoplásicas que possam ser tratados.

[00138] Em outra modalidade, o método compreende ainda a de- tecção da presença do scVACV administrado, no distúrbio neoplástico ou na célula cancerígena e/ou em uma amostra de um indivíduo admi- nistrado com um vírus isolado ou recombinante ou composição descri- tos aqui. Por exemplo, o indivíduo pode ser testado antes da adminis- tração e/ou após a administração do scVACV ou da composição des- crita aqui para avaliar, por exemplo, a progressão da infecção. Em al- gumas modalidades, um scVACV da descrição compreende uma cas- sete de detecção e a detecção da presença do VACV quimérico admi- nistrado compreende a detecção da proteína codificada por cassete de detecção. Por exemplo, em que a cassete de detecção codifica uma proteína fluorescente, o indivíduo ou a amostra é fotografada usando um método de visualização da fluorescência.

[00139] Em um aspecto, as formulações oncolíticas da presente invenção compreendem uma quantidade eficaz de um scVACV da descrição, e um carreador farmaceuticamente aceitável. O termo "far- maceuticamente aceitável" já foi explicado acima na seção anterior.

[00140] Em algumas modalidades, a composição da invenção é administrada em uma instalação de tratamento de poxvírus. Em certos aspectos, uma instalação de tratamento de poxvírus é uma instalação em que os indivíduos que necessitam de imunização ou tratamento com uma composição ou método da descrição podem ser imunizados ou tratados em um ambiente tal que sejam sequestrados de outros in- divíduos que não se destinem a ser imunizados ou tratados ou que possam ser potencialmente infectados pelo indivíduo tratado (por exemplo, cuidadores e membros da família). Em algumas modalida- des, os indivíduos que não pretendem ser imunizados ou potencial- mente infectados pelo indivíduo tratado, incluem pacientes com VIH, pacientes submetidos a quimioterapia, pacientes submetidos a trata- mento por câncer, doenças reumatológicas, ou doenças autoimunes, pacientes que estão ou receberam transplante de órgãos ou tecidos, pacientes com deficiências imunológicas, crianças, gestantes, pacien- tes com dermatite atópica, eczema, psoríase, condições cardíacas e pacientes com imunossupressores, etc. Em algumas modalidades, a instalação de tratamento de poxvírus é uma instalação de tratamento de ortopoxvírus. Em algumas modalidades, a instalação de tratamento de poxvírus é uma instalação de tratamento de varíola.

[00141] Em algumas modalidades, a composição da invenção com- preendendo o scVACV é administrada por um especialista em eventos adversos da varíola. Em algumas modalidades, os eventos adversos da varíola incluem, mas não se limitam a, eczema vaccinatum, vacci- nia progressiva, encefalite pós-vacinal, miocardite e cardiomiopatia dilatada. Vetores virais para expressão gênica recombinante

[00142] Em um aspecto, os poxvírus quiméricos sintéticos (sSCVACVs) da invenção podem ser modificados para transportar sequências hete- rólogas. As sequências heterólogas podem ser de diferentes espécies de poxvírus ou de qualquer fonte não poxviral. Em um aspecto, as se-

quências heterólogas são epitopos antigênicos que são selecionados de qualquer fonte não poxviral. Uma fonte não poxviral, tal como usada no presente pedido, refere-se a organismos diferentes do poxvírus. Em algumas modalidades, o vírus recombinante pode expressar um ou mais epitopos antigênicos de uma fonte não poxviral, incluindo, mas não limi- tado a, Plasmodium falciparum, micobactérias, Bacillus anthracis, Vibrio cholera, MRSA, rhabdovirus, vírus influenza, vírus da família dos flaviví- rus, paramixovírus, vírus da hepatite, vírus da imunodeficiência humana ou vírus que causam febre hemorrágica, como hantaviruses ou filoví- rus, ou seja, vírus do Ebola ou Marburg. Em outro aspecto, as sequên- cias heterólogas são epitopos antigênicos de diferentes espécies de poxvírus. Estas sequências virais podem ser usadas para modificar o espectro do hospedeiro ou a imunogenicidade do scVACV.

[00143] Em algumas modalidades, um scVACV da invenção pode codificar um gene/ácido nucleico heterólogo que expressa um ácido nucleico terapêutico (por exemplo, ácido nucleico anti-senso) ou um peptídeo terapêutico (por exemplo, peptídeo ou proteína com uma ati- vidade biológica desejada).

[00144] Em algumas modalidades, a expressão de uma sequência heteróloga de ácido nucleico é de preferência, mas não exclusivamen- te, sob o controle transcricional de um promotor de poxvírus. Em al- gumas modalidades, a sequência heteróloga de ácido nucleico é pre- ferencialmente inserida em uma região não essencial do genoma do vírus. Os métodos de inserção de sequências heterólogas no genoma poxviral são conhecidos por um versado na técnica. Em algumas mo- dalidades, o ácido nucleico heterólogo é introduzido por síntese quími- ca. Em uma modalidade exemplar, um ácido nucleico heterólogo pode ser clonado no locus VACV105/J2R do scVACV da descrição.

[00145] Um scVACV de um aspecto da presente invenção pode ser usado para a introdução de uma sequência heteróloga de ácido nu-

cleico em uma célula-alvo, a sequência sendo homóloga ou heteróloga na célula-alvo. A introdução de uma sequência de ácidos nucleicos heterólogos em uma célula-alvo pode ser usada para produzir peptí- deos ou polipeptídeos heterólogos in vitro e/ou vírus completos codifi- cados pela sequência. Em uma modalidade, este método compreende a infecção de uma célula hospedeira com o scVACV da invenção; o cultivo da célula hospedeira infectada em condições adequadas; e o isolamento e/ou enriquecimento do peptídeo, proteína e/ou vírus pro- duzidos pela célula hospedeira. As condições adequadas para a cultu- ra das células hospedeiras infectadas pelo scVACV, para expressar o peptídeo ou polipeptídeo heterólogo, são bem conhecidas na técnica e são variáveis dependendo da célula hospedeira usada (ver, por exem- plo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sam- brook et al., 1989)).

[00146] Entende-se que as modalidades do presente pedido descri- tas são meramente ilustrativas de algumas das aplicações dos princí- pios do presente pedido. Numerosas modificações podem ser feitas pelos versados na técnica com base nos ensinamentos apresentados aqui sem se afastar do verdadeiro espírito e escopo do pedido.

[00147] Os seguintes exemplos são apresentados como sendo re- presentativos do presente pedido. Esses exemplos não devem ser in- terpretados como limitando o escopo da invenção, uma vez que essas e outras modalidade equivalentes serão aparentes em vista da descri- ção, figuras e modalidades acompanhantes em anexo.

