VACUNA CONTRA LA VIRUELA
Esta invención se refiere a métodos y composiciones para uso en la vacunación contra la viruela. Antecedentes de la Invención El virus varióla, el agente causativo de la viruela, es un miembro del género Orthopoxvirus, gue también incluye los virus de la viruela de los monos, la viruela del ganado vacuno y vaccinia. La enfermedad ocasionada por las cepas principales de varióla está caracterizada por una baja dosis infecciosa (10-100 viriones) , un largo periodo de incubación (promediando 12 días) , fiebre, síntomas constitutivos, rozaduras que avanzan a una etapa pustular, muerte en hasta 30% de los afectados, y cicatrices faciales en los sobrevivientes. La enfermedad es difundida de persona a persona vía la ruta respiratoria por contacto (goti-tas), y posiblemente por aerosol. La viruela fue una de las mas importantes causas de morbidez y mortalidad alrededor del mundo hasta la primera mitad del siglo veinte. Sin embargo, debido en parte a la falta de depósitos animales para el virus, el uso sistemático de una vacuna (virus vaccinia vivo, atenuado) fue altamente efectivo en el combate a esta enfermedad. De hecho, entre 1967 y 1977 un programa global de erradicación de la viruela tuvo como resultado la eliminación de la enfermedad natural (Fenner y colaboradores, WHO, Ginebra, p. 1640, 1988) . Debido a la ausencia de viruela y el riesgo de eventos adversos asociados con la vacuna, ha cesado la vacunación rutinaria de niños, personal de hospitales y personal militar, y en la actualidad solamente son inmunizadas las personas que trabajan con vaccinia y virus relacionados en laboratorio. De esta manera, una porción sustancial de la población mundial no tiene inmunidad a la viruela. La población restante tiene poca inmunidad residual, pues la inmunidad por vacuna solamente dura cinco años después de la vacunación primaria y menos de 20 años después de la re-vacunación. La erradicación de la viruela y el cese de la vacunación han creado, de esta manera, vulnerabilidad en la población a ataques encubiertos o guerra biológica empleando el virus varióla. Si ocurriese tal evento, la difusión epidémica no seria frenada por una barrera inmune en la población (Anón, (editorial) , Lancet 353:1539, 1999; Henderson, Science 283 : 1279-1282 , 1999; Henderson y colaboradores, J.A.M.A. 281:2127-2137, 1999). Debido a las incertidumbres que rodean a la erradicación de la viruela, la vacuna fue almacenada para uso por emergencias. En los Estados Unidos, por ejemplo, se almacenaron originalmente 155,000 frascos de vacuna (nominalmente, 15.5 millones de dosis) producida por Wyeth Laboratories, bajo el control de los Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades) , en Atlanta, Georgia, Estados Unidos. En una reunión del National Vaccines Advisory Coinmittee (Comité Nacional Asesor de Vacunas) en enero de 1999, los CDC reportaron el estado del repositorio nacional de vacunas contra la viruela. En ese momento, de las 15.5 millones de dosis mantenidas por Wyeth, 3.4 millones de dosis no pasaron las pruebas de control de calidad y 10.3 millones estaban mas allá de la fecha de caducidad estipulada por la última prueba de control para uso extendido, dejando 1.7 millones de dosis que cumplían con las especificaciones de su liberación (LeDuc, presentación al National Vaccines Advisory Committee, Washington, D.C., Estados Unidos, 11-12 de enero de
1999) . En adición al limitado suministro, la vacuna es empacada en frascos de 100 dosis, lo que restringe la distribución e incrementa la posibilidad de desperdicio durante una emergencia. En adición al inventario de los Estados Unidos, hay un suministro de vacuna (Lister, cepa Elstree) almacenado en el
National Institute of Public Health (Instituto Nacional de Salud Pública) de Bilthoven, Holanda, y ciertos otros países tienen suministros de vacunas contra la viruela, que en el momento de la erradicación pueden haber incluido hasta 300 millones de dosis. Sin embargo, problemas similares de estabilidad en almacenamiento han reducido este suministro a menos de 50 millones de dosis (Henderson, Science 283:1279-1282, 1999) . Compendio de la Invención La invención provee cepas estables del virus vaccinia que son aisladas de células cultivadas en las cuales se ha propagado Dryvax®, y que tienen características que las hacen adecuadas para uso como vacunas humanas contra la viruela. La invención también provee métodos de generar estas cepas y métodos de usarlas para impedir la infección por viruela y la enfermedad. En consecuencia, en un primer aspecto, la invención provee una cepa clonal de virus vaccinia atenuado que se aisla de células cultivas en las cuales se ha cultivado Dryvax® y, cuando se administra a un ser humano en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune protectora o terapéutica contra el virus varióla en el ser humano, es atenuada de manera aceptable en el ser humano. Las cepas clónales pueden tener, por ejemplo, sustan-cialmente la misma virulencia y/o inmunogenicidad que Dryvax®, . De preferencia, el virus vaccinia es producido en sustancialmente las mismas o mayores cantidades que Dryvax® cuando se inocula en cultivos celulares, y/o tiene sustancialmente el mismo patrón de digestión que Dryvax® cuando se digiere con una endonucleasa de restricción . La cepa clonal puede también tener, por ejemplo, sustancialmente la misma virulencia y/o inmunogenicidad que la cepa ACAM1000 del virus vaccinia (depositada como depósito ATCC No. PTA-3321 el 19 de abril de 2001; ver clona 2, mas adelante) cuando se prueba en modelos animales apropiados o en seres humanos. De preferencia, tal virus vaccinia es producido en sustancialmente las mismas o mayores cantidades que la cepa ACAM1000 del virus vaccinia cuando se inocula en cultivos celulares, y/o tiene sustancialmente el mismo patrón de digestión que la cepa ACAM1000 del virus vaccinia cuando se digiere con una endonucleasa de restricción. Un ejemplo de un virus vaccinia que se incluye en la invención es ACAM1000 (depósito ATCC No. P A-3321) . En un segundo aspecto, la invención provee una composición farmacéutica que incluye una cepa clonal del virus vaccinia, como se describió antes y en cualquier otra parte en la presente, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En un tercer aspecto, la invención provee un método de prevenir o tratar la infección por el virus varióla en un paciente administrando tal composición farmacéutica al paciente, así como el uso de tal composición para este propósito, así como el uso de tal composición en la preparación de un medicamento para este propósito. La composición farmacéutica puede ser administrada a un paciente, por ejemplo, por escarificación, en una cantidad que varía, por ejemplo, de 1 x 104 a 1 x 106 unidades formadoras de placas. En un cuarto aspecto, la invención provee un método de obtener una cepa clonal de virus vaccinia atenuado para uso como una vacuna. Este método implica (i) propagar Dryvax® en un sistema de cultivo celular, y (ii) aislar del sistema de cultivo celular una cepa clonal del virus vaccinia que tiene sustancialmente la misma virulencia, la misma inmunogenicidad, las mismas características de crecimiento en cultivo, o el mismo patrón de digestión con endonucleasa de restricción que Dryvax® o la cepa del virus vaccinia AC¾M1000. La virulencia del virus vaccinia puede ser probada en este método, por ejemplo, mediante una prueba en piel de conejo o una prueba de neuro-virulencia de ratón lactante. Las características de crecimiento en cultivo pueden ser determinadas usando, v.gr., células diploides humanas (MRC-5) . De preferencia, el virus vaccinia