EXEMPLOS Exemplo 1. Seleção e desenho de fragmentos sobrepostos do geno- ma viral VACV ACAM2000 quimérico sintético contendo cepa hairpin de VACV WR e sequência duplex (scVACV ACAM2000-WR DUP/HP)

[00148] O desenho do genoma do scVACV foi baseado na sequên-

cia do genoma previamente descrito para VACV ACAM2000 [Gen- bank, nº de acesso AY313847] (Osborne JD et al. Vaccine. 2007; 25(52):8807-32). O genoma foi dividido em 9 fragmentos sobrepostos (Fig. 1). Esses fragmentos foram desenhados de modo que comparti- lhassem pelo menos 1,0 kbp de sequência sobreposta (ou seja, homo- logia) com cada fragmento adjacente, para fornecer sítios onde a re- combinação homóloga levará à montagem de genomas de compri- mento total (Tabela 1). Estas sequências sobrepostas forneceram ho- mologia suficiente para realizar uma recombinação precisa entre os fragmentos co-transfectados (Yao XD, Evans DH. Revista de Virologia. 2003;77(13):7281-90).

[00149] Tabela 1: Fragmentos do genoma da VACV ACAM2000 usados neste estudo. São descritos o tamanho e a sequência no ge- noma de VACV ACAM2000 [Genbank, nº de acesso AY313847].

[00150] Para auxiliar na sub-clonagem desses fragmentos, os sítios de restrição Aarl e Bsal foram silenciosamente mutados em todos os fragmentos, exceto nos dois fragmentos de codificação ITR. Os sítios de restrição Bsal nos dois fragmentos de codificação ITR não foram mutados, caso essas regiões contenham sítios de reconhecimento es- pecíficos de sequência nucleotídica que são importantes para a repli-

cação eficiente do DNA e resolução de concatémero.

[00151] Uma cassete YFP/gpt sob o controle de um promotor tardio precoce de poxvírus foi introduzida no locus da timidina quinase, de modo que a reativação do VACV ACAM2000 (VACV ACAM2000 YFP- gpt:: 105) foi fácil de visualizar sob microscópio de fluorescência. O locus do gpt também forneceu uma ferramenta potencial para selecio- nar os vírus reativados usando seleção de fármacos.

[00152] Tradicionalmente, os hairpins terminais têm sido difíceis de clonar e sequenciar, portanto, não é de surpreender que a sequência de genoma do VACV ACAMZ2000 esteja incompleta. Ao inspecionar a região terminal da cepa de VACV ACAMZ2000 publicada, parece haver algumas diferenças entre ACAM2000 e a cepa de VACV WR muito bem caracterizada (Genbank, nº de acesso AY243312) (Fig. 2). Na cepa WR, existem sequências de repetição tandem de 70 bp imedia- tamente a jusante do loop hairpin covalentemente fechado localizado no terminal 5' e 3' do genoma do VACV. Estes são seguidos por duas sequências de repetição de 125 bp e oito sequências de repetição de 54 bp (Fig. 2A). No entanto, na sequência de VACV ACAMZ2000 publi- cada, apenas quatro sequências de repetição de 54bp foram identifi- cadas (Fig. 2B). A presença das sequências de repetição 70bp, 125bp e 54bp foi confirmada em um isolado do tipo selvagem do VACV ACAMZ2000 após o sequenciamento (usando lIllumina), indicando que a sequência publicada atual do ACAM2000 é incompleta. Devido aos comprimentos de leitura curta das leituras de Illumina (< 300 nucleotí- deos), os inventores foram incapazes de determinar com precisão o que a sequência genômica real ACAM2000 estava nesta — 3 kbp. Em vez disso, os inventores decidiram recriar um vírus VACV ACAM2000 que tinha uma sequência semelhante ao VACV WR do hairpin terminal para pouco antes do códon de parada do gene C23L (Fig. 2). Isto in- cluiu as sequências de repetição tandem de 125 bp e 54 bp que, em-

bora não incluídas na sequência ACAM2000 publicada, foram detecta- das quando foi realizada a sequenciação de Illumina de próxima gera- ção do wtVACV ACAMZ2Z000. No término 5' dos fragmentos de ITR es- querdo e direito VACV ACAM2000 modificados também foram incluí- dos um sítio de restrição Nhel, que permitiria anexar diretamente a se- quência de repetição tandem de 70bp às extremidades do ITR (discu- tido no Exemplo 2). As sequências de loop hairpin dos terminais Fe S do wtVACV ACAM2000 são apresentadas na Fig. 9 e na SEQ ID NO: e 19, respectivamente.

VACV ACAM2000 quimérico sintético contendo cepa hairpin de VACV ACAM2000 e sequência duplex (scvVACV ACAM2000- ACAM2000 DUP/HP)

[00153] O desenho do genoma do scVACV foi baseado na sequên- cia do genoma previamente descrito para VACV ACAM2000 [Gen- bank, nº de acesso AY313847] (Osborne JD et al. Vaccine. 2007; 25(52):8807-32). O genoma foi dividido em 9 fragmentos sobrepostos (Fig. 1). Esses fragmentos foram desenhados de modo que comparti- lhassem pelo menos 1,0 kbp de sequência sobreposta (ou seja, homo- logia) com cada fragmento adjacente, para fornecer sítios onde a re- combinação homóloga levará à montagem de genomas de compri- mento total (Tabela 1). Estas sequências sobrepostas forneceram ho- mologia suficiente para realizar uma recombinação precisa entre os fragmentos co-transfectados (Yao XD, Evans DH. Revista de Virologia. 2003;77(13):7281-90).

[00154] Para auxiliar na sub-clonagem desses fragmentos, os sítios de restrição Aarl e BSAI foram silenciosamente mutados em todos os fragmentos, exceto nos dois fragmentos de codificação ITR. Os sítios de restrição Bsal nos dois fragmentos de codificação ITR não foram mutados, caso essas regiões contenham sítios de reconhecimento es- pecíficos de sequência nucleotídica que são importantes para a repli-

cação eficiente do DNA e resolução de concatémero.

[00155] Uma cassete YFP/gpt sob o controle de um promotor tardio precoce de poxvírus foi introduzida no locus da timidina quinase, de modo que a reativação do VACV ACAM2000 (VACV ACAM2000 YFP- gpt:: 105) foi fácil de visualizar sob microscópio de fluorescência. O locus do gpt também forneceu uma ferramenta potencial para selecio- nar os vírus reativados usando seleção de fármacos.

[00156] As sequências de loop hairpin dos terminais F e S do wtVACV ACAMZ2000 são apresentadas na Fig. 9 e na SEQ ID NO: 20 e 19, respectivamente. Exemplo 2. Ligação dos hairpin loops terminais F e S do VACV WR nos fragmentos de ITR direito e esquerdo do VACV ACAM2000

[00157] Um fragmento de repetição de 70bp idêntico à cepa de VACV WR foi sintetizado (Fig. 20; SEQ ID NO: 10). Os locais de res- trição Sapl and Nhel foram incluídos nos terminais 5' e 3' do fragmento de repetição tandem de 70bp para facilitar a ligação na sequência hairpin de VACV WR e nos fragmentos de ITR direito e esquerdo de VACV ACAMZ2O00O, respectivamente. Antes de os hairpin loops termi- nais de VACV WR poderem ser ligados ao fragmento de repetição tandem de 70bp, o loop tinha de ser estendido a 58bp adicional usan- do uma sequência duplex sintetizada pela IDT Technologies (Fig. 3A). Isto deve-se à sequência extra imediatamente a jusante do sítio de re- solução de concatémero, antes da primeira sequência de repetição de 7Obp encontrada na cepa de VACV WR. A sequência duplex foi pro- duzida através da síntese de duas moléculas de DNA de fita simples que, quando temperadas juntas, produziriam uma molécula de DNA duplex com uma saliência de 5-TGT na extremidade 5' e uma saliên- cia de 5-GGT na extremidade 3' (Fig. 3A; SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12). Uma vez que os hairpin loops terminais F e S de VACV WR geram uma saliência de 3-ACA nos seus hairpin loops, o duplex de 58 bp foi ligado aos hairpins para gerar um hairpin loop terminal de — 130 bp que parecia idêntico à sequência encontrada na cepa VACV WR até o início da sequência de repetição de 70 bp (Fig. 3B). Este frag- mento hairpin/duplex foi purificado em gel e, posteriormente, ligado a extremidade digerida com Sapl do fragmento de repetição 70bp. A di- gestão do fragmento de repetição tandem de 70bp com o Sapl criou uma saliência de três bases (5-CCA), complementar à saliência 'GGT na estrutura de hairpin/duplex do terminal. A repetição tandem de 70bp foi misturada com uma estrutura de hairpin/duplex do terminal F (Fig. 4, faixa 4) ou uma estrutura de hairpin/duplex do terminal S (Fig. 4, fai- xa 5) a um excesso molar de — 5 vezes em relação ao fragmento de repetição tandem de 70bp na presença de DNA ligase. Isto produziu uma mudança ascendente no gel de eletroforese de DNA em compa- ração com a reação apenas de 70 bp (Fig. 4, faixa 3), indicando que o hairpin/duplex terminal foi ligado com sucesso ao fragmento de repeti- ção tandem de 70 bp (Fig. 4).

[00158] Este fragmento de repetição tandem de hairpin/duplex/70bp terminal foi posteriormente ligado ao fragmento de ITR esquerdo ou direito ACAM2000 de 70bp que tinha sido previamente modificado nas extremidades terminais para incluir o sítio de restrição Nhel. Quando este fragmento foi digerido, uma saliência de 5-CTAG foi deixada no seu término 5'. No término 3' do fragmento de repetição tandem de 7Obp, o sítio Nhel é usado para ligar diretamente esse fragmento às regiões LITR e RITR dos fragmentos de DNA VACV ACAMZ2000. Após a digestão dos fragmentos de ITR esquerdo e direito de VACV ACAMZ2000, o fragmento de repetição tandem S terminal hair- pin/duplex/70bp ou o fragmento de repetição tandem F terminal hair- pin/duplex/70bp foram ligados de forma separada ao fragmento de ITR esquerdo ou direito usando o DNA ligase em uma razão molar 1:1 du- rante a noite a 16 ºC. O DNA ligase foi então inativado pelo calor a 65

ºC antes de ser transfectado para as células BGMK infectadas pelo vírus do fibroma de Shope (SFV).

Ligação dos hairpin loops terminais F e S do VACV ACAM2000 nos fragmentos de ITR direito e esquerdo do VACV ACAM2000

[00159] Um fragmento de repetição de 70bp idêntico à cepa de VACV ACAMZ2O0O00O foi sintetizado. Os locais de restrição Sapl and Nhel foram incluídos nos terminais 5' e 3' do fragmento de repetição tandem de 70bp para facilitar a ligação na sequência hairpin de VACV ACAMZ2000 e nos fragmentos de ITR direito e esquerdo de VACV ACAMZ200O0, respectivamente. Antes de os hairpin loops terminais de VACV ACAMZ2Z000 poderem ser ligados ao fragmento de repetição tandem de 70bp, o loop tinha de ser estendido a 58bp adicional usan- do uma sequência duplex sintetizada pela IDT Technologies. Isto de- ve-se à sequência extra imediatamente a jusante do sítio de resolução de concatémero, antes da primeira sequência de repetição de 70bp encontrada na cepa de VACV ACAMZ2000. A sequência duplex foi pro- duzida através da síntese de duas moléculas de DNA de fita simples que, quando temperadas juntas, produziriam uma molécula de DNA duplex com uma saliência de 5-TGT na extremidade 5' e uma saliên- cia de 5-GGT na extremidade 3' (SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22). Uma vez que os hairpin loops terminais F e S de VACV ACAM2000 geram uma saliência de 3-ACA nos seus loops terminais, o duplex de 58 bp foi ligado aos hairpins para gerar um loop hairpin terminal de — 130 bp. Este fragmento hairpin/duplex foi purificado em gel e, posteri- ormente, ligado a extremidade digerida com Sapl do fragmento de re- petição 70bp. A digestão do fragmento de repetição tandem de 70bp com o Sapl criou uma saliência de três bases (5-CCA), complementar à saliência 5GGT na estrutura de hairpin/duplex do terminal. A repeti- ção tandem de 70bp foi misturada com uma estrutura de hair- pin/duplex do terminal F ou uma estrutura de hairpin/duplex do termi-

nal S a um excesso molar de — 5 vezes em relação ao fragmento de repetição tandem de 70bp na presença de DNA ligase. Isto produziu uma mudança ascendente no gel de eletroforese de DNA em compa- ração com a reação apenas de 70 bp, indicando que o hairpin/duplex terminal foi ligado com sucesso ao fragmento de repetição tandem de 70 bp.