identificado usando este método, cuando se administra a un ser humano en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune protectora o terapéutica contra el virus varióla en el ser humano, es avirulento de manera aceptable en el ser humano. La invención aporta diversas ventajas. Por ejemplo, previamente, la vacuna contra la viruela fue producida por inoculación del virus vaccinia en la piel de terneros, seguida por escarificación de la piel de los terneros para cosechar virus vivo. La preparación cruda de virus obtenida sufría mínima purificación antes de uso en la vacunación de receptores humanos, dejando abierta la posibilidad de contaminación por patógenos. Las vacunas de la presente invención son producidas en un sistema de cultivo celular que es aceptable por las normas modernas para la manufactura de vacunas y es altamente purificado, de esta manera eliminando este problema. Una ventaja adicional de usar virus clonados, tales como los de la presente invención, es que es poco factible que las características de tales virus cambien durante la propagación y la elaboración de vacunas, en comparación con poblaciones mixtas de virus. De hecho, se ha demostrado que un virus de acuerdo con la invención conserva su fenotipo bajo paso y expansión repetidos en cultivo celular, está libre de contaminantes, y es capaz de ser producido en cultivo celular en cantidades adecuadas para elaboración de vacunas a gran escala. Otros aspectos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, los dibujos y las reivindicaciones. Breve Descripción de los Dibujos Las figuras 1A-1D son una serie de gráficas que muestran los resultados de experimentos en los cuales ratones lactantes fueron cuestionados con las clonas de vaccinia indicadas, una preparación de virus vaccinia policlonal, o Dryvax®. Se muestra el número de ratones sobrevivientes y el tiempo promedio de supervivencia después de estos cuestionamien-tos . La figura 2 muestra un análisis de digestión con la enzima de restricción HindIII de clonas de vacuna de la invención, en comparación con una preparación de virus policlonal y Dryvax®. Descripción Detallada La invención provee cepas clónales de virus vaccinia atenuados que pueden usarse en métodos de vacunación contra la viruela (es decir, virus varióla) . Como se describe adicional-mente mas adelante, las cepas de vaccinia atenuadas de la invención son obtenidas aislando clonas de vaccinia de cultivos celulares en los cuales se ha propagado Dryvax®. La invención también provee métodos de usar vacunas que incluyen estos virus vaccinia en la prevención de viruela, así como métodos de obtener tales cepas clónales de los virus vaccinia. Las vacunas de la invención son derivadas de, y tienen características similares a, Dryvax® (cepa de New York City Board of Health (Departamento de Salud de la Ciudad de New York) , Wyeth Laboratories), que está licenciada actualmente por la U.S. Food and Drug Administration (Administración y Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos) (FDA) y consiste en una población mixta de virus vaccinia generados en piel de terneros. Las vacunas deben tener una virulencia atenuada de manera aceptable para seres humanos que son vacunados con ellas. Un nivel aceptable de atenuación puede ser, por ejemplo, un nivel que es similar a (v.gr., que no difiere en una manera estadísticamente significativa de) que observa con Dryvax®, y puede determinarse usando cualquiera de las pruebas in vitro o in vivo descritas mas adelante. Una propiedad del virus vaccinia es su neurotropismo, o capacidad de replicar en células del sistema nervioso central, ocasionando inflamación (es decir, encefalitis) . De preferencia, las vacunas de la invención no son mas neurotrópicas que Dryvax®, y no ocasionan encefalitis post-vacunación en los pacientes tratados.