[00160] Este fragmento de repetição tandem de hairpin/duplex/70bp terminal foi posteriormente ligado ao fragmento de ITR esquerdo ou direito ACAM2000 que tinha sido previamente modificado nas extremi- dades terminais para incluir o sítio de restrição Nhel. Quando este fra- gmento de ITR esquerdo ou direito foi digerido, uma saliência de 5"- CTAG foi deixada no seu término 5'. No término 3' do fragmento de repetição tandem de 70bp, o sítio Nhel é usado para ligar diretamente esse fragmento às regiões LITR e RITR dos fragmentos de DNA VACV ACAMZ2000. Após a digestão dos fragmentos de ITR esquerdo e direito de VACV ACAMZ2000, o fragmento de repetição tandem S ter- minal hairpin/duplex/70bp ou o fragmento de repetição tandem F ter- minal hairpin/duplex/70bp foram ligados de forma separada ao frag- mento de ITR esquerdo ou direito usando o DNA ligase em uma razão molar 1:1 durante a noite a 16 ºC. O DNA ligase foi então inativado pelo calor a 65 ºC antes de ser transfectado para as células BGMK infectadas pelo vírus do fibroma de Shope (SFV). Exemplo 3. Preparação dos fragmentos de DNA sobrepostos de VACV ACAM2000

[00161] Cada um dos fragmentos de DNA sobrepostos de VACV ACAMZ2000 na Tabela 1 foram clonados em um plasmídeo fornecido pela GeneArt usando a enzima de restrição /-Scel. Antes da transfec- ção desses fragmentos de DNA sintéticos em células BGMK, os plas- mídeos foram digeridos com /-Scel e os produtos foram corridos em gel para confirmar que os fragmentos de DNA foram linearizados com sucesso (Fig. 5). Após a digestão a 37 ºC durante 2 h, as reações fo- ram posteriormente inativadas pelo calor a 65 ºC. As amostras foram armazenadas em gelo ou a 4 ºC até que fossem criados os fragmentos de ITR/repetição tandem hairpin/duplex/70bp terminal (conforme des- crito acima). Exemplo 4. Reativação de fragmentos de dsDNA quimicamente sinte- tizados

[00162] A cepa de SFV Kasza e BSC-40 foram originalmente obti- dos da American Type Culture Collection. As células do rim de macaco verde de búfalo (BGMK) foram obtidas a partir de G. McFadden (Uni- versidade da Flórida). As células BSC-40 e BGMK são propagadas a 37 ºC em CO, a 5% em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com L-glutamina, aminoácidos não essenciais, piruvato de sódio, anti- bióticos e antimicóticos, e soro bovino fetal a 5% (FCS; ThermoFisher Scientific). Reativação do scvVACV ACAM2000-WR DUP/HP ou scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP em células infectadas pelo vírus de fibroma de Shope

[00163] As células do rim de macaco verde de búfalo (BGMK) fo- ram cultivadas em MEM contendo pratos de cultura de tecidos de 60 mm até atingirem aproximadamente 80% de confluência. As células foram infectadas com o vírus do fibroma de Shope (SFV) em MEM sem soro a uma MOI de 0,5 por 1 h a 37 ºC. O inóculo foi substituído por 3 ml de MEM aquecido contendo FCS a 5% e devolvido à incuba- dora por uma hora adicional. Entretanto, as reações de transfecção foram estabelecidas da seguinte forma. Após aproximadamente 2h a 37 ºC, os fragmentos linearizados de VACV ACAMZ2000 foram trans- fectados (usando Lipopectamina 2000) para as células BGMK infecta- das pelo SFV em equivalentes molares, com base no comprimento de cada fragmento que compuseram o genoma da VACV ACAMZ2000.

Diferentes quantidades de DNA total foram testadas e 5, 6 e 7,5 ug de DNA foram capazes de reativar com sucesso o ACAMZ2000 desses fragmentos de DNA sobrepostos. Os complexos foram incubados à temperatura ambiente por 10 minutos e, em seguida, adicionados por gotejamento às células BGMK previamente infectadas com SFV. Cer- ca de 24 horas após a infecção, os meios foram substituídos por uma nova MEM contendo FCS a 5%. As células foram cultivadas por mais 3-4 dias (total de 4-5 dias) a 37 ºC.

[00164] As partículas de vírus foram recuperadas ao raspar as célu- las infectadas para o meio de cultura de células e realizando três ciclos de congelamento e descongelamento. O extrato bruto foi diluído 10? em MEM sem soro e 4 ml do inóculo é revestido em 9—16 placas de cultura de tecidos de 150 mm de células BSC-40 para recuperar o scVACV ACAM2000 YFP-gpt::105 reativado. Uma hora após a infec- ção, o inóculo foi substituído pelo MEM contendo FCS a 5% e ágar Noble a 0,9%. Placas fluorescentes amarelas foram visualizadas sob um microscópio invertido e placas individuais foram colhidas para pos- terior análise. As placas com SCVACV ACAM2000 YFP-gpt:: 105 fo- ram purificadas em placa três vezes com seleção de fluorescência amarela.

[00165] Após 4 dias, as placas infectadas contendo os clones SFV e VACV ACAM2000 foram colhidas, seguidas de três ciclos de conge- lamento descongelamento para liberar o vírus, e depois diluídas e pla- queadas serialmente em células BSC-40, que promovem preferenci- almente o crescimento dos vírus VACV ACAM2000 em comparação aos vírus SFV. Foram realizadas três rodadas de purificação da placa, seguidas de um volume dos estoques de vírus em placas de cultura de tecidos de 10-150 mm. O vírus foi posteriormente lisado dessas célu- las e separado em uma almofada de sacarose a 36%, seguido de puri- ficação adicional em um gradiente de densidade de sacarose a 24%-

40%. O DNA genômico foi isolado desses genomas purificados e a sequenciação de Illumina da próxima geração foi realizada para con- firmar a sequência dos genomas do vírus sintético. Exemplo 4. Propriedades de crescimento comparadas ao vírus ACAMZ2000 do tipo selvagem

[00166] Curvas de crescimento in vitro em múltiplas etapas do VACV ACAM2000-WR DUP/HP sintético isolado, seaVACV ACAM2000- ACAM2000 DUP/HP e VACV ACAMZ2000 do tipo selvagem em células epiteliais do rim de macaco (BSC-40). As células foram infectadas com uma multiplicidade de infecções 0,03, o vírus foi colhido nos momentos indicados (3h, 6h, 12h, 21h, 48h e 72h), e o vírus foi titulado em célu- las BSC-40. Os dados mostrados na Fig. 6 representam três experi- mentos independentes. Conforme ilustrado na Fig. 6, os vírus scVACV ACAM2000-WR DUP/HP e wtVACV ACAMZ2Z000 cresceram com uma cinética de crescimento indistinguível ao longo de um período de 72 horas.