Las vacunas y los métodos de la presente invención son descritas adicionalmente en lo sucesivo. Indicaciones para Uso La indicación principal para uso de las vacunas de la invención está en la prevención de viruela en poblaciones expuestas o potencialmente expuestas a viruela después de un acto de bio-terrorismo o de guerra biológica. La eficacia de las vacunas de la invención es ventajosamente elevada (> 95%) y las vacunas protegen contra tanto la difusión del virus de persona a persona como la exposición primaria a aerosol en dosis elevadas de armas biológicas. Dada esta indicación principal, las vacunas de la invención pueden ser usadas, por ejemplo, para crear un nuevo inventario nacional de vacunas contra la viruela (vacci-nia) , y puede continuarse anualmente la elaboración para mantener un inventario continuo de vacunas adecuadas por un periodo de tiempo prolongado. Las vacunas no están destinadas para uso rutinario, salvo en trabajadores de laboratorios que están expuestos a vaccinia, viruela de ganado vacuno, viruela de monos, varióla, u otros miembros del género Orthopoxvirus . De otra manera, las vacunas son para liberarse bajo condiciones de emergencia, como se determine por las autoridades de seguridad nacional y salud pública. Bajo la circunstancia de tal emergencia, los riesgos de eventos adversos asociados con vaccinia serian reducidos frente a los beneficios potenciales de proteger a individuos contra la viruela y a la sociedad contra la difusión de la enfermedad. Se reconoce que el uso de las vacunas por emergencias puede ser difícil de controlar, que los infantes, quienes están en mayor riesgo de encefalitis post-vacunación, recibirán las vacunas, y que pueden ignorarse precauciones y contra-indicaciones para uso en personas con condiciones subyacentes (v.gr., historia de eczema, embarazo e inmuno-supresión) . Por estas razones, es importante que las vacunas derivadas de cultivos celulares de la invención no sean mas virulentas que el producto licenciado actualmente . Dependiendo de eventos que no pueden ser predecidos con precisión, pueden haber una decisión de llevar a cabo profilaxis pre-exposición de ciertos grupos, incluyendo personal militar, personal médico civil, y los llamados "primeros en responder". El perfil de seguridad inherente de las vacunas en estos grupos, aunque de gran importancia, es acrecentado por la aplicación deliberada del producto y por evitarse el uso en individuos con factores de riesgo para eventos adversos. Bajo estas circunstancias, los riesgos principales son auto-inoculación, vaccinia ocular, e infección accidental, todos los cuales son eventos adversos auto-limitados. Hay un pequeño riesgo de infección accidental de otros con factores de riesgo subyacentes. Por supuesto, si cambiaran las circunstancias en el país o en el mundo tal que se pensara ser deseable la vacunación rutinaria de miembros adicionales de la población (v.gr., niños), o incluso toda la población, las vacunas de la presente invención pueden ser usadas para estos fines también. Modos y Cantidades de Administración Las vacunas de la invención son preparadas mediante la propagación de una cepa deseada del virus vaccinia (v.gr., cepa ACAM1000; depósito ATCC No. PTA-3321; ver mas adelante) en sistemas de cultivo celular, y la purificación de la cepa cultivada del sistema usando métodos estándar. Por ejemplo, la cepa puede ser cultivada en células de fibroblastos de pulmón humanos, diploides, tales como células MRC-5, células de fibroblastos de embrión de pollo primarias, o cualquier otro tipo apropiado de células, como puede determinarse por un técnico en la materia. El cultivo puede tener lugar usando cualquier sistema apropiado tal como, por ejemplo, la Nunc Cell Factory© (Fábrica de Células Nunc) . Virus purificado puede ser liofilizado para uso posterior o puede ser preparado de inmediato en una solución farmacéutica. Son conocidas en la materia numerosas soluciones farmacéuticamente aceptables para uso en la preparación de vacunas, y pueden adaptarse fácilmente para uso en la presente invención por un técnico en la materia. (Ver, v.gr., Remlngton's Pharmaceutical Sciences (18a. edición), A. Gennaro, editor, 1990, Mack Publishing Co., de Easton, Pennsylvania, Estados Unidos.) Sin embargo, los virus pueden ser simplemente diluidos en una solución fisiológicamente aceptable, tal como una solución salina estéril o solución salina amortiguada, estéril, con o sin un coadyuvante o portador. De manera opcional, la solución farmacéutica puede contener un componente que aporte viscosidad