[00167] Uma comparação entre as curvas de crescimento de SscVACV ACAM2Z000-WR DUP/HP (marcador YFP-gpt), scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP (marcador YFP-gpt)) scVACV ACAM2000-WR DUP/HP (sem marcador) (marcador YFP-gpt substitu- ído pela sequência do gene J2R), seaVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP (sem marcador) (marcador YFP-gpt substituído pela sequên- cia do gene J2R) e wtVACV ACAM2000 mostra que não há diferença estatística nas propriedades de crescimento desses vírus em relação ao wWtACAM2000 VACV (Fig. 7). Exemplo 5. Confirmação da sequência do genoma scVACV ACAM2000-WR DUP/HP YFP-gpt::105 por PCR e análise de fragmen- tos de restrição

[00168] Análise mais aprofundada dos genomas scVACV ACAMZ2000 YFP-gpt::105 por digestão de restrição, seguido por eletro-

forese em gel de campo de pulso (PFGE), foi realizada em DNA ge- nômico isolado por purificação de gradiente de sacarose (Yao XD, Evans DH. Methods Mol Biol. 2004; 269:51-64). Dois clones indepen- dentes scVACV ACAM2Z000-WR DUP/HP mais um controle VACV WRAJ2R, onde a sequência do gene J2R foi substituída por um marcador YFP-gpt, e um controle wWVACV ACAM2Z000 (VAC ACAMZ2000) foram purificados e, em seguida, deixados não di- geridos, digeridos com Bsal, Hindlll ou Notl e Pvul. O DNA genômico isolado de ambos scVACV ACAM2Z000-WR DUP/HP e wtVACV ACAMZ2000 foram digeridos com Bsal e Hindlll. Uma vez que a maioria dos sítios da Bsal no genoma de scVACV ACAMZ20O00 tinha sido silen- ciosamente mutado, um fragmento — 200kbp, na sua maioria intato, foi observado após a digestão da Bsal (Fig. 8, faixas 8 e 9). Isto é diferen- te dos genomas de controle wtVACV ACAMZ2Z000 e wtVACV WR (VAC WRAJ2R), que tinham sido extensivamente digeridos quando tratados com Bsal (Fig 8, faixas 6 e 7). Para confirmar que o genoma de scVACV ACAM2000-WR DUP/HP ainda poderia ser digerido com outra enzima, esses genomas foram digeridos com Hindlll, que produ- ziu numerosas bandas dos clones seVACVACAM2000-WR DUP/HP (Fig 8, faixas 12 e 13). Para confirmar a presença dos elementos de repetição tandem 70bp dentro das regiões ITR, o DNA genômico foi digerido com Notl e Pvul (Fig 8, faixas 14 a 17).

[00169] Na amostra de controle wtVACV WR (VAC WRAJ2R) foi detectada uma banda a cerca de 3,6 kbp (marcada com asteriscos), que engloba todas as repetições tandem de 70 bp na cepa WR de VAC. Considerando que a cepa de VACV WR usada como modelo pa- ra desenhar a síntese dos elementos de repetição do ITR, esperava-se que algumas bandas fossem detectadas nos clones SCVACVA- CAMZ2000 tratados com Notl/Pvul próximo ao mesmo tamanho do ob- servado na cepa WR. Quando os dois clones s0CVACV ACAM2000-WR

DUP/HP foram comparados, observaram-se diferenças no tamanho dessa região, sugerindo que nem todas as repetições de 70bp foram incorporadas a cada genoma reconstruído (Fig. 7, faixas 16 e 17). Isto não é inesperado, uma vez que outros demonstraram que estes ele- mentos de repetição podem expandir-se e contrair-se sob pressão se- letiva na cultura de células (Paez e Esteban (1988). Viro- logy;163(1):145-54).

[00170] Em geral, a análise in vitro do genoma de scVACV ACAM2000-WR DUP/HP YFP-gpt::105 sugeriu que a reativação do VACV ACAM2000-WR DUP/HP a partir de fragmentos de DNA quimi- camente sintetizados foi bem-sucedida e que o vírus scVACV ACAM2000-WR DUP/HP comportou-se in vitro como o vírus wtVACV ACAM2000. Exemplo 6. Confirmação da sequência do genoma de scVACV ACAMZ2000 YFP-gpt::105 por análise de sequência genômica

[00171] Foram sequenciados dois clones de seVACV ACAM2000- WR DUP/HP e dois clones de seVACV ACAM2Z000- ACAM2000 DUP/HP. As leituras de Illumina foram de novo montadas usando CLC Genomics Workstation (versão 11) com um tamanho de palavra de 35 ou 61. Os contigs montados foram então importados para o software Snapgene e alinhados a uma sequência de referência da sequência esperada de SCACAM2000 com base nos fragmentos sintéticos for- necidos pelo GeneArt.

[00172] Parao clone 1doscVACV ACAM2000-WR DUP/HP, o con- tig 1 foi de 16.317 pb e correspondeu à maior parte da região do ITR (exceto para as sequências de repetição do tandem). O contig 2 foi de

167.020 pb e alinhado com a região central conservada do genoma (posições nucleotídicas de 19.467 a 186.486). Para o clone 2 do scVACV ACAM2Z000-WR DUP/HP, o contig 3 foi de 16.322 pb e cor- respondeu à maior parte da região do ITR (exceto para as sequências de repetição do tandem). O contig 1 foi de 167.020 pb e alinhado com a região central conservada do genoma (posições nucleotídicas de

19.467 a 186.486). Houve uma única substituição de nucleotídeos (C a A) na posição de nucleotídeo 136791 do contig do clone 2. Isto corres- pondia à posição 156.256 do nucleotídeo na sequência do genoma SCACAMZ2000 e resultou numa alteração do aminoácido de um Asp para Tyr em VAC ACAM2000 177 (A41L).

[00173] Para o clone 1 de scvVACV ACAM2Z000-ACAM2000 DUP/HP, o contig 1 foi de 167.020 pb e alinhado com a região central conservada do genoma (posições nucleotídicas de 19.469 a 186.488). Para o contig 2 foi de 16.150 pb e correspondeu à maior parte da regi- ão do ITR (exceto para as sequências de repetição tandem). Quando este contig foi mapeado para o genoma de referência no Snapgene, observaram-se gaps na sequência nas posições 2633 a 3417 e nas posições nucleotídicas 15.175 a 15.220. A primeira região de gap cor- responde à região de repetição de 54 bp e é muito provável que seja devido à incapacidade de montar essas regiões com precisão usando ferramentas de montagem de novo. O mapeamento das leituras de Illumina bruta diretamente para o genoma de referência não resultou em nenhum gap dentro de nenhuma das regiões. Para o clone 2 do scVACV ACAM2000-ACAM2000DUP/HP, o contig 1 foi de 16.075 pb e correspondeu à maior parte da região do ITR (exceto as sequências de repetição tandem). O contig 2 foi de 167.078 pb e alinhado com a região central conservada do genoma (posições nucleotídicas de

19.469 a 186.546). Houve um gap observado no contig 2 da posição nucleotídica 15.176 a 15.220. O mapeamento das leituras de Illumina bruta diretamente para o genoma de referência não resultou em ne- nhum gap dentro dessa região, entretanto. Nenhum clone sequenciado de scVACV ACAM2Z2000-ACAM2000 DUP/HP apresentou quaisquer outras mutações de nucleotídeos em qualquer posição dentro do ge-

noma.