(v.gr., glicerol) y/o un componente que tenga propiedades bactericidas (v.gr., fenol). Las vacunas pueden ser almacenadas a una concentración de 107-109 unidades formadoras de placa
(PFU)/ml, por ejemplo 108 PFU/ml . Las vacunas de la invención pueden ser administradas a pacientes, por ejemplo, por escarificación, usando métodos estándar. Por ejemplo, puede usarse una aguja bifurcada en tal enfoque. De manera alternativa, la vacuna puede ser administrada usando cualquiera otra ruta estándar que se encuentre ser aceptable por un técnico en la materia. Por ejemplo, la vacuna puede ser administrada por inyección sub-cutánea o intra-dérmica, o por otra ruta parental, tal como por inyección intra-muscular . La cantidad de vacuna administrada a un adulto de talla promedio puede ser, por ejemplo, de 1 x 104 a 1 x 106 unidades formadoras de placa. Como un ejemplo especifico, pueden usarse 2.5 x 105 unidades formadoras de placa. De preferencia, la vacunación es llevada a cabo antes de cualquier exposición a varióla, pero la vacunación también puede ser llevada a cabo con pacientes que han estado expuestos a varióla, de preferencia unos cuantos dias después de la exposición. La vacunación puede ser llevada a cabo solamente una vez en la vida de una persona, o puede repetirse después de un periodo de tiempo, tal como de varios años (v.gr., 5 a 10 años), como se determine ser apropiado por un técnico en la materia. Identificación de Candidatos para Vacuna La invención también incluye métodos de identificar candidatos para vacunas de vaccinia. Estos candidatos pueden ser identificados aislando cepas clónales a partir de cultivos celulares inoculados con Dryvax®, y caracterizando estas clonas usando cualquiera de los métodos in vitro o in vivo descritos mas adelante. Por ejemplo, una cepa para vacuna candidata puede ser comparada con Dryvax® en cuanto a tamaño de placa, rendimiento en cultivo celular (usando, v.gr., células MRC-5) , virulencia cutánea en conejos, neuro-virulencia en ratones lactantes, neuro-virulencia en monos, o protección en modelo de cuestionamiento de ratón. Los candidatos preferidos son aquéllos con virulencia similar a o menor que la de Dryvax®, que inducen inmunidad protectora que es similar a o mayor que la de Dryvax®, y que también tienen características de crecimiento que son similares a o mayores que las de Dryvax®. Antes de la presente invención, era impredecible el aislamiento de una cepa clonal que tuviera las características satisfactorias de un candidato para vacuna, debido a que la larga historia del paso de vaccinia ha dado como resultado la generación de múltiples sub-poblaciones de variantes (es decir, un enjambre genético), con propiedades biológicas potencialmente diferentes. También era incierto si una sola variante, aislada por purificación de placas (es decir, clonación biológica) tendría las mismas características fenotípicas que la suma de las múltiples variantes en la población original del virus mixto. De hecho, antes de la presente invención, hubiera sido sorprendente que este fuera el caso. El desarrollo y la caracterización pre-clínica de las vacunas de la invención son descritos adicionalmente, como sigue. Desarrollo y Caracterización Pre-Clinica de Vacunas de Vaccinia Como se discutió antes, Dryvax® es la vacuna de vaccinia que está licenciada actualmente por la FDA, fue derivada de la cepa del New York City Board of Health (NYCBH) , y fue producida hasta 1982 por Wyeth-Lederle mediante el método de la linfa de ternero bovino (ver también el depósito ATCC No. VR-325) . Dryvax® consiste en un virus vaccinia vivo, atenuado y no existe como un producto de cultivo celular. Se adaptó la cepa de la vacuna contra la viruela del virus vaccinia para propagación bajo condiciones controladas en cultivos desarrollados en laboratorio de células de fibroblastos de pulmón humanos de modo que pudieran usarse técnicas modernas para la producción de vacunas. Para desarrollar una vacuna de cultivo celular, se tuvo que separar Dryvax® de contaminantes virales advenedizos potenciales mediante el paso a dilución terminal, y se hizo esto con y sin clonación, como se discute adicionalmente mas adelante. De la mezcla de variantes (el enjambre genético) en Dryvax®, se seleccionaron vacunas candidatas que tenían características biológicas similares en animales y similitud genómica a la vacuna licenciada, aportando un alto grado de certeza de que eran tan efectivas clínicamente como el producto de linfa de ternero original . En una estrategia usada para adaptación, el virus vaccinia fue clonado para aislar el virus de posibles microorganismos contaminantes derivados de la piel de ternero. Mediante el uso de esta estrategia, se aislaron seis clonas. Los virus clonados exhibieron una variedad de características con mayor o menor virulencia en comparación con Dryvax®. De manera sorprendente, dada la mezcla esperada de variantes en Dryvax®, se encontraron tres clonas similares a Dryvax® en pruebas de virulencia en animales y diferían principalmente en la tasa de crecimiento en cultivo celular. Cualquiera de estas cepas, así como otras con características similares, puede usarse en métodos de vacunación contra viruela, de acuerdo con la invención. En otra estrategia, el virus no fue clonado, con la expectativa de que fuese mas factible que el virus derivado por este método se comportara como la cepa de la cual fue derivado. Sin embargo, se encontró de manera sorprendente que la cepa producida sin clonación, aunque se comportó de manera similar a Dryvax® en pruebas in vitro, no tenía las características de la cepa de la vacuna, sino que de hecho era mas virulenta cuando se probó en animales de laboratorio. De esta manera, se enfocaron los esfuerzos de desarrollo en virus clonados con características simílares a las de la cepa de vacuna Dryvax®. Los detalles de la caracterización son los siguientes. Se inoculó Dryvax® en cultivos de células MRC-5 y seis clonas del virus vaccinia fueron obtenidas por purificación de placas . Cada clona fue re-clonada dos veces para asegurar clonalidad y libertad de contaminantes. También se inoculó Dryvax® en cultivos de células MRC-5 a una multiplicidad de infección (MOI) de 0.001 PFU por célula para derivar una preparación de virus sin clonar (policlonal) . Este virus fue posteriormente pasado en células MRC-5 dos veces mas a una baja MOI . Las seis clonas y la preparación policlonal fueron todas probadas en una extensa serie de análisis comparativos al lado de Dryvax® en cuanto a características in vitro e in vivo. En particular, cada clona y la preparación policlonal fueron analizadas en cuanto a morfología de placas, rendimiento en células MRC-5, patrones de mapeo con endonucleasa de restricción, la formación de cavidades cutáneas en conejos, y neuro-virulencia en ratones. Un sub-conjunto de clonas fue probado adicionalmente respecto de inducción de inmunidad protectora en ratones. El objetivo fue el de seleccionar una cepa de vacuna a partir del grupo de Dryvax® con similitud biológica a Dryvax®. La Tabla 1 resume los resultados de estos estudios.
Tabla 1. Caracterización de Siete Virus Vaccinia Candidatos
*PFU/ml x 105
De estos estudios, las clonas 2 y 4 fueron identificadas como teniendo características que muestran que estas clonas son adecuadas para uso como una nueva vacuna contra viruela. La clona 6 también tiene características adecuadas, pero no se desarrolla también como las clonas 2 y 4 en cultivo. Neuro-Virulencia en Ratones Lactantes Se determinó que ratones adultos eran no susceptibles a inoculación intra-craneal (IC) de Dryvax® sin modificar. Por tanto, se desarrolló una prueba en ratones lactantes. Los ratones lactantes (3 a 4 días de edad) fueron inyectados con diluciones lOx de virus y se determinó el tiempo de supervivencia. Se condujeron tres experimentos, con Dryvax® probada en cada uno como un estándar. Se observó que los ratones lactantes inoculados IC con Dryvax® desarrollaron encefalitis fatal de manera uniforme con una LD50 de -1.0 log10 PFU y un tiempo medio a la muerte de siete días. Esta prueba fue entonces determinada ser útil para comparar la neuro-virulencia de candidatos para vacunas con Dryvax® parental . Los resultados de estos experimentos son resumidos en la Tabla 2, y se muestran en las figuras 1A-1D el número de ratones sobrevivientes y los tiempos promedio de supervivencia encontrados en este análisis.