[00174] As leituras de Illumina também foram mapeadas para um mapa de referência em CLC Genomics. As leituras de lIllumina cobri- ram o comprimento total da sequência de referência com uma cobertu- ra média de 1925 e 2533, para os clones 1 e 2 de scVACV ACAM2000-WR DUP/HP, respectivamente, e uma cobertura média de 2195 e 1602 para os clones 1 e 2 de saAVACV ACAMZ2000-ACAM2000 DUP/HP, respectivamente.

[00175] No geral, os dados de sequenciamento corroboram os da- dos de análise genômica in vitro e confirmam que o scVACV ACAM20000-WR DUP/HP e scVvACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP foram reativados com sucesso nas células infectadas pelo SFV. Exemplo 7. Remoção do marcador de seleção YFP/gpt

[00176] Após a reativação do seVACV ACAM2000 YFP-gpt::105, o marcador de seleção yfp/gpt no locus da timidina quinase pode ser removido. Exemplo 8. Variações da sequência de nucleotídeos entre várias ce- pas de VACV dentro do hairpin terminal e região duplex nos ITRs

[00177] Variações de sequência de nucleotídeos na região "duplex" diretamente a jusante do sítio de resolução de concatémero na cepa de VACV WR, cepas ACAM 2000, Dryvax e Copenhague são mostra- das na Fig. 9. Variações de sequência são vistas como 4 substituições de nucleotídeos e 3 deleções de nucleotídeos entre as cepas wtA- CAMZ2000, Dryvax DPP15, Tian Tan e Copenhague, em comparação com a cepa WR. Exemplo 9. Determinação da virulência em modelo intranasal murino ou via escarificação da cauda

[00178] Os efeitos da toxicidade do scVACV ACAM2Z0000-WR DUP/HP e do scevVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP são determi- nados neste estudo. Para este experimento, 6 grupos de camundon-

gos Balb/c são administrados em 3 doses diferentes de scVACV ACAM20000-WR DUP/HP e scVACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP descritos nos Exemplos 1-7 e comparados a um grupo controle de PBS, bem como a um grupo controle wtVACV (WR) e a um grupo con- trole WrVACV ACAM2000 (12 grupos de tratamento no total). Há 3 ca- mundongos adicionais incluídos neste experimento que não recebem nenhum tratamento durante o período de duração do estudo. Todos os camundongos são amostrados para sangue em pontos predetermina- dos durante todo o experimento e os camundongos adicionais servem como uma linha de base para a análise sérica.

[00179] Antes da inoculação de camundongos Balb/c, todas as ce- pas de vírus são cultivadas em células BSC-40 (rim de macaco verde africano), colhidas por tripsinização, lavadas em PBS, extraídas de cé- lulas por homogeneização de dounce, purificadas através de uma al- mofada de sacarose a 36% por ultracentrifugação, ressuspensas em PBS, e tituladas de forma a que as concentrações finais se situem en- tre 107 UFP/ml e 10º UFP/ml.

[00180] As doses escolhidas para este estudo (10º UFP/dose, 106 UFP/dose e 10º” UFP/dose) baseiam-se em estudos prévios usando cepas de vacinas conhecidas de VACV, incluindo Dryvax e IOC (Me- daglia ML, Moussatche N, Nitsche A, Dabrowski PW, Li Y, Damon IK, et al. Genomic Analysis, Phenotype, and Virulence of the Historical Brazilian Smallpox Vaccine Strain IOC: Implications for the Origins and Evolutionary Relationships of Vaccinia Virus. Revista de Virologia. 2015;89(23):11909-25; Qin L, Favis N, Famulski J, Evans DH. Evolu- tion of and evolutionary relationships between extant vaccinia virus strains. Revista de Virologia. 2015;89(3):1809-24).

[00181] Os vírus são administrados intranasalmente ou através de escarificação da cauda. Ver detalhes dos Exemplos 10 e 11 abaixo. Exemplo 10. Determinar se o scVACV administrado através de inocu-

lação intranasal confere proteção imunológica contra um desafio letal de VACV-WR

[00182] Uma vez que a perda de peso é usada como uma medida de virulência em camundongos, o wtVACV (cepa WR) é administrado intranasalmente a uma dose de 5 x 10º UFP, o que leva a uma perda de peso de aproximadamente 20-30%. O clone de VACV Dryvax, DPP15, também é administrado intranasalmente a 107 UFP/dose, para que a virulência dessa bem conhecida vacina contra varíola possa ser diretamente comparada às versões sintéticas seaVACV ACAM20000- WR DUP/HP e scvACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP. Os camun- dongos são adquiridos junto aos laboratórios Charles River e, uma vez recebidos, são aclimatados ao seu ambiente durante pelo menos uma semana antes da administração do vírus.

[00183] “Cada camundongo recebe uma dose única de vírus (- 10yul) administrada através da injeção intranasal, sob anestesia. Os camun- dongos são monitorados para detectar sinais de infecção, como incha- ço, secreção ou outras anomalias todos os dias durante um período de dias. Cada camundongo é monitorado especificamente para perda de peso todos os dias após a administração do vírus. Camundongos que perdem mais de 25% do seu peso corporal, além de outros fatores de morbidade, são submetidos à eutanásia de acordo com os nossos protocolos de cuidados de saúde animal da Universidade de Alberta.

[00184] “Mesmo nas doses mais elevadas de seaVACV ACAM20000- WR DUP/HP e scvACV ACAM2000-ACAM2000 DUP/HP testadas, pode não haver sinais evidentes de doença em camundongos Balb/c. Uma das cepas de VACV (cepa da vacina contra a varíola brasileira IOC), em alguns casos, não produziu doença a 10” UFP (Medaglia ML, Moussatche N, Nitsche A, Dabrowski PW, Li Y, Damon IK, et al. Ge- nomic Analysis, Phenotype, and Virulence of the Historical Brazilian Smallpox Vaccine Strain IOC: Implications for the Origins and Evolu-

tionary Relationships of Vaccinia Virus. Revista de Virologia. 2015;89 (23):11909-25). É impraticável testar doses muito maiores do que isso devido à dificuldade de se fazer estoques purificados com titulações em excesso de 10º UFP/mL.

[00185] Trinta dias após a inoculação do vírus, os camundongos são posteriormente desafiados com uma dose letal de VACV-WR (10º UFP/dose) através da inoculação intranasal. Os camundongos são monitorados de perto para sinais de infecção como descrito acima. Os camundongos são pesados diariamente e os camundongos que per- dem mais de 25% do seu peso corporal, além de outros fatores de morbidade, são submetidos à eutanásia. Espera-se que os camun- dongos inoculados com PBS antes da administração de uma dose letal de VACV-WR apresentem sinais de perda de peso significativa e ou- tros fatores de morbidade dentro de 7-10 dias após a inoculação. Aproximadamente 14 dias após o desafio letal com VACV-WR todos os camundongos são eutanizados e o sangue é colhido para confirmar a presença de anticorpos neutralizantes específicos para VACV no so- ro através de ensaios padrão de redução da placa. Exemplo 11. Determinar se o scVACV administrado através da escari- ficação da cauda confere proteção imunológica contra um desafio letal de VACV-WR

[00186] Os animais imunocompetentes Balb/C são anestesiados antes do início do procedimento de escarificação da cauda. Na base da cauda, uma série de 15-20 arranhões/picadas são feitos usando a ponta de uma agulha de calibre 25 sobre um comprimento de 1-2 cm. Um volume de 3-5uL dos diferentes vírus é aplicado ao local de escari- ficação.

[00187] O camundongo é deixado anestesiado até que o vírus te- nha tido a chance de ser absorvido no local da escarificação. Os ca- mundongos são monitorados diariamente para sinais de perda de peso sobre um período de 28 dias. Uma pústula forma-se no local da escari- ficação da cauda (conhecida como "pega") — 8-10 dias após a escarifi- cação.

[00188] Vinte oito dias após a inoculação do vírus, os camundongos são posteriormente desafiados com uma dose letal de VACV-WR (10º UFP/dose) através da inoculação intranasal. Os camundongos são monitorados de perto para sinais de infecção como descrito acima. Os camundongos são pesados diariamente e os camundongos que per- dem mais de 25% do seu peso corporal, além de outros fatores de morbidade, são submetidos à eutanásia. Espera-se que os camun- dongos inoculados com PBS antes da administração de uma dose letal de VACV-WR apresentem sinais de perda de peso significativa e ou- tros fatores de morbidade dentro de 7-10 dias após a inoculação. Aproximadamente 14 dias após o desafio letal com VACV-WR todos os camundongos são eutanizados e o sangue é colhido para confirmar a presença de anticorpos neutralizantes específicos para VACV no so- ro através de ensaios padrão de redução da placa.

[00189] “Todos os animais não vacinados sucumbem a esta dose letal de VACV WR dentro de 7 dias após o desafio do vírus.

Claims (55)

REIVINDICAÇÕES

1. Vírus vaccinia quimérico sintético (scVACV), caracteriza- do pelo fato de que é replicado e reativado a partir de DNA derivado de DNA sintético, o genoma viral do referido vírus diferindo de um ge- noma selvagem do referido vírus, na medida em que se caracteriza por uma ou mais modificações.

2. SscVACV de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o DNA sintético é selecionado de um ou mais de: DNA sintetizado quimicamente, DNA amplificado por PCR, DNA modi- ficado e polinucleotídeos compreendendo análogos nucleosídeos.

3. scVACV de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o DNA sintético é DNA sintetizado quimicamente.

4. scVACV, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais modificações compreendem uma ou mais deleções, inserções, substituições ou uma combinação destas.

5. scVACV, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que uma ou mais modificações compreendem uma ou mais modificações para eliminar um ou mais sítios de restrição únicos.

6. scVACV, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais modificações compreendem uma ou mais modificações para adicionar ou reparar um ou mais sítios de restrição únicos.

7. scVACV, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais modificações compreendem uma ou mais modificações para eliminar um ou mais sítios de restrição Aarl.

8. scVACV, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais modificações compreendem uma ou mais modificações para eliminar todos os sítios de restrição Aarl.

9. scVACV, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais modificações compreendem uma ou mais modificações para eliminar um ou mais sítios de restrição Bsal.

10. O scVACV, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o genoma viral compre- ende hairpin loops terminais heterólogos.

11. scVACV, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o genoma viral compreen- de hairpin loops terminais derivados de uma cepa diferente do vírus vaccinia.

12. scVACV, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o genoma viral compreen- de hairpin loops terminais derivado de uma cepa de VACV WR.

13. scVACV, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o genoma viral compreende hairpin loops terminais homólogos ou heterólogos e em que as regiões de repetição tandem compreendem um número diferente de repetições do que o wtVACV.

14. scVACV, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o genoma é o genoma de uma cepa de VACV selecionada do grupo consistindo em: Western Reserve, Clone 3, Tian Tian, Tian Tian clone TP5, Tian Tian clone TP3, NYCBH, NYCBH clone Acambis 2000, Wyeth, Copenhagen, Lis- ter, Lister 107, Lister-LO, Lister GL-ONC1, Lister GL-ONC?, Lister GL- ONC3, Lister GL-ONCA, Lister CTC1, Lister IMG2 (Turbo FP635), IHD- W, LC16m18, Lederle, Tashkent clone TKT3, Tashkent clone TKTA, USSR, Evans, Praha, L-IVP, V-VET1 ou LIVP 6.1.1, Ikeda, EM-63,

Malbran, Duke, 3737, CV-1, Connaught Laboratories, Serro 2, CM-01, NYCBH Dryvax clone DPP13, NYCBH Dryvax clone DPP15, NYCBH Dryvax clone DPP20, NYCBH Dryvax clone DPP17, NYCBH Dryvax clone DPP21, VACV-IOC, Chorioallantois Vaccinia vírus Ankara (CVA), vaccinia Ankara modificada (MVA) e MVA-BN.

15. scVACV, de acordo com a reivindicação 14, caracteri- zado pelo fato de que o genoma viral do scVACV se baseia no geno- ma da cepa NYCBH, clone Acambis 2000.

16. scVACV, de acordo com a reivindicação 14, caracteri- zado pelo fato de que o genoma viral do scVACV é baseado no geno- ma da cepa NYCBH, clone Dryvax.

17. scVACV, de acordo com a reivindicação 14, caracteri- zado pelo fato de que o genoma viral do scVACV se baseia no geno- ma da cepa Lister, V-VET1.

18. scVACV, de acordo com a reivindicação 14, caracteri- zado pelo fato de que o genoma viral do scVACV se baseia no geno- ma da cepa do vírus modificado Ankara (MVA).

19. scVACV, de acordo com a reivindicação 14, caracteri- zado pelo fato de que o genoma viral do scVACV se baseia no geno- ma da cepa MVA-BN.

20. scVACV, de acordo com a reivindicação 14, caracteri- zado pelo fato de que o genoma viral do scVACV se baseia no geno- ma da cepa IOC.

21. scVACV, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 20, caracterizado pelo fato de que os hairpin loops terminais esquerdo e direito a) compreende a forma lenta e a forma rápida do hairpin loop terminal do vírus vaccinia, respectivamente, b) compreen- de a forma rápida e a forma lenta do hairpin loop terminal do vírus va- ccinia, respectivamente, c) ambos incluem a forma lenta do hairpin loop terminal do vírus vaccinia, ou d) ambos compreendem a forma rápida do loop terminal do vírus vaccinia.