Tabla 2. Neuro-Virulencia para Ratones Lactantes, Candidatos para Vacunas de Vaccinia
Pueden usarse pruebas adicionales para probar la virulencia de los candidatos para vacunas. Por ejemplo, se desarrolló una prueba de virulencia cutánea en conejos. Esta prueba fue desarrollada de manera exitosa usando inoculación intra-dérmica de Dryvax® sin pasar, que produjo lesiones de cavidad relacionadas con la dosis, caracterizadas por eritema, induración, y en algunos casos una lesión central. Como otro ejemplo, puede usarse una prueba de neuro-virulencia en monos. En esta prueba, se prueba un candidato derivado de Dryvax® clonado contra Dryvax® por inoculación IC de dosis graduadas de virus . También se desarrolló un modelo de cuestionamiento de ratones para pruebas de protección. En este modelo, la cepa WR de vaccinia fue usada para cuestionar ratones de 6 a 8 semanas de edad por la ruta intra-nasal (IN) . La LD50 es de ~4.5 log10 PFU y el tiempo medio a la muerte es de 6-7 días después del cuestionamiento. La prueba es suficientemente robusta para uso en estudios de protección pre-clinica con el nuevo candidato para vacuna. También pueden usarse modelos similares usando otros virus del género Orthopoxvirus, tales como el virus de viruela de ganado vacuno . Se probó la capacidad de Dryvax® y las clonas 2 y 4 para inducir inmunidad protectora contra cuestionamiento por vaccinia WR en ratones. La clona 3 también fue probada para determinar si una clona con mayor virulencia también induce una mayor respuesta inmune. Se inmunizaron ratones de cuatro semanas de edad con dosis graduadas de cada cepa del virus. El virus fue inoculado en la piel por escarificación con una aguja bifurcada, que es el método usado para inocular Dryvax® en seres humanos.
Tres semanas después de la inmunización, se cuestionaron los ratones con 6.5 log10 PFU (100 LD50) de vaccinia WR por la ruta IN. Se determinó la tasa de supervivencia durante 14 dias después del cuestionamiento. La protección que responde a la dosis fue observada con todas las cepas del virus, y todas las clonas protegieron ratones al menos también como Dryvax®. No hubo diferencias en la actividad protectora entre las clonas. Los tiempos promedio de supervivencia a diferentes dosis de inmunización son resumidos en la Tabla 3 y se muestran en la Tabla 4 las dosis protectoras al 50% (PD50) . Tabla 3. Tiempo de Supervivencia de Ratones Inmunizados Después de Cues ionamien o con 100 LD50 de Vaccinia WR
Tabla 4. Dosis Protectoras al 50% de Dryvax® y Candidatos para Vacunas
Análisis con Endonucleasa de Restricción ADN de Dryvax® y cada candidato para vacuna fue purificado y sometido a digestión por endonucleasa de restricción mediante HindIII para determinar si habían diferencias genéticas entre las cepas. No se detectaron diferencias, como se muestra en el análisis electroforético del ADN genómico digerido mostrado en la figura 2. Selección de Un Sustrato Celular Se realizaron estudios de replicación de Dryvax® y rendimientos en células MRC-5 y células de fibroblastos de embrión de pollo primarios (CEF) , y mostraron que los rendimientos eran menores en células CEF que en células MRC-5. De esta manera, se seleccionaron las células MRC-5 como el sustrato para desarrollo de vacunas. Los candidatos pueden ser sometidos a prueba en células CEF u otras para comparar los rendimientos de las vacunas. También se compararon los medios de crecimiento para expansión de células MRC-5. Los medios Williams E, esencial mínimo (MEM) y MEM de Dulbecco dieron resultados equivalentes. El enriquecimiento de los medios con suero bovino fetal (FBS) adicional, aminoácidos no esenciales, vitaminas y piruvato de sodio no aportó ventajas sobre el medio con 10% de FBS respecto a la viabilidad o el crecimiento celular. La cinética de crecimiento de MRC-5 a la densidad de siembra de células apropiada fue adecuada. La densidad de placas celulares fue determinada ser de 2 x 104 células/cm2. Se determinó que el tiempo para la división fue de 3 a 5 días, y se determinó que la duplicación/división de la población fue de 1 a 1.5. Se definió un método para producir bancos celulares y para expansión celular para crecimiento o desarrollo de virus. Se mostró que los métodos estándar de tripsinización eran adecuados para disociación celular. Se mostró que un método alternativo usando pronasa bacteriana era útil, y puede tener la ventaja de evitar productos derivados de animales en la elaboración. Otras formas de realización de la invención están presentes en las siguientes reivindicaciones.