22. scVACV, de acordo com a reivindicação 21, caracteri- zado pelo fato de que a forma lenta compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de nucleotí- deos da SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 19 e a forma rápida compre- ende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 20.

23. scVACV, de acordo com a reivindicação 22, caracteri- zado pelo fato de que a forma lenta compreende uma sequência de nucleotídeos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 19 e a forma rápida compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 20.

24. scVACV, de acordo com a reivindicação 23, caracteri- zado pelo fato de que a forma lenta compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de nucleotí- deos da SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 19 e a forma rápida compre- ende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 20.

25. scVACV, de acordo com a reivindicação 24, caracteri- zado pelo fato de que a forma lenta compreende a sequência de nu- cleotídeos da SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 19 e a forma rápida con- siste na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO:

20.

26. scVACV, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o vírus é replicado e reati- vado a partir de fragmentos de DNA quimicamente sintetizados sobre- postos que correspondem substancialmente a todo o genoma viral do SCcVACV.

27. scVACV, de acordo com a reivindicação 26, caracteri-

zado pelo fato de que o vírus é replicado e reativado a partir de 2-14 fragmentos sobrepostos.

28. scVACV, de acordo com a reivindicação 27, caracteri- zado pelo fato de que o vírus é replicado e reativado a partir de 6-12 fragmentos sobrepostos.

29. scVACV, de acordo com a reivindicação 28, caracteri- zado pelo fato de que o vírus é replicado e reativado a partir de 9 fra- gmentos sobrepostos.

30. scVACV, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 29, caracterizado pelo fato de que o vírus é reativado usando recombinação e reativação catalisada por leporipoxvírus.

31. scVACV, de acordo com a reivindicação 30, caracteri- zado pelo fato de que o leporipoxvírus é selecionado do grupo consis- tindo em: vírus do fibroma de Shope (SFV), vírus do fibroma de lebre, vírus do fibroma de coelho, vírus do fibroma de esquilo, ou vírus do mixoma.

32. Método para produção de um vírus vaccinia quimérico sintético (scVACV), caracterizado pelo fato de que compreende as se- guintes etapas: (i) sintetizar quimicamente fragmentos de DNA sobrepostos que correspondam a praticamente todo o genoma viral do vírus vacci- nia; (ii) transfectar os fragmentos de DNA sobrepostos em célu- las infectadas pelo vírus auxiliar; (ili) cultivar as ditas células para produzir uma mistura de partículas de vírus auxiliar e de partículas de vírus vaccinia quimérico sintético nessas células; e (iv) plaquear a mistura em células hospedeiras específicas do scVACV para recuperar o scVACV.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracteriza-

do pelo fato de que o vírus auxiliar é selecionado do grupo que consis- te em: um leporipoxvírus, um vírus da bolba aviária e um vírus auxiliar inativado por psoraleno.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracteriza- do pelo fato de que o leporipoxvirus é selecionado do grupo consistin- do em: vírus do fibroma de Shope (SFV), vírus do fibroma de lebre, vírus do fibroma de coelho, vírus do fibroma de esquilo, ou vírus do mixoma.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracteriza- do pelo fato de que o leporipoxvirus é SFV.

36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 32 a 35, caracterizado pelo fato de que as células infectadas do vírus auxiliar são células BGMK.

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 32 a 36, caracterizado pelo fato de que a etapa (i) compreende ainda hairpin loops terminais quimicamente sintetizados de outra cepa de VACV e os ligando aos fragmentos compreendendo os términos esquerdo e direito do genoma viral.

38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 32 a 37, caracterizado pelo fato de que os fragmentos de DNA sobrepostos compreendem: (i) sequências de nucleotídeos que são pelo menos 85% idênticas às sequências das SEQ ID NOs: 1-9; (ii) sequências de nucleotídeos que são pelo menos 90% idênticas às sequências das SEQ ID NOs: 1-9; (ili) sequências de nucleotídeos que são pelo menos 95% idênticas às sequências das SEQ ID NOs: 1-9; ou (iv) sequências de nucleotídeos que consistem nas se- quências das SEQ ID NOs: 1-9.

39. Vírus vaccinia quimérico sintético (scVACV), caracteri-

zado pelo fato de que é gerado pelo método como definido em qual- quer uma das reivindicações 32 a 38.

40. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o scVACV como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 31 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

41. Composição farmacêutica de acordo com a reivindica- ção 40, caracterizada pelo fato de que o scVACV é inativado.

42. Composição farmacêutica de acordo com a reivindica- ção 41, caracterizada pelo fato de que a inativação é realizada por ca- lor, UV ou formalina.

43. Método para introdução da resposta oncolítica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma composição compreendendo o scVACV como de- finido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 40 a

42.

44. Método para expressão de uma proteína heteróloga em uma célula hospedeira, caracterizado pelo fato de que compreende a introdução da sequência heteróloga de ácido nucleico no scVACV co- mo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31, infectando a célula hospedeira com o scVACV e cultivando as células hospedeiras em condições para expressão da proteína heteróloga.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que a sequência de ácido nucleico heteróloga é deri- vada de uma espécie diferente de poxvírus ou de qualquer fonte não poxviral.

46. Método para o desencadeamento ou impulsionamento da resposta imune contra o vírus vaccinia, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo que precisa do mesmo de uma composição compreendendo o scVACV como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou uma composição farma- cêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 40 a 42.

47. Método para o desencadeamento ou impulsionamento da resposta imune contra o vírus da varíola, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo que precisa do mes- mo de uma composição compreendendo o scVACV como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou uma composição farma- cêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 40 a 42.

48. Método para o desencadeamento ou impulsionamento da resposta imune contra o vírus da varíola de macaco, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo que pre- cisa do mesmo de uma composição compreendendo o scVACV como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou uma composi- ção farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 40 a 42.

49. Método para imunização de um indivíduo humano para protegê-lo da infecção pelo vírus da varíola, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao dito indivíduo de uma composi- ção compreendendo o scVACV como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 40 a 42.

50. Método para o tratamento da infecção pelo vírus da va- ríola, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo que precisa do mesmo de uma composição compreendendo o ScVACV como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 40 a 42.

51. Método para o tratamento do câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indiví- duo que precisa do mesmo de uma composição compreendendo o

SscVACV como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 40 a 42.

52. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 43 ou 46 a 51, caracterizado pelo fato de que a administração pode ser selecionada a partir da escarificação dérmica, da administra- ção intramuscular ou intravenosa.

53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 43 ou 46 a 52, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada em uma instalação de tratamento de poxvírus.

54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 43 ou 46 a 53, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada por um especialista em eventos adverso de varíola.

55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracteriza- do pelo fato de que os eventos adversos da varíola são selecionados dentre: eczema vaccinatum, vaccinia progressiva, encefalite pós- vacinal, miocardite e cardiomiopatia dilatada.

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